专利名称：：用于调节血管发育的组合物和方法用于调节血管发育的组合物和方法发明领域本发明一般地涉及可用于调节血管发育的组合物和方法。本发明部分地途。'，、、，、、
背景技术：
：维管联结(vascularsupply)的发育是许多生理性和病理性过程的基本要求。活跃生长中的组织诸如胚胎和肿瘤要求充足的血液供应。它们通过生成促血管发生因子来满足这一需要，所述促血管发生因子经由称为血管发生(angiogenesis)的过程促进新血管形成。血管的管形成是复杂但有序的生物学事件，牵涉所有或许多以下步骤a)自已有的内皮细胞(EC)增殖出EC或自祖细胞分化出EC;b)EC迁移并接合以形成索样结构；c)血管索然后发生管发生(tubulogenesis)以形成具有中央内腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初级血管丛发生进一步重塑(remodeling)和整形(reshaping);及f)内皮周细胞(peri-endothelialcell)被募集来包围内皮管，为血管提供维持和调控功能，此类细胞包括用于小毛细血管的周细胞、用于更大血管的平滑肌细胞、和心脏中的心肌细胞。Hanahan，D.Science277:48-50(1997);Hogan,B.L.和Kolodziej,P.A.NatureReviewsGenetics.3:513-23(2002);Lubarsky,B.和Krasnow,M.A.Cell.112:19-28(2003)。现在完全确立了血管发生牵涉多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman等,J.Biol.Chem.267:10931-34(1992);Klagsbmn等，Annu.Rev.Physiol.53:217-39(1991);及GarnerA.,"Vasculardiseases",于PathobiologyofOcularDisease.ADynamicApproach,GarnerA禾口KlintworthGK编，第2版，MarcelDekker，NY，1994,pp1625-1710。4在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman等，Nature339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肺瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肺瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持"休目民，，状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性胂瘤继续生长，而且让转移性肺瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肺瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肺瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner等,N.Engl.J.Med.324:1-6(1991);Horak等，Lancet340:1120-1124(1992);Macchiarini等，Lancet340:145-146(1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman,Nat.Med.1(1):27-31(1995》。血管发育过程受到严密调节。迄今为止，多种分子，多为由周围细胞生成的分泌性因子，已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为牵涉刺激血管发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara等，Endocr.Rev.18:4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外，VEGF已显示为与肺瘤和眼内病症有关的新血管形成的关4定介导物。Ferrara等，Endocr.Rev.见上文。VEGFmRNA在多数所检查的人肿瘤中过表达。Berkman等,J.Clin.Invest,91:153-159(1993);Brown等，HumanPathol.26:86-91(1995);Brown等，CancerRes.53:4727-4735(1993);Mattern等,Brit.J.Cancer73:931-934(1996);Dvorak等，Am.J.Pathol.146:1029-1039(1995)。同样，眼部液体中VEGF的浓度水平与糖尿病性视网膜病和其它缺血相关视网膜病患者中的活跃的血管增殖的存在高度相关。Aiello等，N.Engl.J.Med.331:1480-1487(1994)。此外,研究证明了VEGF在AMD患者脉络膜新血管膜中的定位。Lopez等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37:855-868(1996)。抗VEGF中和性抗体在棵(小)鼠中遏制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等，Nature362:841-844(1993);Warren等，J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995);Borgstr6m等，CancerRes.56:4032-4039(1996);Melnyk等，CancerRes.56:921-924(1996)),而且在缺血性视网膜病症模型中还抑制眼内血管发生(Adamis等，Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996))。因此，抗VEGF单克隆抗体或其它VEGF作用抑制剂是有希望用于治疗肿瘤和多种眼内新血管病症的候选物。此类抗体记载于例如1998年1月14日公布的EP817，648和1998年10月15日公布的W098/45331和W098/45332。一种抗VEGF抗体，贝伐单抗(bevacizumab)，已获FDA批准与化疗方案联合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)。而且，贝伐单抗正在许多进行中的关于治疗各种癌症适应症的临床试验中接受调查。鉴于血管发生在许多疾病和病症中的作用，希望获得调控一种或多种引起这些过程的生物学效应的手段。显然仍然需要具有对于开发成治疗剂而言最佳的临床属性的药剂。本文所述发明满足了这种需求并提供了其它好处。完整收录本文中所引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)作为参考。发明概述本发明部分基于如下发现，即血管发育受到使用调节德耳塔样4(可互换地称为"DLL4")活化Notch受体途径的药剂进行的处理的抑制。DLL4拮抗剂处理导致血管结构(包括肺瘤血管结构)中升高的内皮细胞(EC)增殖、不适当的内皮细胞分化和不适当的动脉发育。惊人的是，抗DLL4抗体处理导致数种不同癌症中肿瘤生长的抑制。因而，本发明提供了用于调节(例如促进或抑制)牵涉血管发生的过程和用于靶向与血管发生有关的病理学疾患的方法、组合物、试剂盒和制品。一方面，本发明提供了用于治疗肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂。一方面，本发明提供了用于降低、抑制、阻断或预防癌症或肿瘤生长的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的抗DLL4拮抗剂。一方面，本发明提供了用于抑制血管发生的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)。一方面，本发明提供了用于治疗与血管发生有关的病理学疾患的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗6体)。在有些实施方案中，所述与血管发生有关的病理学疾患是肺瘤、癌症和/或细胞增殖性病症。在有些实施方案中，所述与血管发生有关的病理学疾患是眼内新血管疾病。一方面，本发明提供了用于刺激内皮细胞增殖的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂。在有些实施方案中，所述受试者患有与血管发生有关的病理学疾患(诸如肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症)。一方面，本发明提供了用于抑制内皮细胞分化的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂。在有些实施方案中，所述受试者患有与血管发生有关的病理学疾患(诸如肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症)。一方面，本发明提供了用于抑制动脉发育的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂。在有些实施方案中，所述受试者患有与血管发生有关的病理学疾患(诸如肺瘤、癌症和/或细胞增殖性病症)。一方面，本发明提供了用于抑制血管灌注(vascularperfosion)的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂。在有些实施方案中，所述受试者患有与血管发生有关的病理学疾患(诸如肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症)。另一方面，本发明提供了在患有与血管发生有关的病理学疾患的受试者中增强抗血管发生剂功效的方法，包括给所述受试者联合施用有效量的DI丄4拮抗剂与所述抗血管发生剂。此类方法可用于治疗病症，例如癌症或眼内新血管疾病，尤其是那些对单独抗血管发生剂治疗应答差的疾病或病症阶段。所述抗血管发生剂可以是任何能够降低或抑制血管发生的药剂，包括VEGF拮抗剂i者如抗VEGF抗体。一方面，本发明提供了如下方法，包括联合施用有效量的DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)与有效量的另一种治疗剂(诸如抗血管发生剂)。例如，联合使用DLL4拮抗剂与抗癌剂或抗血管发生剂以治疗各种肿瘤性或非肿瘤性疾患。在一个实施方案中，所述肺瘤性或非肿瘤性疾患是与血管发生有关的病理学疾患。在有些实施方案中，所述其它治疗剂是抗血管发生剂、抗肿瘤剂和/或化疗剂。DLL4拮抗剂可以与有效用于那些目的的其它治疗剂序贯或联合施用，或是在同一组合物中或是作为分开的组合物。DLL4拮抗剂和其它治疗剂(例如抗癌剂、抗血管发生剂)的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或作7为两种或更多不同的组合物，使用相同或不同的施药路径。或者/另外，可以以任意次序序贯进行施药。或者/另外，可以以序贯施药和同时施药的任意次序组合来实施各步骤。在某些实施方案中，施用两种或更多组合物之间可以存在范围从几分钟至几天、至几周至几个月的时间间隔。例如，可以首先施用抗癌剂，接着是DLL4拮抗剂。然而，还涵盖同时施药或首先施用DLL4拮抗剂。因而，一方面，本发明提供了如下方法，包括施用DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)，接着施用抗血管发生剂(诸如抗VEGF抗体，诸如贝伐单抗)。在某些实施方案中，施用两种或更多组合物之间可以存在范围从几分钟至几天、至几周至几个月的时间间隔。在某些方面，本发明提供了通过施用有效量的DLL4拮抗剂和/或血管发生抑制剂和一种或多种化疗剂来治疗病症(诸如肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症)的方法。多种化疗剂可用于本发明的联合治疗方法。本文中在"定义"下提供了所考虑的化疗剂的例示性和非限制性列表。DLL4拮抗剂和化疗剂的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或作为两种或更多不同的组合物，使用相同或不同的施药路径。或者/另外，施药可以以任意次序序贯进行。或者/另外，可以以序贯施药和同时施药的任意次序组合来实施各步骤。在某些实施方案中，施用两种或更多组合物之间可以存在范围从几分钟至几天、至几周至几个月的时间间隔。例如，可以首先施用化疗剂，接着是DLL4拮抗剂。然而，还涵盖同时施药或首先施用DLL4拮抗剂。因而，一方面，本发明提供了如下方法，包括施用DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)，接着施用化疗剂。在某些实施方案中，施用两种或更多组合物之间可以存在范围从几分钟至几天、至几周至几个月的时间间隔。一方面，本发明提供了DLL4拮抗剂在制备用于治疗性和/或预防性处理病症诸如与血管发生有关的病理学疾患的药物中的用途。在有些实施方案中，所述病症是肺瘤、癌症和/或细胞增殖性病症。一方面，本发明提供了用于治疗病症的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4激动剂。在有些实施方案中，所述病症与DLL4-Notch受体途径的表达和/或活性(诸如DLL4-Notch受体途径的活性增加)有关。在有些实施方案中，所述病症是其中期望血管发生、新血管形成和/或肥大的病症，例如血管创伤、伤口、撕裂、切口、烧伤、溃疡(例如糖尿病性溃疡、压迫性溃疡、血友病溃疡、静脉曲张性溃疡)、组织生长、体重增加、外周动脉疾病、引产、毛发生长、大疱性表皮松解症、视网膜萎缩、骨折、骨脊柱融合(bonespinalfbsion)、半月板撕裂(meniscaltear)等。在有些实施方案中，所述病症是其中期望抑制血管发生的病症。在有些实施方案中，所述DLL激动剂是DBZ。DLL4拮抗剂和激动剂在本领域是已知的，而且有些在本文中有描述和例示。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂是结合DLL4并中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰DLL4相关效应的一个或多个方面的分子。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂是结合Notch受体(诸如Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4)并中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰DLL4相关效应的一个或多个方面的分子。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂能够促进内皮细胞增殖、抑制内皮细胞分化、抑制动脉发育和/或降低血管灌注。如本领域中所完善建立的，内皮细胞增殖、内皮细胞分化、动脉发育和血管功能(诸如血管灌注)可以使用多种测定法(有些在本文中有描述和例示)中任一种来评估并在多种定量值方面来表示。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂促进内皮细胞增殖、抑制内皮细胞分化、抑制动脉发育和/或降低血管功能(诸如血管灌注降低)的能力是相对于没有DLL4拮抗剂治疗时的内皮细胞增殖、内皮细胞分化、动脉发育和/或血管功能(诸如血管灌注)的水平而评估的。在有些实施方案中，促进内皮细胞增殖、抑制内皮细胞分化、抑制动脉发育和/或降低血管功能(诸如血管灌注降低)的能力是在体外测定法(诸如本文所述HUVEC测定法)中测定的。在有些实施方案中，促进内皮细胞增殖、抑制内皮细胞分化、抑制动脉发育和/或降低血管功能(诸如血管灌注降低)的能力是在体内测定法(诸如本文所述小鼠视网膜发育测定法)中测定的。DLL4拮抗剂可以是抗DLL4抗体。在有些实施方案中，所述抗DLL4抗体是单克隆抗体。在有些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。在有些实施方案中，所述抗体选自嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、人源化抗体和人抗体。在有些实施方案中，所述抗体是抗体片段。在有些实施方案中，所述抗体是Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2或scFv。在有些实施方案中，所述抗体包含表l所示的重链和轻链可变区。表lVHNFGGYFDYWGQGTLVT(SEQIDNO:l)VLKVEIKR(SEQIDNO:2)在一个实施方案中，所述抗体是嵌合抗体，例如包含嫁接至异源非人、人或人源化序列(例如框架和/或恒定域序列)的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。在一个实施方案中，所述非人供体是小鼠。在一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变获得(例如噬菌体展示筛选等)。在一个实施方案中，本发明的嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个实施方案中，所述鼠轻链V区融合至人K轻链。在一个实施方案中，所述鼠重链V区融合至人IgGlC区。人源化抗体包括那些具有FR中氨基酸替代的人源化抗体和嫁接的CDR中有变化的亲和力成熟变体。CDR或FR中的替代氨基酸不限于供体或受体抗体中存在的那些。在其它实施方案中，本发明抗体还包含Fc区中氨基酸残基的变化，其导致效应器功能改善，包括CDC和/或ADCC功能和B细胞杀伤增强。本发明的其它抗体包括具有改善稳定性的特定变化的那些抗体。在其它实施方案中，本发明抗体包含Fc区中氨基酸残基的变化，其导致效应器功能降低，例如CDC和/或ADCC功能降低和/或B细胞杀伤降低。在有些实施方案中，所述DLL4拮抗剂是DLL4免疫粘附素。一方面，本发明提供了包含一种或多种DLL4拮抗剂和载体的组合物。一方面，所述载体是药学可接受的。在有些实施方案中，所述DLL4拮抗剂是抗DLL4抗体。一方面，本发明提供了用于治疗肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症的组合物，其包含有效量的DLL4拮抗剂和药学可接受载体，其中所述用途包括抗血管发生剂的同时或序贯施用。在有些实施方案中，所述DLL4拮抗剂是抗DLL4抗体。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是抗VEGF抗体(诸如贝伐单抗)。一方面，本发明提供了用于治疗肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症的组合物，其包含有效量的DLL4拮抗剂和药学可接受载体，其中所述用途包括抗10癌剂的同时或序贯施用。在有些实施方案中，所述DLL4拮抗剂是抗DLL4抗体。在有些实施方案中，所述抗癌剂是化疗剂。在有些实施方案中，所述用途还包括抗血管发生剂的同时或序贯施用。在有些实施方案中，所述DLL4拮抗剂是抗DLL4抗体。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是抗VEGF抗体(诸如贝伐单抗)。一方面，本发明提供了一种制品，其包括容器和装在该容器内的组合物，其中所述组合物包含一种或多种DLL4拮抗剂或DLL4激动剂。一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括第一容器，其中装有包含一种或多种DLL4拮抗剂或DLL4激动剂的组合物；和第二容器，其中装有缓冲液。在一个实施方案中，所述緩沖液是药学可接受的。在一个实施方案中，所述DLL4拮抗剂是抗DLL4抗体。另一方面，本发明提供了用于制备组合物的方法，包括将治疗有效量的DLL4拮抗剂或DLL4激动剂与药学可接受载体混合。附图简述图l:DLL4介导的Notch信号传导调节EC增殖。a-c,f，3-D血纤蛋白凝胶中的HUVEC萌芽测定法(sproutingassay)。抗DLL4抗体(YW26.82)或DBZ促进HUVEC萌芽(a)。Ki67染色显示抗DLL4抗体或DBZ引起HUVEC的过度增殖(b)。在存在SF条件化培养基时，抗DLL4抗体或DBZ增加了HUVEC的萌芽(c)。d,h,抗DLL4抗体的系统递送引起EC在新生视网膜中的大量积累。视网膜血管结构(异凝集素染色)的4氐放大率(顶部)和高放大率(底部)的共焦图像(d)。Ki67染色显示在用抗DLL4抗体处理的新生视网膜中EC增殖增加(h)。e,通过固定化DLL4引起的Notch活化抑制HUVEC增殖。f，在存在或没有DBZ时，抗VEGF抗体抑制HUVEC萌芽。g,Notch对VEGFR2的调节。响应以下条件的VEGFR2表达的定量PCR分析HUVEC的3-D血纤蛋白凝胶培养物(7d)中由抗DLL4抗体或DBZ引起的Notch阻断(左边)，或HUVEC的2-D培养物(36hr)中由固定化DLL4引起的Notch活化(右边)。分别使用5吗/ml和0.08(iM的抗DLL4抗体和DBZ(a-c,e-g)。图2:DLL4介导的Notch信号传导调节EC分化。a,在存在抗DLL4抗体或DBZ时，失去了由在血纤蛋白凝胶中生长的HUVEC形成的腔管(lumen)样结构(白箭头)。代替地，芽内高度充满了细胞(黑箭头)。b，Notch对TGF卩2li的调节。响应以下条件的TGFP2表达的定量PCR分析HUVEC的3-D血纤蛋白凝胶培养物(7d)中由抗DLL4抗体或DBZ引起的Notch阻断(左边)，或HUVEC的2-D培养物(36hr)中由固定化DLL4引起的Notch活化(右边)。c,抗DLL4抗体阻断动脉发育。用a平滑肌肌动蛋白(ASMA)和异凝集素染色的新生小鼠视网膜的共焦图像。如图ld所述处理新生小鼠。d，用ASMA和异凝集素染色的成年小鼠视网膜的共焦图像。用PBS或抗DLL4抗体(10mg/kg，每周两次)处理8周龄的小鼠2周。图3:DLL4和/或VEGF的选择性阻断破坏了肿瘤血管发生并抑制了肿瘤生长。a-f,如下肿瘤模型的结果HM7(a)、Colo205(b)、Calu6(c)、MDA-MB-435(d)、MV-522(e)和WEHI3(f)。显示了平均肿瘤体积及SE。g-h，肿瘤血管组织学研究。来自对照、抗DLL4抗体和抗VEGF处理的小鼠的EL4肿瘤切片中的抗CD31免疫组织化学(g)。EL4肿瘤切片中的凝集素灌注和抗CD31染色(h)。i-p，如下肿瘤模型的结果SK-OV-3X1(i)、LL2(j)、EL4(k)、H1299(1)、S認ES-l(m)、MX-1(n)、SW620(。)和LS174T(p)。图4:DLL4/Notch在小鼠肠的稳态中不是必需的。来自对照(a,d，g，j)、抗DLL4抗体(10mg/kg,每周两次，6周)(b,e,h,k)和DBZ(30|imol/kg，每天一次，5天)(c，f,i,l)处理小鼠的小肠的免疫组织化学研究。如H&E(a，b，c)和Alcian蓝(d,e，f)染色所示，DBZ引起杯形细胞对TA群体的替代。这种变化在抗DLL4抗体处理中完全不出现。Ki67(g，h,i)和HES-l(j,k,l)染色还证实抗DLL4抗体未能复制DBZ的效果。图5:抗DLL4抗体的表征。a,抗DLL4抗体(YW26.82)的表位作图。作为C末端人胎盘碱性磷酸酶(AP)融合蛋白表达的一组DLL4突变体的图示。在用纯化的抗DLL4抗体(YW26.82，0.5昭/ml)包被的96孔微量滴定板上测试了含有融合蛋白的293T细胞条件化培养基。使用一步PNPP(Pierce)作为底物和OD405nm吸光度测量来检测所结合的DLL4.AP。b-d,YW26.82对DLL4的选择性结合。如所示的(liig/ml)用纯化的重组蛋白包被96孔NuncMaxiSorp平板。通过ELISA测定法测量YW26.82在指定浓度的结合。使用TMB作为底物和OD450nm吸光度测量用抗人抗体HRP偶联物来检测所结合的抗体。使用抗HER2和重组ErbB2-ECD作为测定对照(b)。经载体、全长DLL4、Jagl或DLL1瞬时转染的293细胞的FACS分析。仅在经DLL4转染的细胞上检测到显著的YW26.82结合(顶部小图)。分别通过重组大鼠Notchl-Fc(rrNotcM-Fc，中间小图)和重组大鼠Notch2-Fc(rrNotch2-Fc,底部小图)来确认Jag1和DLL1的表达。使用2吗/ml的YW26.82、rrNotchl-Fc或rrNotch2-Fc(R&DSystem),接着是山羊抗人IgG-PE(1:500，JacksonImmunoResearch)(c)。抗DLL4抗体阻断DLL4-AP而非DLLl-AP对所包被的rNotchl的结合，且计算IC50为约12nM(左边小图)。抗DLL4抗体阻断DLL4-His而非Jagl-His对所包被的rNotchl的结合，且计算IC50为约8nM(右边小图)(d)。e，YW26.82对内源性表达的DLL4的特异性结合。经对照或DLL4特异性siRNA转染的HUVEC的FACS分析。使用2iig/ml的YW26.82,接着是山羊抗人IgG-PE(1:500，JacksonImmunoResearch)(e)。图6:Notch活化对DLL4的上调。在没有或存在DBZ(0.08jiM)时，通过固定化的C末端加His标签的人DLL4(氨基酸1-404)来刺激HUVEC。刺激后36小时，通过使用抗DLL4抗体的FACS分析来检查内源DLL4表达。发明详述通用技术本文中描述或提到的技术和规程一般得到了冬领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的方法Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual第3版(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y;CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等编(2003));丛书METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))，Harlow和Lane编(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL,及ANIMALCELLCULTURE(R.I.Freshney编(1987))。定义术语"DLL4"(可互换地称为"德耳塔样4"或"5样4"),在用于本文时，除非另有明确说明或者上下文另有说明，指任何天然的或变异的(无论是天然的或合成的)DLL4多肽。术语"天然序列，，明确涵盖天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。术语"野生型DLL4"—般指包含天然存在DLM蛋白13的氨基酸序列的多肽。术语"野生型DLL4序列"一般指在天然存在DLL4中发现的氨基酸序列。术语"Notch受体"(可互换地称为"Notch"),在用于本文时，除非另有明确说明或者上下文另有说明，指任何天然的或变异的(无论是天然的或合成的)Notch受体多肽。人具有四种Notch受体(Notchl、Notch2、Notch3、和Notch4)。在用于本文时，术语Notch受体包括所有四种人Notch受体或任一种。术语"天然序列，，明确涵盖天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。术语"野生型Notch受体"一般指包含天然存在Notch受体蛋白的氨基酸序列的多肽。术语"野生型Notch受体序列"一般指在天然存在Notch受体中找到的氨基S臾序列。"DLL4核酸"指编码上文所定义的DLL4多肽的RNA或DNA，或者在严长度大于约10个核苷酸的RNA或DNA。严格条件如下(1)为洗涤采用低离子强度和高温度，例如0.15MNaCl/0.015M柠檬酸钠/0.1%NaDodS04，于50°C，或(2)在杂交期间使用变性剂，诸如曱酰胺，例如50%(vol/vol)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙蹄吡咯烷酮/50mM磷酸钠緩冲液pH6.5及750mMNaCl2,75mM柠檬酸钠，于42。C。"嵌合DLL4"分子指包含融合或键合至异源多肽的全长DLL4或其一个或多个结构域的多肽。嵌合DLL4分子一般会与天然存在DLL4共享至少一种生物学特性。嵌合DLL4分子的一个例子是为纯化目的而带上表位标签的嵌合DLL4分子。另一种嵌合DLL4分子是DLL4免疫粘附素。术语"DLL4免疫粘附素"与术语"DLL4免疫球蛋白嵌合物"可互换使用，指将DLL4分子(天然的或变异的)的至少一部分与免疫球蛋白序列组合起来的嵌合分子。免疫球蛋白序列优选但非必须是免疫球蛋白恒定域(Fc区)。免疫粘附素可拥有人抗体的许多有价值的化学和生物学特性。由于免疫粘附素可以自连接至适宜人免疫球蛋白铰链和恒定域(Fc)序列的具有期望特异性的人蛋白质序列来构建，可以使用完全人的构件来实现感兴趣的结合特异性。此类免疫粘附素对患者具有最低限度的免疫原性，而且对于长期或反复使用是安全的。在有些实施方案中，Fc区是天然序列Fc区。在有些实施方案中，Fc区是变异Fc区。在有些实施方案中，Fc区是功能性Fc区。14已有记载用于治疗用途的同源多聚体(homomultimeric)免疫粘附素的例子包括用于阻断HIV结合细胞表面CD4的CD4-IgG免疫粘附素。自临分娩前给产妇施用CD4-IgG的I期临床试验得到的数据表明这种免疫粘附素在预防HIV的母婴传播方面可能是有用的(Ashkenazi等，Intern.Rev,Immunol.10:219-227(1993))。还已开发了一种结合肿瘤坏死因子(TNF)的免疫粘附素。TNF是一种促炎细胞因子，其已显示为感染性休克的主要介导物。根据感染性休克的小鼠模型，一种TNF受体免疫粘附素已显示出有希望成为治疗感染性休克的临床应用的候选物(Ashkenazi,A.等，PNASUSA88:10535-10539(1991》。ENBREL(依那西普(etanercept),—种包含融合至IgGFc区的TNF受体序列的免疫粘附素)在1998年11月2日经美国食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗类风湿性关节炎。ENBREL⑧在类风湿性关节炎治疗中的新的扩充的用途在2000年6月6日得到FDA的批准。关于TNF阻断剂(包括ENBREL)的最新信息参见Lovell等，N.Engl.J.Med.342:763-169(2000)及第810-811页的同期社论(accompanyingeditorial);Weinblatt等，N.Engl.J.Med.340:253-259(1999);及综述Maini和Taylor,Annu.Rev.Med.51:207-229(2000)。如果免疫粘附素结构的两个臂具有不同的特异性，则该免疫粘附素根据双特异性抗体类推而称为"双特异性免疫粘附素"。Dietsch等，J.Immunol.Methods162:123(1993)记载了这样一种双特异性免疫粘附素，其组合P-选择蛋白、E-选择蛋白和粘附素分子的胞外结构域，其中每一种选择蛋白在自然界中在不同细胞类型中表达。结合研究指出了如此形成的双特异性免疫球蛋白融合蛋白具有与衍生它的单特异性免疫粘附素相比增强的结合髓样细胞系的能力。术语"异源粘附素，，(heteroadhesin)与表述"嵌合异源多聚体粘附素"可互换使用，指嵌合分子(氨基酸序列)的复合物，其中每一种嵌合分子组合一个生物学活性部分(诸如每一种异源多聚体受体单体的胞外结构域)和一个多聚化结构域。"多聚化结构域，，促进异源多聚体复合物内嵌合分子的稳定相互作用。多聚化结构域可以经免疫球蛋白序列、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区、或在嵌合异源多聚体的嵌合分子间形成分子间二石充4建的游离硫醇而相互作用。多聚化结构域可包含免疫球蛋白恒定区。另外，多聚化区可进行改造，使得空间相互作用不仅促进稳定的相互作用，而且还促进自单体混合15物形成异源二聚体多过同源二聚体。通过将第一多肽的界面上的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建"隆起"(protuberance)。任选通过将大氨基酸侧链用较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面上创建与隆起大小相同或相似的补偿性"空腔"(cavity)。免疫球蛋白序列优选但非必须是免疫球蛋白恒定域。本发明的嵌合物中的免疫球蛋白模块可以自IgG、、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM，但优选lgC^或IgG3获得。术语"Fc区"在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都^^皮消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群、及混合了有K447残基的抗体和没有K447残基的抗体的抗体群。除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)(明确收入本文作为参考)中的EU索引的编号方式。"如Kabat中的EU索引"指人IgGlEU抗体的残基编号方式。"功能性Fc区，，拥有天然序列Fc区的"效应器功能，，。例示性的"效应器功能，，包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文中所>开的。"天然序列Fc区"包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgGlFc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区；以及它们的天然存在变体。"变异Fc区，，包含由于至少一处氨基酸修饰(优选一处或多处氨基酸替代)而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然16序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约l处至约10处氨基酸替代，优选约l处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80°/。的同源性，最优选与它们具有至少约90%的同源性，更优选与它们具有至少约95%的同源性。"分离的"抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(l)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%,最优选内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用Coomassie蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。术语"抗体，，和"免疫球蛋白，，以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。"可变的，，指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取(3-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成(3-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR—起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD.(1991))。桓定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的(细胞)毒性中抗体的参与。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，17各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的"FC"片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。"Fv"是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链可在与双链Fv种类类似的"二聚体，，结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊推动物物种的抗体(免疫球蛋白)的"轻链"可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(人)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类IgA、1gD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作a、5、s、y和P。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。"抗体片段"只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、说明书第16/93页ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。术语"高变区"、"HVR"或"HV"在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体.包含六个高变区三个在VH中(Hl、H2、H3),三个在VL中(Ll、L2、L3)。本文中4吏用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5片反,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991》。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表KabatCDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到OxfordMolecuIar的AbM抗体建模软件的使用。"接触(contact)"高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。环LIHIHIKabatL24-L34L50-L56L89-L97H31-H35BAbML24-L34L50-L56L89-L97H26-H35B(Kabat编号方式)H31-H35H26-H35(Chothia编号方式)H50-H65H50-H58H95-H102H95-H102ChothiaL26-L32L50-L52L91-L96H26-H32H26-H32接触L30-L36L46-L55L89-L96H30-H35BH30-H35H2H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58113H95-H102H95-H102H96-H101H93-H101高变区可包括如下"延伸的高变区"VL中的24-36或24-34(Ll)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(Hl)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。"框架，，或"FR"残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。19术语"单克隆抗体"在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语"单克隆"表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler等，Nature256:495(I975);Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版,1988;Hammerling等,于MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas,563-681,Elsevier,N.Y.,1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等，Nature352:624-628(1991);Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991);Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等，Nature362:255-258(1993);Bmggemann等，YearinImmuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,806;5,569,825;5,591,669(都属于GenPharm);5,545,807;WO1997/17852;美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg等,20Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-813(1994);Fishwild等，NatureBiotechnology14:845-851(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996);Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995》。非人(例如鼠)抗体的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。"嵌合"抗体(免疫球蛋白)中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相'同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。"单链Fv"或"scFv，，抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，SCFV多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun,在Rosenburg和Moore编的《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》第113巻中，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)。"抗原"指抗体可选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合21物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。优选地，靶抗原是多肽。术语"双抗体(diabody)"指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(Vh-Vl)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VO。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP404,097;WO93/11161;Hollinger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。"人抗体"指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。"亲和力成熟的，，抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体会具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994);Schier等，Gene169:147-155(1995);Yelton等，J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等，J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins等，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。抗体"效应器功能"指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，，或"ADCC，，指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的耙细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体"武装"(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRII和FcyRIII。Ravetch22和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR^达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6'737，056中所然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。"人效应细胞"指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcYRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以,人天然来源例如血液分离。"Fc受体，，或"FcR，，描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(Y受体)，包括FcyRI、FcyRII和FcYRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FqRII受体包括FcryRIIA("活化受体")和FcryRHB("抑制受体")，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcYRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcYRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Dagron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet,A画.Rev.Immunol.9:457-492(1991》Capel等，Imm画methods4:25-34(1994);deHaas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。术语"FcR，，在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn,它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976);Kim等，J.Immunol.24:249(1994))并调节免疫球蛋白的稳态。WO00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入该专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie1997,Hinton2004)。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的经转染的人细胞系或转基因小鼠中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。23"补体依赖性细胞毒性"或"CDC"指存在补体时对耙细胞的溶解。经典补体途径的敖活是由补体系统第一组分(Clq)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的Clq结合能力的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551Bl和WO99/51642。在此明确收入那些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等，J.Immunol.164:4178-4184(2000)。"含Fc区多肽"指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素(见下文定义)。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化多肽的过程中或者通过重组改造编码多肽的核酸。因而，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。"阻断性"抗体或"拮抗性"抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性。"长期"施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。"间歇"施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。"病症"或"疾病"指任何会受益于本发明的物质/分子或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肺瘤；癌瘤、母细胞瘤和肉瘤。术语"细胞增殖性病症"和"增殖性病症"指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。"月中瘤"在用于本文时指所有肿瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语"癌症"、"癌性"、"细胞增殖性病症"、"增殖性病症"和"肺瘤"在本文中提到时并不互相排斥。术语"癌症"和"癌性"指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、24非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌.胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管发生失调可导致可通过本发明的组合物和方法来治疗的许多病症。这些病症包括非赘生性的和赘生性的疾患。赘生性疾患包括但不限于上文所描述的那些。非赘生性病症包括但不限于不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、4艮屑病、4艮屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、新血管性青光眼、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成(发红)、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯氏(Grave)病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignantpulmonaryeffusion)、脑水肺(例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的)、滑液炎症(synovialinflammation)、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多嚢卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rdspacingoffluiddiseases)(膽J^炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫纤维瘤(uterinefibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD(克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长(非癌症)、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎有关的)和胸腔积液。在用于本文时，"治疗"或"处理"指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、减緩疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。"个体，，指脊推动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。为了治疗目的，"哺乳动物"指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是，哺乳动物指人。"有效量，，指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的曰f。物质/分子的"治疗有效量"可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。"预防有效量，，指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量会低于治疗有效量。术语"细胞毒剂，，在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如曱氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新石咸(vincristine)、长春石咸(vinblastine)、依才乇泊苦(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。"化疗剂"指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents),诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide);石黄酸步克基酯类(alkylsulfonates),i者如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)牙口。底泊舒凡(piposulfan);氮丙卩定类(aziridines)，i者i口苯佐替派(benzodepa)、卡波酉昆(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑石克4弋石粦酰胺(triethylenethiophosphoramide)26和三羟曱蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));S-9-四氢屈大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酉分(dronabinol),MARINOL);(3-^立帕酉昆(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦月旨酸(betulinicacid);喜树石威(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(IIYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东K菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(pod叩hyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊脊(teniposide);隐条素类(cryptophycins)(净争另ll是隐藻素l和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1陽TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每纟帛承卩素(spongistatin);氛芥类(nitrogenmustards),i者力口笨丁酉臾氛芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧口定氮芥(uracilmustard);亚石肖脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类，诸如歸二炔类抗生素(enediyne)(例如力。利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素YlI和加利车霉素coIl(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克4立霉素(aclacinomycin)、》文线菌素(actinomycin)、孝、茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin),放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、；也4乇比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epimbicin)、依索27t匕星(esorubicin)、j尹达t匕星(idarubicin)、麻西罗審素(marcellomycin)、丝裂審素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、揪榄霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、《连佐星(streptozocin)、杀纟吉才亥菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗^/i射物类，诸如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、曱氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物，诸如氟达4立滨(fludarabine)、6-统u基嘌p令(mercaptopurine)、石克口米嘌口令^"^:wk;m八^工*口麥口y6v/Wi;八/"r，、n"^;v^八、,ff-念口々来乂、,'，4^-r'lJir^^Lri^/Jt;^r/"rtnn:+n"u:np、V"u"uupiuiv^、刁、7、"iiugui"ui丄n乂，化y^:7V，w,一一入wIC-W穴、CUl"L"L/lllC,、阿扎胞苦(azacitidine)、6-氮尿苦、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿芬(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苦(floxuridine);名,;敫素类，i者如卡鲁睾酉同(calusterone)、丙酸屈4也名,酉同(dromostanolonepropionate)、表石克#:醇(epitiostanol)、美力食烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸^卜充剂，诸如亚叶酸(folinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酉交(aminolevulinicacid);恩、尿口密口定(eniluracil);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defofamine);地美可辛(demecolcine);地吖西昆(diaziquone);elfornithine;依利醋按(elliptiniumacetate);埃坡霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidainine);美登木素生物石威类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)禾口安丝菌素(ansamitocin);米4乇脈月宗(mitoguazone);米4乇'宽、酉昆(mitoxantrone);莫喊达醇(mopidamol);二/法》肖吖p定(nitracrine);喷司1也丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);p比柔比星(pirarubicin);洛索蒽敏(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK⑧多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);虫累》走4者(spirogermanium);纟田交《连孑包菌S同卧复(tenuazonicacid);三亚胺醌(triaziquone);2，2'，2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、祝孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素28(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);达卡巴口秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);。底泊溴》克(pipobroman);gacytosine;阿糖胞普(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);类紫杉醇(taxoids),例i口TAXOL⑧帕利4也塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米茅贞斗立剂型巾白牙'H也塞(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR);6-硫鸟嘌呤(thioguanine);巯基噤呤(mercaptopurine);曱氨虫莱呤(methotrexate);粕类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡4白(carboplatin);长春石咸(vinblastine)(VELBAN);铂；依托泊芬(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新石咸(vincristine)(ONCOVIN);奥沙利柏(oxaliplatin);亚叶酸(leucovorin);长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE);能灭瘤(novantrone);依达曲沙、(edatrexate);道i若霉素(daunomycin);氨基虫莱口令(aminopterin);伊本膦酸盐(ibandronate);拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟曱基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸(retinoids),诸如视黄酸(retinoicacid);卡培他滨(capecitabine)(XELODA);任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、EVISTA⑧雷洛昔芬(raioxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD);功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如LUPRON⑧和ELIGARD醋Si亮丙瑞林(leuprolideacetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酉交布舍瑞4木(buserelinacetate)和曲普瑞4木(triptorelin);其它4元29雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸曱地孕酉同(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗峻(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、DIDROCAL⑧依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、ZOMETA⑧唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX阿伦膦酸盐(alendronate),AREDIA⑧帕米膦酸盐(pamidronate)、SKEL1D⑧替鲁膦酸盐(tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸盐(risedronate);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗，诸如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN⑧拓朴异构酶l抑制剂；ABARELIX⑧rmRH;lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016);及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。"生长抑制剂，，在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(诸如表达DLL4的细胞)生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞(诸如表达DLL4的细胞)百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春石咸(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓朴异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴口秦(dacarbazine)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《TheMolecularBasisofCancer》，Mendelsohn和Israel编，第l章，题为"Cell30cycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs",Murakaini等人,WBSaunders,Philadelphia,1995，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))都是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer)是巾自利他塞(TAXOL,Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。"多柔比星(Doxorubicin)"是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-a-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9，10-四氢-6,8,ll-三羟基-8-(羟基乙酰基)-l-曱氧基-5，12-萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione"眼内新血管疾病"指以眼部新血管形成为特征的疾病。眼内新血管疾病的例子包括但不限于增殖性视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、年龄相关黄斑变性(AMD)、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、vonHippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜静脉阻塞(包括视网膜中央静脉阻塞(CRVO))、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、等。疾病的"病理，，包括所有危及患者康乐的现象。例如，这包括但不限于异常的或不可控的细胞生长、转移、对邻近细胞正常机能的千扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平释放、炎性或免疫学应答的抑制或恶化、等。与一种或多种其它治疗剂"联合"施用包括同时(共同)施用和任何次序的序贯施用。"载体"在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH緩沖水溶液。生理学可接受载体的例子包括緩冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和31PLURONICSTM。"脂质体，，指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物(诸如DLL4多肽或其抗体)的小嚢泡。脂质体的成分通常排列成双层形式，与生物膜的脂质排列相似。术语"VEGF，，和"VEGF-A"可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子及相关的121个、145个、183个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung等，Science246:1306(1989);Houck等,Mol.Endoci'in.5:1806(1991);及Hobinson和Stringer,JournalofCellScience,144(5):853-865(2001)所述，及其天然存在等位形式和加工形式。"VEGF拮抗剂"指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与一种或多种VECiF受体的结合)的分子。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂(诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂)、及融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron)、VEGF121-gelonin(Peregrine))。VEGF拮抗剂还包括VEGF的拮抗性变体、针对VEGF的反义分子、RNA适体(aptamer)、和针对VEGF或VEGF受体的核酶(ribozyme)。"VEGF抗体"指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。抗VEGF抗体可在把向和干预其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。参见例如美国专利6，582,959;6,703,020;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;WO2005/044853;EP0666868B1;美国专利申请20030206899，20030190317,20030203409,20050112126，20050186208,和20050112126;Popkov等，JournalofImmunologicalMethods288:149-164(2004);及W02005012359。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如P1GF、PDGF或bFGF。抗VEGF抗体"贝伐单抗"(bevacizumab,BV)，也称为"rhuMAbVEGF"或"Avastin⑧"，是依照Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgGl框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgGl，而大约7%的序列衍生自鼠抗体A4.6丄贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体(包括抗VEGF抗体片段"ranibizumab"，也称为"Lucentis⑧")进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。术语"生物学活性"和"有生物学活性的"就DLL4多肽而言指与DLL4有关的物理/化学特性和生物学功能。在有些实施方案中，DLL4"生物学活性，，包括下列一项或多项结合Notch受体(例如Notchl、Notch2、Notch3、Notch4);活化Notch受体；和激活Notch受体下游分子信号传导。在此语境中，术语"调控"包括^1进和抑制二者。"DLL4拮抗剂"指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰DLL4活性的分子，包括例如降低或阻断Notch受体活化、降低或阻断Notch受体下游分子信号传导、破坏或阻断Notch受体结合DLL4、和/或促进内皮细胞增殖、和/或抑制内皮细胞分化、和/或抑制动脉分化。DLL4拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、拟肽(peptidomimetics)、药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、等等。拮抗剂还包括蛋白质的小分子抑制剂、和融合蛋白、特异性结合蛋白质由此隔绝该蛋白质结合其靶物的受体分子及其衍生物、蛋白质的拮抗性变体、针对蛋白质的siRNA分子、针对蛋白质的反义分子、RNA适体、和针对蛋白质的核酶。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂是结合DLL4并中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰DLL4生物学活性的分子。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂是结合Notch受体(诸如Notchl、Notch2、Notch3和/或Notche4)并中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰DLL4生物学活性的分子。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂调控DLL4相关效应的一个或多个方面，包括但不限于下列任何一项或多项降低或阻断Notch受体活化，降低或阻断Notch受体下游分子信号传导，破坏或阻断Notch受体结合DLL4，和/或促进内皮细胞增殖，和/或抑制内皮细胞分化，和/或抑制动脉分化，和/或抑制肿瘤血管灌注，和/或治疗和/或预防肿瘤、细胞增殖性病症或癌症，和/或治疗或预防与DLL4表达和/或活性有关的病症，和/或治疗或预防与Notch受体表达和/或活性有关的病症。术语"抗肿瘤组合物"指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如"抗癌剂"。治疗剂(抗癌剂，在本文中也称为"抗肿瘤剂")的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、毒素、和其它用于治疗33癌症的药剂例如抗VEGF中和性抗体、VEGF拮抗剂、抗HER-2、抗CD20、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂、erlotinib、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受体中的一种或多种结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、血小板衍生生长因子(PDGF)和/或干细胞因子(SCF)的受体酪氨酸激酶的抑制剂(例如曱磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(GleevecNovartis))、TRAIL/Apo2L、及其它生物活性和有机化学剂等。术语"前体药物"或"药物前体"在用于本申请时指与母药(parentdrug)相比对肺瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体或衍生物形式药用活性物质。参见例如Wilman，"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14，pp.375-382,615thMeetingBelfast(1986)及Stella等,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",DirectedDrugDelivery,Borchardt等编，pp.247-267，HumanaPress(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸根前体药物、含硫代磷酸根前体药物、含硫酸根前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含P-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转变为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。"血管发生因子"或"血管发生剂"指刺激血管发育，例如^1进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、P1GF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、T正配体(血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、DLL4等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族成员、及TGF-oc和TGF-13。参见例如Klagsbrun和D，Amore，Annu.Rev.Physiol.53:217-39(1991);Streit和Detmar,Oncogene22:3172-3179(2003);Ferrara和Alitalo，NatureMedicine5(12):1359-1364(1999);Tonini等,Oncogene22:6549-6556(2003)(例如列举血管发生因子的表l);及Sato,Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(2003)。"抗血管发生剂，，或"血管发生抑制剂，，指或是直接或是间接抑制血管发生34(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透'l"生的小分子量物质、多核苷酸(包括例如抑制性RNA,即RNAi或siRNA)、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、或阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinibmalate)、AMG706或例如国际专利申请WO2004/113304中所记载的那些)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun禾口D'AmoreAnnu,Rev.Physiol.53:217-39(1991);'Streit牙口DetmarOncogene22:3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3);Ferrara禾口AlitaloNatureMedicine5(12):1359-1364(1999);Tonini等Oncogene22:6549-6556(2003)(例如列举抗血管发生因子的表2);及Sato,Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。本发明的方法和组合物本发明部分基于下述发现，即用调控Notch受体途径的德耳塔样4(可互换地称为"DLL4")活化的试剂进行的处理抑制血管发育。用DLL4拮抗剂进行的处理导致血管结构(包括肿瘤血管结构)中增加的内皮细胞(EC)增殖、不当的内皮细胞分化、和不当的动脉发育。惊人地，用抗DLL4抗体进行的处理导致对数种不同癌症中肿瘤生长的抑制。不限于理论，认为增加的EC增殖和削弱的EC分化导致不当的肺瘤血管功能，导致对肿瘤生长的抑制。因而，认为DLL4拮抗剂展示了用于治疗癌症的广泛有效方法。因而，本发明提供了用于调控(例如促进或抑制)牵涉血管发生的过程和用于靶向与血管发生有关的病理疾患(诸如癌症)的方法、组合物、试剂盒和制品。依照本发明，DLL4调控剂和/或DLL4调控剂和其它治疗剂的组合可用于治疗多种病症。因而，本发明涵盖使用有效量的DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体或DLL4免疫粘附素)抑制Notch受体(诸如Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4)的DLL4活化来抑制血管发生的方法。另一方面，本发明提供了抑制血管发35生的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂能够促进内皮细胞增殖、抑制内皮细胞分化、抑制动脉发育、和/或降低血管灌注。另一方面，本发明提供了刺激内皮细胞增殖、抑制内皮细胞分化、抑制动脉发育、和/或抑制肿瘤血管灌注的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂。要用DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)治疗的赘生性病症的例子包括但不限于本文中术语"癌症"和"癌性"下所描述的那些。适合于用本发明中有用的拮抗剂治疗的非贅生性疾患包括但不限于例如不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、源自心肌梗死的水肺、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、新生血管性青光眼、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成(发红)、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、曱状腺增生(包括格雷夫斯氏(Grave)病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignantpulmonaryeffusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的)、滑液炎症、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多嚢卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rdspacingoffluiddiseases)(膽J^炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫纤维瘤(uterinefibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD(克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长(非癌症)、肥胖症、脂肪组织块生长、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎有关的)和胸腔积液。用DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)治疗的病症的其它例子包括上皮的或心脏的病症。DLL4的调控剂(例如DLL4的激动剂或活化剂')可用于治疗病理疾患。在有些实施方案中，DLL4的调控剂(例如DLL4的激动剂)可用于治疗其中希望抑制血管发生的病理病症。DLL4的调控剂(例如DLL4激动剂)还可用于治疗其中希望血管发生或新血管形成和/或肥大的病理病症，其包括但不限于例如血管损伤、伤口、撕裂、切口、烧伤、溃疡(例如糖尿病性溃疡、压迫性溃疡、血友病溃疡、静脉曲张性溃疡)、组织生长、体重增加、周围动脉病、引产、毛发生长、大疱性表皮松解症、视网膜萎缩、骨折、骨脊柱融合(bonespinalfusion)、半月板撕裂等。联合疗法如上所述，本发明^是供了耳关合疗法，其中DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)或DLL4激动剂与另一疗法一起施用。例如，DLL4拮抗剂与抗癌剂或抗血管发生剂联合使用以治疗各种赘生性或非赘生性疾患。在一个实施方案中，所述赘生性或非赘生性疾患的特征在于与异常或不想要的血管发生有关的病理学病症。DLL4拮抗剂可以与对那些目的有效的另一药剂顺次或联合施用，或是在同一组合物中或是作为分开的组合物。或者/另外，可以施用DLL4的多种抑制剂。DLL4拮抗剂(或DLL4激动剂)和其它治疗剂(例如抗癌剂、抗血管发生剂)的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或者作为两种或更多不同的组合物，使用相同或不同的施用路径。或者/另外，施药可以以任一次序顺次进行。或者/另外，所述步骤可以作为顺次施药和同时施药二者的任何次序的组合来实施。在某些实施方案中，两次或更多组合物施用之间可以有范围为数分钟、至数天、至数周、至数月的时间间隔。例如，可以先施用抗癌剂，接着是DLL4拮抗剂。然而，也涵盖同时施用或先施用DLL4拮抗剂。因而，一方面，本发明提供了如下方法，其包括施用DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)，接着施用抗血管发生剂(诸如抗VEGF)。在某些实施方案中，两次或更多组合物施用之间可存在范围为数分钟、至数天、至数周、至数月的时间间隔。与DLL4拮抗剂(或DLL4激动剂)联合施用的治疗剂的有效量取决于医师或兽医的判断。完成剂量施用和调整以实现对待治疗疾患的最大控制。此外剂量取决于诸如待使用的治疗剂的类型和所治疗的特定患者等因素。抗癌剂的合适剂量就是当前所用的那些，而且可以由于抗癌剂与DLL4拮抗剂的联合作用(协同)而降低。在某些实施方案中，抑制剂的组合增强单一抑制剂的功效。术语"增强"指治疗剂在其常用或批准的剂量功效得到提高。还可参见本文中标题为"药用组合物"的部分。37典型的是，DLL4拮抗剂和抗癌剂适于相同或相似的疾病以阻断或降低病理学病症，诸如肺瘤、癌症、或细胞增殖性病症。在一个实施方案中，所述抗癌剂是抗血管发生剂。与癌症有关的抗血管发生疗法是致力于抑制为支持肿瘤生长而提供养分所需要的肿瘤血管发育的癌症治疗策略。因为血管发生牵涉原发性肿瘤生长和转移二者，所以本发明提供的抗血管发生治疗不但能够在原发性位点抑制肿瘤的赘生性生长，而且能够预防肺瘤在继发性位点的转移，从而容许由其它治疗剂攻击肿瘤。本领域已经筌定和知道许多抗血管发生剂，包括本文所列的那些，例如定义中所列的，还可参见例如Carmeliet和Jain，Nature407:249-257(2000);Ferrara等,NatureReviews:DrugDiscovery,3:391-400(2004);SatoInt.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)。还可参见美国专利申请US20030055006。在一个实施方案中，DLL4拮抗剂与抗VEGF中和性抗体(或片段)和/或另一VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂(包括但不限于例如可溶性VEGF受体(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR陽3、neuropillins(例如NRP1、NRP2))片段)、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制剂、VEGF的反义策略、针对VEGF或VEGF受体的核酶、VEGF的拮抗性变体、及其任意组合联合使用。或者/另外，任选的是，可以在VEGF拮抗剂和其它药剂外对患者共施用两种或更多血管发生抑制剂。在某些实施方案中，可以与DLL4拮抗剂、VEGF拮抗剂和抗血管发生剂联合施用一种或多种别的治疗剂，例如抗癌剂。在本发明的某些方面，可用于DLL4拮抗剂(或DLL4激动剂)的联合肿瘤疗法的其它治疗剂包括其它癌症疗法(例如手术、放射学治疗(例如牵涉照射或施用放射性物质)、化疗、本文所列和本领域知道的抗癌剂的治疗、或其组合)。或者/另外，结合本文披露的相同抗原或两种或更多本文披露的不同抗原的两种或更多抗体可以共施用于患者。有时，还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。化疗剂一方面，本发明提供了治疗病症(诸如肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症)的方法，其通过施用有效量的DLL4拮抗剂(或DLL4激动剂)和/或血管发生抑制剂和一种或多种化疗剂来实现。多种化疗剂可用于本发明的联合治疗方38法。本文在"定义"中提供了所设想的化疗剂的例示性和非限制性列表。DLL4拮抗剂和化疗剂的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或者作为两种或更多不同的组合物，使用相同或不同的施用路径。或者/另外，施药可以以任一次序顺次进行。或者/另外，所述步骤可以作为顺次施药和同时施药二者的任何次序的组合来实施。在某些实施方案中，两次或更多组合物施用之间可以有范围为数分钟、至数天、至数周、至数月的时间间隔。例如，可以先施用化疗剂，接着是DLL4拮抗剂。然而，也涵盖同时施用或先施用DLL4拮抗剂。因而，一方面，本发明提供了如下方法，其包括施用DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体)，接着施用化疗剂。在某些实施方案中，两次或更多组合物施用之间可存在范围为数分钟、至数天、至数周、至数月的时间间隔。正如本领域普通技术人员会理解的，化疗剂的适宜剂量一般会在单独或联合其它化疗剂施用该化疗剂的临床疗法中早就采用的那些剂量附近。根据所治疗的疾患，剂量有可能发生变化。施行治疗的医师能够为受试者个体确定适宜的剂量。复发性肺瘤生长本发明还提供了用于抑制或预防复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。复发性肺瘤生长或复发性癌细胞生长用于描述正在接受一种或多种当前可用疗法(例如癌症疗法，诸如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物学疗法/免疫疗法、抗VEGF抗体疗法，特別是特定癌症的标准治疗方案)或用一种或多种当前可用疗法治疗过的患者在临床上不足以治疗该患者或不再由该疗法取得任何有益效果使得这些患者需要别的有效疗法的状况。在用于本文时，该表述还指"无响应/顽固性"患者的状况，例如描述患者对疗法有响应但遭受副作用、形成抗性、对疗法不响应、对疗法的响应不令人满意等。在各种实施方案中，癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，其中癌细胞数目没有显著的减少，或者增多了，或者肿瘤尺寸没有显著的缩小，或者增大了，或者癌细胞的尺寸或数目未能任何进一步缩小或减少。确定癌细胞是否是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长可以在体内或在体外进行，通过本领域知道的用于测定治疗对癌细胞有效性的任何方法，在这样的语境中使用本领域公认的"复发性"或"顽固性"或"无响应"的含义。对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤是复发性肺瘤生长的一个例子。本发明提供了在受试者中阻断或降低复发性肿瘤生长或复发性癌细胞39生长的方法，其通过施用一种或多种DLL4拮抗剂(或DLL4激动剂)以阻断或降低受试者中的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长来实现。在某些实施方案中，可以在癌症治疗剂之后施用拮抗剂。在某些实施方案中，与癌症疗法同时施用DLL4拮抗剂。或者/另外，DLL4拮抗剂疗法与另一癌症疗法交替施行，这可以以任意次序进行。本发明还涵盖施用一种或多种抑制性抗体来预防癌症在有癌症素因的患者中发作或复发的方法,。一般地，所述受试者当前正在接受癌症疗法。在一个实施方案中，癌症疗法是使用抗血管发生剂的治疗，例如VEGF拮抗剂。抗血管发生剂包括本领域知道的那些和本文定义中所列的那些。在一个实施方案中，抗血管发生剂是抗VEGF中和性抗体或片段(例如人源化A4.6.1、AVASTIN(Genentech，SouthSanFrancisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。参见例如美国专利6，582，959,6,884,879，6,703,020;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;EP0666868B1;美国专利申请20030206899,20030190317,20030203409，20050112126;Popkov等，JournalofImmunologicalMethods288:149-164(2004);及W02005012359。别的药剂可以与VEGF拮抗剂和DLL4拮抗剂联合施用以阻断或降低复发性胂瘤生长或复发性癌细胞生长，例如见本文中标题为"联合疗法"的部分。DLL4DLL4是一种跨膜蛋白质。胞外区包含8个EGF样重复，以及在所有Notch配体间保守且是受体结合所必需的DSL结构域。预测的蛋白质还包含跨膜区，和缺乏任何催化基序的胞质尾。人DLL4蛋白是685个氨基酸的蛋白质，包含以下区域信号肽(氨基酸l-25);MNNL(氨基酸26-92);DSL(氨基酸155-217);EGF样(氨基酸221-251);EGF样(氨基酸252-282);EGF样(氨基酸284-322);EGF样(氨基酸324-360);EGF样(氨基酸366-400);EGF样(氨基酸402-438);EGF样(氨基酸440-476);EGF样(氨基酸480-518);跨膜(氨基酸529-551);胞质结构域(氨基酸552-685)。DLL4核酸和氨基酸序列是本领域已知的，而且在本文中有进一步讨论。编码DLL4的核酸序列可利用所需DLL4区域的氨基酸序列来设计。或者，可使用DLL4的cDNA序列(或其片段)。人DLL4的登录号是NM—019074，而小鼠DLL4的登录号是NM—019454。DLL4结合Notch受体。进化上保守的Notch途径是许多发育过程以及出生后自我更新器官系统的关键调节物。从无脊推动物到哺乳动物，Notch信号传导引导细胞通过无数的细胞命运决定，并影响增殖、分化和凋亡(Miele和Osborne,1999)。Notch家族由结构上保守的细胞表面受体组成，该受体由DSL基因家族的膜结合配体活化(来自果蝇(Drosophila)的称为德耳塔(Delta)和锯齿(Serrate)，来自秀丽线虫(C.elegans)的称为Lag-2)。哺乳动物具有四种受体(Notchl、Notch2、Notch3、Notch4)和五种配体(Jagl、Jag2、DLL1、D113和DLL4)。在被邻近细胞上所呈递的配体活化后，Notch受体发生连续的蛋白水解切割。这导致Notch细胞内结构域(NICD)的释放，其易位入细胞核并与DNA结合蛋白RBP-Jk(也称为CSL，即CBFl/Su(H)/Lag-l)和其它转录辅因子一起形成转录复合物。Notch活化的主要靶基因包括HES(毛发/分裂增强子(Hairy/EnhancerofSplit))基因家族和HES相关基因(Hey、CHF、HRT、HESR)，其继而以组织和细胞类型特异性方式调节下游转录效应物(Iso等，2003;Li和Harris，2005)。DLL4调控物DLL4调控物指调控DLL4活性的分子，例如激动剂和拮抗剂。术语"DLL4激动剂"用于指DLL4的肽和非肽类似物(诸如本文所述多聚化DLL4),及其它试剂，只要它们具有通过天然Notch受体(例如Notchl、Notch2、Notch3、Notch4)发信号的能力。术语"激动剂"在Notch受体的生物学作用的语境中定义。在某些实施方案中，激动剂拥有上文所定义的DLL4的生物学活性，诸如结合Notch受体(例如Notchl、Notch2、Notch3、Notch4)、活化Notch受体、和活化Notch受体下游分子信号传导。在有些实施方案中，DLL4激动剂抑制内皮细胞增殖、促进内皮细胞分化、和/或促进动脉发育。在有些实施方案中，DLL4激动剂抑制血管发育。DLL4调控物是本领域已知的，而且其中一些在本文中有描述和例示。所涵盖的DLL4拮抗剂(诸如抗DLL4抗体和DLL4免疫粘附素)的例示性和非限制性列表在本文中"定义"下提供。可用于本发明的调控物可以通过本领域已知的多种测定法来表征它们的物理/化学特性和生物学功能。在有些实施方案中，DLL4拮抗剂的特征在于下列任何一项或多项结合DLL4，结合Notch受体，降低或阻断Notch受体活化，降低或阻断Notch受体下游分子信号传导，破坏或阻断Notch受体结合DLL4，和/或促进内皮细胞增殖，和/或抑制内皮细胞分化，和/或抑制动脉分化，和/或抑制肿瘤血管灌注，和/或治疗和/或预防肿瘤、细胞增殖性病症41或癌症，和/或治疗或预防与DLL4表达和/或活性有关的病症，和/或治疗或预防与Notch受体表达和/或活性有关的病症。在有些实施方案中，DLL4激动剂的特征在于下列任何一项或多项结合Notch受体(例如Notchl、Notch2、Notch3、Notch4),活化Notch受体，活化Notch受体下游分子信号传导，抑制内皮细胞增殖，促进内皮细胞分化，和/或促进动脉发育。表征DLL4拮抗剂和激动剂的方法是本领域已知的，而且其中一些在本文中有描述和例示。抗体DLL4抗体是本领域已知的，而且其中一些在本文中有描述和例示。抗DLL4抗体优选是单克隆的。本发明的范围还涵盖本文中所提供的抗DLL4抗体的Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')2片段。这些抗体片段可通过传统手段来制备，诸如酶促消化，或者可以通过重组技术来生成。此类抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段可用于下文所列的诊断和治疗目的。单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变。如此，修饰语"单克隆"指明抗体的特征，即不是不同抗体的混合物。本发明的抗DLL4单克隆抗体可使用最初由Kohler等，Nature256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816，567)来制备。在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。DLL4的抗体一^:通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射DLL4和佐剂来生成。DLL4可以使用本领域众所周知的方法来制备，其中有些方法在本文中有进一步描述。例如，DLL4的重组生产在下文中有描述。在一个实施方案中，将动物用包含DLL4胞外结构域(ECD)且其融合至免疫球蛋白重链Fc部分的DLL4衍生物免疫。在一个优选的实施方案中，将动物用DLL4-IgGl融合蛋白免疫。通常将动物针对DLL4的免疫原性偶联物或衍生物和单磷酰脂质A(MPL)/二棒分枝菌酸海藻糖(trehalosedicrynomycolate,TDM)RibiImmunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)进4亍免疫，一,〉容液皮内注射于多个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并对血清测定抗DLL4滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103，AcademicPress,1986)。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄。票呤鸟噤呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄噤呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，California,USA)获得的MOPC-21和MPC-ll小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已描述用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987)。可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对DLL4的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103，AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、43腹水或血清适当分开。抗DLL4抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的合成抗体克隆来制备。在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区片段(Fv)的噬菌体。通过针对期望抗原的亲和层析淘选此类噬菌体文库。表达能够结合期望抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。任何抗DLL4抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，NIHPublication9l-3242，BethesdaMD(l"l),巻1_3中记载的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗DLL4抗体克隆。抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自重链(VL)和轻链(VH),都呈现三个高变环或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的、柔性的肽共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为"Fv噬菌体克隆"或"Fv克隆"。VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库能提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等，EMBOJ,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因片段，使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks等，J.Mol.Biol"222:581-597(1991)所述，或44者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，而另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，在此装配Fab-夕卜壳蛋白结构，其通过取代一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等，Nucl.AcidsRes.，19:4133-4137(1991)所述。一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗DLL4克隆，那么可以给受试者免疫DLL4以产生抗库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗DLL4克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗DLL4抗体应答，使得DLL4免疫产生生成针对DLL4的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的产生在下文中有描述。可以如下获得抗DLL4反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达DLL4特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过用DLL4亲和层析或者细胞对荧光染料标记的DLL4的吸附及后续的流动激活细胞分选(FACS)进行的细胞分离。或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用DLL4在其中没有抗原性的任何动物(人或非人的)物种构建抗体文库。为了体外掺入抗体基因的文库构建，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬；猫、猪、牛、马、和鸟类等)获得感兴趣的免疫细胞。从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA,即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5'末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等，Nature,341:544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子(leaderexon)内，如Jones等，Biotechnol.，9:88-89(1991)所述，正45向引物基于恒定区内，如Sastry等，Proc.Natl.Acad,Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。优选的是，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL排列，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)或Omm等，NucleicAcidsRes.,21:4491-4498(1993)的方法所述。为了将所扩增的DNA克隆到表达载体中，可以在PCRSI物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等，Nature,352:624-628(1991)所述。人工合成的重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson等，J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)),并定位(Matsuda等，NatureGenet.，3:88-94(1993));这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构型)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)所述。人VK和VX区段已经克隆和测序(Williams和Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的轻链全集。基于一系列VH和VL折叠及L3和H3长度的合成的V基因全集会编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe等，Gene，128:119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等，Nucl.AcidsRes.,21:2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分别克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含不同的组合来联合两种文库，库容量只受细胞存在数的限制(约1012个克隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(KcT1为约1(T8M)的多样性抗体。或者，可以将全集依次克隆入同一载体，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，如Clackson等，Nature,352:624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VLDNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，"细胞内PCR装酉己，，用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等，Nucl.AcidsRes.，20:3831-3837(1992)所述。未免疫文库(naivelibrary)(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(Kd-'为约10、10M-')，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建和再次选择次生文库，如Winter等(1994),见上文所述。例如，在Hawkins等，丄Mol.Biol"226:889-896(1992)的方法或Gram等,Proc.Natl,Acad.SciUSA,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung等，Technique,1:11-15(1989))。另夕卜，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO96/07754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的链重新改组中筛选更高亲和力，如Marks等，Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力在10一M范围的抗体和抗体片段。DLL4核酸和氨基酸序列是本领域已知的而且在本文中有进一步讨论。编码DLL4的DNA可以通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于通过Engels等，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28:716-734(1989)中记载的任何方法，诸如三酯、亚磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法进行的化学合成。在一个实施方案中，编码DLL4的DNA的设计中使用表达宿主细胞所优选的密码子。或者，编码DLL4的DNA可以从基因组或cDNA文库分离。构建编码DLL4的DNA分子后，将该DNA分子与表达载体，诸如质粒中的表达控制序列可操作连接，其中所述控制序列受到该载体转化的宿主细胞的识别。一般而言，质粒载体包含复制和控制序列，其衍生自与宿主细胞相容的物种。载体通常携带复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。适于在原核和真核宿主细胞中表达的载体是本领域已知的，有些在本文中有进一步描述。可以使用真核生物体，诸如酵母或衍生自多细胞生物体诸如哺乳动物的细胞。任选的是，编码DLL4的DNA与分泌前导序列可操作连接，导致表达产物被宿主细胞分泌到培养基中。分泌前导序列的例子包括stll、ecotin、lamB、疱渗GD、lpp、碱性磷酸酶、转化酶、和a-因子。适用于此处的还有蛋白A的36个氨基酸的前导序列(Abrahmsen等，EMBOJ.,4:3901(1985))。宿主细胞用上文所述本发明的表达或克隆载体转染，优选转化，并在常规营养培养基中培养，培养基可以为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而适当修改。转染指宿主细胞摄取表达载体，无论任何编码序列事实上是否表达。本领域普通技术人员知道许多转染方法，例如CaP04沉淀和电穿孔。若宿主细胞内存在此载体运转的任何指示，则认为转染成功。用于转染的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有进一步描述。转化指将DNA导入生物体，使得DNA可进行复制，或是作为染色体外元件，或是通过染色体整合。根据所用宿主细胞，使用适于所述细胞的标准技术进行转化。用于转化的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有进一步描述。用于生成DLL4的原核宿主细胞可以如Sambrook等，见上文一般所述进行培养。用于生成DLL4的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养，所述培养基是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。本发明公开的宿主细胞涵盖体外培养物中的细胞以及宿主动物体内的细胞。DLL4的纯化可以使用本领域公认的方法来实现，本文描述了其中一些。纯化的DLL4可以附着于合适的基质，诸如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、羟基曱基丙烯酸酯凝胶、聚丙烯酸和聚曱基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体、诸如此类，用于噬菌体展示克隆的亲和层析分离。DLL4蛋白对基质的附着可以通过MethodsinEnzymology,巻44(1976)中记载的方法来实现。将蛋白质配体附着于多糖基48质，例如琼脂糖、右旋糖苷或纤维素的常用技术牵涉用卣化氰活化载体，随后将肽配体的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶联至活化^T的基质。或者，DLL4可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于本领域已知的用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的DLL4。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理条件。对结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，88:7978-7982(1991)所述，或者用石咸洗脱，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述，或者通过DLL4抗原竟争洗脱，例如在与Clackson等，Nature,352:624-628(1991)的抗原竟争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-l，000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bass等，Proteins,8:309-314(1990)和WO92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marks等，Biotechnol.,10:779-783(1992)所述)来促进。有可能在对DLL4具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些上文所述亲和力成熟技术进行)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制DLL4，罕见的高亲和力噬菌体能竟争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化DLL4—起温育，但是生物素化DLL4的摩尔浓度低于DLL4的目标摩尔亲和常数。然后用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类"平衡捕捉"容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。49抗DLL4克隆可以进行活性选择。在一个实施方案中，本发明提供了阻断Notch受体(诸如Notchl、Notoh2、Notch3和/或Noteh4)与DLL4间结合但不阻断Notch受体与第二蛋白质间结合的抗DLL4抗体。对应于此类抗DLL4抗体的Fv克隆可以如下选择(1)如上所述自噬菌体文库分离抗DLL4克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养群体来扩增所分离的噬菌体克隆群体；(2)对想要阻断活性的DLL4和想要不阻断活性的第二蛋白质进行选择；(3)将抗DLL4噬菌体克隆吸附至固定化的DLL4;(4)使用过量的所述第二蛋白质洗脱任何不想要的克隆，它们识别与所述第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享的DLL4结合决定蔟；并(5)洗脱在步骤(4)后保持吸附的克隆。任选地，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。编码杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重組宿主细胞中获得期望单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.OpinioninImmunol"5:256(1993)及Pluckthim,Immunol.Rev"130:151(1992)。编码Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat等，见上文)以形成编码全长或部分重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA,然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成"杂合的，，全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用"嵌合"和"杂合，，抗体的定义中。在一个优选的实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成完全人的、全长或部分重链和/或轻链的编码序列。还可以修饰编码衍生自杂交瘤的抗DLL4抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA,通过共价接合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有Fc克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的"嵌合"或"杂合"抗体。抗体片段本发明涵盖抗体片段。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);Brennan等，Science229:81(1985》。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185;美国专利No.5,571,894;及5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合物。参见AntibodyEngineering,Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是"线性抗体"，例如如美国专利No.5,641，870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。人源化抗体本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为"输入"残基，它们通常取自"输入"可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-327(1988);Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988)),即用(非人)高变区序列替代人抗体的相应序列。因此，此类"人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567),其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变域的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的"最适(best-fit)"方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等，J.Immunol.151:2296(1993);Chothia等，J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992);Presta等，J.Immunol.151:2623(1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对草巴抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。人抗体人抗DLL4抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成人单克隆抗DLL4抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如KozborJ.Immunol"133:3001(1984);Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987);及Boemer等，J.Immunol"147:86(1991).现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生52成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等，Nature362:255-258(1993);Bruggerma皿等，YearinImmunol.7:33(1993)。基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为"表位印记"(epitopeimprinting),如上所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链恢复了在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后遭到破坏的抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCTWO93/06213，公布于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。双特异性抗体双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体。在本案中，结合特异性之一针对DLL4，另一结合特异性针对任何其它抗原。例示性的双特异性抗体可结合DLL4蛋白质的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达DLL4的细胞。这些抗体拥有DLL4结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-a、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello,Nature305:537(1983))。由于免疫^求蛋白重《涟和轻<涟的随才几分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披53露于WO93/08829,公布于1993年5月13日及Traunecker等，EMBOJ.10:3655(1991)。依照一种不同且更优选的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CHl)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相等比例表达导致高产量时或在该比例没有特別意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，MethodsinEnzymology121:210(1986)。依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性"空腔"。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联或"异源偶联，，抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO91/00360;WO92/00373;和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab，片段转变为硫代硝基苯曱酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肺瘤靶物的溶解活性。还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)记载的"双抗体，，技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(vo,所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补V^和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152:5368(1994)。涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，丄Immunol.147:60(1991)。多价抗体多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体会包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽链可包含VH-CHl-柔性接头-VH-CHl-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。抗体变体在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成而制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体氨基酸序列。可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称为"丙氨酸扫描诱变"，如Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展示出功能敏感性的氨基酸位置。如此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在輩巴密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。56氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请US2003/0157108(Presta,L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见USMO4/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd.)。WO2003/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利No.6,602，684(Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO1997/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO1998/58964(Raju，S.)和WO99/22764(Raju，S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US2005/0123546(Umana等)。本文中的优选糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残基编号方式)。涉及"脱岩藻糖型"或"岩藻糖缺乏型"抗体的出版物的例子包括US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US572003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lecl3CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请号US2003/0157108Al,Presta，L;及WO2004/056312Al，Adams等，尤其是实施例ll)和敲除细胞系，诸如a-l,6-岩藻糖转移酶基因，FUT8,敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004))。另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表2中"优选替代"栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表2中称为"例示替代，，的更多实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。表2原始残基例示替代优选替代Ala(A)Val;Leu;lieValArg(R)Lys;Gin;AsnLysAsn(N)Gin;His;Asp;Lys;ArgGinAsp(D)Glu;AsnGluCys(C)Ser;AlaSerGin(Q)Asn;GluAsnGlu(E)Asp;GinAspGly(G)AlaAlaHis(H)Asn;Gin;Lys;ArgArgHe(I)Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸；lie;Val;Met;Ala;PhelieLys(K)Arg;Gin;AsnArgMet(M)Leu;Phe;lieLeu58<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>异显著的替代来实现(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、亲水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威性的His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基Gly、Pro;及(6)芳香力臭的Trp、Tyr、Phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改良的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。将如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然发生氨基酸序列变体介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。可能希望在免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG,、IgG2、IgG3或lgG4Fc区)。依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，方法中所使用的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如W099/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988);美国专利No.5,648,260;美国专利No.5,624,821;及W094/29351。WO00/42072(Presta)和WO2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG转移给胎儿)(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等，J.Immunol.24:249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基S复序列且Clq结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,55IB1,W099/51642。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)。抗体衍生物可进一步修饰抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-l,3-二氧戊环、聚-1,3，6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗等。筛选具有期望性质的抗体抗体可以用本领域已知的各种测定法对其物理/化学性质和生物学功能进行表征。在有些实施方案中，抗体表征为如下任一项或多项结合DLL4，减弱或者阻断Notch受体活化，减弱或者阻断Notch受体下游分子信号传导，破坏或者阻断Notch受体结合DLL4，和/或促进内皮细胞增殖，和/或抑制内皮细胞分化，和/或抑制动脉分化，和/或抑制肿瘤血管灌注(tumorvascularperfusion),和/或治疗和/或预防肿瘤、细胞增殖性病症或癌症，和/或治疗或预防与DLL4表达和/或活性有关的病症，和/或治疗或预防与Notch受体表达和/或活性有关的病症。纯化的抗体还可以通过一系列测定法进行表征，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。在本发明的某些实施方案中，对此处制备的抗体分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的抗体检验它们的抗原结合活性。本领域下技术的任何直接的或竟争性的结合测定法Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、"夹心式/三明治式"免疫测定法、免测沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。在下面的实施例部分提供例示性的抗原结合测定法。具有本文所述独特特性的抗DLL4抗体可以如下得到，即通过任何便利的方法对抗DLL4杂交瘤克隆筛选期望特性，其中一些在本文中有描述和例示。例如，如果需要阻断或不阻断Notch受体结合DLL4的抗DLL4单克隆抗61体，那么可以在结合竟争测定法中测试候选抗体，诸如竟争性结合ELISA，其中板孔用DLL4包被，将感兴趣Notch受体过量的抗体溶液铺到经过包被的板上，并酶法检测结合的抗体，例如使结合的抗体接触偶联有HRP的抗Ig抗体或生物素化抗Ig抗体并显现HRP显色反应，例如通过用链霉亲合素-HRP和/或过氧化氢使板显色并通过分光光度法用ELISA读板仪在490nm检测HRP显色反应。在有些实施方案中，所述抗体是具有一些但不是全部效应器功能已有变化的抗体，这使其成为许多应用的期望候选物，其中抗体在体内的半衰期4艮重要但某些效应器功能(诸如补体和ADCC)不是必需的或者是有害的。在某些实施方案中，测量所生成的免疫球蛋白的Fc活性以确保只有期望性质得到保留。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺失FqR结合(因此可能缺失ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcYRI、FcyRII和FcyRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464页的表3概述了造血细胞上的FcR表达。美国专利No.5,500,362或5,821，337描述了用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的一个例子。可用于这些测定或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中。也可以进行Clq结合测定法以证实抗体不能结合Clq从而缺失CDC活性。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)所述。也可以利用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定，例如实施例部分所描述的那些。载体、宿主细胞和重组方法为了重组生产抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因性特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源的。应当领会,62任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。a.使用原核宿主细胞生成抗体i.载体构建可使用标准重组技术来获得编码抗体多肽构件的多核普酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核普酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨千青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，如此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利No.5,648，237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的例子。另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如XGEMTM-ll来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。表达载体可包含两种或更多启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5')的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(例如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、P-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist等，Cell20:269(1980))。在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、Pe旧、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌抹(例如大肠杆菌trxB-菌抹)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba和Pluckthun，Gene159:203(1995))。适于表达抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的例子包括埃希氏菌属(EscherichiaX例如大肠埃希氏菌(E.coli))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌属(Enterobacterial假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))物种、鼠伤寒沙门氏菌64(Salmonellatyphimurium)、津占质妙、雷氏菌(Serratiamarcescans)、克雷"f白氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副3求菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌抹的例子包括菌抹W3110(Bachmann,CellularandMolecularBiology,第2巻，Washington,D.C.,美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110AfhuA(AtonA)ptr3lacIqlacL8AompTA(nmpc-fepE)degP41kanR的菌抹33D3(美国专利No.5,639,635)。其它菌抹及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌入1776(ATCC31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC31,608)也是合适的。这些例子只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等，Proteins8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。ii.4元体生成用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化4丐的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孑L。在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成多肽的原核细胞。合适培养基的例子包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luriabroth)。在有些实施方案中，培养基还含有^4居表达载体的构建而选裤:的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围是约20。C至约39。C,更优选约25r至约37。C,甚至更优选约3(TC。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。如果表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因而，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选地，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等，J.Immunol.Methods263:133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定法进一步分离和鉴定所表达多肽。在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵规程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1，000至100，000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(例如OD550约180-220,在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。为了提高多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所66分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴倡活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等，J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999);Georgiou等人，美国专利No.6,083,715;Georgiou等人，美国专利No.6,027,888;Bothmann和Pliickthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);Ramm和PKickthun，J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arie等,Mol.Microbiol.39:199-210(2001))。为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌抹用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌抹，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶ni、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly等，(1998)见上文；Georgiou等人，美国专利No.5,264,365;Georgiou等人，美国专利No.5,508,192;Hara等，MicrobialDrugResistance2:63-72(1996)。在一个实施方案中，在表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌抹作为宿主细胞。抗体纯化可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的规程是合适纯化规程的例示免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如SephadexG-75的凝胶过滤。在一个方面，将固定化在固相上的蛋白A用于全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白A固定化其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异性粘附。作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得感兴趣抗体特异性结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异性结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收感兴趣抗体。b.使用真核宿主细胞生成抗体载体构件通常包括但不限于如下一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。(i)信号序列构件在真核宿主细胞中使用的载体还可在感兴趣成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱渗病毒gD信号。将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。复制起点通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。选择基因构件表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，如此幸免于选4奪方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苦激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，首先通过将所有转化子在含有曱氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竟争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCCCRL-9096)。或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美68国专利No.4,965,199。(iv)启动子构件表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个石咸基处。在许多基因的转录起点上游70至80个石威基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苦酸(SEQIDNO:3)。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号(SEQIDNO:4)。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419，446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601，978中记载了该系统的一种修改形式。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。(v)增强子元件构件常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、a-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。(Vi)转录终止构件在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺普酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。(vii)宿主细胞的选纟奪和转化适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊推动物宿主细胞。脊推动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham等,J.Gen.Virol.36:59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCLIO)、中国仓鼠卵巢细胞ADHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCCCCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL1587)、人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34)、牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)、人肺细胞(W138,ATCCCCL75)、人肝细胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳瘤(MMT060562，ATCCCCL51)、TRI细胞(Mather等,AnnalsN,Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))、MRC5细月包、FS4细胞和人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。(viii)宿主细胞的培养可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基Ham等，Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可根据需要70补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、4丐、镁和磷酸盐)、緩沖剂(诸如HEPES)、核苦酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。(ix)抗体的纯化在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(优选的纯化技术是亲和层析)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人yl、y2、或y4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人y3(Guss等，EMBOJ.5:1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用BakerbondABX丁M树脂(J.T.Baker,Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在任何初步纯化步骤之后，可将含有感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱緩冲液，优选在低盐浓度(例如约O-0.25M盐)进行。71免疫偶联物本发明涵盖包含偶联有细胞毒剂的抗DLL4抗体的免疫偶联物(可互换的称为"抗体-药物偶联物"或"ADC")，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。抗体—药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos和Epenetos，AnticancerResearch19:605-614(1999》Niculescu-Duvaz和Springer,Adv.DrugDel.Rev.26:151-172(1997);美国专利4,975,278)容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肺瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(BaWwin等,Lancet603-05(1986年3月15日)；Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",在《MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报导可用于这些策略(Rowland等，CancerImmunol.Immunother.21:183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、曱氨虫莱p令(methotrexate)和长春；也辛(vindesine)(Rowland等，1986,见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等，Jour,oftheNat.CancerInst.92(19):1573-1581(2000);Mandler等，Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028(2000);Mandler等，BioconjugateChem.13:786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP1391213;Liu等，Pro"Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996))、和加利车霉素(Lode等,CancerRes.58:2928(1998);Hinman等，CancerRes.53:3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓朴异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。ZEVALIN(ibritumomabtiuxetan,Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgGlK单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的'"In或^Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77(2000);Wiseman等，Blood99(12):4336-42(2002);Witzig等，J.Clin.Oncol.20(10):2453-63(2002);Witzig等，J.Clin.Oncol.20(15):3262-69(2002))。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细月包减少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin,WyethPharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(DrugsoftheFuture25(7):686(2000);美国专利No.4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001)。Cantuzumabmertansine(ImmunogenInc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DMl连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(MillenniumPharm.，BZLBiologies,ImmunogenInc.),即由抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatinE(AE)和单曱基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌瘤上的LewisY特异)和cAC10(对血液学恶性肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina等，NatureBiotechnology21(7):778-784(2003)),且正在进行治疗性开发。本文(例如上文)描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴急草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括^Bi、131I、131In、9。Y和版Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡73啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二曱酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯曱酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯曱基-3-曱基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物石威类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。i.美登素和美登木素生物碱类在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的抗体(全长或片段)。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物4,137,230;4，248，870;4,256,746;4,260,608;4，265，814;4,294,757;4，307，016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4，322，348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4，371,533。美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途美国专利No.5,208,020;5,416,064;及欧洲专利EP0425235Bl，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连74接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肺瘤活性。Chari等，CancerResearch52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1_美登木素生物石咸偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3xl()S个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物程度相似的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之棵抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5,208，020或欧洲专利0425235Bl;Chari等,CancerResearch52:127-131(1992);2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述和例示了别的连接基团。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二曱酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡咬基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟曱基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。ii.Auristatin和多4立司〗也汀在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的抗体(美国专利No.5,635,483;5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.AgentsandChemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US5，663，149)和抗真菌活性(Pettitetal(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物才莫块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172)。例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单曱基auristatin药物模块DE和DF，披露于"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands",2004年11月5日提交的美国流水号10/983,340,明确将其公开内容完整收入本文作为参考。典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.Schr6der和K,Liibke，ThePeptides,巻l,pp76-136，1965，AcademicPress)。auristatin/多拉司他汀药物才莫块可依照以下文献中的方法来制备US5,635,483;US5，780，588;Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettit等(1998)Anti-CancerDrugDesign13:243-277;Pettit等Synthesis,1996，719-725;Pettit等(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.15:859-863;及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784;"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands",2004年11月5日提交的美国流水号10/983，340，将其完整收入本文作为参考(披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单曱基缬氨酸化合物的接头和方法)。iii.加利车霉素在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5，770，710;5，773，001;5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于yll、a2I、a3I、N-乙酰基-YlI、PSAG和eil(Hinman等，CancerResearch53:3336-3342(1993);Lode等，CancerResearch58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。iv.其它细胞毒剂可与抗体偶联的其它抗肺瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053，394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草(sapaonariaofficinalis)4卬制物、白才对毒蛋白(gelonin)、丝4木霉素(mitogellin)、局P艮曲菌素(restrictocin)、S^霉素(phenomycin)、依i若霉素(enomycin)牙口单^离77孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。本发明还涵盖抗体和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。例子包括At211、Im、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb^和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc"m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri),诸如碘-123、碟-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、轧、锰或铁。可以已知方式将》文射性标记物或其它标记物4参入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc99m或I123、Re186、Re鹏和In川。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等，Biochem.Biophys.Res，Commun.80:49-57(1978))可用于掺入碘-123。《MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy》(Chatal，CRCPress,1989)详细记载了其它方法。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT),亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二曱酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如l，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的l-异硫氰酸苯甲基-3-曱基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见W094/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的"可切割接头"。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二曱基接头、或含二硫化物接头(Chari等，CancerResearch52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC:商品化(例如购自78PierceBiotechnologyInc.,Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-K画S、sulfo-MBS、sulfo匿SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙蹄基砜)苯曱酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(ApplicationsHandbookandCatalog)第467-498页。v.抗体-药物偶联物的制备在抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物模块(D)偶联，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物模块。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC,包括(l)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L,随后与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC的别的方法。Ab-(L-D)pI接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基("MC")、马来酰亚氨基丙酰基("MP")、缬氨酸-瓜氨酸("val-cit")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")、对氨基节氧羰基("PAB")、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯("SPP")、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l羧酸酯("SMCC)、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯曱酸酯("SIAB")。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands"，2004年11月5日提交的美国流水号10/983，340，将其完整内容收入本文作为参考。在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D,或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。抗体的亲核基团包括但不限于(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、硫醇基、和羟基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卣代曱酸酯、和酸性囟化物；(ii)烃基和苯曱基卣化物，诸如囟代乙酰胺；(iii)酪类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会如此形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体)而将反应性硫醇基导入抗体(或其片段)。还可通过修饰抗体来生成抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子模块。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，BioconjugateChem.3:138-146(1992);US5，362，852)。此类醛可与药物模块或接头亲核体反应。同样，药物模块上的亲核基团包括但不限于胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卣代曱酸酯、和酸性卣化物；(ii)烃基和苯曱基卣化物，诸如囟代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。在又一个实施方案中，可将抗体与"受体"(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肺瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的"配体"(例如亲合素)。对DLL4多肽的共价4务饰多肽拮抗剂或激动剂(例如多肽拮抗剂片段、DLL4融合分子(例如DLL4免疫粘附素)、抗DLL4抗体)的共价修饰包括在本发明的范围内。如果适当，它们可通过化学合成或者通过酶促或化学切割所述多肽来进行。将多肽的其它类型共价修饰引入分子，其通过将多肽的目标氨基酸残基与能够与选定侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂反应，或者通过将修饰后的氨基酸或非天然的氨基酸掺入正在增长的多肽链，例如Ellman等，Meth.Enzym.202:301-336(1991);Noren等,Science244:182(1989);及美国专利申请公开文本20030108885和20030082575。半胱氨酰残基最常见的是与a-卣代乙酸(盐/酯)(和相应的胺)反应，诸如氯乙酸或氯乙酰胺，以得到羧曱基或羧酰氨曱基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴代三氟丙酮、a-溴代-P-(5-imidozoyl)丙酸、氯乙酰基磷酸(盐/酯)、N-烃基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、曱基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯曱酸(盐/酯)、2-氯汞基-4-硝基酚、或氯-7-硝基苯并-2-氧-1,3-二唑反应而衍生化。组氨酰残基通过与二乙基-焦-碳酸(盐/酉旨)在pH5.5-7.0反应而衍生化，因为此试剂相对特异于组氨酰侧链。对溴苯曱酰曱基溴化物(para陽bromophenacylbromide)也是有用的；此反应通常在pH6.0的0.1M二曱月申酸納中进4亍。赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。与这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基电荷的效果。适于衍生化含a-氨基的残基的其它试剂包括亚氨基酯，诸如皮考啉亚氨酸曱酯(methylpicolinimidate)、磷酸吡哆醛酯、吡喷醛、氯硼氪化物、三硝基苯磺酸、O-曱基异脲、2，4-戊二酮、和与乙醛酸(glyoxylate)的转氨^f崔化反应。精氨酰残基通过与一种或数种常规试剂反应来修饰，其中有苯曱酰曱醛(phenylglyoxal)、2，3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化由于胍官能团的高pKa所以需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可81以与赖氨酸以及精氨酸S-氨基反应。酪氨酰残基可以进行特异性修饰，对在酪氨酰残基中引入光谱标记物特别感兴趣，其通过与芳香族重氮化合物或四硝基曱烷反应。最常见的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基曱烷分别形成O-乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。用1251或13'1碘化酪氨酰残基以制备带标记物的蛋白质供放射免疫测定法使用。羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳二亚胺(R-N=C=N-R，)反应而进行选择性修饰，碳二亚胺中的R和R，是不同的烃基，诸如l-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二曱基戊基)碳二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变成天冬酰胺酰和谷酰胺酰残基。谷酰胺酰和天冬酰胺酰残基常常脱酰胺，分别成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围。其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链a-氨基的曱基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co"SanFrancisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C末端羧基的酰胺化。另一类型的共价修饰牵涉向本发明的多肽化学或酶促偶联糖苷。这些规程的优点在于它们不需要在具有N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生多肽。取决于所使用的偶联模式，可以将糖附着于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基诸如半胱氨酸的巯基，(d)游离羟基诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基，(e)芳香族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法可参阅1987年9月11日公布的WO87/05330及Aplin和Wriston,CRCCrit.Rev.Biochem.pp.259-306(1981)。本发明多肽上存在的任何碳水化合物模块的消除可通过化学或酶促方法实现。化学的脱糖基化作用需要使多肽暴露于化合物三氟曱磺酸或等效化合物。此处理导致除连接糖(linkingsugar)(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整。化学的脱糖基化作用参阅Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)及Edge等，Anal.Biochem.118:131(1981)。例如抗体上的，碳水化合物才莫块的酶促切割可通过82使用多种内切和外切糖苷酶来实现，参阅Thotakura等，Meth.Enzymol.138:350(1987)。本发明多肽的另一类型的共价修饰包括将多肽连接至多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美国专利No.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791，192或4,179，337所列方式。药用配制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy第20片反(2000))〉'昆合来制备水溶液、冻干或其它干燥配制剂形式的包含抗体的治疗用配制剂，供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓沖剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二曱基千基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯曱醇；对羟基苯曱酸烃基酯，诸如对羟基苯曱酸曱酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微胶嚢)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)、或粗滴乳状液。此类^支术4皮露于例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy第20版(2000)。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过83滤来实现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶嚢。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和^乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的免疫球蛋白在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37。C的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。还涵盖可以通过基因疗法将本发明中有用的药剂导入受试者。基因疗法指通过给受试者施用核酸进行的疗法。在基因疗法的应用中，为了实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如为了替换缺陷基因，将基因引入细胞。"基因疗法"包括通过单次处理实现持久效果的常规基因疗法及牵涉一次或重复施用治疗上有效的DNA或mRNA的基因治疗剂施用二者。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于阻断某些基因的体内表达。参见例如实施例中描述的DLL4-siRNA。早已显示可以将短反义寡核苷酸输入细胞，在那里它们起抑制剂的作用，尽管由于细胞膜对它们的摄取受限制因而它们的胞内浓度低(Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4143-4146(1986))。可以修饰寡核苦酸以增强它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。关于基因疗法的方法的一般性综述参阅例如Goldspiel等，ClinicalPharmacy12:488-505(1993);Wu和Wu，Biotherapy3:87-95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science260:926-932(1993);Morgan禾口Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);及May，TIBTECH11:155-215(1993)。重组DNA
技术领域：
普遍知道的、可以使用的方法记载于Ausubel等人编(1993)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY及Kriegler(1990)GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY。剂量和施用依照已知方法将分子施用于人类患者，诸如静脉内施用(像推注或持续一段时间的连续输注)、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径，和/或皮下施用。在某些实施方案中，本发明的治疗牵涉联合施用DLL4拮抗剂和一种或多种抗癌剂(例如抗血管发生剂)。在一个实施方案中，存在别的抗癌剂，例如一种或多种不同的抗血管发生剂、一种或多种化疗剂等。本发明还涵盖施用多种抑制剂，例如针对同一抗原的多种抗体或针对不同癌活性分子的多种抗体。在一个实施方案中，与DLL4拮抗剂和/或一种或多种抗血管发生剂一起施用不同化疗剂的混合物。联合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和/或任一次序的顺次施用。例如，DLL4拮抗剂可以在施用抗癌剂之前、之后、交替，或者可以同时给予。在一个实施方案中，有一段时间所有(两种或更多)活性剂同时发挥其生物学活性。对于疾病的预防或治疗，DLL4拮抗剂的适宜剂量取决于上文定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用抑制剂是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抑制剂的响应、及主治医师的判断。将抑制剂一次性或者在一系列治疗中适当的施用于患者。在联合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或治疗协同量施用。在用于本文时，治疗有效量指导致所针对疾病或疾患得到减轻或抑制的本发明组合物的施用量和/或DLL4拮抗剂和一种或多种其它治疗剂的共施用量。药剂组合的施用效果可以是叠加的。在一个实施方案中，施用的效果是协同效应。治疗协同量指协同的或显著的减轻或消除与特定疾病有关的状况或症状所必需的DLL4拮抗剂和一种或多种其它治疗剂(例如血管发生抑制剂)的量。根据疾病的类型和严重程度，大约lng/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)DLL4拮抗剂或血管发生抑制剂是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或者是通过连续输注。典型每日剂量的范围可以为大约l吗/kg到大约100mg/kg或者更多，取决于上述因素。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据疾患，治疗维持到直至发生期望的疾病症状抑制。然而，其它剂量方案可能也是有用的。典型的是，临床医师会施用分子，直至剂量达到提供所需生物学效应。可以通过常规技术和测定法来容易的监测本发明疗法的进展。例如，血管发生抑制剂(例如抗VEGF抗体，诸如AVASTIN⑧(Genentech))的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。在另一个例子中，此类化疗剂的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。化疗的准备和剂量给药方案还记载于ChemotherapyService,M.C.Peny编，Williams&Wilkins,Baltimore,MD(1992)。治疗功效终点来测量。例如，癌症治疗可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或大小收缩、距进展的时间、存活持续时间、无进展存活、整体响应率、响应持续时间、和生活质量来评估。因为本文所述抗血管发生剂靶向肺瘤血管结构而不必是赘生性细胞本身，所以它们代表了一类独特的抗癌药，并因此可以要求独特的对药物的临床应答的测量和定义。例如，二维分析中大于50%的肿瘤收缩是宣告响应的标准截留。然而，抑制剂可以引起对转移性扩散的抑制而没有原发瘤的收缩，或者可以仅仅发挥抑制肿瘤效果。因而，可采用测定治疗功效的方法，包括例如测量血管发生的血浆或尿液标志物和通过》文射学成像测量响应。提供下文实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。在此完整收入本说明书中引用的所有专利和参考文献的公开内容作为参考。实施例除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实施例和整篇说明书中以ATCC编号所筌别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA20108)。在实施例之后列出了实施例中所引用的参考文献。由此本文收入所有引用的参考文献作为参考。实施例l:材料和方法86实施例中使用了下列材料和方法。HUVEC血纤蛋白^珠测定法。HUVEC血纤妄白凝胶珠测定法的详情已有记载(Nakatsu,M.N.等，MicrovascRes66,102-12(2003))。简言之，以350-400个HUVEC/珠包净皮CytodexTM3珠(AmershamPharmaciaBiotech)。将约200个HUVEC包被的珠子埋入12孔组织培养板的一个孔中的血纤蛋白凝块。将8x1(/个SF细胞铺于该凝块之上。第7天和第9天之间终止测定以免疫染色和成像。在有些实验中，通过用生物素-抗CD31(克隆WM59，eBioscience)和链霉亲合素-Cy3染色来使HUVEC芽显现。为了HUVEC细胞核染色，将血纤蛋白凝胶在2。/。低聚曱醛(PFA)中固定过夜，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)染色。为了Ki67染色，将血纤蛋白凝胶用IOX胰蛋白酶-EDTA处理5分钟以去除上层SF，用PBS中的10。/。FBS中和，并在4。/oPFA中固定过夜。然后将血纤蛋白凝胶用PBST中的10。/。山羊血清封闭4小时，与家兔抗小鼠Ki67(Ready-To-Use,克隆Sp6，LabVision)—起温育过夜，接着用抗家兔lgG-Cy3(JacksonImmunoResearch)进行二级检测。所有过夜温育在4。C进行。小鼠新生视网膜研究。在P1和P3，给来自同一窝的新生CDl小鼠i.p.注射PBS或YW26.82(10mg/kg)。在P5，收集眼睛，并用PBS中的4%PFA固定过夜。将解剖的视网膜用PBST中的10%山羊血.清封闭3小时，然后与一抗一起温育过夜。一级混合物(cocktail)包括生物素化的异凝集素B4(25吗/ml，西非单叶豆(Bandeiraeasimplicifolia);Sigma)和下列之一家兔抗小鼠Ki67(1:1，Ready-To-Use,克隆Sp6，LabVision)或小鼠Cy3偶联的抗otSMA(1:2000，Sigma-Aldrich),及PBLEC(1%TritonX-IOO，O.lmMCaCl2，O.lmMMgCl2，0.1mMMnCl2,在PBSpH6.8中)中的10%血清。然后将视网膜在PBST中清洗，并与Alexa488链霉亲合素(1:200;MolecularProbes)和Cy3-抗家兔IgG(1:200;JacksonImmunoResearch)的二抗组合物一起温育过夜。在完成染色后，将视网膜用PBS中的40/。PFA后固定。所有过夜温育在4。C进行。通过共焦荧光显微术捕获平展视网膜的图像。肺瘤模型。使用8-10周龄的米色雌性棵小鼠。为了获得皮下肿瘤，给小鼠在右后体侧注射含有50%matrigel(BDBioscience)的0.1ml细胞悬液。将5xl(^个人结肠癌HM7细胞、10xl(^个人结肠癌Colo205细胞、10xl(^个人肺癌Calu6细胞、10xl(^个人肺癌MV-522细胞、10xl(^个小鼠白血病WEHI-3细87胞、10xl(^个小鼠淋巴瘤EL4细胞、10xl(^个人卵巢癌SK-OV-3Xl细胞、10x106个小鼠肺癌LL2细胞、1Ox106个白血病/淋巴瘤EL4细胞或1Ox106个非小肺癌H1299细胞注射入每只小鼠。对于人黑素瘤MDA-MB-435模型，给小鼠在乳房脂肪垫中注射含有50%matrigel的0.1ml细胞(5乂106个)悬液。经i.p.施用抗DLL4抗体YW26.82(10mg/kg体重，每周两次)。对于下列肿瘤才莫型，每只试验小鼠在右体侧接受植入的皮下肿瘤碎块(lmm":非小肺癌SKMES-1、人乳腺癌MX-1、人结肠直肠癌SW620和人腺癌LS174T。通过测径器测量来对肿瘤生长定量。通过测量长度(l)和宽度(w)并计算体积(V=h^/"来测定肿瘤体积(mm3)。每组中包括10至15只动物。使用双尾Student氏t检验(two-tailedStudent'st-test)实施处理组的统计学比较。胂瘤血管标记和免疫组织化学。用异氟烷麻醉小鼠。i.v.注射FITC标记的番茄(Lycopersiconesculentum)凝集素(150吗，在150|110.9%NaCl中；VectorLaboratories),并容许循环5分钟，之后系统灌注。用PBS中的1%PFA对血管结构经过心脏地(transcardially)灌注3分钟。取出肿瘤，并通过在相同的固定剂中浸没2小时来后固定，接着为了防冻在30。/。蔗糖中温育过夜，然后在OCT中包埋。将切片(41im厚度)用抗小鼠CD31(l:50，BDPharmingen)，接着用Alexa594山羊抗大鼠IgG(1:800，MolecularProbes)染色。小鼠肠的组织学和免疫组织化学。将福尔马林固定且石蜡包埋的小鼠小肠组织切片成3(im厚度。如制造商(PolyScientific)所推荐的，使用Alcian蓝实施肠细胞类型的组织化学鉴定。为了抗Ki67染色，将切片用靶物恢复液(S1700,DAKO)预处理，并与家兔抗Ki67(1:200,克隆SP6，Neomarkers)—起温育。用VectastainABCElite试剂盒(VectorLabs)检测7.5g/ml的二级山羊抗家兔(VectorLabs)。用Mayer氏苏木精复染所有Ki67染色切片。为了HES-1染色，使用抗大鼠HES-1(克隆NM1，MBL，International),接着是TSA-HRP。RNA干扰。耙向人DLL4的SMART集合小干扰RNA(siRNA)双链体和Si对照无把siRNA#2(SiControlNon-TargetsiRNA#2)购自Dharmacon。使用OptiMEM-1和Lipfectamine2000(Invitrogen),以40%汇合的HUVEC进行siRNA双链体(50nM)的转染。siRNA转染后48小时进行FACS分析。4种抗DLL4SMART集合siRNA的序列如下CAACTGCCCTTATGGCTTTTT(SEQIDNO:5)(寡聚物1，有义)，AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT(SEQIDNO:6)(寡聚物1，反义)，88CAACTGCCCTTCAATTTCATT(SEQIDNO:7)(寡聚物2，有义)，TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT(SEQIDNO:8)(寡聚物2，反义)，TGACCAAGATCTCAACTACTT(SEQIDNO:9)(寡聚物3，有义)，GTAGTTGAGATCTTGGTCATT(SEQIDNO:10)(寡聚物3，反义)，GGCCAACTATGCTTGTGAATT(SEQIDNO:11)(寡聚物4，有义)，TTCACAAGCATAGTTGGCCTT(SEQIDNO:12)(寡聚物4，反义)。Notch配体Notch阻断ELISA。用0.5吗/ml重组大鼠Notchl-Fc(rrNotchl-Fc,R&DSystems)包被96孔微量滴定板。在该测定法中使用含有DLL4-AP(融合至人胎盘碱性磷酸酶的DLL4的第l-404位氨基酸)的条件化培养基。为了制备条件化培养基，用表达DLL4-AP的质粒及Fugen6试剂(RocheMolecularBiochemicals)瞬时转染293细胞。转染后5天，收获条件化培养基，过滤，并存储在4。C。将0.15-25ng/ml滴定的纯化的抗体与下述稀释度的DLL4-AP条件化培养基在室温预温育1小时，在该稀释度的DLL4-AP条件化培养基赋予对所包被rrNotch1-Fc的50%最大可实现结合。然后将该抗体/DLL4-AP混合物在室温添加至rrNotchl-Fc包被的平板l小时，之后将平板在PBS中清洗数次。使用一步PNPP(Pierce)作为底物和OD405nm吸光度测量来检测所结合的DLL4-AP。用DLL1-AP(人DLL1，氨基酸1-445)实施同样的测定法。用纯化的DLL4-His(C末端加His标签的人DLL4，氨基酸l-404)和Jagl-His(R&DSystem)实施类似的测定法。用小鼠抗His单抗(l吗/ml，RocheMolecularBiochemicals)、生物素4匕的山羊抗小鼠(JacksonImmunoResearch)和链霉亲合素-AP(JacksonImmunoResearch)^r测所结合的加His标签的配体。RNA提取和实时定量RT-PCR。使用RNeasy⑧迷你试剂盒(Qiagen)按照制造商的说明书进行从2-D培养物中的HUVEC提取总RNA。为了从在血纤蛋白凝胶中生长的HUVEC提取总RNA,用10X胰蛋白酶-EDTA(Gibco)处理血纤蛋白凝胶5分钟以去除上层成纤维细胞，接着用PBS中的10。/。FBS中和。然后将该凝胶凝块自组织培养孔取出，并在微量管中进行离心(10K、5分钟)以去除过量液体。将所得凝胶"沉淀物"用溶解緩沖液(RNeasy⑧迷你试剂盒)溶解，并像2-D培养物中的HUVEC那样进一步处理。使用RNA6000纳米芯片和Agilent2100生物分析仪(AgilentTechnologies)评估RNA质量。使用7500实时PCR系统(AppliedBiosystems)—式三份进行实时定量RT-PCR。使用人89GAPDH作为参照基因以标准化。将表达水平表述为相对于来自3次分别测定的对照的均值(士SEM)mRNA倍数变化。VEGFR2、TGF(32和GAPDH的正向和反向？1物及探针序列如下TGFb2正向GTAAAGTCTTGCAAATGCAGCTA(SEQIDNO:13)反向CATCATCATTATCATCATCATTGTC(SEQIDNO:14)探针AATTCTTGGAAAAGTGGCAAGACCAAAAT(SEQIDNO:15)VEGFR2正向CTTTCCACCAGCAGGAAGTAG(SEQIDNO:16)反向TGCAGTCCGAGGTCCTTT(SEQIDNO:17)探针CGCATTTGATTTTCATTTCGACAACAGA(SEQIDNO:18)GAPDH正向GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQIDNO:19)反向GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQIDNO:20)探针CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(SEQIDNO:21)实施例2:噬菌体抗DLL4抗体的生成通过在重链和轻链的互补决定区(CDR)内引入多样性来在单个框架(人源化抗ErbB2抗体，4D5)上构建合成噬菌体抗体文库(Lee,C.V.等，JMolBiol340,1073-93(2004);Liang，W.C.等，JBiolChem281，951-61(2006》。针对固定化在Maxisorp免疫板上的加His标签的人DLL4(氨基酸1-404)实施对未免疫(naiVe)文库的平板淘选。四轮富集后，随机挑取克隆，并使用噬菌体ELISA鉴定特异性结合物。用加His标签的鼠DLL4蛋白进一步筛选所得hDLL4结合克隆以鉴定跨物种克隆。对于各个阳性噬菌体克隆，将重链和轻链可变区亚克隆入被改造成表达全长IgG链的pRK表达载体。将重链和轻链构建体共转染入293或CHO细胞，并使用蛋白A亲和柱从无血清培养基中纯化所表达的抗体。通过ELISA测试纯化后的抗体阻断DLL4和大鼠Notch1-Fc之间的相互作用，并通过FACS测试其对表达全长人DLL4或鼠DLL4的稳定细胞系的结合。为了亲和力成熟，通过软随机化策略(softrandomizationstrategy)构建具有衍生自感兴趣初始克隆的CDR环(CDR-L3、-Hl、和-H2)的三种不同組合的噬菌体文库，使得各个选定位置突变成非野生型残基或者以约50:50频率90维持野生型(Liang等，2006，见上文)。然后通过四轮针对人和鼠二者的加His标签的DLL4蛋白的、逐渐提高严格性的溶液相淘选来鉴定高亲和力克隆。实施例3:抗DDL4抗体的表征抗DLL4单抗YW26.82的表位作图。抗DLL4单抗26.82识别存在于人DLL4胞外结构域(ECD)的EGF样重复序列编号2(EGL2)中的结合决定簇。EGL2包含人DLL4ECD的氨基酸252-282。简言之，使DLL4ECD突变体表达为碱性磷酸酶融合蛋白，并评估与抗体的结合。图5a描绘了表达为C末端人胎盘碱性磷酸酶(AP)融合蛋白的一组DLL4突变体的图示。圆括号指出该融合蛋白中所包括的DLL4序列。在用纯化的抗DLL4单抗(YW26.82,0.5吗/ml)包被的96孔微量滴定板上测试含该融合蛋白的293T细胞条件化培养基。使用一步PNPP(Pierce)作为底物和OD405nm吸光度测量来纟全测所结合的DLL4.AP。单抗YW26.82结合包含DLL4EGL2结构域的构建体，而不结合缺乏DLL4EGL2结构域的构建体。这证明抗DLL4单抗YW26.82识别人DLL4ECD的EGL2结构域中的表位。单抗YW26.82选择性结合小鼠和人DLL4。如所指示的(l吗/ml)用纯化的重组蛋白包被96孔NuncMaxisorp平板。通过ELISA测定法测量在指定浓度的YW26.82的结合。使用TMB作为底物和OD450nm吸光度测量用抗人抗体HRP偶联物来检测所结合的抗体。使用抗HER2和重组ErbB2-ECD作为测定对照(图5b)。该实验结果显示在图5b中。单抗YW26.82结合人和小鼠DLL4，而没有可检测地结合人DLL1和人JAG1。这些结果证明单抗YW26.82选择性结合DLL4。经载体、全长DLL4、Jagl或DLLl瞬时转染的293细胞的FACS分析也证明单抗YW26.82选择性结合DLL4。如图5c所示，仅在经DLL4转染的细胞上检测到YW26.82的显著结合(顶部小图)。在经DLLl或Jagl转染的细胞上没有检测到显著结合。分别通过重组大鼠Notchl-Fc(rrNotch1-Fc,中间小图)和重组大鼠Notch2-Fc(rrNotch2-Fc,底部小图)证实Jagl和DLLl的表达。使用2吗/ml的YW26.82、rrNotchl-Fc或rrNotch2-Fc(R&DSystem),接着使用山羊抗人IgG-PE(1:500,JacksonImmunoResearch)。竟争实验证明单抗YW26.82高效且选择性阻断Notch与DLL4的相互作用，但不阻断Notch与其它Notch配体的相互作用。如图5d所示，抗DLL4单抗阻断DLL4-AP而非DLL1-AP与所包被的rNotch1.的结合，计算IC50约为12nM(左边小图)。抗DLL4单抗阻断DLL4-His而非Jagl-His与所包被的rNotchl的结合，计算IC50约为8nM(右边小图)。抗DLL4单抗YW26.82特异性结合人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中内源表达的DLL4。实施了经对照或DLL4特异性siRNA转染的HUVEC的FACS分析。使用2jig/ml的YW26.82，接着使用山羊抗人IgG-PE(1:500，JacksonImmunoResearch)。该实验结果显示在图5e中。观察到对未转染的HUVEC(对照)和对经对照siRNA转染的HUVEC的结合。与之相比，结合在经DLL4siRNA转染的HUVEC中显著降低。这些实验证明抗DLL4单抗YW26.82特异性结合HUVEC中内源表达的DLL4。实施例4:抗DDL4抗体处理增加了体外内皮细胞增殖在存在共培养的人皮肤成纤维细胞(SF)时，在血纤蛋白凝胶中生长的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生成具有独特腔管样结构的芽(Nakatsu,M.N.等MicrovascRes66，102-12(2003))。抗DLL4抗体YW26.82的添加明显增加了芽的长度和数目(图la)。由蛋白质复合物的Y-分泌酶活性所催化的Notch蛋白水解加工是Notch活化过程中一个至关重要的步骤(Baron，M.SeminCellDevBiol14,113-9(2003))。有趣的是，Y-分泌酶抑制剂二苯并氮卓(dibenzazepine，DBZ)(vanEs,J.H.等，Nature435，959-63(2005);Milano，J.等，ToxicolSci82,341-58(2004))对HUVEC萌芽具有相同的效果。考虑到这两种处理具有不同的机制，萌芽的增强显然可归因于Notch信号传导的衰减。Ki67染色揭示EC萌芽的增强是由于细胞增殖的提高(图lb)。在最初的血纤蛋白凝胶测定法中，共培养的SF细胞支持HUVEC萌芽和随后的腔管形成。通过用条件化培养基替代SF细胞，抗DLL4单抗和DBZ都仍能够增强HUVEC萌芽(图lc)，这支持DLL4/Notch信号传导的EC自主性作用。在相反的实验中，由固定化DLL4蛋白进行的Notch活化导致显著的生长抑制(图le)。这些发现表明DLL4/Notch信号传导的活化状态与EC增殖密切相关。实施例5:抗DDL4抗体处理增加了体内内皮细胞增殖早期的出生后小鼠视网膜以清楚定义的一系列事件发展成定型的(stereotypic)血管模式(Stone,J.和Dreher，Z.JCompNeurol255,35-49(1987);Gerhardt，H.等，JCellBiol161,1163-77(2003);Fruttiger，M.InvestOphthalmolVisSci43，522-7(2002))。新生视网膜中正在生长的EC中显著且动态的DLL4表达表明DLL4可能的作用是调节视网膜血管发育(Claxton，S.和Fruttiger,M.GeneExprPatterns5,123-7(2004》。YW26.82的系统递送引起深刻的一见网膜血管结构改变。在视网膜中发生EC的大量积累，产生具有原始血管形态学的片样(sheet-like)结构(图ld)。观察到EC中Ki67标记的显著增加，表明EC增殖得到提高(图lh)。因此，新生小鼠中DLL4阻断后视网膜EC的这种过度增殖表型确证了体外发现。实施例6:DLL4/Notch在调节上皮细胞增殖中的重要作用VEGF控制EC的数个基本方面(Ferrara，N.Exs，209-31(2005);Coultas，L.等，Nature438,937-45(2005))。然而，知之甚少的是，VEGF信号传导是如何整合入复杂的血管过程，诸如动静脉(AV)分化和等级血管组织(hierarchicalvascularorganization),即明显需要别的高度协调的信号传导途径的事件。斑马鱼中的遗传研究表明VEGF在动脉内皮分化过程中在Notch途径上游起作用(Lawson,N.D.等，Development128，3675-83(2001))。我们发现用VEGF刺激HUVEC引起DLL4表面表达升高(未显示的数据)，这与最近关于VEGF刺激DLL4mRNA上调的报道一致(Patel,N.S.等，CancerRes65，8690-7(2005))。有趣的是，在Notch活化后DLL4自身上调(图6)，这表明有一种正反馈机制，通过该机制DLL4有效传递VEGF信号传导至Notch途径。筒言之，在没有DBZ或存在DBZ(0.08(iM)时，用固定化的C末端加His标签的人DLL4(氨基酸1-404)刺激HUVEC。刺激后36小时，通过使用抗DLL4抗体的FACS分析来检查内源DLL4表达。值得注意的是，由于阻断Notch信号传导而产生的EC过度增殖仍依赖于VEGF。在3-D血纤蛋白凝胶培养物中，抗VEGF单抗处理消除了大多数EC萌芽，或是在存在DBZ时或是在没有DBZ时(图lf),这提出如下的可能性，即过度增殖行为可能的部分原因是VEGF信号传导的增强。确实，YW26.82或DBZ对Notch的阻断导致VEGFR2上调(图lg)。相反地，固定化DLL4对Notch的活化抑制VEGFR2表达(图lg)。因此，尽管VEGF可以在DLL4/Notch途径上游起作用，DLL4/Notch能够通过负调节VEGFR2表达来微调应答。93实施例7:抗DLL4抗体处理阻断内皮细胞分化且阻断动脉发育在EC增殖增加外，拮抗DLL4/Notch亏1起血纤蛋白凝胶中EC芽显著的形态学变化。多细胞腔管样结构基本不存在(图2a)，这表明EC分化有缺陷。在单抗YW26.82处理的视网膜中，放射状交互的动脉和静脉的特征样式受到严重破坏。与视网膜动脉有关的抗a平滑肌肌动蛋白(ASMA)染色完全不存在(图2c)。该观察结果与DLL4+A胚胎中有缺陷的动脉发育非常类似。从不同角度的这些发现突出了DLL4/Notch在调节EC分化中的重要作用。实施例8:TFGp表达与Notch活化状态有联系类似于Notch途径，TGFP信号传导是环境依赖性的，且对细胞分化、增殖和生长抑制具有不同效果，且常常是相反的效果。此外，已经将TGF(3途径与血管过程联系起来(Urness，L.D.等，NatGenet26,328-31(2000);Oshima,M.等，DevBiol179,297-302(1996);Larsson，J.等，EmboJ20,1663-73(2001))。例如，激活素受体样激酶l(ALK1)(—种EC特异性I型TGF卩受体)的缺陷导致卵黄嚢中的原始EC网络和动静脉功能失常(AVM),即具有有缺陷的Notch信号传导的小鼠所共享的表型(Urness,L.D.等，NatGenet26，328-31(2000);Iso,T.等，ArteriosclerThrombVaseBiol23，543-53(2003))。这引导我们去调查这两种途径之间的可能联系。我们发现TGF(32表达(图2b)与Notch活化状态密切联系，这表明TGF(3途径可能在Notch途径下游起作用。综上所述，我们的发现支持如下的模型，其中充当"信号传导路由器"("signalingrouter")的DLL4/Notch轴通过调节DLL4表达来整合VEGF信号传导，并使TGF(3途径参与促进EC分化。实施例9:抗DLL4抗体处理抑制体内肿瘤生长为了直接研究DLL4/Notch信号传导在肿瘤血管发生过程中的可能作用，我们调查了在临床前肿瘤模型中阻断DLL4对肿瘤生长的影响(图3a-d)。在HM7、Colo205和Calu6异种移植物肺瘤模型中(图3a-c)，在肿瘤确立(肿瘤大小2250mm3)后启动YW26.82处理。在所有三种模型中，对照和处理组之间的生长速率分离在定量给药后三天变得明显。处理组的肿瘤体积在处理的两周里保持不变。在皮下肿瘤外，抗DLL4单抗还抑制在小鼠乳房脂肪垫中生长的肿瘤。在MDA-MB-435肿瘤模型中，在注射肿瘤细胞后14天开始处理。94页对照和处理组之间的肿瘤生长曲线的差异在定量给药后6天内是明显的，且随着处理的持续而变得越发显著(图3d)。我们还调查了在临床前肿瘤模型中阻断DLL4和/或VEGF对许多肿瘤生长的影响(图3e-f;i-p)。在MV-522和WEHI3异种移植物肺瘤模型中，在肿瘤确立(肿瘤大小2250mm3)后启动YW26.82处理和/或抗VEGF处理。在MV-552模型中，YW26.82和抗VEGF处理都单独地抑制肿瘤生长，但这两种处理的联合是最有效的。在WEHI3模型中，抗VEGF处理对肿瘤生长不显示效果，而YW26.82处理显示对肺瘤生长的显著抑制。在SK-0V-3X1、LL2、EL4、H1299、SKMES-1、MX-1、SW620和LS174T模型中，在肺瘤确立后施用YW26.82处理(5mg/kg,IP,每周两次)和/或抗VEGF处理(5mg/kg，IP,每周两次)。在这些^ft型的每种中，YW26.82处理单独地抑制肿瘤生长。此外，在测试了联合的所有这些模型中，YW26.82与抗VEGF的联合表现出增强的功效。实施例10:抗DLL4抗体处理增加了胂瘤内皮细胞增殖鉴于肿瘤生长抑制，我们将EL4小鼠淋巴瘤肿瘤模型用于血管组织学研究。我们发现抗DLL4单抗处理导致内皮细胞密度的显著增加(图3g)。相反地，抗VEGF具有完全相反的效果(图3g)，尽管这两种处理在该模型中表现出相似的功效。实施例ll:抗DLL4抗体处理抑制肿瘤血管灌注因为DLL4/Notch途径的体外阻断削弱了由EC形成腔管样结构(图2a)，因此调查了抗DLL4单抗处理是否引起肺瘤血管结构中的相似缺陷，并影响有效的血流。FITC-凝集素的系统灌注揭示了抗DLL4单抗处理导致肿瘤血管的凝集素标记的显著降低(图3h)。值得注意的是，已经显示了ALK1缺陷小鼠中动静脉功能失常引起异常的血液循环(Umess,L.D.等，NatGenet26,328-31(2000))。考虑到DLL4/Notch信号传导在AV分化中的重要作用，在胚胎和早期的出生后视网膜中，抗DLL4单抗都可能影响肿瘤EC的细胞命运指定(cellfatespecification),并引起有缺陷的定向血流。确实，在经抗DLL4单抗处理的Colo205肿瘤中，存在这样的区域，其中高EC密度与低可存活肿瘤细胞含量有关，这表明血管功能差。洞察精确的血管缺陷需要利用血管成像技术的进一步研究。95实施例12:DLL4/Notch在小鼠肠稳态中不是必需的考虑到Notch信号传导在调节出生后自我更新系统稳态中的多效性作用，关于Notch全局抑制的主要顾虑是其可能有害。例如，维持未分化的肠内隐窝祖细胞需要Notch信号传导(vanEs，J.H.等，Nature435，959-63(2005);Fre，S.等，Nature435，964-8(2005))。确实，由于隐窝区室内杯形细胞的大量增加，Y-分泌酶抑制剂(其会不加选择地阻断所有Notch活性)在啮齿类动物中引起不想要的副作用(Milano,J.等，ToxicolSci82，341-58(2004);Wong,G.T.等，JBiolChem279,12876-82(2004))。通过免疫组织化学分析，我们检查了用抗DLL4单抗处理的小鼠的小肠。与DBZ处理形成对比，处理六周后抗DLL4单抗和对照组之间没有鉴别出上皮隐窝细胞分化或增殖概况(proliferationprofile)的差异(图4)。此外，抗DLL4单抗没有改变快速分裂的移行扩增(transitamplifying,TA)群体中Notch靶基因HES-1的表达(图4)。这些结果支持如下观点，即DLL4/Notch信号传导主要局限于血管系统。实施例13:抗DLL4抗体处理不影响成年视网膜血管结构尽管DLL4的阻断对新生小鼠中视网膜血管发育具有深刻的影响，但抗DLL4抗体的施用对成年视网膜血管结构没有可见的影响(图2d)。如此，DLL4/Notch信号传导在活跃的血管发生过程中是关键性的，但在正常血管维持中发挥不太重要的作用。与该观点一致，在抗DLL4单抗处理过程中，在每周两次服用10mg/kg长达8周的携瘤小鼠中没有观察到明显的体重减轻或动物死亡。在肿瘤模型中，抗DLL4单抗和抗VEGF对肺瘤血管结构展现出相反的效果，这表明不相交叠的作用机制。认为上述书面说明书足以使本领域技术人员能够实施本发明。然而，根据上迷说明书，除本文所示和所述的那些外，本发明的各种改良对本领域技术人员而言是显而易见的，并落在所附权利要求的范围内。9权利要求1.一种用于治疗肿瘤、癌症或细胞增殖性病症的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂，由此治疗所述肿瘤、癌症或细胞增殖性病症。2.权利要求l的方法，其中所述肿瘤、癌症或细胞增殖性病症是结肠癌、肺癌、黑素瘤或淋巴瘤。3.—种用于治疗与血管发生有关的病理学疾患的方法，包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的DLL4拮抗剂，由此治疗所述与血管发生有关的病理学疾患，其中所述DLL4拮抗剂能够刺激内皮细胞增殖、抑制内皮细胞分化、抑制动脉发育或抑制血管灌注。4.权利要求3的方法，其中所述与血管发生有关的病理学疾患是肿瘤、癌症和/或细^L增殖性病症。5.权利要求3的方法，其中所述与血管发生有关的病理学疾患是眼内新血管疾病。6.—种用于在需要此类治疗的受试者中刺激内皮细胞增殖的方法，包括给所述受试者施用有效量的DLL4激动剂，由此刺激内皮细胞增殖。7.—种用于在需要此类治疗的受试者中降低或抑制内皮细胞分化的方法，包括给所述受试者施用有效量的DLL4拮抗剂，由此抑制内皮细胞分化。8.—种在需要此类治疗的受试者中降低或抑制动脉发育的方法，包括给所述受试者施用有效量的DLL4拮抗剂，由此抑制动脉发育。9.一种在需要此类治疗的受试者中降低或抑制肿瘤血管灌注的方法，包括给所述受试者施用有效量的DLL4拮抗剂，由此抑制肿瘤血管灌注。10.权利要求l-9中任一项的方法，还包括给所述受试者施用有效量的抗血管发生剂。11.权利要求10的方法，其中所迷抗血管发生剂在施用所述DLL4拮抗剂之前或之后施用。12.权利要求10的方法，其中所述抗血管发生剂与所述DLL4拮抗剂同时施用。13.权利要求10-12中任一项的方法，其中所述抗血管发生剂是血管内皮细胞生长因子(VEGF)的拮抗剂。14.权利要求13的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。15.权利要求14的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。16.权利要求1-15中任一项的方法，还包括施用有效量的化疗剂。17.—种在患有与血管发生有关的病理学疾患的受试者中增强抗血管发生剂功效的方法，包括给所述受试者联合施用有效量的DLL4拮抗剂与所述抗血管发生剂，由此增强所述抗血管发生剂的抑制活性。18.权利要求17的方法，其中所述与血管发生有关的病理学疾患是肿瘤、癌症和/或细胞增殖性病症。19.权利要求17的方法，其中所述与血管发生有关的病理学疾患是眼内新血管疾病。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述DLL4拮抗剂是抗DLL4抗体。21.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述DLL4拮抗剂是DLL4免疫粘附素。22.权利要求20的方法，其中所述DLL4抗体是单克隆抗体。23.权利要求20的方法，其中所述DLL4抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。24.权利要求20的方法，其中所述DLL4抗体是抗体片段。25.权利要求24的方法，其中所述抗体片段是Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2或scFv。全文摘要本发明提供了使用DLL4调节剂调节血管形成的方法。此外，提供了使用DLL4调节剂诸如DLL4拮抗剂的治疗方法。文档编号A61K38/17GK101489576SQ200780026028公开日2009年7月22日申请日期2007年6月6日优先权日2006年6月6日发明者严民宏申请人:健泰科生物技术公司