专利名称：：多组分疫苗的利记博彩app
技术领域：
：本发明总体涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)，特别涉及多组分疫苗和使用该疫苗保护不受HIV-1感染的方法。冃京生产有效的HIV-1疫苗是AIDS研究的重要目标。迄今，预防性疫苗的开发由于下述原因而尚未成功Hiv具有多样性(Gaschen,Science296:2354(2002));免疫细胞在黏膜位点(mucosalsite)凋亡的快速发生(Mattapallil等,Nature434:1093(2005);Veazey等，Science280:427(1998);Guadalupe等，J.Virol77:1-1708(2003);Brenchley等，J.Exp.Med.200:749(2004);Menhandru等，J.Exp.Med.200:761(2004));HIV-1是具有病毒性细胞储存器(cellularreservoir)的整合病毒(integratingvirus)(Fauci，Science245:305(1989));自体HIV-1先天中和抗体应答的诱导的延迟(在病毒在血浆的增加后的八周到一年内)(Abel等，J.Virol80:6357-67(2006),Wei等，Nature422:307-12(2003);Richman等，Proc.Natl.Acad,Sci.USA100:4144-9(2003))。本发明涉及多组分疫苗，其通过使用共有的和/或嵌合的HIV基因(Gaschen等，Science296:2354(2002);Liao等，Virology353:268(2006),Gao等，J.Virol.79:1154(2005),Weaver等，J.Virol.80:6754(2006),Fischer等，NatureMedicine,13(1):100-106(2007)，Epub2006Dec24)、被设计用来破坏免疫耐受性以使得可在黏膜位点诱导所需的中和抗体的特异性的策略(strategy)(例如，通过使用调节性T细胞抑制和/或TLR-9激动剂佐剂)和被设计用来克服HIV-1诱导的凋亡的策略(例如，诱导抗磷脂酰丝氨酸(PS)抗体、抗CD36抗体和/或抗tat抗体)，来解决由HIV多样性引起的问题。
发明内容本发明总体涉及HIV。更具体地，本发明涉及可被用来保护人类不受HIV-1感染的多组分HIV疫苗。根据以下描述，将明白本发明的目的和优点。附图简述图1是紧接在急性HIV-1感染之后的抗体应答的概括图。图2A-2F:Fas配体相对于病毒量。(图2A)Fas配体，6246组；(图2B)Fas配体，6240组；(图2C)Fas配体，9076组;(图2D)Fas配体，9021组;(图2E)Fas配体，9020组；(图2F)Fas配体，9032组。图3A-3F:Fas(CD95)相对于病毒量。(图3A)Fas(CD95)，6246组；(图3B)Fas(CD95)，6240组；(图3C)Fas(CD95),9076组；(图3D)Fas(CD95)，9021组；(图3E)Fas(CD95),9020组；(图3F)Fas(CD95)，9032组。图4A-4E:TNFR2相对于病毒量。(图4A)TNFR2,6240组；(图4B)TNFR2,6244组；(图4C)TNFR2,6246组；(图4D)TNFR2，9020组；(图4E)TNFR2,9021组。图5A和5B:TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)。(图5A)TRAIL,9020组；(图5B)TRAIL,9021组。图6A和6B:PD-1是在慢性HIV-1感染时在T细胞和B细胞上被上调。(图6A)CD3+;(图6B)CD19+。图7A-7D:(图7A和7B)在未被感染的细胞上的抗-PS;(图7C和7D)在MN感染的细胞和病毒体上的抗-PS。图8A和8B:mAb4E10和2F5结合至肽-脂质体缀合物。约1000RU的合成脂质体(红色)；月旨质-GTHl-4E10(图8A，红色)；或4E10-GTHl-脂质(图8A，蓝色)被锚定至BIAcoreLl传感芯片。第四组流动细胞(flowcell)未被处理(绛红色)，其不含脂质。在另一个传感芯片上，脂质-GTHl-2F5(图8B，绿色)；或2F5-GTHl-脂质(图8B，蓝色)或单独的脂质体(图8B，红色)被锚定。MAb4E10(图8A)或mAb2F5(图8B)被注射在每个传感芯片上，并将结合应答记录在BIAcore3000仪器上。利用两步法构象变化模型和mA评估软件，由曲线拟合分析获得Kd值。方法:从AvantiPolarLipids(Alabaster,AL)购买溶解在氯仿中的磷脂POPC(l-棕榈酰-2-油酰-训-丙三醇基-3-卵磷脂)、POPE(l-棕榈酰-2-油酰-s"-丙三醇基-3-磷脂酰乙醇胺)、DOPE((l,2-二油酰，-丙三醇基-3-磷脂酰乙醇胺)、DMPA(1,2-肉豆蔻酰，-3-磷酸脂)和胆固醇。通过将适当摩尔量的磷脂分散在耐氯仿的管中来制备磷脂脂质体。以45:25:20:10(POPC:POPE:DMPA:胆固醇)的摩尔比将脂质的氯仿溶液加至肽溶液中。将HIV-1膜近极肽(proximalpeptide)溶解在70%氯仿、30%甲醇中。每种肽被添加至肽:总磷脂的摩尔比为1:420。通过温和搅拌混合磷脂，并在温和的氮气流中将混合物在通风橱中干燥。通过将脂质在高真空F储存(15h)而除去任何残留的氯仿。通过添加PBS或TBS缓冲液(pH7.4)并在高于Tm的温度F保持10-30分钟，同时间歇性剧烈搅拌以重悬磷脂，其后在超声波仪(MisonixSonicator3000，MisonixInc.,Farmingdale,NY)中超声处理，从而制备磷脂的水悬浮液。将超声波仪设定为每个循环运行3个连续循环(共45秒的超声处理)。每个循环包括5秒的超声波脉冲(70瓦特功率输出)，其后为12秒的脉冲停止周期。在超声处理结束时，将片状脂质体的悬浮液保藏在4°C，并在锚定至BIAcore传感芯片之前被解冻并如h所述被再次超声处理。肽被合成并通过反向HPLC纯化，并通过质谱分析确认纯度。用于本研究中的肽包括以下肽HIV-1gp412F5表位肽-GTHl-2F5(YKRWIILGLNKIVRMYS-QQEKNEQELLELDKWASLWN);2F5-GTH1(QQEKNEQELLELDKWASL豐-YKR額LGLNKIV腿YS);和HIV-1gp414E10表位肽，GTH1醒4E10(YKRWIILGLNKIVRMYS画SLWNWFNIT丽LWYIK);4E10-GTH1(SL糊WFNITNWLWYIK-YKRWIILGLNKIVRMYS)图9:本发明多组分疫苗克服的有害急性感染事件的方案。图10:非人类灵长类动物(NHP)ONTAK消耗(剂量/动力学)。图11:用rPA免疫的NHP中的T-Reg。图12:抗-PA结合的ELISA。图14A-14C:用于测量血浆凋亡MP的流式细胞技术的开发。为了开发出使用流式细胞术分析血浆的新方案，首先分析了聚苯乙烯珠粒(bead)的混合物(图14A)。尺寸为0.1jLim至1.0pm的珠粒被与BDLSRII等比例混合，并使用BDLSRII稀释并分析珠粒。这些尺寸是根据之前的研究(通过尺寸来定义微粒)而被使用的(Werner,Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.26(1):112-6(2006)Epub2005年10月20日，Distler等，Apoptosis10:731-741(2005))。因为光电倍增管具有鉴别比前向散射检测器的二极管更小的颗粒的增强的能力，所以侧向散射被用作尺寸鉴别器。为了测定最佳的稀释范围，分析了聚苯乙烯珠粒混合物的一系列的连续稀释(图14B)。通过进行这样的实验发现，任何未被足够稀释的样品，因为巧合和高中断率，将产生与实际不符的少的事件计数(eventcount)。当流式细胞仪因为事件太紧密或对于系统单独(同时)处理来说太快而不能处理事件时，就会出现中断的事件。通过将样品稀释到一次只有-^个颗粒流过检测器时，由细胞仪处理的事件计数就更加准确。实际..匕，当珠粒混合物以1:1000被稀释时，4种不同尺寸的珠粒不能被很好地鉴别，而以1:100000稀释时，每种尺寸的数目可被清楚地检测到。为了分析血浆微粒(图14C)，使用相似的连续稀释以通过实验确定最佳的稀释(未显示数据)。为消除计数存在于血浆中的死细胞(但小于细胞微粒且不具有前向或侧向散射)的可能性，发生在确定的微粒门(microparticlegate)范围内的事件被计数。此门(gate)包括在低侧向散射范围内的O.l，珠粒并包括在较高侧向散射范围内的l.Opm珠粒，而不包括具有非常小的前向和侧向散射的颗粒(图14A和14C中的红色方框)。对于每个实验操作，聚苯乙烯涂料(sizing)珠粒都以1:100,000被稀释，使得所有数据以相同方式被收集(gated)。在血浆样品中，研究者发现大部分微粒在0.1至0.5pm之间(证明侧向散射面积小于104的红色微粒门内的个体)。也存在较大的微粒(大于0.5pm但小于1.0pm)，但所占比例较小。图15A-15D:血浆MP的表型匕的冻融循环的效果。因为某些细胞外标记物在血浆供体样品中的表达水平很低，所以对冷冻和融化血浆对微粒表型的影响作了研究。来自HIV-1慢性感染供体的血桨被分成3份。第一份保持在2(TC(新鲜的)。第二份在-80C冷冻IO分钟并被融化(冷冻lx)，而第三份被同样地冷冻、融化，并被再冷冻(冷冻2x)。所有三个样品随后被稀释、过滤和离心。使用CD3(图15A)、CD45(图15B)、CD61(血小板MP标记物)(图15C)和膜联蛋白V(图15D)来染色MP重悬液。绿色方框内的百分数表示在被同时分析的同种型对照的背景抽取后，那种特定标记物的MP阳性的百分数。这些百分数在第一个冻融循环时增加，而在另-个冻融循环后减少，表明样品完整性在血浆MP的表型分型中起重要作用。图16A-16C:HIV、丙肝病毒(HCV)和乙肝病毒(HBV)受试者的血浆病毒量。研究了30个HIV+阳转血浆组(panel)(HBV和HCV阴性)、10个HBV阳转组(HIV阴性)和10个HCV阳转组(HIV阴性)。各组正式HIV(图16A)、HCV(图16B)和HBV(图16C)的病毒量增加的动力学。第0天被确定为HIV病毒量达到100拷贝数/ml的第一天，HCV病毒量达到600拷贝数/ml的第一天和HBV病毒量达到700拷贝数/ml的第一天。图17A-17C:凋亡的血浆标记物。图17A:通过ELISA测量每个血浆样品的TRAIL、TNFR2和Fas配体，并与病毒量水平比较。图17B显示三个有代表性的受试者。为了比较受试者之间的凋亡的血浆标记物的增加量，将第0天前的平均值与第O天之后的平均值比较，并计算增加的百分数。(图17C)在HCV和HBV感染受试者中测量相同的凋亡的血浆标记物。显示了.一个HCV受试者和-个HBV受试者的结果。图18A和18B:凋亡的血浆标记物的总结。图18A:对每组数据进行Boxplot分析。展示了急性HIV-1、HBV和HCV小组的结果，其中垂直线表示最大值和ii最小值。利用Student'sT测试技术P值。蓝色方框表示p<0.01。图18B:峰值被分析物相对于最大病毒扩张(rO)的出现时间(timing)。结果来自于成对的Wilcoxcm秩检验，低p值表示(峰值日期的)两个平均值显著不同。这暗示峰值(例如扩张峰值日和TRAIL峰值日)的平均"达到时间"显著不同。到达时间之间的"延迟"可根据平均值、中值和四分位差来描述。在此组，每个被分析物最大值的"达到时间"都与峰值病毒扩张(红色方框)比较。来自Wilcoxon检验的p值显示在被分析物上方。还记载了平均延迟时间(括号内中值时间)。圆圈表不弁吊但。图19A和19B:血浆样品中的相对微粒计数。图19A:对于每个被研究的30个受试者，获得每个连续时间点的相对微粒计数。显示了三个有代表性的受试者。图19B:对IO个HBV和IO个HCV感染的受试者进行相同的分析。显示了一个HCV受试者和一个HBV受试者的结果。图20:从急性HIV-1感染受试者收集的血浆MP的投射式电子显微照片。通过超速离心使血浆MP成丸状，并通过蔗糖垫(pad)纯化。MP的尺寸为0.05微米至0.8微米。发明的详细描述本发明涉及多组分、多功能HIV疫苗，其用来克服i)HIV多样性，ii)中和抗体诱导的耐受约束(toleranceconstraints)和Hi)凋亡诱导的免疫抑制。本发明提供"种HIV疫苗，其包含集中的(centralized)HIV基因插入物(insert)(共有的、嵌合的)、耐受性破坏成分(例如，TLR-激动剂、调节性T细胞抑制)和可以抑制凋亡的免疫抑制或抑制凋亡本身的成分(例如，抗-PS、抗-CD36抗体诱导和/或抗HIVtat抗体诱导)。导致产生HIV-1包膜免疫通常不会产生的抗体特异性的佐剂和其他免疫体制(immunizationregimen)的使用，已在之前被提议(PCT/US2006/013684;US申请第11/785,007号；US申请第11/812,992号；US临时申请第60/960,413号)。此成果是由观察到许多广谱中和抗HIV-1单克隆抗体是自身抗体且可能受免疫调节控制而得到的(Haynes等，Science308:1906(2005)，Haynes等，HumanAntibodies14:59(2006))。已被用来在小鼠中破坏耐受性的一种佐剂体制(adjuvantregimen)是在油基佐剂中的寡CpG(Tran等，Clin.Immunol.109:278(2003))。对于人类，可使用B型寡CpG，包括2006或10103oCpG(McCluskie和Krieg,Curr.Topic.Microbiol.Immunol.311:155-178(2006))。但是，可能很难完全克服耐受性控制(即使是临时性的)，并且自身抗体的产生也受调节性T细胞控制(Shevach，Immunity25:195-201(2006))。因此，使用佐剂体制并结合使用使调节性T细胞临时失活的体制的免疫，可被用来诱导抗-HIV-l抗体(通常通过负免疫调节机制来防止被诱导)。调节性T细胞可通过使用以下方式被失活或消除使用糖皮质激素诱导的TNF家族相关的受体配体(GITRL)DNA免疫(Stone等，J.Virol.80:1762-72(2006));使用CD40配体DNA免疫(Stone等，Clin.VaccineImmunol.13:1223-30(2006));或与疫苗免疫同时使用CD25mab或ONTAK、IL-2-毒素缀合物(参见PCT/US2005/37384、PCT/US06/47591、US申请第11/302,505号和US申请第11/665,251号)(以下实施例2中提供的数据证实了对猕猴使用ONTAK增强了抗体的产生)。破坏对被使用的免疫原的耐受性的另一途径是设计具有胞质域内质网保留序列(retentionsequence)(例如赖氨酸-赖氨酸)的重组插入基因(insertgene)，并靶定HIV基因(例如包膜)以实现保留在内质网内(Cornall等,JEM198:1415-25(2003))。这样设计的基因可以为，例如，重组腺病毒免疫原DNA，或重组疱疹性口炎病毒免疫原DNA或它们的组合。任何其他载体也可被用来递送插入基因(例如，表l中给出的载体)农1C咖-Sgpl60cmMRVRGIQRNCQHLWRWGTLILGMLMICSAAENLWVTVYYGVPVWKEAOTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPUPQEIVLENVT咖FTO4WKNNMVEQMHEDIISL卿SLKPCVKLTPLCVTLNCTNVNVTNTTNNTEEKGEIKNCSFNITTEIRDKKQKVYALFYRLDWPIDDKKNNSSNYRLINCNTSAItqacpkvsfepipihycapagfailkcndkkfngtgpcknvstvqcthgikpwstqlllngslaeEEIIIRSENITroiAKTIIVQLNESVEINCTRPNNNTRKSIRIGPGQAFYATGDIIGDIRQAHQIISgtkwnktlqqvakklrehfnnktiifkpssggdiieitthsfncrgeffycntsglfnstwigngtknnnntndtitlpcrikqiinmwqgvgqamyappiegkitcksnitgllltrdggnnntneteiprpgggdmrdnwrselykykvvkieplgvaptkaerrvveager&vszgftvflgwigaagstosaasitlwoarollsgivooosnllraieaoohlloltvwgikoloarvl&verylkdoolLGIWGCSGKLICTTTVPWNSSWSMKSODEIWDNMTWMEWEREI匿tdiiysli咖q咖ekmeoEUiALDK(msLTOJwFD工T测LWY工iaF工M工VGGLIGLRIVFAVLSIV服VRQGYSPLSFGTLIPNPRGPDRPEGIEEEGGEQDRDRSIRLVNGFLALAWDDUISLCLFSYHRLRDFILIAARWE)IiLGRKGLRJW5WEALKYLWNLliQYWGQELKNSAISI^DTTAIAVAEGTDRVIEVVQRACRAILNIPRRIRQGIiERAIA磁伶錄裕鍵"黑体浙—A，教々^'/ffi-7被力/7>:效统，///-2力黑沐激分，.免發汰.势^"虚乂'7沐/〃7>，统跨嚴t舒裕凝'"效乂字/4凌示。^r^w化！游^:变#成￡,存'.5M泣ir游尺,异成fi,"嫩餘欲教/';rMRVRGI卿CQHLWRWGTLILG顧ICS織NLWVTVYYGVPVWKEANTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPUPQEIVLENVTENFNMWKNNMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTNVNVTNT丽TEEKGEIKNCSFNITTEiRDKKQKVYALFYRLDWPIDr)NNNNSSNYRLINCNTSAItqacpkvsfepipihycapagfailkcndkkfngtgpcknvstvqcthgikpwstqlllngslaeeeiiirsenitnnaktiivq匿sveinctrpnnntrksirigpgqafyatgdiigdirqahcnisGTKWNKTLQQVAKKLHEHFIMKTIIFKPSSGGDLEITTHSFNCRGEFFYCNTSGIiFNSTWIGNGTKnnnntndtitlpcrikqiinmwqgvgqamyappiegkitcksn工tcllltrdggnnntneteifrpgggdmrdhwrselykykwkiepiigvaptkaerrvvekeer&vgigavflqflsaagstiggaasirltvoarollsgivooosnllrmeaoqhllol，gikoloarvlaverylkdoolLGIWGCS孤LALDTOWkSL,FDI丽LWYIKIFIMIVGGLIGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPlsfqtlipnprgpdrpegieeeggeqdrdrsirlvngflalawddlrslclfsyhrlrdfiliaarTVEIitiGRKGLRRGWEALKYLWNlXQYWGQEIiKNSAISIXDTTAIAVAEGTDRVI,QRACRAILNIPRRIRQGLERAL函敲絲称统"黑体,产;^统菱示，朋-/號勿,纖，朋-2为黑沐虔纷，.免发傻势区"^t，体辨,纖表示，i^l鄉以顏乂字体歸。在4^體游/:辦成i,在J^錢鄉/c棘成五，M^OT泣点。在c厕餘iCOK-Sgpl60MRVRGIQRNCQHLWRWGTLILGMLMICSAAENLWVTVYYGVPVWKEANTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQE工VLE,ENFIWWKNNMVEQMHEDI工SLWDQSliKPCVKLTPLCVTLNCTNVNVTNTTNNTEEKGE!IKNCSFNTTTE工RD卿KVYALFYRLDVVPIDDKNNNSSlinfRLl:NCNTSAITQACPWSFEPIPIHYCAPAGFAIIiKCNDKKFNGTGPCKNVSTVQCTHGIKPWSTQLLLNGSLAEEEIIIRSENITNNAKTIIVQLNESVEINCTRPNMNTRKSIRIGPGQAFYATGDIIGDIRQMICNISGTKWNKTLQQVAKKLREHFNNKTIIFKPSSGGDLEITTHSFNCRGEFFYCNTSGLFNSTWIGNGTKNNNNTNDTITKPCRIKQIIlWQGVG0JpiyAPPIEGKITCKSNITSLLLTRDG3NNNTNETEIFRPlttoarollsgivo。OSNLLRAIEAOOHLLOLTVWGIKOLemRVLM/ERYLKDOOLLGIWGCSGKL工CTTTyTOMSSWSMKSODEl抑nmtwm臓匿匿TDliTfsti鹏SiLaldkw&sowiwFD工TNWLWY工KIFIMIVGGLIGLRIVFAVLSIVnrvrqgyspLSFQTLIPNPRGPDRPEGIEEEOSEQDRDIlSIRLWGFLMjAWDDLIlSLCLiFSraRLRDFIIiIAARTVELLGRKGlillRGWSALKYLWNLLQYWGQELJCNSAISI^DTTAIAVAEGTDRVIEVVQRACRAILNIPRRIRQGLERALD激合翁賴凝以黑体浙K劍錄表示，//iW被^77淑錄，/恥2为黑伴教分'—免嫂'汰势区"及乂字沐浙7"，錄:，機^^離犬字沐新。CC9-Sgpl60KKMRVRGIQRNCQHLW柳GTMLGMLMICSAAEKLWTVYYGVPVWKEANTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQErVLENVTEKFKMWK2INMVE,EDIISLWDQSLKPCVKLTOLCVTLNCTNVNVTNTTNNTSEKGEIKNCSFNITTEIRDKKQKVYALFyRLDWPIDDNNNNSSNYRLINCWTSAITQACPKVSF固P工HYCAPAGFA工LKCNDKK鹏TGPCKNVSTVQCTHGIKPWSTQLL國SLAEEE工IIRSENITHNAKTInTQLNESVEINCTRPNMrTRKSlRIGPGQAFYATGDIIGDIRQAHCNISGTKWNKTLQQVAKKLREHFNNKTIIFKPSSGGDLEITTHSFNCRGEFFYCNTSGIiFNSTWIGNGTKKNKNTNDTITLPCRIKQIINMWQGVGQMIYAPPIEGKITCKSNrrGLLLTRDGGKNNTNETEIFRPGGGDMRDNWRSELVKYKWKIEPLGVAPTKAKRRWEKEKH&V^lCAVFLgFLGAJWSSTMQaASirlwoarollsgivooosmllraieaoohlloltvwgikolqarvlaverylkdoolLG工WGCSGKLlCTTTVPWNSSWSNKSODgJlWD鹏TWMEWEREJ:NMYTDirySLIEE幼UQOEKHEO迈LiAiDKWASLWNwFD工TNWLWYIK工F工M工VGGIiIGLiRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTLIPKrPRGPDRPEGIEEEGGEQDRDRSIRLWGFLALAWDDLRSLCLFSYHRLRDFILIAARTVEULGRKGLRRGWEALKYLWNLIiQYW3QEL鹏AISIiliDTTAIAVAEGTDIlVIEVVQRACRAILN工PRRIRQGLSRALIiKKJRFL朋160mr卿irknyqhlwrggtli/lgiivicSAVEKLWTVYYC5VPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNvwathacvptdpnpqewlgnvtekfkmwknwmveqmqediislwdqslkpcvkltplcvtlnckdvnatnttktgseg簡rgeikncsfnittsirdevqkeyalfykldvvpidnkntsyrliscdtsvitqacpkisfepipihycapagfailkcndktfngkgpcknvstvqcthgirpwstqlllngslaeEEWIRS匿TNWAKTII卿KESVEI!TCTRPlWKTRKSIHIGPGRAFYTrGE工rcDlRQAHCNISrakwndtl柳vikl卿fenktivfnhssggdpeivmhsfncggeffycnstqlfnstwnnntegsnntegntitlpcrikqiinmwqetckamyappirgqircssnitgllltrdgginengteifrpgGGDMKDMWRSELYKYKWXIEPLGVAPTKAKRRWOREKRAVglGAVgLG梦3^ft6SmiSaA^lTLtvoarlllsgivooowwllraieaoormloltvwg工ko:loarvlaverylgdoollgiwgcsgkliCTTAW鄉ASWS服SIiDRlWNKMTWMEWEREIDNYTSEIYTM腿S讽效EKNE卿LmiDKWASL薩FDITKWLWYIKIFIMIVGGLIGLRIVFTVLSIVnrvrqgysplsfqtllpaprGPDRPEGIEEEGGERDRDRSGRIiVKGFLALIWVDLRSinFSYHRLRDIiLTVTOIVEIXGRRGWEvlkywwnllqwsqelknsavsllhataiavaegtdriiealqrtyrai呵ptrirqglerall激合裙称凝"黑体浙f:叙续表示，被'勿K劍錄，/恥2为黑体都分，^疫汰势区被龙7，续.并含#"爿歷r務，^#^^^字体标。mrvkgirkny,wrggtlmigi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^(A亚型)jrpl(B亚型)_^72w2(c亚型)h^隔,禽群__豚鼠数目-iSi^50X的中和滴定量是在假型HlVd病毒中和分析中测定的。如果免疫后血清的滴定量》3倍免疫前血清，并且中和滴定量的值>30，那么中和被认为是阳性的(黑体表示的数字)。92US715b.柳is7條qmss1sb.蛇，彻鹏必必幼彻gs必必sg必必ssge必0必必必必必必8必必必必必必必必必必必s敏必必6幼旭e必必ss必必ss吣gwm必必必^必必8效8J必必必必必必幼^必g敏必必s微^的必必sg必必^g鄉ss必必幼必必必必s必s必必必必必必必必必g欲^鄉挪g鄉^iwfl認g^必必n必幼必必^^必,f彻必必,鉞^恥n鄉g必必ii8il必必,必^ff,砝；^,§2必|§s站御鹏gs:s必^敏船敏必必:gs必必gs必必gss糊g必sgl鄉g必必鄉鄉必必鄉鄉^鄉柳TI:必ll^必必敏鄉必g^船必必必必必必必f必微aEg…simiisiss必是碧必w羞Ems:卿<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>用来处理HIV-1基因的载体包括用于初免(priming)的DNA(Letvin等，Science312:1530-33(2006))、用于加强(boosting)的重组腺病毒(Barouch等，Nature441:239-43(2006),Letvin等，Science312:1530-33(2006),Thorner等，J.Virol.Epub.2006年10月11日))、重组疱疹性口炎病毒(Publicover等，J.Virol.79:13231-8(2005))和重组分枝杆菌(例如减毒的TB、rBCG或重组耻垢分枝杆菌)(Hovav等，J.Virol"epub"2006年10月18日，Yu等，Clin.Vacc.Immunol.13:1204-11(2006),Derrick等，Immunology,epub.2006年10月31日)。这些载体的任何一个可以初免/加强组合的形式被使用，且免疫的途径可为全身免疫(例如IM、SC)或黏膜免疫(po、IN、阴道内黏膜免疫、直肠内黏膜免疫)。如以..匕所指出的，本发明的接种方法包括特定的成分，该成分用来克服HIV-1诱导的凋亡和免疫抑制，以消除在黏膜位点的HIV-1传染后T和B细胞应答的延迟。最近的研究显示，虽然多个抗体物种出现在急性HIV感染的极早期，但非中和抗-gp41抗体出现得最早，且自体中和抗体在传染后的儿个月内都不会出现(图1)(Wei,Nature422:307-12(2003),RichmanProc.Natl.Acad.Sci.USA100:4144-9(2003))。假设在感染SIV的猕猴中，大量的凋亡与感染和血浆病毒量增加同时发生，那么问题是这样的免疫细胞的大量凋亡是否发生在人类急性HIV感染的最早期。凋亡最通常是通过肿瘤坏死受体家族的成员来介导的，包括Fas(CD95)和Fas配体(CD178)、TNF受体I和II和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)。Fas和FasL在慢性HIV-1感染中被异常调节(Cossarizza等，AIDS14:346(2000);Westendorp等，Nature375:497(1995);Sloand等，Blood89:1357(1997))。已经在研究确定在急性HIV感染中血浆Fas或FasL是否会升高。已发现，在许多AHI病人体内，血浆FasL的急剧上升与血浆病毒量的上升同时发生(图2)。另外，在几个(并非所有)病人体内，血浆Fas也伴随上升(图3)。TNFR2水平在慢性HIV中增力Q，且是疾病发展的前兆(Zangerle等，ImmunolLett.41:229(1994))，并且TNFR2在HIV与单核细胞相互作用的早期阶段被触发(triggered)(Rimaniol等，Cytokine9:9-18(1997))。如图4所示，在伴随病毒量增加的感染过程期间，在许多AHI病人体内发现了可溶性TNFR2的升高。最后，TRAIL在HIV感染起见介导未受感染T细胞的凋亡(Kasich等,JEM186:1365(1997);Miura等，J.Exp.Med.193:51(2001))。图5显示血浆TRAIL水平在AHI病人体内也升高。因此，HIV病毒体和HIV包膜可直接诱导在AHI中的T细胞死亡，可溶性TRAIL可结合至未受感染细胞并诱导在AHI中的死亡，且伴随细胞的HIV感染和大量凋亡，含高水平的磷脂酰丝氨酸的细胞和类似颗粒大量存在于AHI中。最近研究显示，PD-1(程序化死亡分子-l)存在于慢性HIV感染中的人类B细胞的表面上。这表明人类B细胞在HIV感染中准备(primed)凋亡。HIV特异性CD8+T细胞PD-1表达与CD8+T细胞对缺乏控制的慢性HIV感染的应答有关(Petrovas等，JEM203:2281(2006))。已经在HIV感染的细胞和病毒体的表面.h发现了磷脂酰丝氨酸(PS)(图7)，并且Callahan等已发现PS是单核细胞HIV感染的辅因子(Callahan,J.Immunol170:4840(2003))。凋亡细胞的PS依赖性摄取促进TGF-fil分泌(Huynh等，J.Clin.Invest.109:41(2002))，并且PS和PS受体之间的相互作用抑制了体内的抗体应答(Hoffman等，J.Immunol.174:1393(2005))。INF-a(—种抗病毒细胞因子)使淋巴细胞对凋亡敏感(Carrero等，JEM200:535(2004))。在慢性HIV感染中PS+脱落膜颗粒(shedmembraneparticle)增加(Aupeix等，J.Clin.Invest.99:1546(1997))，且凋亡微粒调节巨噬细胞免疫应答(Distler等,Apoptosis10:731(2005))。凋亡微粒完全是促炎的(Distler等，PNAS102:2892(2005))，且促炎细胞因子的诱导激起HIV感染和病毒体产生过程。被氧化的PS-CD36相互作用在凋亡细胞的巨噬细胞依赖性噬菌作用中起着必不可少的作用，且B细胞也表达CD36(Greenberg等，JEM,2006年11月13日,网上出版物)。因此，伴随急性HIV感染的大量凋亡，以及所引起的TRAIL的释放、经由FAS-FASL相互作用的凋亡的介导和含PS病毒和其他颗粒的释放，所有这些共同对宿主进行最初的免疫抑制，防止保护性B细胞的快速应答。本发明包括防止凋亡的策略，其包括但不限于，使用含PS的HIV免疫原，例如PS脂质体，具有或没有CON-S或CON-Tgpl40或HIVenv表位与脂质体联合，例如2FR-GTH1肽脂质缀合物(图8A和8B)，该缀合物与佐剂一起使用以破坏耐受性并诱导抑制PS-CD36相互作用的抗-PS抗体。或者，重组CD36可被靶定以升高抗-CD36抗体，优选地，抗-PS抗体和抗-CD36抗体在黏膜位点被诱导以防止凋亡介导的免疫抑制。可用来防止凋亡的本发明的其他策略包括在HIV疫苗免疫原中的HIVtat基因或蛋白质，以诱导抗tat蛋白抗体，该抗体将抑制tat在免疫细胞中诱导凋亡的能力(Eusoli等，MicrobesInfect.7:1392-9(2005))。可被使用的tat的形式包括101个氨基酸tat蛋白质或编码该蛋白质的基因(Watkins等，Retrovirology3:1742(2006))。除以上所述之外，在疫苗中还可包括全胱天蛋白酶(pancaspase)抑制剂(例如zVAD-FMK(参见Dean等，CancerTreat.Rev.33:203-212(2007),Meng等，Current.OpinionCellBiol.18:668-676(2006)))，以同时抑制与凋亡有关的任何疫苗或免疫细胞活化，以让抗体应答快速出现。任何Env相关的免疫抑制都将被克服。全胱天蛋白酶抑制剂也可被用来治疗慢性HIV感染。通过使用具有各种TNF抑制剂(例如Etanercept，-一种二聚体人TNFRp75-FC融合蛋白)或具有抗TNFa抗体(例如Infliximab或Adalimumab)(参见"RheumatoidArthritis(风湿性关节炎)",EWSt.Clair、DSPisetsky和BFHaynes著，LippincottWilliams和Wilkins,2004，特别是第31和32章)和Fas-Fas配体相互作用的抑制剂(像Fas-Fc)和TRAIL-DR5相互作用的抑制剂(例如DR5-Fc)(这些可用在一起或单独使用)的HIV抗原来免疫，也可实现免疫抑制凋亡损失的弥补。这样的试剂也可被用来治疗慢性HIV感染。本发明的多组分疫苗的成分，可与药学上可接受的载体一起，通过本领域熟知的技术适当地配制。疫苗成分的合适的使用途径包括全身性的使用(例如，肌肉内或皮下)、黏膜使用或鼻内使用。最适宜的剂量可由本领域的技术人员来确定，且可根据病人和所使用的特定成分的不同而有所改变。本发明的某些方面可在以下非限制性的实施例中被更加详细地描述。实施例1疫苗成分多组分疫苗的基本成分为1.破坏免疫耐受性的策略；2.克服多样性并诱导广泛有活性的中和抗体的免疫原，3.避免与发生在急性HIV感染时的免疫细胞和其他细胞的大量凋亡相关的免疫抑制的策略，4.提供黏膜免疫应答的载体/制剂。本发明的一个实施例为以卜.的多组分免疫原DNA初免包括具有KK胞质域模体(破坏免疫耐受性并处理多样性和中和抗体应答)的重组CON-S共有gpl60HIVEnv重组体，使用重组水泡性口炎病毒加强，该病毒包括CON-Sgpl40HIVEnv和嵌合gag-nef基因、共有pol基因、tat基因(处理多样性和黏膜免疫应答)，重组CON-Sgpl40蛋白在"B"或"C"型oCpG和角鲨烯乳液中初免和加强，该乳液与DNA和rVSV免疫(中和抗体应答、破坏免疫耐受性)并结合在DNA质粒中的CD40配体和GITRL(在每个免疫中使用)一起给药。实施例2非人类灵长类炭疽PA接种模型(猕猴)猕猴TReg细胞衰竭模型已被开发用于测试在TReg瞬时失活对宿主免疫应答(对炭疽保护性抗原(rPA)的免疫应答)的影响。5天内注入ONTAK(15mcg/Kg)到猕猴，显著降低(pO.05)了CD4十/CD25+细胞在外周血中的比例(在图IO中红线和深黑表示)。重要的是，使用抗人CD25单克隆抗体克隆2A3(BDBiosciences)监测NHP(猕猴)CD25。还要注意的是，ONTAK是人IL-2-白喉毒素，众所周知它能够消除动物的CD25+细胞。为了检验ONTAK可能增强宿主对生物防御性免疫原的免疫反应的假说，对中国猕猴幼猴进行了单独的保护性抗原(rPA，25pg)免疫或与ONTAK(15mcg/kgIV)连续5天的联合注入。动物(11=3/组)在免疫后的第-7、5、10、12、19、33、40天被抽血以检验CBC/diff、免疫表型、化学组(chemistrypanel)、血浆和血清。图11显示的是在免疫组中CD4+/CD25TReg细胞在PB的频数。ONTAK输注的猴子的TReg部分(compartment)有明显下降。TReg部分在注入盐水和PA+铝(Alum)免疫的动物组中未受影响。两种检测方法用于评估在NHP模型+AONTAK中对PA的初次体液应答的数量和质量。首先，研究了抗原特异性Ig同种型结合，其次，在TNA测定中测定血清中和炭疽毒素(PA+LF)的能力。所使用的PA(25貼+铝)的剂量诱导抗PA的体液反应始于第19天，如绘制于对数表(图12)的几何平均终点滴度所显示的。可以观察到，ONTAK适度地改善了在第19天的单次免疫后PA特异性IgG和IgM的终点结合滴定(endpointbindingtiter),但这种区别并未维持到第40天(图12)。建立了炭疽毒素中和分析(TNA)，以用于分析小鼠和猕猴的血清。待测血清在分析中被连续稀释。图13A显示随时间变化的最佳稀释度(1:512)的中和曲线的百分比。图13B显示免疫后19、33和40天的实验组NTs。。相对于单独的PA+铝，在免疫后33天的ONTAK的炭疽毒素中和滴度峰值有提高，这提示ONTAK在NHPs中抗PA应答的功能性增强。实施例3在急性HIV-1感染的在病毒量增加时，血浆FAS配体、TNFR2、TRAIL和凋亡微粒的水平被提高实验细节微阳转组(HIV-1+/HCV-/HBV-,n=30,HIV-1-/HCV-/HBV+,n=10,和HIV國1隱,HCV+/HCV-,n-10)从ZeptoMetrix公司(Buffalo,NY)获得。每组由编号的血浆组成(4-30)，每隔3天从血浆供体收集血浆。1^1-/1^^-/1^￥-人血浆(n=25)从InnovativeResearch(Southfield,MI)获得。所有研究都获得杜克大学人类学科机构评审委员会的批准。蘇量淑血浆样本的病毒量测试由QuestDiagnostics(Lyndhurst,NJ)(HIV-1RNAPCRUltra)完成。HCV和HBV的病毒量由Zeptometrix完成；选择HCV病毒量由PhilipNorris，BloodSystemsResearchInstitute,SanFrancisco,CA提f共。銜亡颜微记激游虹ZS^Fas、Fas配体、TRAIL(Diaclone,BesanconCedex,France)和TNFR2(HycultBiotechnology,Uden，TheNetherlands)的ELISA根据制造商的说明书进行操作。血浆以不稀释(TRAIL)、以1:10稀释(TNFR2)或以1:2稀释(Fas配体)分析鉴定。銜亡微(MV游量众每个血浆样本的MP数量采用流式细胞仪确定。所有的流式细胞术分析在LSRIIFlowCytometer(BDBiosciences,SanJose,CA)上进行，数据分析采用FlowJo(Ashland,OR)软件进行。在MP实验使用之前，所有的缓冲液(不含转和镁的PBS)(Cellgro,Herndon,VA)和甲醛(Sigma，St.Louis，MO)通过0.22过滤器(Millipore,Billerica,MA)过滤。用以稀释血浆样本(1%甲醛在不含钙和镁的PBS)的缓冲液被用来确定背景MP计数(在流式细胞仪上，60秒内计数约1500个事件)。为确定MP门(gate),在流式细胞仪上分析了大小从0.1到1|im的FluoSpheres荧光微球(MolecularProbes,Eugene,OR)。MP门围在珠粒周围，包括0.1pm、0.2pm、0.5和1.0的珠粒。每个血浆样本采用1%甲醛/PBS缓冲液以1:100和h1000稀释，数据在60秒内获得。最佳的样本稀释度通过实验获得，可接受的标准为稀释的血浆中断计数<5%，噪信比O.l(噪信比-在PBS/实验血浆MP计数中的背景MP计数)(图14和15)。微表微析血浆样本(2ml)稀释于5ml的已过滤盐水，然后被过滤通过5pm过滤器(PallCorporation,EastHills,NY)。稀释后的样本进行离心(1小时，200000Xg，4°C)(SorvallRCM150GX,ThermoFisherScientific,Waltham，MA)。移去顶部的2.5ml上清液，加入2.5ml的新鲜的盐水，然后离心1小时(200000Xg)。沉淀物在lml的过滤盐水中洗2遍，在清洗毕后，移去90(^1的上清液，沉淀物在剩余的200pl的盐水中重悬。10的MP悬浮液与抗体和/或膜联蛋白V—起孵育(总体积100nl，20分钟，20°C，避光)。含1。/。BSA(Sigma)的盐水作为染色缓冲液与抗体一起孵育，加入2.5mMCaCl2到缓冲液中以进行膜联蛋白V染色。作为膜联蛋白V的对照，50mMEDTA被加入到缓冲液中，孵育20分钟，用盐水/甲醛将体积调至500nl，用流式细胞仪在24小时内分析。结合的抗体包括鼠抗人CD45-PE、CD3-PE、CD4-PE、CD6a、CD63、CCR5-PE、CD14-PE、CD19-PE和同种型对照(BDBiosciences,SanJose,CA)和膜联蛋白V结合AlexaFluor647(MolecularProbes,Eugene,OR)。贿微糊德藩8mL的血浆以l:5稀释于过滤后的盐水和MP沉淀(l小时，200000Xg，4°C)中。洗沉淀(1小时，200000Xg，4°C)。在lmL盐水中重悬沉淀，清洗两遍(100000Xg，30分钟)。用500pl盐水重悬MP沉淀，加入lmL4()n/。蔗糖溶液，然后MP离心(100000Xg，90分钟)。固定沉淀(1%甲醛，《C过夜)，沉淀(100000Xg，60分钟)，浸泡在1%四氧化锇中IO分钟，用盐水冲洗。沉淀用琼脂固定，树脂包埋，6(TC烘烤过夜。超薄切片，染色，用PhilipsCM12透射电镜检测。统#藩为了在所有的血清转换板中建立一个参考点(referencepoint),第"0"天被定义为HIV-1病毒量达到100拷贝数/ml，HCV病毒量达到600拷贝数/ml，HBV病毒量达到700拷贝数/ml的那天。为确定在HIV-1、HBV和HCV感染中细胞凋亡的血浆标志物增加的百分比，将TRAIL、TNFR2或Fas配体在第0天前的均值水平与第0天后的均值水平进行比较，并计算增加的百分比，([(第0天后均值-第0天前均值)/第0天后均值]x脂)。为对比感染中的细胞凋亡的血浆标志物，在阳转组的第一个样本中，未感染供体中的TRAIL、TNFR2或Fas配体的均值水平，和病毒量峰值时的均值水平与在HIV-1感染者和HBV、HCV感染者中进行了比较(数据未显示)。每组数据以方框图分析显示。简言之，对于三组的分析，计算了最大值、最小值、平均值和第一、第三的四分位数(被方框包围)。异常值(1.5X第三的四分位数与第一的四分位数之差)被剔除。采用Students't检验，每组的均值都进行了计算，也计算了P值。为分析在HIV-1感染过程中细胞凋亡的血浆标志物的出现时间，韵律学(metrics)被用来确定病毒扩张速度。韵律学包括最大病毒扩张速度、(rQ)和每个细胞凋亡的血浆标志物峰值的日期。这些分析中，总共30个受试者，其中有6个因为相关病毒量数据太少不能满足韵律学可信的需要而被排除。病毒扩张速度ro通过病毒增长的两个最快增殖点确定。为了确定病毒量和分析韵律学的时间关系，每对数据都进行WilcoxonRankSumTest。每个检测对比最大病毒扩张速度的日期和韵律学峰值的日期。为优化已有的流式细胞术流程以研究微粒，我们进行了各种实验。首先，采用LSRII分析梯度稀释的聚苯乙烯微球以确定可以接受的信噪比和中止计数(图14)。通过实验还确定了细胞外标志物，例如CD3、CD45、血小板标志物CD61和膜联蛋白V的表达水平比一个冻融周期明显下降，显示样本完整的重要性。潜菜在倉丝/f/K/感燊^在疯毒量J:;^y^或J:评好，犬多教疯乂游77^/丄、7M^2浙E4S忠沐游/7t乎教J:^7。为对比病毒的动力学，也为了确定血浆供体病人之间的细胞凋亡的血浆标志物和微粒水平的时序，针对30例HIV-1病人、10例HCV病人和10例HBV病人中的每一个，确定了一个普遍的时间点(第0天)。第"0"天定义为病人的HIV-1病毒量达到100拷贝/ml，HCV病毒量达到600拷贝/ml，HBV病毒量达到700拷贝/ml水平，这些水平是由每个病毒量测定的检测极限限制的。接下来，为确定细胞凋亡的血桨标志物的变化是否能够在急性HIV-1感染过程的早期被检测，在每个血浆供体成为HIV-1病毒量阳性时所有的血浆样本进行了可溶性TRAIL、TNFR2和Fas配体的水平检测，这些水平与HCV、HBV早期感染的水平进行了对比(图17)。可溶性TRAIL、TNFR2和Fas配体的水平改变的百分比由第0天前的分析物水平均值对比第0天后的分析物水平均值得到。急性HIV-1感染受试者中，27/30显示了TRAIL超过20%的增量，26/30显示了TNFR2的增加，23/30提高了Fas配体的水平(图17B)。比较可知，HCV+和HBV+感染受试者显示了>20%的增长在TRAIL,TNFR2或Fas配体仅有0/10，3/10,2/10(在HBV),特别在(HCV)仅有1/10,6/10和7/10受试者(图17C)。方框图分析用于确定分析物水平在病毒量峰值时与病人进入病毒量增长前抽取的样本是否具有显著差异。在病毒量峰值时的TRAIL,TNFR2和Fas配体水平，相对于从每个急性HIV-1感染病人第0天前抽取的最早的血浆样本，具有显著的差异(对于TRAILp<0.01,对于TNRF2p<0.001，对于Fas配体p<0.001)(图18A)。在峰值时的TRAIL,TNFR2和Fas配体水平，也与非感染血浆样本对照组的TRAIL,TNFR2和Fas配体水平具有显著差异(分别为pO.001,pO.001和pO.OOl，)(图18A)。为研究TRAIL,TNFR2和Fas配体的峰值水平与峰值病毒量的时间关系，分析了细胞凋亡分析物峰值的出现与病毒量峰值的关系，受试者的数字显示在血浆细胞凋亡分析物出现在HIV-1病毒量峰值之前、同步、之后的情况(表5)。大部分急性HIV-1感染受试者(30/30对于TRAIL,27/30对于TNFR2，和26/30对于Fas配体)，显示峰值分析物水平出现在一个30天的时间框架内(例如，在病毒量峰值出现的15天前，在时间点上，15天后X表5)。大多数受试者的TRAIL水平(21/30)在病毒量峰值之前出现峰值，而TNFR2和Fas配体水平则更经常与病毒量的峰值同步(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>在30例急性HIV-1感染病人的研究中，大多数显示了TRAIL,TNFR2和Fas配体的峰值水平接近(在15天内)病毒量峰值。进一步地，大多数病人显示TRAIL水平峰值在病毒量峰值之前，TNFR2和Fas配体水平峰值与病毒量的峰值同步。在10例HCV和10例HBV的受试者研究中也有相同的结果。为从统计学上分析分析物水平峰值与病毒动力学的时间关系，进行了成对Wilcoxon秩和检验。重要的p值显示分析物水平峰值的平均日期与病毒增殖峰值(r。)的平均日期有显著差异。病毒扩张速度峰值显示病毒在最大速率复制的日期(平均5.5天)。需要注意的是，r。是不同于Ro的，Ro是繁殖率。重要的一点是，TRAIL水平峰值在病毒量峰值之前或1.7天后出现，TNFR2水平峰值在病毒量峰值之后7.5天出现，Fas配体水平峰值与ro的9.8天后出现。相同血清转换板的分析揭示病毒量平均在第0天后的13.9天(中值13天，四分位数间距3天)达到最大水平，说明TRAIL水平峰值在病毒量峰值之前出现，而TNFR2和Fas配体达到峰值水平的时间与最大病毒量的时间非常接近。息微糊定量流式潘應术分析因为血浆板没有可用的共同外周血单核细胞样本，血浆板对从10nM到l.OnM大小的血浆微粒的相关水平进行了分析，免疫细胞的出现和外来标志物也在MP中确定。流式细胞术用于确定MP的相关水平，比较每个个体的初期与潜伏期的血浆样本(图19)。为使血浆MP可视化，结合了梯度蔗糖的MP进行了透视电镜分析。采用上述的方法确定出现在血清转换板的每个样本的MP相关数字(图14)。大部分急性HIV-1感染受试者显示MP数值峰值接近(在0天的15天前或15天后)病毒量的峰值。在30个HIV-1血清转换板的研究中，18个微粒数值的峰值接近病毒量的峰值，这18个中的11个峰值即刻发生在病毒量峰值之前(表6)。作为对照，HCV和HBV血清转换板也进行了相同的分析以表示微粒数，未观察到MP峰值。表6HIV-1HCVHBVMP峰值水平在VL峰值的30天内(+/-15)18/305/105/10MP峰值水平在VL峰值之前11/182/55/5MP峰值水平与VL峰值同步4/182/50/5MP峰值水平在VL峰值之后3/181/50/5在30例急性HIV-1感染病人的研究中，大部分显示了MP峰值接近(在15天内)病毒量峰值，大部分病人显示了MP峰值发生在病毒量峰值之前。逾炎微游表娜微藩图20是血浆MP伴随结合蔗糖梯度的透视电子显微图。通过引用将以上引用的所有文献和其他信息源以整体形式合并到本文中。3权利要求1、一种在哺乳动物体内诱导产生抗HIV-1的免疫反应的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用i)集中的HIV-1基因序列，ii)破坏哺乳动物免疫耐受性的试剂，和iii)抑制HIV-1诱导的凋亡或HIV-1诱导的凋亡的免疫抑制效果的试剂，其中以足够产生所述免疫反应的量施用i)、ii)和iii)。2、根据权利要求1所述的方法，其中所述集中的HIV-1基因序列为共有的或嵌合的HIV-1基因序列。3、根据权利要求2所述的方法，其中所述集中的HIV-1基因序列存在于载体中。4、根据权利要求3所述的方法，其中所述载体为病毒载体。5、根据权利要求4所述的方法，其中所述病毒载体为重组腺病毒载体或重组水泡性口炎病毒载体。6、根据权利要求3所述的方法，其中所述载体为重组分枝杆菌载体。7、根据权利要求6所述的方法，其中所述重组分枝杆菌载体为减毒的TB、rBCG或重组耻垢分枝杆菌。8、根据权利要求2所述的方法，其中所述集中的HIV-1基因序列为共有HIV-1基因序列。9、根据权利要求8所述的方法，其中所述共有:HIV-1基因序列为共有HIV-1env、gag、pol、nef或tat基因序;歹!j。10、根据权利要求9所述的方法，其中所述的同源的HIV-1基因序列为同源的HIV-1env基因序列。11、根据权利要求10所述的方法，其中所述的同源的HIV-1基因序列为同源的HIV-lgpl60基因序列。12、根据权利要求2所述的方法，其中所述的集中HIV-1基因的序列为嵌合体的HIV-1基因序列。13、根据权利要求12所述的方法，其中所述的嵌合体的HIV-1基因序列为嵌合体的HIV-1gag或nef基因序列。14、根据权利要求1所述的方法，其中所述的集中HIV-1基因的序列包括编码细胞质结构域内质网滞留信号的序列。15、根据权利要求14所述的方法，其中所述的编码细胞质结构域内质网滞留信号的序列包括赖氨酸-赖氨酸结构。16、根据权利要求1所述的方法，其中所述的打破哺乳动物免疫耐受的药剂为调节性T细胞抑制剂或TLR-9激动剂。17、根据权利要求1所述的方法，其中所述的打破哺乳动物免疫耐受的药剂包括寡聚CpGs。18、根据权利要求17所述的方法，其中所述的寡聚CpGs处于油基佐剂中。19、根据权利要求17所述的方法，其中所述的寡聚CpGs为一种B型的寡聚CpGs。20、根据权利要求16所述的方法，其中所述的打破哺乳动物免疫耐受的药剂为调节性T细胞抑制剂。21、根据权利要求20所述的方法，其中所述的调节性T细胞抑制剂包括糖皮质激素诱导的TNF家族相关受体的配体(GITRL)编码序列、抗CD25抗体或ONTAKo22、根据权利要求1所述的方法，其中所述的抑制HIV-1诱导的细胞凋亡的药剂诱导产生抗磷脂酰丝氨酸(PS)抗体、抗CD36抗体或抗HIVtat抗体。23、根据权利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1诱导的细胞凋亡的药剂诱导产生抗磷脂酰丝氨酸抗体，并包括磷脂酰丝氨酸脂质体。24、根据权利要求23所述的方法，其中所述的磷脂酰丝氨酸脂质体包括一种HIV免疫原。25、根据权利要求24所述的方法，其中所述的磷脂酰丝氨酸脂质体包括HIVenv表位。26、根据权利要求24所述的方法，其中所述的HIV免疫原包括2F5-GTH1肽脂质结合物。27、根据权利要求23所述的方法，其中所述的磷脂酰丝氨酸脂质体包括CON-S。28、根据权利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1诱导的细胞凋亡的药剂诱导产生抗磷脂酰丝氨酸(PS)抗体，所述的抗磷脂酰丝氨酸(PS)抗体抑制磷脂酰丝氨酸-CD36的相互作用。29、根据权利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1诱导的细胞凋亡的药剂诱导产生抗CD36抗体。30、根据权利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1诱导的细胞凋亡的药剂在所述的哺乳动物的粘膜部位上诱导产生抗磷脂酰丝氨酸(PS)抗体、抗CD36抗体。31、根据权利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1诱导的细胞凋亡的药剂诱导产生抗HIVtat抗体。32、根据权利要求1所述的方法，其中所述的4中对HIV-1诱导的细胞凋亡有免疫抑制效果的药剂被用于给药。33、根据权利要求32所述的方法，其中所述的一种对H1V-1诱导的细胞凋亡有免疫抑制效果的药剂包括一种TNF抑制剂。34、根据权利要求33所述的方法，其中所述的TNF抑制剂包括-一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体抗TNF受体、Fas-Fas配体相互作用的抑制剂或TRAEL-DR5相互作用的抑制剂。35、根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法进一步包括向所述的哺乳动物给予足够剂量的pancaspase抑制剂以抑制HIV-1诱导细胞凋亡的免疫细胞的活性。36、根据权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物为人类。37、一种组合物，包括一个集中HIV-1基因的序列，一种打破哺乳动物免疫耐受的药剂，和一种抑制HIV-1诱导的细胞凋亡或者对HIV-l诱导的细胞凋亡有免疫抑制效果的药剂。全文摘要本发明总体涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)，特别涉及多组分疫苗以及利用该疫苗保护不受HIV-1感染的方法。文档编号A61K39/00GK101600453SQ200780042673公开日2009年12月9日申请日期2007年11月19日优先权日2006年11月17日发明者华鑫·辽,南希·G·斯密斯,峰·高,巴顿·F·海恩斯,米尼亚·S·阿拉姆申请人:杜克大学