不使用蛋制备流感病毒疫苗的利记博彩app

专利名称：：不使用蛋制备流感病毒疫苗的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于保护免受流感病毒感染的疫苗的制造领域。
背景技术：
：目前对抗人流感病毒感染的季节性疫苗的制备方法包括以下步骤[l，2]:(a)分离流通的病毒株；(b)对分离的病毒进行抗原和遗传分析；(C)选择在将要来临的季节中适用的病毒株；(d)通过重配或采用反向遗传学制备高生长种株；(e)将种株分发给疫苗生产商；(f)由生产商评价该种株在工业生产中的适用性；和(g)培养种株以制备病毒，然后由该病毒制造疫苗。该过程中步骤(a)-(e)由FDA和政府批准的国际流感中心进行，通常得到世界卫生组织的资助；步骤(f)和(g)由生产商自己进行。步骤(d)将病毒从天然适合感染人体的形式转化为可以在工业培养条件下生长至高效价的形式。对于甲型流感病毒，该步骤通常包括产生6:2重配株，该重配株包括来自(c)中选择的毒株的HA和NA编码基因组区段，其余6个基因组区段来自在鸡蛋中有效培养的毒株，该毒株通常是A/PR/8/34。重配步骤后，毒株在含胚蛋中反复传代以实现蛋适应和生长促进。对于乙型流感病毒，通常可直接获得具有优良生长特征的原型株并在含胚蛋中反复传代而无需产生重配病毒。因此，分发给疫苗生产商之前进行的步骤包括在蛋中对流感病毒进行传代。即使在步骤(g)中由生产商在细胞底物上而不是蛋上培养病毒，病毒仍将在步骤(a)的分离和步骤(e)的生产商接受之间的某些阶段通过蛋进行传代。例如，步骤(a)包括使底物与患者样品相接触，使得任何样品上的病毒可感染底物。然后，底物扩增存在的病毒，得到扩增后的病毒用于进一步研究。该步骤在蛋或哺乳动物细胞中进行。已知可用于原代分离的细胞包括MRC-5细胞[3]、Vero细胞[4、5]、MDCK细胞[6]、HepG2细胞[7]、LLCMK2细胞[8]等。但是，通常仍然使用鸡蛋来分离用于制造流感病毒的参比株。鸡蛋的使用在当前操作中至关重要，在2003年第四季度，FDA否决了大多数适当的H3N2毒株的使用(A/Fujian/411/2002)，因为它们最初不是从鸡蛋分离的[29]，并且也没有获得抗原性类似的从蛋分离的毒株。过去曾提出在流感病毒生产的多个阶段不再使用鸡蛋。参考文献10提出，疫苗应采用(i)经传代的高生长临床分离株或(ii)从至少一种天然来源的哺乳动物流感病毒株衍生的重配株，在细胞培养物中培养，前提是所述分离株或重配株没有经过禽蛋传代。因此，参考文献10所述的方法从经选择或操作利于在所选细胞培养物中培养的种病毒开始。参考文献11比较了通过蛋传代的病毒和通过MDCK细胞传代的病毒，但特别选择前者用于疫苗制备。参考文献12建议，大流行性流感疫苗的种病毒可通过以下方式制备大流行毒株在哺乳动物细胞培养物上直接繁殖而不是通过胚胎蛋，但指出蛋传代是大流行间期制造所必须的。这种强制性蛋传代的原因在于，人们相信蛋传代可用作外来物质的"滤器"管理机构已接受，在从人体进行最初临床分离到给予人体的最终疫苗产品的过程中，在禽类系统中进行一系列传代能防止哺乳动物类型的外来物质与流感病毒共同复制。本发明的目的是提供适用于流感疫苗生产的额外方法，该方法减少了蛋的使用，较佳地避免使用蛋。在一个具体的方面，本发明的目的是提供在流感病毒分离过程中有用的额外和改善的操作。
发明内容虽然过去曾提出在流感病毒生产的多个阶段不再使用鸡蛋，本发明在多个方面与这些建议不同。种病毒的制备本发明的第一方面提供了制备用于制造疫苗的流感种病毒的方法，该方法包括以下步骤(i)用从患者直接获得的或来自原代分离物的流感病毒感染细胞系；(ii)将步骤(i)中所得受感染细胞系的病毒进行至少一次传代；和(iii)对步骤(ii)的受感染细胞进行培养以制备流感病毒。从步骤(iii)培养物纯化的流感病毒即可用作种病毒。与参考文献12不同，步骤(i)中使用的流感病毒是乙型流感病毒或是非大流行性甲型流感病毒，即目前是甲型流感病毒H1N1或H3N2株。步骤(i)、(ii)或(iii)都不涉及在蛋中进行病毒培养或传代。优选地，至少两个步骤，理想地所有三个步骤都在相同的细胞类型中进行，例如都在MDCK细胞中进行。步骤(ii)的传代通常包括使流感病毒在细胞培养物中复制；例如从培养物上清液收集复制的病毒；和将收集的复制病毒转移到未感染的细胞培养物中。可重复该过程。至少一次传代之后，在步骤(iii)使病毒复制，收集病毒，只是病毒用作种病毒而不是转移到未感染的培养物进行进一步传代。第一方面所用细胞系优选不是人细胞系。通过避免使用人细胞，即使不使用蛋也可维持对外来试剂的"滤除"。因为与人的近亲关系，细胞系也优选不是灵长类细胞系，例如不是Vero细胞系(猴肾细胞系)。参考文献10提出在疫苗制造期间使用Vero细胞，但这种细胞可感染许多人病毒，因而步骤(i)中使用的流感病毒样品中存在的任何其它人病毒将与流感病毒平行生产，导致最终种病毒的污染。用于本发明第一方面的优选细胞系是犬细胞系，如MDCK细胞系(马-达二氏犬肾细胞系)，不同于参考文献10的具体公开内容。MDCK细胞的进一步细节在下文中给出。已经发现，MDCK细胞具有相当于禽蛋所能实现的对抗外来物质的"滤除"作用。因此，基于该发现，MDCK细胞可用于代替蛋而不会增加管理风险，虽然参考文献13中报道了流感病毒蛋传代可具有MDCK培养期间的生长优点，但避免了蛋中的培养。参考文献14描述，从人患者分离的流感毒株，无需在蛋或细胞培养物中进行任何传代，即可在包含无血清培养基的MDCK细胞培养物中进行有效培养。因此，步骤(i)的感染可采用从患者直接获取的临床样品(例如由咽部拭子等)中的流感病毒，或者可采用己经过原代分离的病毒。在一些情况下，步骤(i)之前的原代分离可在蛋中进行，但用于本发明的优选原代分离物是不使用蛋获得的分离物，例如在哺乳动物细胞中获得的分离物。已知可用于原代分离的细胞包括但不限于MRC-5细胞[3]、Vero细胞[4、5]、MDCK细胞[6]、HepG2细胞[7]、LLCMK2细胞[8]等。如果本发明在步骤(i)中釆用原代分离物，原代分离优选在与步骤(i)-(iii)相同的细胞类型中进行。已知MDCK适用于流感病毒的原代分离、传代和培养，但下面将描述MDCK分离的改良形式。为了尽可能多地了解流感病毒分离物的历史，优选采用从临床分离物直接获得病毒而不是使用原代分离物。目前的流感监控系统包括医院原代分离，将感兴趣毒株送到国家和国际流感中心。除使用患者样品进行原代分离之外，通常还需要留出一部分并进行储存(例如通过冷冻)，从而能够恢复原始材料进行再次分离。如果可获得储存的样品，则可在步骤(i)中使用该样品代替原代分离物。如果分离物的来源不明，尤其是用不是从临床样品直接获得的病毒开始时，可在步骤(i)和(iii)之间使用反向遗传学以产生新的病毒株，该新的病毒株具有至少一个来自亲本病毒的病毒基因组区段。在步骤(i)和(iii)之间采用反向遗传学可从步骤(iii)中使用的病毒产品中分离步骤(i)中使用的病毒产品，因而可用作对抗可能在步骤(i)之前已经引入的外来物质的滤器。除了以这种方式用作"滤器"之外，反向遗传学技术也可用于其他原因，例如产生重配株、操纵编码序列、置换特定区段等。进一步的细节将在本发明第二方面中给出。瞎合伸用后向遗传学柃犬与流威病羞的细胸谅羔本发明的第二方面提供了制备用于制造疫苗的流感种病毒的方法，该方法包括以下步骤(i)用从患者直接获得的或来自原代分离物的流感病毒感染细胞系；(ii)制备由步骤(i)中所得受感染细胞系产生的流感病毒的至少一个病毒RNA区段的cDNA，并在反向遗传学方法中采用该cDNA制备新的流感病毒，该新的流感病毒中至少一个病毒RNA区段与步骤(i)的流感病毒相同；(iii)用新的流感病毒感染细胞系，然后培养该细胞系以制备新的流感病毒。步骤(i)中使用的病毒可以是任何亚型的甲型流感病毒，或者可以是乙型流感病毒。优选的甲型流感病毒亚型是H1、H3和H5。步骤(i)、(ii)或(m)都不涉及在蛋中进行病毒培养或传代。优选地，所有步骤在相同类型的细胞中进行，例如它们都可以在MDCK细胞中进行。本发明第二方面的其他特征如上文第一方面中所述。因此，优选使用MDCK细胞，等等。下文中更详细地描述反向遗传学技术。步骤(ii)中转移的基因组区段可包括HA区段，可包括NA区段和/或一个或多个其他区段。种病毒本发明的第一和第二方面提供了种病毒。这些种病毒可以各种方式使用。种病毒的表征(例如)包括，对核酸和/或蛋白质序列进行测序，检査其与其他毒株(例如流通株)的抗原相关性，检査其免疫原性，等等。种病毒可用于引发抗血清。种病毒可分配给疫苗生产商。种病毒可储存备用。种病毒可用于制备工作种子批。该系统能实现原始种病毒的安全储存，而可采用工作种子批进行日常应用。可将工作病毒种冷冻备用。工作种子批的制备可包括在细胞培养物中进行病毒培养的步骤，优选在与制造种病毒相同的细胞类型上进行。不采用蛋中生产来制备工作种子批。种病毒可用于感染细胞系，培养细胞系以提供用于疫苗生产的病毒或用于制备诊断试剂。本发明种病毒与目前使用的蛋衍生的种病毒存在许多共有特征，但在多个方面不同。例如，本发明优选的甲型流感病毒种病毒包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自PR/8/34流感病毒的病毒区段，如下更详细所述。无需蛋的疫苗生产本发明的第三方面提供了制备用于制造疫苗的流感病毒的方法，该方法包括以下步骤(i)获得在群体中流通的流感病毒或者包含血凝素的流感病毒，该血凝素具有在群体中流通的流感病毒的代表性抗原性；(ii)用步骤(i)获得的流感病毒感染细胞系；(iii)将由步骤(ii)受感染细胞系获得的病毒进行至少一次传代，以得到种株；和(iv)培养步骤(iii)的种株以产生流感病毒。与第一和第二方面存在相互差异一样(见上文)，本发明的第四方面提供了制备用于制造疫苗的流感病毒的方法，该方法包括以下步骤(i)获得在群体中流通的流感病毒或者包含血凝素的流感病毒，该血凝素具有在群体中流通的流感病毒的代表性抗原性；(ii)用步骤(i)获得的流感病毒感染细胞系；(iii)制备由步骤(i)中所得受感染细胞系产生的流感病毒的至少一个病毒RNA区段的cDNA，并在反向遗传学方法中采用该cDNA制备流感种病毒，该流感种病毒中至少一个病毒RNA区段与步骤(i)的流感病毒相同；和(iv)用流感种病毒感染细胞系，然后培养来自步骤(iii)的经传代的细胞系以产生流感病毒。本发明还提供了制备流感病毒疫苗的方法，该方法包括第三和第四方面的这些步骤(i)-(iv)，然后是步骤(v):处理步骤(iv)所得病毒以产生疫苗。步骤(v)中采用的技术详情在下文中给出。步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)都不涉及在蛋中培养或传代病毒。步骤(i)中使用的病毒可以是任何亚型的甲型流感病毒，或者可以是乙型流感病毒。优选的甲型流感病毒亚型是H1、H3和H5，例如H1N1或H3N2。步骤(i)中使用的病毒自从最初分离开始就不曾在蛋上繁殖，优选地从最初提供病毒的患者一直到步骤(i)开始的过程中的任何阶段都不曾在蛋上繁殖。流感疫苗领域中使用的术语"具有代表性抗原性"用于描述实际上可能没有在群体内广泛流通，但可引发对抗流通中的毒株的免疫应答，同时便于生产的病毒株。"具有代表性抗原性"的毒株引发的血清(例如)在血凝抑制试验能够抑制流通毒株。步骤(i)可包括从许多不同的毒株开始，然后选择进一步使用的毒株。例如，步骤(i)可包括从许多不同的甲型流感病毒HlNl毒株开始，然后选择进一步使用的毒株。步骤(i)可包括从许多不同的甲型流感病毒H3N2毒株开始，然后选择进一步使用的毒株。步骤(i)可包括从许多不同的乙型流感病毒株开始，然后选择进一步使用的毒株。选择将基于选择包含在流感病毒中的毒株时常规使用的免疫和血清学标准，例如选择具有流通中最常见毒株和/或致病株的代表性抗原性的毒株。步骤(iii)之后可进行以下步骤证明种病毒具有步骤(i)所得毒株的代表性抗原性。该验证步骤可以在步骤(iv)开始之前进行，或者可以与步骤(iv)平行进行。本发明还提供了制备流感病毒疫苗的方法；该方法包括以下步骤(a)获得通过包括第一方面的步骤(i)-(iii)或者第二方面的步骤(i)-(iv)的方法制备的病毒；和(b)处理该病毒以制备疫苗。因此，本发明的第三和第四方面能够从患者样品(或原代分离物)制备流感疫苗，而用于制备疫苗的流感病毒在任何阶段都没有经过蛋传代。病毒重配本发明的第五方面提供了制备重配的流感病毒的方法，该方法包括以下步骤(i)用具有第一组基因组区段的第一流感病毒株和具有第二组基因组区段的第二流感病毒株感染细胞系，其中所述第一毒株具有编码所需血凝素的HA区段；和(ii)培养步骤(i)的受感染细胞以制备流感病毒，该流感病毒中至少一个区段来自第一组基因组区段，至少一个区段来自第二组基因组区段，前提是所述来自第一组基因组区段的至少一个区段包括来自第一毒株的HA区段。因此，该方法至少能够将第一毒株的HA区段转移到第二毒株，从而产生具有来自第一或第二毒株的不同病毒基因组区段集合的新的重配株而不需要使用蛋。从步骤(ii)培养物纯化的流感病毒可用于本文其他部分所述的应用。相对于第一毒株，重配株的生长特征得到改善。重配株也可包括来自第一毒株的编码所需神经氨酸酶的NA区段。通常，重配株中所包含的来自第一毒株和第二毒株的区段比例为l:7、2:6、3:5、4:4、5:3、6:2或7:1。通常，大部分区段来自第二毒株。该方法可用于制备甲型流感病毒和乙型流感病毒的重配株。对于甲型流感病毒，在一些实施方式中，第二病毒是PR/8/34，但也可采用其他毒株，包括那些NP、M、NS、PA、PB1或PB2区段中只有1、2、3、4或5个区段与PR/8/34相同的病毒。本发明还提供了通过第五方面的重配方法得到的流感病毒。本发明还提供了该病毒在疫苗制造中的应用。步骤(i)或(ii)都不涉及在蛋中进行病毒培养、重配或传代。重配过程可方便地在与本文其他部分中所述的分离和传代所用相同的细胞类型(例如MDCK细胞)中进行。第一毒株宜是从患者直接获得或来自原代分离物的流感病毒。如上所述，存在使用蛋进行流感病毒分离的强烈倾向。相反，本发明的第六方面采用MDCK细胞。在一些实施方式中，悬浮培养MDCK细胞。在其它实施方式中，MDCK细胞在无血清培养基或在无蛋白培养基中培养。在其它实施方式中，MDCK细胞是非致瘤性的。在其它实施方式中，MDCK细胞不是在覆盖培养基存在下培养的。因此，本发明提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用MDCK细胞培育患者样品，所述MDCK细胞在悬浮培养液中培养。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用MDCK细胞培育患者样品，所述MDCK细胞在无血清培养基中培养。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用MDCK细胞培育患者样品，所述MDCK细胞在无蛋白培养基中培养。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用非致瘤性MDCK细胞培育患者样品。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用MDCK细胞培育患者样品，未向所述MDCK细胞提供覆盖培养基。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用励CK细胞培育患者样品，所述MDCK细胞在无血清悬浮培养液中培养。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用MDCK细胞培育患者样品，所述MDCK细胞在无蛋白悬浮培养液中培养。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用非致瘤性MDCK细胞培育患者样品，所述MDCK细胞在悬浮培养液中培养。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用非致瘤性MDCK细胞培育患者样品，所述MDCK细胞在无血清悬浮培养液中培养。本发明还提供了从患者样品分离流感病毒的方法，该方法包括以下步骤用非致瘤性MDCK细胞培育患者样品，所述MDCK细胞在无蛋白悬浮培养液中培养。本发明还提供了通过上述方法之一分离的流感病毒。本发明还提供了该病差龙;itF苗法lK吿由的^7田一患者样品和MDCK细胞的培育通常导致MDCK细胞被流感病毒，例如人流感病毒，尤其是人甲型流感病毒感染。病毒可以在细胞中复制，然后收集复制的细胞。任选地，可以在下游方法中采用以下步骤，例如检测、表征、分析、制备种病毒、操作等。在MDCK细胞中分离之后，病毒也可以在MDCK细胞中传代和/或培养。作为替代方式，或者也可以在非MDCK细胞，或者蛋，或者其他底物中传代和/或培养。本发明的第六方面涉及MDCK细胞系的使用。原始MDCK细胞系从ATCC获得，但本发明的第六方面采用该细胞系的衍生物。如下所示，在这些衍生物中的分离优于在原始MDCK细胞系中的分离。合适的MDCK细胞及其特征在下文中更详细描述。例如，第六方面的一些实施方式采用可以在悬浮培养液中自发进行复制的MDCK细胞系。参考文献30描述了适合在悬浮培养液中培养的MDCK细胞系，该细胞系('MDCK33016，)尤其适用于第六方面的方法。MDCK33016可以在无血清培养基中生长，无需覆盖培养基即可生长。可以在悬浮培养液(包括无血清培养基)中培养的另一种MDCK细胞系是'B-702'细胞系[36;参见下文]。用于第六方面的非致瘤性MDCK细胞系包括参考文献37中描述的那些，例如'MDCK-S，、'MDCK-SF101'、'MDCK-SF102，和'MDCK-SF103，(参见下文)。在第六方面的一些实施方式中，在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养MDCK细胞。与现有技术的方法不同，本发明第六方面可避免在流感病毒分离期间使用覆盖培养基。优选如上文所述接触MDCK细胞之前，不在蛋中培养病毒。也优选，如上文所述在MDCK细胞中培养的病毒随后不在蛋中培养。对于第六方面所用的患者样品，流感病毒分离中使用的临床样品可以是各种形式，但通常包括呼吸分泌物，包括但不限于直接抽吸物；漱口水；鼻腔洗涤液；鼻腔拭子；咽管拭子；咽部拭子等。这些样品通常从疑似被流感病毒感染的患者获取，包括患有新型流感病毒株的患者。通过第六方面方法分离的流感病毒可用于制备用于制造疫苗的流感种病毒。因此，本发明的第六方面还可包括对来自受感染MDCK细胞系的病毒进行至少一次传代的步骤。然后，该方法可包括培养受感染细胞以制备流感病毒的步骤。培养步骤后纯化的流感病毒可用作种病毒，如本文其他部分所述。根据第六方面分离的病毒也可用作反向遗传技术的来源。因此，可从根据第六方面分离的流感病毒的至少一个病毒RNA区段制备cDNA。然后，该cDNA可用于反向遗传过程以便制备与分离的流感病毒具有至少一个相同的病毒RNA区段的新流感病毒。然后，该新流感病毒可用于感染(例如)细胞系以进一步培养。本发明的第六方面可用于分离任何合适的流感病毒，包括人流感病毒。这些病毒可以是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。常见和有用的甲型流感病毒亚型是H1、H3和H5。在目前的大流行阶段间期，疫苗通常包括两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株。第六方面可用于分离这些毒株，或分离大流行病毒株，如H2、H5、H7或H9亚型毒株。通常，第六方面可用于分离具有HA亚型Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16之一的甲型流感病毒。根据本发明第六方面分离的流感病毒可包括与具有Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖相比，更偏向于与具有Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖结合的血凝素。优选地，发现本发明的分离方法有助于稳定保留病毒HA序列及其寡糖偏好。根据第六方面分离的病毒可用于疫苗制造及治疗方法。因此，本发明也提供了根据第六方面分离的病毒制备的抗原在制造用于提高患者免疫应答的药物中的应用。受体结合人流感病毒结合具有Sia(a2,6)Gal末端二糖(a-2,6连接至半乳糖的唾液酸)的受体寡糖，而蛋具有Sia(a2,3)Gal末端二糖的受体寡糖。人流感病毒在蛋中1的生长提供了与Sia(a2,6)Gal结合相比，更倾向于Sia(a2,3)Gal结合的血凝素的选择压。和蛋一样，Vero细胞主要表达Sia(a2，3)Gal受体[15]。相反，MDCK细胞和PER.C6细胞同时表达Sia(a2，3)Gal和Sia(a2，6)Gal。参考文献16报道转染MDCK细胞以过度表达a-2,6唾液酸转移酶，以利于选择Sia(a2,6)Gal结合。但是，即使没有这种操作，也可在MDCK细胞上培养流感病毒，而不使它们偏向Sia(a2,3)Gal结合。因此，本发明可采用同时表达Sia(a2,3)Gal和Sia(a2,6)Gal的细胞，所产生的流感病毒具有与含(a2,3)Gal末端二糖的寡糖相比，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好。在本发明第一和第二方面的优选实施方式中，步骤(i)中用于感染的流感病毒具有相对于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好。结合偏好在步骤(ii)和步骤(iii)期间保留，使得步骤(iii)所产生的流感病毒具有相对于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好。在本发明第三和第四方面的优选实施方式中，步骤(ii)中用于感染的流感病毒具有相对于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好。这种结合偏好在步骤(iii)和步骤(iv)期间保留，使得步骤(iv)所产生的流感病毒具有相对于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好。为了确定病毒是否具有相对于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好，可利用各种分析试验。例如，参考文献17描述了测定流感病毒受体-结合活性的固相酶联试验，它能够灵敏地定量测定亲合常数。参考文献18采用评估病毒与两种不同的唾液酸糖蛋白(卵类粘蛋白，具有Sia(a2,3)Gal决定簇；和猪012巨球蛋白，具有Sia(a2，6)Gal决定簇)的结合的固相试验，也描述了评价病毒与两种受体类似物游离唾液酸(Neu5Ac)和3'-唾液酸乳糖(Neu5Aca2-3Gaipi-4Glc)的结合的试验。参考文献19报道了采用能够清楚区分a2,3或a2，6连接的受体偏好的聚糖阵列的试验。参考文献20报道了一种基于经过酶修饰包含Sia(a2，6)Gal或Sia(a2,3)Gal的人红细胞凝集的试验。根据试验类型，可利用病毒本身直接进行试验，或者可利用从病毒纯化的血凝素间接进行试验。参比物质目前制造流感病毒的过程包括制备每种毒株的参比试剂，即(i)抗-HA血清和(ii)纯化的全病毒颗粒。SRID试验中可利用这些校正试剂来测定制造商生产的大批抗原中的HA水平，从而能够将该批次抗原稀释，得到每剂量具有所需HA含量的疫苗。在目前的方法中参比毒株通过蛋传代且生产毒株根据蛋培养进行优化，此时参比试剂中的血清和抗原很好地匹配。然而发现，在细胞培养物中产生的血清的抗原匹配较差，很可能是因为在不同系统中的选择压不同。参比血清与抗原之间的反应性差表示HA水平被低估，导致(i)给定批次的剂量较低和(ii)疫苗中HA剂量过多。为了克服细胞培养物衍生抗原与蛋衍生物质产生的血清的匹配问题，本发明提供了基于未曾适应蛋基培养的病毒的参比物质。因此，本发明提供了从动物制备抗血清的方法，该方法包括以下步骤(i)给予动物纯化的流感病毒血凝素；然后(ii)从动物回收含有该血凝素识别抗体的动物血清，其特征在于，步骤(i)中使用的血凝素来自在细胞系中培养的病毒。步骤(i)中使用的血凝素优选来自从未在蛋中培养过的病毒。例如，血凝素可具有相对于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好。可利用在哺乳动物细胞系(例如本文所述的细胞系)如MDCK中生长得到的多糖对用于产生抗血清的血凝素进行糖基化修饰。抗血清可以是甲型流感病毒和乙型流感病毒抗血清。动物优选是哺乳动物，如山羊，更优选绵羊。抗血清不难在绵羊中制备，即通过菠萝蛋白酶处理提取纯化病毒的HA，然后在蔗糖梯度上沉降纯化。将剂量约50pg的血凝素与完全弗氏佐剂(FCA)—起肌内给予绵羊。两周后给予剂量l(Hig，然后以每周的间隔再给予2-4次剂量。然后，收集血清。使用之前，可稀释(例如用含有叠氮化钠的PBS缓冲液)该血清并装填到容器中。该血清可暴露于酸性pH(例如pH5，持续2小时)以符合口蹄疫规定。本发明还提供了从动物制备抗血清的方法，该方法包括以下步骤(i)在细胞系中培养流感病毒；(ii)从步骤(i)培养的病毒纯化血凝素抗原；(hi)将步骤(ii)纯化的血凝素给予动物；和然后(iv)从动物回收含有血凝素识别抗体的动物血清。本发明还提供了通过这些方法得到的抗血清。本发明还提供了包含这种抗血清的凝胶。因此，上述从动物制备抗血清的方法包括将抗血清与凝胶混合的额外步骤。凝胶适用于进行SRID试验，例如，它是琼脂糖凝胶。除了提供抗血清，本发明还提供了抗原参比物质。因此，本发明提供了制备抗原参比物质的方法，该方法包括以下步骤(i)在细胞系中培养流感病毒；(ii)纯化步骤(i)中培养的病毒；和(iii)灭活病毒，其特征在于，步骤(i)中试验的流感病毒从未在蛋中培养过。该方法可还包括以下步骤(iv)将灭活的病毒冻干。步骤(i)中试验的病毒从未在蛋中培养过。例如，血凝素可具有相对于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好。参比物质不含蛋衍生物质(例如，不含卵清蛋白、不含卵类粘蛋白、不含鸡DNA)。可利用在哺乳动物细胞系(例如本文所述的细胞系)如MDCK中生长得到的多糖对参比物质中的糖蛋白进行糖基化修饰。参比物质可以是甲型流感病毒和乙型流感病毒的参比物质。参比物质通常成对使用，所以本发明也提供了包含以下物质的药剂盒(i)从这些方法得到的抗血清和(ii)从这些方法得到的抗原参比物质。本发明还提供了制备药剂盒的方法，该方法包括以下步骤(i)如上所述制备抗血清；(ii)如上所述制备抗原参比物质;和(iii)将步骤(i)和(ii)的产品组合成药剂盒。抗原和抗血清是合适的且可用于SRID试验，本发明提供流感病毒血凝素的单向放射免疫扩散试验，其特征在于，该试验采用从这些方法获得抗血清和/或从这些方法获得的抗原参比物质。SRID试验包括以下步骤制备包含抗血清的凝胶，将抗原参比物质(需要时用水性介质重建)应用于凝胶(通常加入孔中)，然后使抗原放射状扩散到凝胶中。使用前可用去污剂如两性离子去污剂处理抗原。通过本发明的技术制备或分离的病毒(包括种病毒)。本发明优选的甲型流感病毒(包括种病毒、用MDCK细胞从患者样品分离的病毒、重配病毒等)包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自PR/8/34流感病毒的病毒区段。优选不含PR/8/34区段。如果存在一个或多个任意的PR/8/34区段，则它们不包含PR/8/34HA区段并且通常不包含PR/8/34NA区段。因此，优选的病毒是区段NP、M、NS、PA、PB1和/或PB2中至少一个不来源于PR/8/34的病毒。更优选，区段NP、M、PA、PB1和/或PB2中至少一个不来源于PR/8/34。因此，本发明通过在正常HA和NA抗原中加入一个或多个代表流通株的含表位抗原而改善了现有的疫苗。类似地，优选的甲型流感病毒包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自AA/6/60流感病毒(A/AnnArbor/6/60)的病毒区段。优选不含AA/6/60区段。如果存在一个或多个任意的AA/6/60区段，则它们不包含AA/6/60HA区段并且通常不包含AA/6/60NA区段。因此，优选的病毒是区段NP、M、NS、PA、PB1禾B/或PB2中至少一个不来源于AA/6/60的病毒。更优选，区段NP、M、PA、PB1禾口/或PB2中至少一个不来源于AA/6/60。优选的乙型流感病毒包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自AA/1/66流感病毒(A/AnnArbor/l/66)的病毒区段。优选不含AA/1/66区段。如果存在一个或多个任意的AA/1/66区段，则它们不包含AA/1/66HA区段并且通常不包含AA/1/66NA区段。因此，优选的病毒是区段NP、M、NS、PA、PB1禾口/或PB2中至少一个不来源于AA/1/66的病毒。更优选，区段NP、M、PA、PB1和/或PB2中至少一个不来源于AA/1/66。本发明优选的流感病毒(包括种病毒、用MDCK细胞从患者样品分离的病毒、重配病毒等)包括相对于具有Sia(u2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于结合具有Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的血凝素。这种结合偏好如上文更详细所述。本发明优选的流感病毒(包括种病毒、用MDCK细胞从患者样品分离的病毒、重配病毒等)包括糖基化模式不同于蛋衍生病毒的糖蛋白(包括血凝素)。因此，糖蛋白将包括鸡蛋培养病毒所没有的糖形，例如可具有非禽类糖键，包括哺乳动物糖键。细胞系本发明涉及使用支持流感病毒复制的细胞系，并避免使用蛋。细胞系通常是哺乳动物来源。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)及犬细胞，但灵长类细胞的使用是不优选的。可使用各种细胞类型，如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是(例如)非洲绿猴细胞，例如肾细胞如Vero细胞系[21-23]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，如CLDK和MDCK细胞系。因此，合适的细胞系包括但不限于MDCK;CHO;CLDK;HKCC;293T;BHK;Vero;MRC5;PER.C6[24];FRhL2;WI-38;等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[25]、克利尔(Coriell)细胞库[26]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL81、CCL81.2、CRL-1586和CRL-1587;并提供MDCK细胞，目录号为CCL34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。任何这些细胞类型可用于本发明的培养、重配和/或传代。最优选的细胞系是具有哺乳动物型糖基化的细胞系。作为一种较不优选的哺乳动物细胞系的替代方式，可以在禽类细胞系上培养病毒[例如，参考文献27-29]，这些禽类细胞系包括来自鸭(例如鸭视网膜细胞)或鸡(例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF))等的细胞系，但哺乳动物细胞的使用意味着，疫苗可不含禽类DNA和蛋的蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)，从而降低变应原性。用于培养流感病毒的最优选的细胞系是来自马-达二氏犬肾的MDCK细胞系[30-33]。原始MDCK细胞系可购自ATCC(CCL34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献30公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系('MDCK33016'或'33016-PF，，保藏号DSMACC2219，也可见于参考文献34和35)。类似地，参考文献36公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞系('B-702'，保藏号FERMBP-7449)。参考文献37公开了非致瘤性MDCK细胞，包括'MDCK-S'(ATCCPTA-6500)、'MDCK-SF101'(ATCCPTA-6501)、'MDCK-SF102'(ATCCPTA-6502)和'MDCK-SF103'(PTA-6503)。参考文献38公开了具有非常容易感染的MDCK细胞系，包括'MDCK.5F1'细胞(ATCCCRL12042)。本发明可采用任何这些MDCK细胞系。病毒可以在贴壁培养或悬浮培养的细胞上培养。也可使用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可能使用悬浮培养。细胞系优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养。在本发明的内容中，培养基是指没有来自人或动物来源的血清添加剂的无血清培养基。这种培养物中生长的细胞在天然情况下本身包含蛋白质，但无蛋白培养基应理解成表示在不包含(培养基中不加入)蛋白质、生长因子、其他蛋白质添加剂和非血清蛋白质的条件下进行细胞增殖的培养基，但可任选地包含(在培养基中)病毒生长所必需的蛋白质如胰蛋白酶或其他蛋白酶。在病毒复制期间，支持流感病毒复制的细胞系优选在低于37'C的温度下培养[39](例如，30-36°C，或约30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C)。例如，在第六方面，MDCK细胞可以在这些温度下培养(分离步骤之前、期间或之后)，尤其是病毒复制期间。在培养的细胞中繁殖病毒的方法(例如，根据第六方面在培养的MDCK细胞中培养流感病毒)通常包括以下步骤对培养细胞接种待培养的毒株，将受感染的细胞培养病毒繁殖所需的时间，例如通过病毒滴度或抗原表达测定的时间(如，接种后24-168小时)，收集繁殖的病毒。以病毒和细胞之比为1:500-1:1，优选1:100-1:5，更优选1:50-1:10(通过PFU或TCID50检测)接种培养的细胞。可将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，病毒于25-40。C，优选28-37。C，在细胞上吸附至少60分钟，但通常少于300分钟，优选在90-240分钟之间。可通过冻融或酶促作用除去感染的细胞培养物(例如，单层)，以增加收获的培养上清液中的病毒含量。然后使收集的液体灭活或冷冻保存。以约0.0001-10，优选0.002-5，更优选0.001-2的感染复数("m.o丄")感染培养的细胞。更优选以约O.Ol的m.o丄感染细胞。感染后30-60小时收集感染的细胞。优选在感染后34-48小时收集细胞。更优选在感染后38-40小时收集细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间的任何合适阶段，例如接种前、接种同时或接种后加入蛋白酶[39]。在优选实施方式中，尤其是MDCK细胞，细胞系自主要工作细胞库的传代次数不超过40次。病毒接种物和病毒培养物优选不含(即，经测试得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[40]。类似地，第六方面中使用的优选MDCK细胞系不含(E卩，经测试得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒。特别优选不存在单纯疱疹病毒。本发明中使用的MDCK细胞优选不含G418耐药性标记(参考文献16)。因此，该细胞系对G418治疗敏感。本发明中使用的细胞系优选不含外源性质粒(参考文献16)，除非反向遗传技术所需的任何外源性质粒。反向遗传技术如上所述，本发明可直接使用临床分离物或原代分离物。然而，此外，本发明也可使用重配毒株，包括用反向遗传技术产生的毒株(例如，参考文献41-45)。反向遗传技术可利用质粒的体外操作以产生病毒区段的组合，便于操作病毒区段中的编码序列或非编码序列，以引入突变等。该技术可用于甲型和乙型流感病毒。反向遗传技术一般包括表达(a)例如，由poll启动子、细菌RNA聚合酶启动子、噬菌体聚合酶启动子等启动的编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII启动子启动的编码病毒蛋白的DNA分子，以便在细胞中表达两种类型的DNA，导致组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒产生各病毒RNA的质粒方法[46-48]，这些方法也包括使用质粒表达所有或一些病毒蛋白(例如仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，一些方法中使用12种质粒。为了降低所需的质粒数量，近期方法[49]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感vRNA节段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种甲型流感mRNA转录物的序列)上。参考文献49方法的优选方面包括(a)PBl、PB2和PAmRNA编码区位于同一质粒上；和(b)所有8个vRNA编码区位于同一质粒上。一个质粒上包含NA和HA节段而另外六个节段位于另一质粒上也可能是有利的。因为poll启动子的物种特异性，在MDCK细胞中进行反向遗传时可利用犬polI启动子[50]。作为使用polI启动子来编码病毒RNA区段的另一种替代方式，可利用噬菌体聚合酶启动子[51]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。因为poll启动子的物种特异性，对于许多细胞类型(例如MDCK)更宜使用噬菌体聚合酶启动子，但必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。在其它技术中，可使用poll和polll双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[52,53]。虽然用于在蛋中培养的毒株通常包括六个源自PR/8/34甲型流感病毒的RNA区段(HA和N区段来自疫苗株，即6:2重配株)，但避免使用蛋意味着能够消除PR/8/34区段。因此，甲型流感病毒可包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自PR/8/34流感病毒的病毒区段。因此，优选的病毒是区段NP、M、NS、PA、PB1和/或PB2中至少一个不来源于PR78/34的病毒。病毒可包含在禽流感病毒中起源的NS区段。本发明使用反向遗传技术时，能使源自流感病毒的病毒RNA区段转移到目的流感病毒的基因组中。因而这两种病毒中将具有至少一个相同的病毒RNA区段。术语"相同"在这里表示整个区段的相同拷贝，但也可延伸表示在编码区或非编码区中含有修饰的该区段的修饰拷贝。在编码区中进行修饰时，基本上不会改变编码蛋白质的免疫原性和/或活性。因此，可以在HA1/HA2切割位点附近操作HA区段而不改变其在给予患者后诱发有效抗HA抗体的能力。因此，可使用反向遗传技术来修饰根据第六方面分离的病毒的天然HA，例如去除导致病毒在禽类中产生高度致病性的决定簇(例如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域)。疫苗制备目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献54的第17和18章)。疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、"分裂"病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。流感抗原也可以病毒体形式出现。制造任意这些类型的疫苗时都可使用本发明。活病毒包括米迪缪尼公司(Medlmmune)的FLUMISTTM产品(三价活病毒)。通过以下方法制备疫苗在合适的底物上培养病毒，然后从含病毒颗粒的流体纯化病毒颗粒。例如，所述流体可通过离心分离并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。釆用灭活病毒时，该疫苗可包含完整的病毒颗粒、分裂病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。用于灭活病毒的化学方式包括使用有效量的一种或多种以下试剂进行处理去污剂、甲醛、(3-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二乙胺(binaryethylamine)、乙酰基乙烯亚胺或它们的组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或Y射线辐射。可通过各种方法由含病毒液体收获病毒颗粒。纯化方法可包括用线性蔗糖梯度溶液(含有去污剂以破坏病毒颗粒)进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X-IOO、曲通NIOI、溴化十六烷基三甲铵、TergitolNP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制剂，包括"吐温-醚"裂解方法。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，例如参见参考文献55-60等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子型)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、利非他明(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间发生(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解过程可包括澄清含病毒颗粒的物质(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHP04吸附)，从非病毒颗粒材料分离全病毒颗粒，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVACtm、FLUARIX、FLUZONE丁m和FLUSHffiLD产品是裂解疫苗。纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRINtm、AGRJPPALtm和INFLUVACTM产品是亚基疫苗。另一种形式的灭活流感抗原是病毒体[61](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。病毒体可通过用去污剂增溶流感病毒，然后去除核壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括加入病毒膜糖蛋白至磷脂过量，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。本发明可用于储存大量病毒体，如INFLEXALVtm和磨AVAC丁m产品。流感病毒可被减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。HA是灭活流感疫苗中的主要免疫原，一般通过SRID检测参考HA水平使疫苗剂量标准化。疫苗通常含有约15iigHA/毒株，虽然在例如儿童，或大流行情况下还可使用较低的剂量。与较高剂量(例如，3x或9x剂量[62,63])—样，已使用了分数剂量，例如"2(即，7.5吗HA/毒株)、V4和V8[81,82]。因此，疫苗可包含0.1-150吗，优选0.1-50吗，例如0.1-20pg、0.1-15吗、0.1-10吗、0.1-7.5叫、0.5-5叱HA/流感毒株，等等。具体的剂量包括，例如每个毒株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5，等等。对于活疫苗，通过中值组织培养感染剂量(TCID5o)而不是HA含量来检测给药，每种毒株的TCIDs。一般在106-108之间(优选106'5-1075)。本发明所用的毒株可以含有野生型病毒中发现的天然HA，或者是经修饰的HA。例如，已知可修饰HA以除去导致病毒在禽类中高度致病的决定簇(例如，HA1和HA2切割位点附近的超碱性区域(hyper-basicregion))。用于疫苗的流感病毒毒株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包括两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明也可釆用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群从未与其发生过免疫接触的毒株，特别是甲型流感病毒)，如H2、H5、H7或H9亚型毒株，大流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以基于补充有大流行毒株的正常三价疫苗。然而，根据季节和疫苗中包含的抗原特性，本发明可保护免受HA亚型Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16中一种或多种亚型的感染。本发明可保护免受甲型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中一种或多种亚型的感染。本发明组合物不仅适用于免疫大流行间期的免疫，尤其适用于获得对大流行毒株的免疫。可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即有数十年在人群中没有发现的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它能使人致病。含有H5血凝素类型的病毒优选用于获得对大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行毒株。在H5亚型中，病毒分为HA进化支1、HA进化支l'、HA进化支2或HA进化支3[64]，进化支1和3尤其相关。其抗原可有用地包含在本发明组合物中的其它毒株是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[65]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[66]。因此，本发明组合物可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒并制备抗原后将它们混合在一起。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。优选包括来自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株的抗原的三价疫苗。在本发明的一些实施方式中，组合物可包含来自一种甲型流感毒株的抗原。在一些实施方式中，组合物可包含来自两种甲型流感毒株的抗原，只要这两种毒株不是H1N1和H3N2。在一些实施方式中，组合物可包含来自两种以上甲型流感毒株的抗原。本发明提供了制备疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，该方法包括以下步骤(i)接受流感病毒；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的感染细胞以产生流感病毒。步骤(iii)所得病毒可用于制备疫苗，例如通过灭活、配制等方法制备疫苗。步骤(i)接受的流感病毒具有一种或多种以下特性(a)从未在蛋底物上繁殖过；(b)从MDCK细胞，如MDCK33016细胞和/或无血清培养基中培养的MDCK细胞中分离；(c)从未在含血清培养基培养的底物上繁殖；(d)用反向遗传技术产生；(e)它是一种甲型流感病毒，其中不到6个病毒区段来自PR/8/34流感病毒和/或不到6个病毒区段来自AA/6/60流感病毒，或者它是一种乙型流感病毒，其中不到6个病毒区段来自AA/1/66流感病毒；(f)其包括血凝素，血凝素具有相对于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好；和/或(g)其具有糖基化模式不同于蛋衍生病毒的糖蛋白(包括血凝素)。因此，可能如本文其他部分所述获得步骤(i)中接受的流感病毒。宿主细胞DNA当用细胞系培养病毒时，标准方法是使最终疫苗中残余细胞系DNA的量最小化，以便使DNA的致癌活性最小化。因此，当用细胞系培养病毒，则每剂组合物优选含有少于10ng(优选少于lng，更优选少于100pg)的残留宿主细胞DNA，虽然可以存在痕量的宿主细胞DNA。优选每15吗血凝素中宿主细胞DNA含量〈10ng(如〈1ng"100pg)的疫苗，以及每0.25ml体积中宿主细胞DNA含量<10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗。更优选每50昭血凝素中宿主细胞DNA含量<10ng(如〈ng、〈100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量<10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗。优选任何残余宿主细胞DNA的平均长度小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp，等等。可釆用标准纯化方法，例如层析等在疫苗制备期间除去污染性DNA。通过核酸酶处理，例如用DNA酶可促进除去残留的宿主细胞DNA。参考文献67和68披露了减少宿主细胞DNA污染的便利方法，其涉及两步处理，首先可在病毒培养期间使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒粒子破裂期间使用阳离子洗涤剂(例如，CTAB)。用垸化剂，例如P-丙内酯处理也可用于除去宿主细胞DNA，该方法还可优选用于灭活病毒粒子[69]。现在，残留宿主细胞DNA的测定是生物制品的常规管理要求，它在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的实验一般是已验证的实验[70,71]。可通过数学和可以量化的条件来描述验证实验的性能特征，并鉴定可能的误差来源。通常测试该实验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦校正(例如用已知标准量的宿主细胞DNA校正)并检测了某个实验，则可按常规进行定量DNA测定。可采用三种DNA定量的基本技术杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[72];免疫测定方法，如ThreshokFM系统[73];和定量PCR[74]。本领域技术人员熟悉这些方法，但各方法的准确特征，例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(MolecularDevices)的ThreshokFM系统是皮克水平总DNA的定量实验，己用于监测生物药品中污染DNA的水平[73]。典型实验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(TotalDNAAssayKit)中包含所有实验组分。多个商业生产商均提供用以检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTec实验室服务公司(AppTecLaboratoryServices)、BioRelianceTM公司奥西科技公司(AltheaTechnologies)等。对测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNAThresholdTM系统的比较参见参考文献75。药物组合物根据本发明制造的疫苗组合物是药学上可接受的。除了流感抗原，它们通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。如下所述，也可包含佐剂。对这些组分的全面讨论见参考文献76。疫苗组合物通常是水性形式。疫苗组合物可包含防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，这些疫苗优选基本上不含(即，少于5(ig/ml)汞物质，例如不含硫柳汞[59，77]。更优选不含汞的疫苗。可掺入琥珀酸a-生育酚作为汞物质的替代品[59]。特别优选不含防腐剂的疫苗。优选包含生理盐，例如钠盐以控制张力。优选l-20毫克/毫升之间的氯化钠(NaCl)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸氢二钠(disodiumphosphatedehydrate)、氯ifc镁、氯^[七!丐等。疫苗组合物的重量克分子渗透浓度通常在200mOsm/kg-400mOsm/kg之间，优选240-360mOsm/kg之间，更优选处于290-310mOsm/kg范围内。以前有报道说重量克分子渗透浓度对疫苗接种所致的疼痛没有影响[78]，但最好将重量克分子渗透浓度维持在该范围内。疫苗组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是含有氢氧化铝佐剂的组氨酸缓冲剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。所含的缓冲剂范围一般是5-20mM。疫苗组合物的pH通常在5.0-8.1之间，更常见在6.0-8.0之间，例如6.5和7.5之间，或7.0-7.8之间。因此，本发明方法可包括先调节散装疫苗的pH再包装的步骤。疫苗组合物优选无菌。组合物优选无热原，例如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量〈0.1EU。组合物优选无谷蛋白。本发明疫苗组合物，特别是对于裂解或表面抗原疫苗可包含洗涤剂，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(称为"吐温")，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六垸基三甲铵(CTAB)，或脱氧胆酸钠。可以只存在痕量的洗涤剂。因此，疫苗中辛苯聚醇(octoxynol)-10和聚山梨醇酯80的含量各自低于1毫克/毫升。其它痕量的残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。疫苗组合物可包含一次免疫的物质，或可包含多次免疫的物质(即，"多剂量"药剂盒)。在多剂量配置中，优选包含防腐剂。除了在多剂量组合物中包含防腐剂以外，还可将组合物置于装有用于转移物质的无菌适配器的容器中。一般给予的流感疫苗剂量体积是约0.5ml，但可将一半剂量(g卩，约0.25ml)给予儿童。组合物和药剂盒优选保存在2'C-8"C之间。不应冷冻它们。最好避免光线直射。佐剂本发明组合物宜包含佐剂，佐剂的作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。曾经描述过将佐剂与流感疫苗一起使用。参考文献79和80中使用氢氧化铝，参考文献81中使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。参考文献82也描述了铝盐佐剂的应用。希龙疫苗公司(ChironVaccines)的FLUADTM产品包含水包油乳液。可用于本发明的佐剂包括但不限于*包含钙盐和铝盐(或其混合物)的含矿物质组合物。钙盐包括磷酸钙(如参考文献83公开的"CAP"颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐采取任何合适形式(如凝胶、晶体、无定形态等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[84]。下面开始更详细地描述铝盐佐剂。细胞因子诱导剂(详述见下)皂苷[参考文献112的第22章]是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(gw7/a^犯/o"an'fl)Molina树皮的皂苷。皂苷也可商品化购自丽花菝葜0SVm7axomato)(墨西哥菝葜)、满天星(Qy戸o;/n7/fl;am'cw/ato)(婚纱花)和肥皂草0&/70"『^0#"'""0//力(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标StimulonTM出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B禾BQH-C。制备QS21的方法参见参考文献85。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[86]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献112的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可釆用任何已知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献86-88中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[89]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献90和91。脂肪佐剂(详述见下)细菌ADP-核糖基化毒素(例如大肠杆菌不耐热肠毒素"LT"、霍乱毒素"CT"、或百日咳毒素"PT")以及它们的解毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变体毒素[92]。将解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂描述于参考文献93，用作肠胃外佐剂描述于参考文献94。生物粘附剂和粘膜粘着剂，如酯化的透明质酸微球[95]或脱乙酰壳多糖及其衍生物[96]由生物可降解和无毒性材料形成的微粒(即直径为约100nm到约150|im，更优选约200nm到约30|im，或者约500nm到约10|iim的颗粒)，所述材料例如聚(a-羟酸)、聚羟丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚已酸内酯等等，其中优选聚乙丙交酯共聚物，任选地对其处理，使其具有带负电荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子型去污剂，例如CTAB)处理。脂质体(参考文献112第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献97-99所述。聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[IOO]。此类制剂还包括与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂[IOI]，以及与至少一种其它非离子型表面活性剂(例如辛苯聚醇)组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[102]。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。胞壁酰肽，例如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺("thr-MDP")、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺("nor-MDP")、N-乙酰基葡糖胺-N-乙酰基胞壁酰-L-Al-D-异谷-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(N-acetylglucsaminyl-N陽acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamide)("DTP-DPP"，或"Theramide")或N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺("MTP-PE")。从第一种革兰氏阴性菌制备的外膜蛋白蛋白体制品与衍生自第二种革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)制品的组合，其中所述外膜蛋白蛋白体和LPS制品形成稳定的非共价佐剂复合物。这类复合物包括"IVX-908"，它是由脑膜炎奈瑟球菌外膜和LPS组成的复合物。它们已被用作流感疫苗的佐剂[103]。甲基肌苷5'-单磷酸酯("MIMP")[104]。如下式所示的多羟基化吡咯双烷(pyrrolizidine)化合物[105]或其药学上可接受的盐或衍生物其中R选自下组氢，直链或支链、未取代或取代的、饱和或不饱和的酰基、垸基(例如，环垸基)、烯基、炔基和芳基。例子包括但不限于木麻黄素(casuarine)、木麻黄素-6-a-D-吡喃型葡萄糖、3-表-木麻黄素、7-表-木麻黄素、3,7-二表-木麻黄素，等等。Y菊粉[106]或其衍生物，如藻类菊粉(algammulin)。CDld配体，如a-半乳糖苷神经酰胺。'聚氧镜离子(polyoxidonium)聚合物[107，108]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗉衍生物。这些佐剂和其他佐剂活性物质更加详细的描述见参考文献112和113。组合物可包含两种或多种所述佐剂。例如，组合物宜同时包含水包油乳液和细胞因子诱导剂，因为这种组合能改善流感疫苗引发的细胞因子应答，如干扰素Y应答，这种改善作用比单用乳液或细胞因子诱导剂的情况要好得多。组合物中的抗原和佐剂一般形成混合物。水包油乳液佐剂己发现水包油乳液特别适用于佐剂配制的流感病毒疫苗中。已知各种这样的乳液，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中一种或多种油和一种或多种表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴通常直径低于5pm，甚至可具有亚微米直径，用微流化仪可实现这些小尺寸，从而能提供稳定的乳液。优选尺寸小于220nm的油滴，因为能对它们进行过滤灭菌。本发明可使用诸如动物来源(例如鱼)或植物来源的油。植物油来源包括坚果、种子和谷物。坚果油的例子是最常购得的花生油、大豆油、椰油和橄榄油。例如，可利用从霍霍巴豆(jojobabean)获得的霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易购得的，但其它谷物如小麦、燕麦、黑麦、大米、画眉草(teff)、黑小麦等的油也可利用。通过水解、分离和酯化合适的坚果和种子油起始物质可制备种子油中天然不存在的甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可用于实施本发明。本领域熟知从动物来源获得纯油所需的分离、纯化、皂化和其它方法。大多数鱼含有不难回收的可代谢油。例如，本发明可用的几种鱼油的例子是鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油，如鲸蜡。可以5-碳异戊二烯单位通过生物化学方法合成许多支链油，这些支链油通常称为类萜。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯(2,6,10,15,19，23-六甲基-2,6,10，14,18,22-二十四己烯(tetracosahexaene))的支链不饱和类萜，这是本发明特别优选的。角鲨垸是角鲨烯的饱和类似物，其也是优选的油。包含角鲨烯和角鲨垸的鱼油不难从商业来源购得，或可通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可利用油的混合物。可根据表面活性剂的"HLB"(亲水/亲油平衡)将其分类。优选的本发明表面活性剂的HLB至少为IO，优选至少15，更优选至少16。本发明可用的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80;环氧乙垸(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAXTM为商品名出售，例如线形EO/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-l,2-乙二基)基团数目可能不同的辛苯聚醇，其中特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂，例如磷脂酰聚胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙烯乙二醇单月桂基醚(triethyleneglycolmonolaurylether)(节泽30);和失水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中所含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-IOO。可利用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也适用。另一有用的混合物包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性剂的优选用量(重量％)是聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(例如，吐温80)0.01-1%，特别是约0.1%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100或曲通系列的其它洗涤剂)0.001-0.1%，特别是0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0.1-20%，优选0.1-10%,特别是0.1-1%或约0.5%。本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。以体积计，所述乳液的组成可以是约5%角鲨烯，约0.5%聚山梨醇酯80和约0.5%司盘85。以重量计，这些比例可以是4.3%角鲨烯，0.5%聚山梨醇酯80和0.48%司盘85。该佐剂称为"MF59"[109-111]，如参考文献112的第10章和参考文献112的第12章所详述的。MF59乳液优选包含柠檬酸离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如，1%)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10%角鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐温80，角鲨烯:生育酚的重量比优选S1，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5:2。可将吐温80溶解于PBS中获得2%的溶液，然后将90ml该溶液与(5gDL-a-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，随后微流化该混合物来制备这样一种乳液。得到的乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径在100-250nm之间，优选约180角鲨烯、生育酚和曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸缓冲液。含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，a-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液所包含的这三种组分的质量比约为75:11:10(例如，750pg/ml聚山梨醇酯80，110pg/ml曲通X-100和100吗/mla-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括来自抗原的这些组分的影响。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。水相可含有磷酸盐缓冲剂。角鲨烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401("普罗流尼克TML121")的乳液。可以用磷酸缓冲盐水，pH7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用"SAF-r佐剂(0.05-l。/。Thr-MDP、5。/。角鲨烯垸、2.5。/0普罗流尼克L121和0.2%聚山梨醇酯80)配制的苏氨酰-MDP联用[114]。也可不与Thr-MDP联用，例如用"AF"佐剂(5。/。角鲨烷、1.25%普罗流尼克L121和0.2%聚山梨醇酯80)配制[115]。优选微流体化。包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)鲸蜡基/硬脂基醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如失水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如失水山梨糖醇单油酸酯或'司盘80')的乳液。乳液优选是热致可逆的和/或至少90%油滴(按体积计)的大小小于200nm[116]。乳液中还可包含以下一种或多种醛醇；冷冻保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或垸基聚糖苷。这种乳液可被冻干。角鲨烯、泊洛沙姆105和AbilCare的乳液[117]。佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)为5%角鲨烯、4%泊洛沙姆105(普流罗尼类多元醇)和2%AbilCare85(双PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。*具有0.5-50%的油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子表面活性剂的乳液。如参考文献118所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。不可代谢的油(例如，轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(例如，卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(例如，参考文献119所述的GPI-OIOO，通过将脂族胺通过葡糖醛酸的羧基加成到脱酰基皂苷上制备)、二甲基二(十八烷基)溴化铵和/或N,N-二(十八垸基)-N,N-二(2-羟乙基)丙二胺。包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[120]。包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液岡。其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，胆固醇)结合成螺旋状胶束的乳液[121]。这些乳液优选在递送之时与抗原临时混合。因此，在包装或分发的疫苗中，佐剂和抗原通常分开存放，最后在使用时即时配制。抗原一般以水性形式存在，使得可通过混合两种液体来最终制备疫苗。用于混合的两种液体的体积比可以不同(例如，在5:1和1:5之间)，但通常是约l:l。抗原和佐剂混合后，血凝素抗原通常维持在水溶液中，但其自身可能在油/水界面附近分配。进入乳液的油相的血凝素通常极少(如果有的话)。如果组合物包含生育酚，a、P、y、5、s或g生育酚均可用，但优选a-生育酚。生育酚可采取几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等等。D-a-生育酚和DL-ot-生育酚均可用。老年患者(例如，60岁或更大)所用的疫苗中优选包含生育酚，因为据报道维生素e在该患者组中对免疫应答有正面影响[122]。它们还具有抗氧化特性，从而有助于稳定溶液[123]。优选的a-生育酚是DL-a-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。现已发现琥珀酸盐在体内能与TNF-相关的配体协作。此外，已知a-生育酚琥珀酸盐与流感疫苗相容，是替代汞化合物的有用防腐剂[59]。37细胞因子诱导剂给予患者时包含在本发明组合物中的细胞因子诱导剂能够引发免疫应答，以释放细胞因子，包括干扰素和白细胞介素。已知细胞因子应答与针对流感病毒感染的宿主防御的早期和决定阶段有关[124]。优选的药剂可引发以下一种或多种物质的释放干扰素y;白介素l;白介素2;白介素12;TNFa;TNFp;和GMCSF。优选的药剂可诱发与Thl-型免疫应答有关的细胞因子的释放，例如干扰素Y，TNFa，白介素2。优选刺激干扰素Y和白介素2。因此，接受本发明组合物的结果是，用流感抗原刺激时，患者具有以抗原特异性方式释放所需细胞因子的T细胞。例如，体外接触流感病毒血凝素时，从血液纯化的T细胞将释放y干扰素。测定外周血单核细胞(PBMC)这种应答的方法是本领域已知的，这些方法包括ELISA、ELISPOT、流式细胞术和实时PCR。例如，参考文献125报道了监测针对破伤风类毒素的抗原特异性T细胞介导的免疫应答，特别是Y干扰素应答的研究，发现ELISPOT是区别抗原特异性TT-诱导的应答与自发应答的灵敏度最高的方法，但流式细胞术检测胞质内细胞因子是测定再次刺激效果的最有效方法。合适的细胞因子诱导剂包括但不限于，免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序(含有通过磷酸键连接于鸟嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的寡核苷酸、或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。3-0-脱酰基单磷酰脂质A('3dMPL'，也称为'MPL，)[126-129]。咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特("R837")[130,131]、瑞喹莫德("R-848")[132]和它们的类似物；和它们的盐(例如，盐酸盐)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它细节见参考文献133-137。縮氨基硫脲化合物，例如参考文献1-38披露的那些。参考文献138还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。縮氨基硫脲对于刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-a尤其有效。色胺酮化合物，例如参考文献139披露的那些。参考文献139还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。縮氨基硫脲对于刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-a尤其有效。核苷类似物，例如(a)艾沙托拉滨(Isatorabine)(ANA-245;7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药OO(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)参考文献140-142所述的化合物；(f)下式所示化合物R,和R2各自独立为H、卤素、-NRaRb、-OH、d.6烷氧基、取代的Q.6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C6-k)芳基、取代的C6-h)芳基、Cl6焼基或取代的Cl6院基；R3不存在，或是H、Cl6院基、取代的CL6垸基、<:6.1()芳基、取代的Q.u)芳基、杂环基或取代的杂环基；R4和Rs各自独立为H、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(0)-Rd、Cl6烷基、取代的Q-6烷基，或结合在一起形成5元环，如R4，5:在一所示键处实现结合。X!和X2各自独立为N、C、O或S;Rs是H、卤素、-OH、CV6垸基、(:2.6烯基、C2，6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-0-Rc、-0-(d.6烷基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd;R9是H、Cl6院基、取代的Cl6院基、杂环基、取代的杂环基或R9a，其中R9a是:式中:叫RR*RioRm在^w所示键处实现结合。R10和R各自独立为H、卤素、Cl6烷氧基、取代的d.6烷氧基、-NRaRb或-OH;Ra和Rb各自独立为H、Cl6院基、取代的Cl6焼基、-C(0)Rd、C6.10芳基；Rc各自独立为H、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、Cl6院基或取代的Cl6院基；Rd各自独立为H、卤素、Cl6院基、取代的Cl6院基、CL6烷氧基、取代的CL6垸氧基、-NH2、^11((:1.6垸基)、-NH(取代的d-6垸基)、-N(d.6垸基)2、^(取代的(:1.6烷基)2、(VK)芳基或杂环基；Re各自独立为H、Cl6院基、取代的Cl6院基、Cw。芳基、取代的C6.,0芳基、杂环基或取代的杂环基；Rf各自独立地为H、Cl6院基、取代的Cl6院基、-C(0)Rd、磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基；n各自独立为0、1、2或3;p各自独立为O、l或2;或者(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或该互变异构体的药学上可接受的盐。罗唑利宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[143]。参考文献144披露的化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮(Indoledione)化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮(Benzocyclodione)化合物、氨基氮杂乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(Aminobenzimidazolequinolinone)(ABIQ)化合物[145，146]、羟邻苯二甲酰胺(Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、异噁唑化合物、固醇化合物、喹唑酮(Quinazilinone)化合物、吡咯化合物[147]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和氮茚(Benzazole)化合物[148]。40参考文献149披露的化合物。氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[150,151]。磷腈，例如参考文献152和153中描述的聚[二(羧基苯氧基)磷月青]("PCPP"，poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])。小分子免疫增强剂(SMIP)，例如N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪哇并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉隱2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基卜2-甲基丙-2-醇；l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇；N4，N4-二苄基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺。用于本发明的细胞因子诱导剂可以是Toll样受体(TLR)调节剂和/或激动剂。例如，它们可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中的一种或多种的激动齐U。优选的细胞因子诱导剂是TLR7的激动剂(例如，咪唑并喹啉类)和/或TLR9的激动剂(例如，CpG寡核苷酸)。这些免疫增强剂可用于活化先天免疫途径。可以在本发明组合物生产过程的各个阶段加入细胞因子诱导剂。例如，它可位于抗原组合物内，然后将该混合物加入到水包油乳液中。另一种可选方式是细胞因子诱导剂位于水包油乳液中，在这种情况下，可将试剂在乳化之前加入乳液组分，或者可以在乳化之后加入乳液中。类似地，试剂可以凝聚在乳液液滴中。细胞因子诱导剂在最终组合物中的位置和分布将取决于其亲水/亲脂特性，例如该药剂可位于水相、油相和/或油水界面上。该细胞因子诱导剂可偶联于另一种药剂，如抗原(如CRM197)。参考文献154中提供了有关小分子偶联技术的综述。作为另一种可选方式，佐剂可与其它试剂非共价(例如通过疏水作用或离子相互作用)结合。两种优选的细胞因子诱导剂是(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)3dMPL。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除RNA外)单链。参考文献155、156和157公开了可能的类似取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献158-163中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[164]。CpG序列可特异性诱导Thl免疫应答，例如CpG-AODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-BODN。参考文献165-167中讨论了CpG-A和CpG-BODN。CpG优选CpG-AODN。优选构建CpG寡核苷酸时使其5，端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3'端相连接形成"免疫聚体"。参见例如，参考文献164和168—170。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称为ProMune(科雷制药集团公司(ColeyPharmaceuticalGroup,Inc.))。除使用CpG序列以外，还可使用TpG序列[171]。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可以富含嘧啶。例如，其可包含多个连续的胸苷核苷酸(例如，参考文献171所述的TTTT)，和/或其核苷酸组成可含有>25%的胸苷(例如，>35%、>40%、>50%、>60%、>80%，等等)。例如，其可包含多个连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献171所述的CCCC)，和/或其核苷酸组成可含有>25°/。的胞嘧啶(例如，>35%、〉40%、>50%、>60%、>80%，等等)。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸。它们可包含少于100个核苷酸。3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰基脂质A或3-0-脱酰基-4'-单磷酰基脂质A)是单磷酰基脂质A中还原端葡糖胺的3位被脱酰化的佐剂。3dMPL从明尼苏达沙门菌(Sfl/mo"e〃am/""^Wa)的无庚糖突变体(heptoselessmutant)制备，其在化学上类似于脂质A但缺乏酸不稳定的磷酰基和碱不稳定的酰基。它活化单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，刺激几种细胞因子释放，包括IL-1、IL-12、TNF-a和GM-GSF(还可见参考文献172)。参考文献173最先描述了3dMPL的制备。3dMPL可釆取酰化程度不同的相关分子混合物的形式(例如，具有长度可能不同的3、4、5或6条酰基链)。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖的2-位碳(即，2和2'位)被N-酰基化，3'位也被0-酰基化。与碳2相连的基团如式-NH-CO-CH2-CR^'所示。与碳2'相连的基团如式^1"1-(:0-(:12-012112'所示。与碳3'相连的基团如式-0-CO-CH2-CR3R3'所示。代表性的结构是基团R1、112和R3各自独立为-(CH2)n-CH3。n值优选在8-16之间，更优选在9-12之间，最优选10。基团R「、R"和R3'各自独立为(a)-H;(b)-OH;或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH。m-CH3，其中m值优选在8-16之间，更优选10、12或14。在2位，m优选14。在2'位，m优选10。在3'位，m优选12。因此基团R"、R"和W优选十二垸酸、十四烷酸或十六垸酸的-O-酰基。当Rr、112'和R3'均是-H时，3d-MPL只有3条酰基链(2、2邻3'位上各有一条)。当R"、R"和R'中只有两个是-H时，3d-MPL可具有4条酰基链。当R"、R2'和R3'中只有一个是-H时，3d-MPL可具有5条酰基链。当R"、R"和W中无一是-H时，3d-MPL可具有6条酰基链。本发明所用3d-MPL佐剂可以是具有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但混合物中优选包含具有6条酰基链的3d-MPL，特别是要确保以重量计6酰基链形式至少占总3d-MPL的10%，例如^20%、230°/。、240°/。、^50%或更高。发现具有6条酰基链的3d-MPL是最有活性的佐剂形式。因此，本发明组合物中包含的3dMPL的最优选形式具有以下通式(IV):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>通式(IV)当采用混合物形式的3dMPL时，提及本发明组合物中3dMPL的用量或浓度指该混合物中混合的3dMPL诸种类。在水性条件下，3dMPL可形成大小不同，例如直径<150nm或>500nm的胶束聚集体或颗粒。本发明可使用任一种或二者，通过常规试验可选择较佳的颗粒。较小的颗粒因其较佳的活性而优选用于本发明(例如，足够小从而能得到3dMPL的澄清水性混悬液)[174]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm或小于150nm或小于120nm，平均直径甚至可以小于100nm。然而，在大多数情况中，平均直径不会小于50nm。这些颗粒足够小，从而适于过滤灭菌。可通过动态光散射的常规技术评估颗粒直径，该技术能揭示平均颗粒直径。当说到颗粒的直径为xnm时，颗粒分布一般在该平均值附近，但以数量计至少50%(例如，260%、^70%、280%、290%或更多)的颗粒的直径在乂±25%范围内。3dMPL与水包油乳液组合使用是有利的。最好基本上所有3dMPL位于乳液的水相中。可单独使用3dMPL，或与一种或多种其它化合物联用。例如，可将3dMPL与下述物质联用QS21皂苷[175](包含在水包油乳液中[176])、免疫剌激性寡核苷酸、QS21和免疫刺激性寡核苷酸、磷酸铝[177]、氢氧化铝[178]、或者磷酸铝和氢氧化铝。脂肪佐剂本发明中使用的脂肪佐剂包括上述水包油乳液，还包括例如*式1、II或III的化合物或其盐iiiin如参考文献179所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER803022'或'ER804057'，如<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>大肠杆菌(^c/^/c/z/aco/Z)如OM174的脂质A的衍生物(如参考文献180禾口181所述)。阳离子脂质与(通常为中性)共脂质(co-lipid),如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙铵-二植酰基磷脂酰-乙醇胺("VaxfectinTM")或氨基丙基-二甲基-双十二垸基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制剂。优选含有-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2，3-双(顺-9-十四烯酰氧基)-l-丙铵盐(2，3-bis(syn-9-tetradeceneyloxy)-1-propanaminium)的制齐!j[182]。3-0-脱酰基单磷酰脂质A(如上所述)。含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564[183,184]:铝盐佐剂可使用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规的，但只是为方便而使用，并未精确描述所存在的实际化学构成[例如，见参考文献112的第9章]。本发明可用常规用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常至少部分结晶。羟基氧化铝以分子式A10(OH)表示，其与其它铝化合物，例如氢氧化铝Al(OH)3的区别在于红外(IR)光谱，特别是在1070cm"处存在吸收带和在3090-3100cm"处存在强烈的肩峰[参考文献112的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的pl通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力在每mgA1+++1.8-2.6mg蛋白质之间。称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，这些佐剂也常含有少量硫酸根(即，羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中P04/A1摩尔比通常在0.3-1.2之间。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的A1P04。例如，3164cm"的IR光谱带(例如，当加热至200°C时)表明存在结构性羟基[参考文献112的第9章]。磷酸铝佐剂的P04/A1"摩尔比通常在0.3-1.2之间，优选在0.8-1.2之间，更优选0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，特别是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PCVA产摩尔比在0.84-0.92之间，含0.6mgAl3+/ml的无定形羟基磷酸铝。磷酸铝通常是颗粒状的(例如，电子透射显微照片中所见的平板样形态)。这些颗粒在吸附任何抗原后的典型直径是0.5-20)im(例如，约5-10pm)。据报道，pH7.4时，磷酸铝佐剂的吸附能力在每11^八1+++0.7-1.5mg蛋白质之间。磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度成反比，而该取代程度依据沉淀制备该盐所用的反应条件和反应物浓度而不同。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多=PZC酸性越高)或通过添加例如组氨酸缓冲液(使得PZC更具碱性)等缓冲液来改变PZC。本发明所用磷酸铝的PZC通常在4.0-7.0之间，更优选在5.0-6.5之间，例如约5.7。用于制备本发明组合物的铝盐悬液可含有缓冲剂(例如，磷酸盐或组氨酸或Tds缓冲剂)，但不一定。这些悬液优选无菌、无热原。悬液可含有游离的水性磷酸根离子，例如浓度在1.0-20mM之间、优选在5-15mM之间、更优选约10mM。这些悬液也可含有氯化钠。本发明可使用佐剂包含氢氧化铝和磷酸铝的混合物[81]。在这种情况中，磷酸铝可能多于氢氧化铝，例如重量比至少为2:1，例如25:1、26:1、>7:1、28:1、29:1，等等。给予患者的组合物中八1+++的浓度优选低于10毫克/毫升，例如S5毫克/毫升、S4毫克/毫升、S3毫克/毫升、S2毫克/毫升、Sl毫克/毫升，等等。优选的范围在0.3-1毫克/毫升之间。优选最高为0.85毫克/剂。除包含一种或多种铝盐佐剂外，佐剂组分还可包含一种或多种其它佐剂或免疫刺激剂。其它这类组分包括但不限于3-0-脱酰基单磷酰脂质A佐剂('3dMPL');和/或水包油乳液。疫微会赫包发本发明组合物(或药剂盒组分)的合适容器包括小瓶、注射器(例如，一次性注射器)、鼻喷雾器等。这些容器应无菌。如果将组合物/组分存于小瓶中，所述小瓶优选由玻璃或塑料材料制49成。优选先将小瓶灭菌再加入组合物。为避免患者对乳胶过敏的问题，优选用无乳胶的塞子密封小瓶，所有包装材料最好均不含乳胶。小瓶可装有单剂量疫苗，或可装有多剂量("多剂量"小瓶)，例如10份剂量。优选用无色玻璃制成小瓶。小瓶可装有盖子(例如，卢氏(Luer)锁扣)，从而可将预填充的注射器插入盖子中，将注射器的内含物推入小瓶中(例如，重建其中的冻干材料)，再将小瓶的内含物抽回注射器中。将注射器从小瓶中取出后，装上针头，将组合物给予患者。优选使盖子位于封口或覆盖物内，从而要先除去封口或覆盖物再接触盖子。小瓶可具有盖子，从而能无菌取出其内含物，特别是多剂量小瓶。如果要将某组分包装入注射器，注射器可装有针头。如果未装针头，可随注射器提供单独的针头用于装配和使用。这种针头可以是有鞘的。优选安全针头。常见的是1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。注射器可贴有可剥离标签，其上打印了批号、流感季节和内含物的有效期，从而有助于记录保管。注射器的活塞优选具有抑止部件，从而能防止柱塞在抽吸期间意外掉出。注射器可装有乳胶橡胶盖子和/或柱塞。一次性注射器可含有单剂量疫苗。在装上针头之前，注射器一般装有针帽以密封顶端，所述针帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则优选给针头装有丁基橡胶罩。优选的注射器是以"Tip-Lok"TM为商品名投入市场的那些。可给容器做上显示半剂量体积的标记，例如以有助于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标记。如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，则优选使用硼硅酸玻璃而不是钠钙玻璃制成的容器。可随药剂盒或组合物提供(例如，装在同一盒子中)插页，该插页包括疫苗的细节，例如给药的使用说明书，疫苗中抗原的细节等。使用说明书还可包括警告，例如准备肾上腺素溶液以防疫苗接种后的过敏反应，等等。浙方法舰難絲本发明提供了根据本发明制造的疫苗。根据本发明制造的疫苗组合物适合给予人类患者，本发明提供了引起患者免疫应答的方法，该方法包括给予患者本发明组合物的步骤。本发明还提供了用作药物的本发明组合物。本发明还提供了根据本发明制备的流感病毒抗原在制造引起患者免疫应答的药物中的应用。通过这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体反应，优选保护性抗体反应。本领域熟知评估流感病毒疫苗接种后的抗体应答、中和能力和保护作用的方法。人类研究证明针对人流感病毒血凝素的抗体滴度与保护作用有关(血清样品血凝反应-抑制滴度约30-40时，对同源病毒感染的保护作用约为50%)[185]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单向放射免疫扩散(SRID)和/或单向放射溶血(SRH)检测抗体应答。本领域熟知这些试验技术。可以各种方法给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(例如，注射入手臂或腿中)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[186-188]、口服[189]、真皮内[190,191]、透皮、经皮[192]等途径。本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成年人。流感疫苗目前推荐用于儿科和成年人免疫接种，年龄自6个月起。因此，患者可以小于l岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(例如，250岁，260岁，优选265岁)，年轻人(例如，S5岁)，住院患者，卫生保健人员、军队和军事人员，怀孕的妇女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物(例如，奥塞米韦或扎那米韦化合物；例如磷酸奥塞米韦，参见下文)的患者，和出国的人。然而，这些疫苗不仅适用于这些群体，还可应用于更广泛的人群中。对于流行毒株，优选给予所有的年龄组。本发明的优选组合物满足效力的CPMP标准的1、2或3条。在成年人(18-60岁)中，这些标准是(1)^70%血清保护作用；(2)^40%血清转化；禾口/或(3)GMT增加22.5-倍。在老年人(>60岁)中，这些标准是(1)^60%血清保护作用；(2)^30%血清转化；和/或(3)GMT增加22-倍。这些标准51是依据至少50位患者的标签公开研究(openlabelstudy)。可以通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如初免采用胃肠道外途径而加强免疫采用粘膜途径，或者初免采用粘膜途径而加强免疫采用胃肠道外途径等。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于免疫未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫接种新的HA亚型(如大流行爆发中的亚型)。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。可将本发明疫苗与其它疫苗基本上同时(例如，可在医疗保健专家或疫苗接种中心的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与以下疫苗基本上同时给予麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的乙型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联物疫苗(例如，四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗、肺炎球菌偶联物疫苗，等等。与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给予在老年患者中特别有用。类似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，特别是有效抵御流感感毒的抗病毒化合物(例如，奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时(例如，可在医疗保健专家的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者。这些抗病毒(化合物)包括神经氨酸酶抑制剂，例如(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-环己烯-l-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2,6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-丙三基-D-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonicacid)，包括它们的酯(例如乙酯)和它们的盐(例如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-环己烯-l-羧酸乙酯磷酸盐(l:l)，也称为磷酸奥塞米韦(达菲(TAMIFLU)TM)。概述术语"含有"包括"包含"以及"由...组成"，例如"含有"X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。词语"基本上"不排除"完全"，例如"基本上无"Y的组合物可完全无Y。该词语"基本上"可视需要从本发明定义中省去。与数值X有关的术语"约"表示，例如Xi100/0。除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以相互混合，然后将混合的组分再与第三种组分混合等。将动物(具体是牛)材料用于培养细胞时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总体上，优选在完全不含动物来源的材料中培养细胞。当某化合物作为组合物的一部分给予人体时，该化合物可被合适的前药所替换。附图简要说明图1显示了从临床样品分离流感病毒的流程。图2比较了在MDCK-33016细胞中分离的9种病毒样品的HA滴度。在每种样品中，左手边的柱表示第2代，右手边的柱表示第5代。图3比较在三种不同的MDCK细胞类型中培养的10个流感病毒样品的HA滴度。对于每一种样品，三个柱各自的涵义是左边表示悬浮培养的33016，中间表示贴壁培养的33016，右边表示CCL-34MDCK细胞。图4显示了三种病毒与SNA或MAA凝集素的结合。图4A显示了初始分离物的结合，4B显示了在MDCK33016细胞中生长后的结合，4C显示了在蛋中生长后的结合。图5和6显示病毒与3-SL或6-SLN的结合。在这两幅图中共有六组，分别是靠左边三组表示在不同浓度(lpM、0.5pM、0.25itiM)下与3-SL的结合；靠右边三组表示在不同浓度(0.25pM、0.125|iM、0.0625liM)下与6-SLN的结合。在这六组的各组中，每个方柱表示不同的病毒。在图5中，从左到右的三个方柱是(i)细胞分离的病毒；(ii)蛋分离的病毒；和(iii)禽类病毒。在图6中，从左到右的四个方柱是(i)在蛋中进行两次传代后的病毒；(ii)在MDCK中进行两次传代后的病毒；(iii)在蛋中进行五次传代后的病毒；(iv)在MDCK中进行五次传代后的病毒。实施本发明的方式从患者样品中分离病毒在2006-2007北半球流感季节期间从儿童和成人获取含甲型和/或乙型流感病毒亚型的临床样本(鼻腔或喉咙拭子)。通过确定血凝素(HA)滴度、聚合酶链反应(PCR)和病毒滴定，将无血清悬浮培养的MDCK33016细胞系(DSMACC2219)的易感性和可靠性与已建立的MDCKCCL34细胞系(ATCC)和鸡蛋进行比较。通过诊断性聚合酶链反应(PCR)鉴别了248个流感阳性样品。通过以下方法在MDCK33016细胞系和鸡蛋中评价流感病毒复制和分离的易感性和可靠性(i)血凝素(HA)滴度；(ii)用于测量病毒负荷的实时聚合酶链反应(PCR);和(iii)病毒滴定。通过对原始临床样本中以及MDCK细胞和鸡蛋中第二代分离物的HA基因进行测序，评价细胞中复制的准确性。将由悬浮培养的MDCK33016细胞的分离物获得的病毒滴度与贴壁培养的MDCK33016细胞所得结果进行比较。结果表明，MDCK33016悬浮细胞系的分离能力优于已建立的MDCKCCL34细胞系，显著优于鸡蛋所得结果。在MDCK33016细胞中对病毒样品进行传代之后，分离物中均未鉴定到氨基酸取代。相反，几乎所有蛋传代病毒都包含一个或多个氨基酸取代，主要发生在HA1基因中。蛋中传代后观察到的HA基因抗体结合位点中的突变可导致流感病毒的免疫原性改变。55%从急性呼吸道疾病患者获取的临床样品鉴别为流感阳性，具有以下病毒类型79%A/H3N2;12,5%A/H1N1;1.6%B;0.4%H3/B和6.5%未分型。可以利用MDCK33016细胞从临床样品分离病毒(图1)。相反，注入蛋的源自临床样品的病毒中，都没能实现成功分离。用新鲜制备的鸡胚成纤维细胞(CEF)中得到类似的阴性结果。只有利用阳性HA滴度的MDCK33016培养物上清液才能分离和建立蛋中的流感病毒。进一步用源自各个细胞的最初获取物接种蛋，用于参比目的。采用各种方法，成功分离病毒的数量如图l方框所示，也显示了注入的不同病毒类型的数量。从MDCK33016细胞分离的所有三种病毒亚型在蛋中第二次传代后都获得合理的HA滴度(>32)和病毒滴度(>^106)，两种滴度随传代次数增加(图2)。对于所有三种亚型，由临床拭子分离流感病毒时，悬浮生长的MDCK33016细胞优于贴壁细胞系(CCL-34)。悬浮细胞系对阳性流感拭子材料灵敏度较高，如回收率所示(表l)。将在MDCK33016细胞和蛋中进行不同传代次数后的HA序列与原始分离物进行比较(表2)，在MDCK33016细胞中即使传代5次后分离的甲型流感毒株仍未发现突变，而蛋中传代2次后分离的甲型流感毒株即在HA蛋白的抗体结合位点存在突变。在MDCK33016或蛋中分离的乙型流感毒株都未发现突变。分离物在MDCK33016悬浮细胞中复制后的病毒产量比MDCK33016贴壁细胞高至少一个对数值。因此，MDCK33016悬浮细胞系是分离和复制野生型流感毒株的理想体系，因为它具有比鸡蛋更高的分离能力。而且，由于高复制准确性，使用细胞分离物制备人流感疫苗可产生更可靠的疫苗。流通的野生型毒株与疫苗中包含的毒株之间的匹配得到改善，导致疫苗产生更好的流感保护作用。结论(a)相对于蛋，在MDCK33016细胞中所有病毒毒株得到成功分离；(b)从MDCK33016细胞分离的病毒毒株能够在蛋中成功繁殖；(c)与贴壁细胞相比，在悬浮生长的MDCK33016细胞中所有三种流感病毒亚型的回收率较佳；和(d)与原始物质相比，任何在MDCK33016细胞中培养的分离物中不存在HA基因取代，而在蛋中传代两次后即出现这种取代。因此，MDCK33016悬浮细胞系是非常适用于分离和繁殖人流感病毒亚型的底物，因为其能高度可靠地对来自临床分离物的野生型流感病毒进行传代，并能保持野生型病毒的真实特征。受体结合研究了原始分离的病毒、蛋培养的病毒以及MDCK培养的病毒的受体偏好。研究釆用具有2，3-唾液酸连接键(MAA)或2，6-唾液酸连接键(SNA)的凝集素，或2,3-唾液酸乳糖(3SL，一种蛋受体的类似物)和2，6-唾液酸-N-乙酰基乳糖胺(6-SLN，一种人受体类似物)唾液酸糖聚合物(sialylglyc叩olymer)[193]。55图4示出代表性研究结果。标记的峰表明与SNA或MAA凝集素的结合。原始病毒(4A)和在MDCK33016上培养的病毒(4B)具有不同的SNA和MAA峰，而在蛋中培养的病毒SNA和MAA峰基本重叠C4C)。在进一步的实验中采用3-SL和6-SLN检查结合特异性。示例性结果在图5中示出。图左侧的结合表明禽类受体偏好，而右侧结合表明人受体偏好。如图5所示，细胞分离的病毒对人受体有强烈偏好。图6显示了使用在蛋中或MDCK33016悬浮细胞中进行2次或5次传代后的斯图加特分离物(A/H1N1)获得的数据。MDCK传代病毒对6SLN有强烈偏好。结论是，所有MDCK培养的临床人甲型或乙型病毒相对于3SL更易结合6SLN，但发现一些分离物在该试验中对两种物质都不结合。与原始临床分离物不同，蛋适应病毒能结合3SL，或是对3SL和6SLN都不结合。蛋中培养导致的改变在MDCK细胞中分离甲型和乙型流感病毒的各毒株，然后通过以下底物至多传代5次蛋；MDCK细胞CCL-34;MDCK细胞33016;Vero细胞或HEK293-T细胞。每次传代后对病毒HA基因进行测序并测定HA滴度。虽然一些毒株(例如，A/HlNl/Bayern/7/95)的HA序列在蛋和MDCK33016传代过程中稳定存在，但另一些不是这样。例如，在蛋中传代2次后，A/HINI/NordrheinWestfalen/1/05的HA序列在抗体结合位点D出现突变D203N，再传代2次后还出现R329K突变。相反，通过MDCK33016平行传代的病毒中序列未改变。对于A/H1N1/NRW/1/05毒株，用Vero细胞培养时未见生长。另外四种底物可支持其生长，但HA滴度不同。例如，蛋中观察到滴度为32-256，但293T细胞产生的滴度较低(16-32)，而MDCK33016产生的滴度较高(32-512)。应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可在本发明的范围和构思内进行修改。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>参考文献(通过引用将其内容纳入本文)Gerdil(2003)Vaccine21:1776-9。Palese(2006)EmergingInfectiousDiseases12:61-65。deOfia等(1995)JClinMicrobiol33:1948-49。Monto等(1981)JClinMicrobiol13(1):233-235。Govorkova等(1995)JInfectDis.172(l):250-3。Tobita等(1975)MedMicrobiolImmunol(Berl).162(1):9-14和23-27。Oilier等(2004)JClinMicrobiol42(12):5861-5。Schepetiuk&Kok(1993)JVirolMethods42(2-3):241-50。WHO(2003)Weeklyepidemiologicalrecord78:73-80美国专利6,344,354。也参见WO97/38094。美国专利5,162,112Medema等(2004)VirusRes.103(l-2):9-15。[13]Robertson等(1995)Vaccine13:1583-8。Merten等(1996)AdvancesinExperimentalBiology397:141-151。[15]Govorkova等(1996)J.Virol"70:5519-24。[16]Mastrosovich等(2003)JVirol77:8418-25。Gambaryan&Matrosovich(1992)JVirolMethods39(1-2):111-23。Mastrosovich等(1999)JVirol73:1146-55。Stevens等(2006)JMolBiol355:1143-55。Couceiro&Baum(1994)MemInstOswaldoCruz89(4):587-91。Kistner等(1998)Vaccine16:960-8。Kistner等(1999)DevBiolStand98:101-110。Bruhl等(2000)Vaccine19:1149-58。Pau等(2001)Vaccine19:2716-21。http:〃www.atcc.org/http:〃locus.umdnj.edu/WO03/076601。WO2005/042728。58[29]WO03/043415。WO97/37000。Brands等(1999)DevBiolStand98:93-100。Halperin等(2002)Vaccine20:1240-7。Tree等(2001)Vaccine19:3444-50。WO03/023021WO03/023025EP-A-1260581(WOO1/64846)。WO2006/071563。WO2005/113758。WO97/37001。WO2006/027698。Hoffmann等(2002)Vaccine20:3165—3170。Subbarao等(2003)Virology305:192—200。Liu等(2003)Virology314:580—590。Ozaki等(2004)J.Virol.78:1851—1857。Webby等(2004)Lancet363:1099—1103。WO00細50。WOO1/04333。美国专利6649372。Neumann等(2005)ProcNatlAcadSciUSA102:16825-9。WO2007脂008。WO2006/067211。WO01/83794。Hoffmann等(2000)Virology267(2):310-7。Vaccines(疫苗)(2004)，Plotkin和Orenstein编，ISBN0-7216-9688-0。WO02脂22。WO02/067983。WO01/21151。[59]WO02/097072。[60]WO2005/113756。Huckriede等(2003)MethodsEnzymol373:74-91。[62]Treanor等(1996)JInfectDis173:1467-70。[63]Keitel等(1996)ClinDiagnLabImmunol3:507-10。[64]世界卫生组织(WorldHealthOrganisation)(2005)EmergingInfectiousDiseases11(10):1515-21。Herlocher等(2004)JInfectDis190(9):1627-30。[66]Le等(2005)Nature437(7062):1108。[67]EPB0870508。[68]US5948410。[69]WO2007/052163。Lundblad(2001)BiotechnologyandAppliedBiochemistry34:195-197。GuidanceforIndustry:BioanalyticalMethodValidation(工业指南生物分析验证方法).美国卫生和人类服务食品药品管理部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesFoodandDrugAdministration),药物评价禾口石开究中心(CenterforDrugEvaluationandResearch,CDER)，兽医药物中心(CenterforVeterinaryMedicine,CVM).2001年5月。Ji等(2002)Biotechniques.32:1162-7。Briggs(1991)JParenterSciTechnol.45:7-12。Lahijani等(1998)HumGeneTher.9:1173-80。Lokteff等(2001)Biologicals.29:123-32。Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明顿药物科学和实践).第20版ISBN:0683306472[77]Banzhoff(2000)ImmunologyLetters71:91-96。[78]Nony等(2001)Vaccine27:3645-51。[79]美国专利6,372,223。[80]WO00/15251。60<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>[110]Podda&DelGiudice(2003)ExpertRevVaccines2:197-203。[111]Podda(2001)Vaccine19:2673-2680。VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach浪苗设计亚基和佐剂方法)(Powell和Newman编)普莱努(Plenum)出版社1995(ISBN0-306-44867-X)。Vaccineadjuvants:PreparationMethodsandResearchProtocols浪苗佐剂制备方法和研究方案)(分子医学方法丛书(MethodsinMolecularMedicineseries)第42巻)，ISBN:1-59259-083-7，O，Hagan编。Allison&Byars(1992)ResImmunol143:519-25。Hariharan等(1995)CancerRes55:3486-9。US2007/014805。Suli等(2004)Vaccine22(25-26):3464-9。[118]WO95/11700。[119]美国专利6,080,725。[120]WO2006/113373。[121]WO2005/097181。Han等(2005)"维生素E对老年人的免疫功能和感染性疾病的影响"(ImpactofVitaminEonImmuneFunctionandInfectiousDiseasesintheAged)，"欧洲营养、免疫功能和健康大会"(Nutrition,ImmunefunctionsandHealthEuroConference)，巴黎，2005年6月9-10曰。US-6630161。Hayden等(1998)JC//"/"w^101(3):643曙9。[125]Tassignon等(2005)J/mmw"o/M"/z305:188-98。[126]Myers等(1990)Cellularandmolecularaspectsofendotoxinreactions(内毒素反应的细胞和分子方面)第145-156页。Ulrich(2000)参考文献250第16章(第273-282页)。[128]Johnson等(1999)7MedC7ze/42:4640-9。[129]Baldrick等(2002)i^gw/flto^7b;a'co/尸/zarmaco/35:398-413。[130]US4,680,338。[131]US4,988,815。[132]W092/15582。Stanley(2002)C//"五xpDermato/27:571-577。Wu等(2004)Jw"w'ra/7^.64(2):79-83。Vasi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因组区段的至少一个区段包括来自所述第一毒株的HA区段。44.一种制备在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步骤(i)接受从未在蛋底物上繁殖过的流感病毒；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的受感染细胞以制备流感病毒。45.—种制备在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步骤(i)接受在MDCK33016细胞中分离的流感病毒；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的受感染细胞以制备流感病毒。46.—种制备在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步骤(i)接受从未在含血清培养基培养的底物上繁殖过的流感病毒；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的受感染细胞以制备流感病毒。47.—种制备在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步骤(i)接受利用反向遗传技术产生的流感病毒；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的受感染细胞以制备流感病毒。48.—种制备在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步骤(i)接受含有不到6个来自PR/8/34流感病毒的病毒区段的甲型流感病毒；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的受感染细胞以制备流感病毒。49.一种制备在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步骤:(i)接受含有不到6个来自AA/6/60流感病毒的病毒区段的甲型流感病毒；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的受感染细胞以制备流感病毒o50.—种制备在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步骤(i)接受流感病毒，该流感病毒中的血凝素具有相对于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更倾向于结合含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的受感染细胞以制备流感病毒。51.—种制备在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步骤(i)接受具有鸡蛋中未曾观察到的血凝素和/或神经氨酸酶糖形的流感病毒；(ii)用该流感病毒感染细胞系；和(iii)培养步骤(ii)的受感染细胞以制备流感病毒。全文摘要目前，在将流感毒株分发给疫苗生产商之前进行的步骤包括在蛋中对流感病毒进行传代。本发明的目的是提供适用于制造流感疫苗的方法，该方法中减少了蛋的使用，较佳地避免使用蛋。例如，不使用鸡蛋进行流感疫苗分离，可利用(例如)悬浮培养、在无血清培养基中培养、在无蛋白培养基中培养、非致瘤性、不存在覆盖培养基的情况下培养的MDCK细胞(马-达二氏犬肾细胞)。文档编号A61K39/145GK101511385SQ200780033583公开日2009年8月19日申请日期2007年9月11日优先权日2006年9月11日发明者H·特鲁赛姆,T·F·蔡申请人:诺华有限公司