专利名称：一种治疗流感病毒感染的药物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于预防和/或治疗病毒感染的药物，特别涉及用于由流感病 毒引起的感染的药物。本发明的主题是药物，其含有作为活性成分的泛素蛋 白酶系统抑制剂，尤其是蛋白酶体抑制剂。本发明中还涉及蛋白酶体抑制剂 的整体与局部用药，特别优选气雾剂形式的用药。本发明中所述的蛋白酶体 抑制剂活性成分能与至少一种其他的具有抗病毒效果的物质一起用于预防 和/或治疗流感病毒的感染。
背景技术：
1.在动物和人体中的流感病毒感染
流感病毒的感染，即流感病原体造成的感染，对人类和动物身体健康构 成了巨大威胁。同时，这种感染不仅逐年地造成重大死亡，并且由于生病导 致丧失工作能力也带来了巨大的宏观经济损失。在每年爆发的流行病中，流 行性感冒甚至具有越来越大的威胁，因为过去这种全球性的流行病在世界范
围内的反复地暴发，曾经夺去了数百万人的生命。在最近几年爆发的H5N1 亚型的高致病性禽流感事件直接预示着未来几年爆发新一轮全球范围的流 行病的危机。但是，迄今人们还没有获得相应有效的疫苗来抗击病毒。
流感病毒属于正黏液病毒科家族，含有一反义的基因组片段，其编码至 少 11种病毒蛋白(Lamb and Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395,1996)。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M) 的分子特性及血清特性，流感病毒可以分为A、 B和C三种类型。其中，A 型流感病毒对人类和某些动物具有最强的致病性(Webster et al，， Microbiol Rev, 56, 152-79， 1992)。
A型流感病毒颗粒由9个结构蛋白和一个源于宿主细胞的脂质包膜组
成。病毒RNA的节段1 3编码RNA依赖的RNA聚合酶复合物(RDRP) 的组分PB1、 PB2和PA，它们同核糖核蛋白结合，催化这些组分的转录和 病毒基因组的扩增。血凝素(HA)和神经氮酸苷酶(NA)是病毒的表面 糖蛋白，它们由vRNA的节段4和6编码。当前，已知有16种HA亚型和 9种NA亚型，由此将A型流感病毒划分成不同种类。
HA型为H1、 H2和H3的病毒以及NA型为N1和N2的病毒能在人类 中传染(Lamb and Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395,1996)。节段5编码核蛋白(NP)，其为核糖核蛋白复 合物的主要组分。两个最小的vRNA片段中每个都编码两种蛋白。vRNA的 片段7编码基质蛋白Ml和M2蛋白。Ml蛋白与脂质双层膜的内侧结合并 且由内向外包裹住病毒；M2是第三跨膜成分，其功能为pH依赖的离子通 道。片段8的序列携带了核输出蛋白NS/NEP和一个非结构蛋白NS1的信息。 最近，鉴定出第11个A型流感病毒蛋白(Chen et al., source after the exemplary embodiments)。它是PB1-F2蛋白，其通过PBl基因片段的开放阅 读框在一个核苷酸周围移动而形成。
PB1-F2是一种线粒体蛋白，其能够加强诱导受控细胞的死亡和细胞凋亡。
对付RNA病毒的问题在于由病毒聚合酶的高误差率引起的病毒的高变 异性，这使得生产合适的疫苗以及开发抗病毒物质变得很困难。
研究显示，由于病毒的高变异性，使用针对病毒作用的抗病毒物质，会 导致病毒快速的选择抗性变异。例如，抗流感病毒药三环癸胺及其衍生物， 它针对于病毒的一个跨膜蛋白，但是经过几代繁殖就会产生抗性病原体。
流感感染的新型治疗剂，其抑制流感病毒表面蛋白神经氨酸苷酶，已由 Glaxo Wellcome公司和Roche公司用商品名"RELANZA"禾卩"TAMIFLU" 在德国销售，但是在患者体内已出现了其抗性病原体(Gubareva et al J Infect
Dis 178,1257-1262,1998);目前，在人体中发现H5N1型禽流感病毒已对 "TAMIFLU"产生抗药性(Qui et al. Nature 437,1108, 2005)。因此，对这种治
疗剂寄予的希望并不能实现。
由于大部分病毒都是小基因组，因此限制了病毒复制必需的编码能力，
故所有的病毒很大程度上都依赖于它们的宿主细胞的功能。通过影响这些病
毒复制所必需要的细胞功能，就有可能抑制病毒在受感染细胞中的复制。 (Ludwigetal.,TrendsMol.Med. 9, 46-51,2003)。此处，病毒不可能通过适
应取代缺失的细胞功能。此处，在选择压力前，通过突变避免上述问题也是 不可能的。这一点可由一A型流感病毒的例子得出，如，相对非特异性的抑 制剂可抑制细胞激酶和甲基转移酶(Scholtissek and Muller, Arch Virol 119,111-118,1991)，激酶抑制剂选择性地攻击病毒需要的信号通道(Ludwig et al., FEBS Lett 561, 37-43， 2004)。
2.泛素/蛋白酶体系统(UPS)的功能
蛋白酶体在细胞和所有真核细胞的胞液中是主要的蛋白水解成分。它是 具有多种催化活性的酶复合物，占细胞蛋白质总量的1%左右。蛋白酶体在 细胞新陈代谢的各种功能中扮演了一个至关重要的角色，其主要功能是水解 错误折叠的，不具功能的蛋白质。它具有的另一功能是蛋白酶体对细胞或病 毒蛋白的降解，用于T细胞传递的免疫反应，通过产生主要组织相容性I型 分子的多肽配体完成(for review see Rock and Goldberg, 1999)。通常来说， 蛋白酶体降解的耙标都是通过吸附低聚态的泛素(Ub)进行标记的。泛素是 一种高度保留性，由76个氨基酸残基组成的蛋白，其以共价键同目标蛋白 连接。泛素化是一个可逆的过程，泛素分子可以通过一种泛素水解酶再从目 标分子上脱离。目标蛋白的泛素化和蛋白酶体的水解结合在一起通常称为泛 素/蛋白酶体系统(UPS, ubiquitin/proteasome system) (for review see Rock and Goldberg, 1999; Hershko and Ciecha丽er, 1998)。
26S蛋白酶体是分子量为2.5MDa的多酶复合物，由大约31个亚基构成。 蛋白酶体复合物的蛋白水解活性通过20S蛋白酶体实现，其为一个圆柱状 的、分子量为700kDa的、由4个环形物彼此堆积而成的巨大的核心结构。 20S蛋白酶体作为一种复杂的多酶复合物物，包括14个不同的蛋白，并且 是由两个a-、两个P-环，按照aP(3a的顺序排列组合起来的。20S蛋白酶体的 底物特异性包括三种基本的活性类胰蛋白酶型，胰凝乳蛋白酶型和肽谷氨 酰胺-肽水解(PGPH)型或者甚至半胱氨酸蛋白酶型活性，其位于P-亚基 Z,Y和Z。 20S蛋白酶体在体外降解中，蛋白变性并不依赖于多泛素化；而 另一方面，20S蛋白酶体在体内的酶活性通过连接的19S调控亚基调控，共 同形成具有活性的26S蛋白酶体颗粒。19S调控亚基与多泛素化的蛋白的识 别和目标蛋白的非折叠有关。26S蛋白酶体的活性是依赖于ATP的，并且基 本上只降解多泛素化蛋白质(for a review see Hershko and Ciechanover, 1998)。
3.蛋白酶体抑制剂
许多种药物都是蛋白酶体抑制剂。例如化学修饰的肽醛，如三肽醛 N-苯甲氧甲酰-L-亮氨酰-亮氨酰-L-亮氨酸(zLLL，又名MG132)以及有效 的硼酸衍生物MG232。同zLLL类似，还有很多种修饰多肽，如乙烯基肽砜 (the peptide vinyl sulphone)也是蛋白酶体抑制剂(见Elliott和Ross的综述， 2001)。还有一些天然物质，如乳胞素(LC) (Fenteany等，1995)从链霉菌以 及环氧甲酮四肽中获得，环氧甲酮四肽是放线菌类的天然代谢物(Meng et al., 1999a，b)。乳胞素是一种具有高效特异性，并且不具可逆效果的蛋白酶体抑 制剂，主要用于抑制26S蛋白酶体颗粒的胰凝乳蛋白酶型和类胰蛋白酶型的 活性(Fenteany等，1995)。乳胞素不含多肽的基本结构，却含有一个"内酰 胺环、 一个半胱氨酸和一个羟丁基。乳胞素自身并不抑制蛋白酶体。然而， N-乙酰基半胱氨酸残基在水溶液中水解，得到一个乳胞素(3-内酯变体，其能 穿过细胞膜。当进入细胞后，(3-内酯环开始攻击细胞核，并且随后酯交换卩-
亚基的苏氨酰-l-羟基基团(Fenteany et al., 1995)。
环氧甲酮四肽由于其高效性和特异性，被认为是迄今为止最有效的天然 蛋白酶体抑制剂(Meng等，1999; a, b)。还有一类很有潜质的人造蛋白酶体抑 制剂是硼酸-肽衍生物，尤其是被称为"PS-341"的化合物吡喃基-苯基-亮氨 酸基-硼酸。PS-341在生理环境中非常稳定并且在静脉注射后具有生物可接 受性(Adams and Stein, 1996; Adams et al., 1999, US 1,448，012TW01)。
4.蛋白酶体抑制剂的临床应用
抑制蛋白酶体作为细胞蛋白酶的活性，会导致细胞周期调控、转录、整 细胞的蛋白水解以及MHC-I抗原途径的改变(见CiechaiKwer酰等的综述, 2000)。因此，对蛋白酶体的所有酶活性的持续抑制无法与细胞的存活结合， 因此无法与整个生物体的存活结合。然而，特别的，有可逆作用的蛋白酶体 抑制剂，可以选择性地抑制26S蛋白酶体的单独的蛋白水解活性，而不影响 其他的细胞蛋白酶。最初的对蛋白酶体抑制剂的临床研究(Adams等，1999) 表明这种物质种类具有巨大的药用潜能，具有各种应用基础(见Elliot和Ross 的综述,2001)。近年来，蛋白酶体抑制剂作为一种全新的治疗理念，引起人 们越来越多的关注，特别是它在癌症和炎症病状治疗中的应用(Emot和Ross 的综述，2001)。由"Millennium Inc."公司(Cambridge, MA， USA)开发的蛋白酶 体抑制剂，尤其是硼酸的二肽衍生物和化合物PS-341,主要用于抗炎症、免 疫调节和抗肿瘤治疗(Adams等，1999)。
抑制病毒感染的蛋白酶体抑制剂的应用已经讨论许多。尤其是Schubert 等人(2000 a， b)将蛋白酶体抑制剂用于抑制HIV-l和HIV-2病毒的组装、释 放以及蛋白水解成熟等。该作用是基于HIV蛋白酶特异性地阻断了 gag多聚 蛋白的水解途径，而蛋白酶体抑制剂并不影响病毒蛋白本身的酶活性。与 UPS的进一步的关系在劳氏肉瘤病毒RSV (Patnaik等，2000)、猿免疫缺陷病 毒SIV (Strack等，2000)和埃博拉病毒等的出芽(Harty等，2000)中也有报道。
后者的研究表明(Harty等，2000)，细胞泛素连接酶与埃博拉病毒的基质蛋白 有相互的作用。
5.与蛋白酶体抑制剂相关的专利文献
蛋白酶体抑制剂及其医学用途是许多专利和专利申请的主题。美国专利 5,780,454A(Adams等)中记载了硼酸类化合物、酯类化物、它们的合成以及 作为蛋白酶体抑制剂的应用。在细胞中对NF kappa B的抑制被认为是蛋白 酶体抑制剂的机理。
国际专利申请WO 98/10779的主题是蛋白酶体抑制剂在治疗寄生虫感 染中的应用。
在国际专利WO 99/15183中，其蛋白酶体抑制剂是用于自身免疫缺陷疾 病的治疗。其还涉及UPS在NF-kB传递的HIV-1 LTR启动子激活中的作用， 以及细胞核中的转录过程，该转录过程并不是HIV复制所必需的。专利并没 有记载蛋白酶体抑制剂能阻碍HIV病毒的复制。NF-kB的途径当然不适合 于此。
另外还有一些其他的医疗用途治疗纤维化疾病(US 2005/222043A);防 止移植排斥和感染性休克(EP 0967976A);治疗血管收縮(WO 02/060341 A); 或治疗内皮损伤(WO 2004/012732A)。
还有专利记载了蛋白酶体抑制剂在心脏病适应症中的应用(DE 10040742A)。
专利申请EP 1430903A1，即US2004/0106539A1的发明主题是蛋白酶体 抑制剂在治疗病毒感染中的应用。其中使用蛋白酶体抑制剂作为抑制逆转录 酶病毒释放、成熟和复制的方法。人类免疫缺陷病毒(HIV)的例子说明，蛋 白酶体抑制剂抑制了gag蛋白的加工、病毒颗粒的释放、被释放的病毒颗粒 的感染以及病毒的复制。蛋白酶体可以用于逆转录酶病毒的治疗和预防人类 和动物的引起自身免疫缺陷的晶状病毒的感染，特别是AIDS或HIV导致的
痴呆，蛋白酶体还能和其他抗逆转录酶病毒药物联用。
在专利申请EP 1326632 Al中，提出了处理方法、治疗、抑制肝炎病毒 感染的方法以及抑制与其紧密相连的肝炎发病机理和疾病。在药物制剂中用 于抑制肝炎病毒释放、成熟和复制的药物，作为活性成分，具有共同的性质， 即其抑制细胞中的26S蛋白酶体。这包括上面所述的所有蛋白酶体抑制剂， 其能够影响泛素/蛋白酶体途径的活性，特别是能够影响26S和20S蛋白酶 体复合物的酶活性。因此，该发明主要用于肝炎感染的抗病毒治疗，特别是 用于防止急慢性HBV-和HCV感染的发生和持续，以及防止由此引起的肝 癌。
蛋白酶体抑制剂也能用于处理、治疗和抑制黄科病毒感染(WO 2003/084 Al)。在药物制剂中用于抑制黄科病毒释放、成熟和复制的药物，作为活性 成分，具有共同的性质，即抑制细胞中的26S蛋白酶体。
蛋白酶体抑制剂同样也被用来治疗病毒感染，尤其是引起SARS (严重 急性呼吸综合症)的冠状病毒感染。
然而，泛素/蛋白酶体途径对流感病毒复制的重要性，或者蛋白酶体抑制 剂在预防和/或治疗流感病毒感染中的应用尚未见报道。
在德国专利申请DE 103 00 222 Al中记载了用于抑制IVA复制的活性成 份，其特异性的抑制NF-KB信号途径中的成分。该专利说明书中除提到了多 种相关的特异性-作用的NF-kB抑制剂外，也提到了蛋白酶体抑制剂有可能 作为活性成分，但是没有对此提供足够详细的任何实验数据。相反，它完全 是推测认为蛋白酶体抑制剂同样影响NF-kB信号传递途径。德国专利DE 103 00 222A1的明显缺陷就是它至今还错误地认为蛋白酶体抑制剂对NF-kb活 性的作用与对流感病毒的抗病毒作用有关。因此，其没有提供生产制药学上 有效的组合物的可能性，该组合物含有至少一种蛋白酶体抑制剂和/或至少一 种UPA抑制剂，并且适用于治疗IAV病毒感染。德国专利DE 103 00 222 Al 中也没有提供蛋白酶体抑制剂对流感病毒的抗病毒效果。相反地，本发明将
提供，要达到蛋白酶体抑制剂对NF-KB活性的抑制效果，蛋白酶体抑制剂的 剂量要很高，在标准给药条件下，这种剂量在生物体内是无法达到的；并且
由临床实验可知，蛋白酶体抑制剂在此浓度时有很大的毒性，产生副作用，
从而不具有医学合理性。因此，专利DE 103 00 222A1不能说明蛋白酶体抑 制剂是可以用于生产抗流感病毒的抗病毒药物组合物。
国际专利WO 00/33654A1记载了 HIV-1蛋白酶抑制剂-利托那韦作为蛋 白酶体抑制剂的用途。这种蛋白酶抑制剂在浓度约为10pg时，即比特异性 蛋白酶体抑制剂的有效浓度低10000倍，对蛋白酶体具有非特异性作用。此 外，这种极高的浓度不具有生理适用性。由此可以推知，利用利托那韦永久 性抑制UPS对感染HIV的人采用高剂量的抗逆转录病毒的进行治疗的方法 (HAART)，由于持续缺少26S蛋白酶体，必将产生很大的毒副作用。而迄 今为止，都没有向所有用利托那韦治疗的病人描述这种情况。同样地，该专 利也没有任何实验数据来支持这种纯理论的，同时也已被证明确实是错误的 推断。当然，利托那韦作为HIV的蛋白酶抑制剂，的确抑制了HIV病毒的 活性，但是，这并不是由于它非特异性的作用于蛋白酶体，而是在适当的治 疗浓度下排外地、选择性地抑制fflV病毒的蛋白酶。利托那韦只有在治疗时 不可达的高浓度下可以抑制26S蛋白酶体，并且也只有利托那韦可以达到如 此效果，迄今为止，还没有其他的HIV蛋白酶抑制剂有此效果。基本上，利 托那韦在生物体内对UPS有这种奇特的效果。在专利WO 00/33654 Al中， 也纯理论性的提到了流感病毒，但也只是将其与提高免疫状况联系在一起， 特别关注CD4+T细胞的活性。而没有提到对流感病毒的直接抗病毒作用。 此外，该专利中也没有说明蛋白酶体抑制剂可以作为抗病毒药物用于生产治 疗流感病毒的具有药用效果的药物组合物。
国际专利申请WO 03/064453 A2的主题是俗称的特洛伊病毒抑制剂，其 含有蛋白酶体抑制剂和特洛伊多肽。这种抑制剂也可以用于流感病毒的治 疗。然而，在此专利中同样缺少确凿的实验数据证明所述的抗流感病毒的抗
病毒效果是由特洛伊病毒抑制剂产生的。此外，专利中也没有说明特洛伊病 毒抑制剂的这些可能存在的效果是通过对病毒26S蛋白酶体的特异性抑制 而产生的。进一歩推测，只有通过特洛伊组分，蛋白酶体抑制剂才能到达靶 细胞，然后产生这种特异性效果，这同样缺乏确凿的证据。
因此，专利WO 03/064453 A2中没有说明使用蛋白酶体抑制剂治疗流感
病毒o
泛素连接酶抑制剂是专利WO 2005/007141 A2的主题。其记载了抗病毒 组分、抗癌症药物和用于治疗神经分裂症的化合物。专利中并没有提及流感 病毒。另外，该发明和其他公共出版物都没有表明过泛素连接酶能中断流感 病毒的复制。
总的来说，迄今为止，在所有的蛋白酶体抑制剂的用途中都没有提到它 们对流感病毒的作用以及它们在治疗流感病毒感染中的治疗用途。同样地， 也没有讨论蛋白酶体抑制剂对治疗流感病毒感染的效果。此外，也没有测试 过蛋白酶体抑制剂是否抑制了流感病毒的组装和释放。同样地，至今没有报 道过流感病毒感染和UPS之间的联系。在此基础上，使用细胞泛素连接酶 抑制剂和泛素水解酶抑制剂都是具有新颖性的。
发明内容
本发明根本的任务是制备适于治疗流感病毒感染的药物。这类药物对人 类和动物中的流感病毒感染有抗病毒效果。根据本发明的权利要求的特征， 通过引入UPS抑制剂能达到发明目的。本发明的蛋白酶体抑制剂和泛素连 接酶或泛素水解酶抑制剂都有此作用。
根据本发明，在药物制剂中的具有抗病毒效果的药物含有作为活性成分 的蛋白酶体抑制剂和泛素连接酶或泛素水解酶抑制剂。本发明所述的新型药 物可以用于预防和/或治疗流感病毒感染，特别是A型流感病毒感染。
本发明的特征可参见权利要求书。
此外，本发明的药物还可以用于预防和/或处理、治疗和抑制正黏液病毒 感染。在动物模型中，使用本发明的药物抑制了感染的扩散和因此产生的体 内疾病的发展。因此，该药物可以防止流感病毒感染人类和动物，或者能进 一步治愈已有的感染。
药物制剂有助于解决本发明的任务，药物制剂适用于抑制流感病毒，尤 其是IAV病毒的释放、成熟和复制。
本发明的制剂的特征在于其至少含有一种蛋白酶体抑制剂作为有效成 分。此外，这些药物还可以含有其他的UPS成分。这涉及泛素连接酶和/或 泛素水解酶，如调控蛋白泛素化的酶。因此，本发明的目的， 一方面可通过 蛋白酶体抑制剂组合物达到，另一方面可通过泛素连接酶和/或泛素水解酶达 到。在本发明一优选实施例中，同样地使用纯的蛋白酶体抑制剂，其具有显
著的高膜渗透性和对宿主细胞26S蛋白酶体的高特异性。
根据本发明一较佳实施例，抗病毒效果在IAV病毒感染的细胞中尤其
好。它先诱导流感病毒感染细胞的凋亡，由此生物体内被感染的细胞率先死 亡。同时通过抑制流感病毒的组装和成熟，从而中断感染病毒颗粒的释放和 制造。其总体效果就是，通过阻碍病毒的复制和移除有机体内制造病毒的细 胞，达到治疗的效果。
在本发明的另一实施例中，传统的蛋白酶体抑制剂都可以用来抗击流感
病毒感染。为此，应该首先使用那些只与26S蛋白酶体的P-亚基中具有催化 活性的羟基-苏氨酸基发生相互作用的，由此只特异性的抑制蛋白酶体的抑 制剂。本发明另一实质性要素和惊人的效果在于对UPS的抑制更好的诱
导流感病毒感染细胞的死亡(凋亡)。
通过引入至少一种蛋白酶体抑制剂和/或至少一种泛素连接酶或泛素水 解酶抑制剂来实现本发明的效果。根据本发明，开发了用于治疗病毒感染的
药物。在药物制剂中，该药物含作为活性成分的UPS抑制剂，用于抑制流 感病毒。根据本发明较佳的实施例，所述的物质作为蛋白酶体抑制剂使用，
其能抑制、调控或采用别的方式影响UPS的活性。
所述的物质作为蛋白酶体抑制剂，还可以特异性地影响完整的26S蛋白
酶体复合物的酶活性和游离的、具有催化活性的、不与调控亚基组装的20S 蛋白酶体结构的酶活性。这些抑制剂可以抑制26S或者甚至是20S蛋白酶体 复合物的一种、两种或所有三种的基本的蛋白水解活性(胰蛋白酶、胰凝乳 蛋白酶和肽谷氨酰基肽水解活性)。
本发明还提供了能作为蛋白酶体抑制剂的物质，其可以被高等真核细胞 吸收，在进入细胞后同26S蛋白酶体的P-催化亚基作用，从而可逆或不可逆 的抑制蛋白酶体复合物中的一种或所有的蛋白水解活性。
本发明还引入了能作为特效蛋白酶体抑制剂的物质，其被细胞吸收后， 选择性地抑制26S蛋白酶体的单个酶活性，并且也选择性地抑制蛋白酶体的 特殊组装形式，如免疫蛋白酶体。免疫蛋白酶体是26S蛋白酶体的特殊组装 形式，尤其在受到干扰素处理的剌激后组装形成。当与IAV感染反应时也能 形成免疫蛋白酶体。因此，免疫蛋白酶体的特异性抑制独特的体现了蛋白酶 体抑制剂在IAV感染中的抗病毒效果。因此，本发明也提供了这些可以选择 地抑制免疫蛋白酶体所述的物质。
本发明还涉及用于抑制泛素连接酶和/或泛素水解酶的活性的药物。这些 也属于细胞因子，其与单泛素或多泛素发生相互反应。多泛素化通常被认为 是26S蛋白酶体水解蛋白识别信号，对泛素化途径的影响也同样的调节蛋白 酶体的活性。
在本发明中，作为蛋白酶体抑制剂的药物可以以各种形式摄入体内，可 以是口服胶囊的形式、有或没有细胞特异性输送形式、静脉注射、肌肉注射、 皮下注射、气雾剂吸入的形式；或另外，由于使用特殊的给药方式和剂量， 对特定的细胞和器官呈现出低的细胞毒性和/或高的选择性，并且没有或只有 很小的副作用，和相对较高的代谢半衰期和相对小的机体清除率。
本发明与专利DE 103 00 222A1中描述的解决方法相比，其决定性差别
在于本发明显示蛋白酶体抑制剂对IAV病毒复制的特异性效果不包括
NF-KB信号传递途径，然而涉及一个完全不同的细胞途径，即在IAV病毒感 染中释放具感染性的子代病毒的泛素蛋白酶体途径(UPS)。蛋白酶体抑制 剂对IAV病毒感染的抗病毒效果首次用实验方法和在活的有机体内得到了 证明。因此，本发明证明蛋白酶体抑制剂能同样的影响NF-kB信号传递途 径的论断是错误的。本研究结果清楚地表明(见实施例)，当体内蛋白酶体 抑制剂处于有效浓度时，生物体内病毒的NF-kB信号传递途径没有受到影
此外，作为蛋白酶体抑制剂的物质可以是以其天然的形态，从微生物或 其他天然来源中分离得到、通过化学修饰天然物质得到、完全是人工合成制 造得到、通过基因治疗方法在体内合成得到、或通过基因工程方法在体外或
微生物体中制造得到。这些物质包括
① 天然的蛋白酶体抑制剂
环氧甲酮四肽(Epoxomycin )禾卩Eponemycin; 阿克拉霉素A (AclacinomycinA，又称阿柔比星Aclarubicin); 乳胞素及其化学修饰物，特别是具有细胞膜穿透性的变异体"乳胞素(3-内酯变体"；
② 合成制造的
化学修饰的醛基肽如N-苄氧羰基-L-亮氨酸-L-亮氨酸-L-亮氨酸(又名 MG132或zLLL)，及其硼酸其衍生物MG232; N-苄氧羰基-亮氨酸-亮氨酸-正缬氨酸-H(又名MG115);N-乙酰基-L-亮氨酸-L-亮氨酸-L-正亮氨酸(又名 LLnL); N-节氧羰基-异亮氨酸-谷氨酸(OBut)-丙氨酸-亮氨酸-H(又名PSI);
多肽，其c末端为环氧酮(又名Epoxomicin / Epoxomycin or Eponemycin);乙烯基砜(如节氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-乙烯基 砜或4-羟基-5-碘-3-硝基苯乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-乙烯基砜, 又名NLVS);乙二醛基或硼酸残基(如吡唑基-CONH(CHPhe)CONH(CH-异
丁基)-B(OH)2)又名"PS-431"或苯酰基(Bz)-苯丙氨酸-boroLeu、苯乙酰基 -亮氨酰-亮氨酰-boroLue、苄氧羰基-Phe-boraLeu;频哪醇酯，如苄氧羰基 (Cbz)-亮氨酰-亮氨酰-boroLeu-频哪醇酯； 和
特别合适的是C末端含有环氧酮结构的多肽和多肽衍生物，如环氧甲酮 四肽(Epoxomicin，分子式为C28H86N407)禾口 Eponemycin (分子式为 C20H36N2O5);
尤其是二肽硼酸衍生物，特别是化合物PS-296 (8-喹啉基-磺酰
-CONH-(CH-萘基)-CONH(-CH-异丁基)-B(OH)2);化合物ps-303 (nh2(ch-
萘基-CONH-(CH-异丁基)-B(OH)2);化合物PS-321 (吗啉基-CONH-(CH-萘 基)-CONH-(CH-苯丙胺酰)-B(OH)2);化合物PS-334 (CH3-NH-(CH-萘基 -CO丽-(CH-异丁基)-B(OH)2);化合物PS-325 (2-苯酚-CONH-(CH-homo-苯 丙胺酰)-CONH-(CH-异丁基)-B(OH)2);化合物PS-352 (苯丙胺酰 -CH2-CHrCONH-(CH-苯丙胺酰)-CONH-(CH-异丁基)-B(OH)2);化合物 PS-383 (吡啶基-CONH-(CHpF-苯丙胺酰)-CONH-(CH-异丁基)-B(OH)2;这里 也包括己经由亚当斯等人于1999年报道过的化合物。除了 Epoxomicin和 Eponemycin,硼酸多肽衍生物也是特别合适的化合物。这些蛋白酶体抑制剂 都很有效，对蛋白酶体都具有很好的特异性，不会抑制细胞中的其他蛋白酶， 因此没有副作用。
在本发明中，所述的作为蛋白酶体抑制剂的药物，均具有意想不到的效
果
通过抑制流感病毒的复制，从而阻断传染性子代病毒的产生，防止流感 病毒在有机体中进一步蔓延；
抑制受感染细胞中流感病毒的释放； 限制急性流感病毒感染的蔓延；
抑制流感病毒新感染或反复感染而引起的病毒血症，并增强自身疫系统
和/或使用效果相似或不同的已知药物消除病毒的成功率。
本发明的技术特征反应在各项权利和说明书中，其中单个和多个技术特 征都能结合效果实施例体现，为此要求保护所述的技术特征。本发明还涉及 已知元素和新元素的结合应用——蛋白酶体抑制剂一则和泛素连接酶，二则 和泛素水解酶。
在本发明中，蛋白酶体抑制剂用于
治疗人类和动物中由流感病毒和相关负链RNA病毒造成的流感病毒感 染及其相关疾病；
作为用于影响、抑制或调控泛素/蛋白酶体途径的药物；
作为用于影响完整的26S蛋白酶体复合物的酶活性的药物，和作为用于 影响游离的、不与调控亚基组装的、具有催化活性的20S蛋白酶体结构的酶 活性的药物，以及作为选择性抑制免疫蛋白酶体的药物。
在本发明中，UPS抑制剂的用途还在于
防止疾病的爆发，并减少已感染人体中感染的爆发；
预防由于接触传染性生物样品、被感染的人群及其附近环境而引起的系 统性流感病毒感染。
在本发明中，UPS抑制剂既能系统给药又能局部给药，较佳的是气雾化 给药。本发明的蛋白酶体抑制剂的活性成分可以联合至少一种其他抗病毒有
效物质用以预防和/或治疗流感病毒引起的感染。
图h蛋白酶体抑制剂的气雾剂形式治疗Balb/c小鼠
图1A是小鼠的温度数据图，图1B是小鼠的身体活性数据图。分别采 用蛋白酶体抑制剂(红线)和溶剂(黑线)治疗小鼠，每日治疗3次。图中 的数据是6只小鼠测量数据的平均值，共测量了 288次(每隔5分钟测量一 次)。
图2:蛋白酶体抑制剂对抑制流感病毒复制的有效性-
先将A549细胞(2xl06，图2A、 2B)和MDCK细胞(4xl06，图2C)在标 示浓度的特定蛋白酶体抑制剂中预培育l小时。然后，将其感染禽流感病毒 A/FPV/Bratislava/79(H7N7)(多重感染，MOI = 0.01)。分别在感染后的8h， 24h和36h，收集培养基上清液，在MDCK细胞中采用空斑法测定病毒滴度。
图3:观察时间24小时内，蛋白酶体抑制剂的抗病毒有效浓度条件下对 MDCK细胞无毒性
(图3A， 3B， 3C)采用一定浓度的蛋白酶体抑制剂处理MDCK细胞 (2xl0"。在此毒性试验中，用细胞凋亡释放物质星孢菌素处理MDCK(0.3 pM)
(图中的粗黑线条)。在16h或24h后，收集贴壁细胞和上清液中细胞，用 50吗/ml的碘化丙啶染色。用流式细胞计数仪(BDFACScan)分析处理。从图 中可以看出，相对于未处理实验细胞的存活率。
图4:在抗病毒有效浓度范围内，蛋白酶体抑制剂无法防止TNFa诱导的IkBoi 的降解.-
将A549细胞(2xl06，图4A、 4B)和HEK293细胞(4X 106，图4C、 4D) 在标示浓度的特定蛋白酶体抑制剂中预培育l小时。然后，将所有的细胞用 20 ng/ml的TNFa重组体激活15分钟后将细胞裂解；将裂解产物用SDS凝 胶电泳法分离并转移到硝酸纤维素膜上；用具有IkBoi特异性的兔血清(Santa Cruz Biotechnologies公司)检测IkB(x的降解。
图5: MG132抑制流感病毒的复制
在MG132(10iiM)存在下，用FPV(MOhl)感染A549细胞。24h后，收
集上清液，采用空斑法测定子代病毒滴度。
图6: MG132抑制TRAIL和FasL的病毒诱导性诱导
用FPV (MOPl)感染A549细胞，在含MG132 (10)iM)的培养基中培养。 24h后，将细胞用4%的多聚甲醛固定，并用抗-TRAIL和抗-CD95L染色。
图7: MG132对受感染小鼠的抗病毒效果
用FPV感染C57B1/6小鼠(10VU，滴鼻感染)，8例小鼠通过在笼中雾 化吸入MG132进行处理(实线)，还有14例小鼠未经处理(虚线)。对于笼中 处理，用2ml lmM的MG132 (Sigma公司)气溶胶对这些动物进行为期5 天的治疗。每天，在第一次感染时刻的前1小时开始处理，持续5天。每天 测量动物的体重。如图可见感染FPV的小鼠在MG132处理和未经处理条件 下的存活曲线。
字母縮写列表
DNA 脱氧核糖核酸
kDa 千道尔顿(分子量单位)
Ki 抑制常数
LC 乳胞素
MDa 百万道尔顿
MHC 主要组织相容性复合物
NLVS 蛋白酶体抑制剂z-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸-乙烯基砜(NLVS)
PGPH 肽谷氨酰基肽水解
PI 蛋白酶体抑制剂
PCR 聚合酶链式反应
RNA 核糖核酸
RSV 劳氏肉瘤病毒
RT 逆转录酶
Ub 泛素 UPS 泛素/蛋白酶体系统 Vero-Zellen 人类永久转化细胞株Vero VprfflV-l蛋白Vpr
zLLL 三肽醛N-苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸
具体实施例方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。
实施例l:用气雾剂治疗小鼠后，蛋白酶体抑制剂没有显示出任何有毒副作 用。
为了考察蛋白酶体抑制剂在以气雾剂形式给药后是否存在毒副作用，用 500 nM蛋白酶体抑制剂处理6只小鼠，每天3次，持续5天。在此，2 ml 的蛋白酶体抑制剂(500 nM)是通过一个雾化器(PARI )来达到雾化效果 的。每次治疗10分钟，治疗时间分别在9: 00、 12: 00和15: 00。在实验 中，选6例小鼠，用溶剂(DMSO/H20)处理。为测量小鼠的体温和身体活 性，将一个小型传感器植入小鼠体内。并将信号接收器板置于鼠笼的底部， 此时接收器又将接收到的信号反馈到计算机中，通过特定的数据软件来对这 些数据进行分析处理。
传感器植入小鼠体内后，持续5天考察小鼠的健康状况；然后再进行为 期5天的蛋白酶体抑制剂治疗。治疗期间，分别用蛋白酶体抑制剂和溶剂治 疗的小鼠，其体温(图1A )及身体活性(图1B )均相等。图中以治疗的 第5天为例，显示了第5天的测量值。测量査表明，用浓度为500 nM的蛋 白酶体抑制剂对进行5天的治疗后，小鼠没有表现出明显的毒副作用。因此， 蛋白酶体抑制剂在所属浓度范围内可以在小鼠模型中用来研究对流感病毒 的抗病毒活性。
实施例2:在观察期间，蛋白酶体抑制剂以浓度依赖的方式有效地阻止流感 病毒的复制，并且在有效的抗病毒浓度范围内对宿主细胞没有明显的毒副作 用。
为考察蛋白酶体抑制剂是否抑制流感病毒的复制，选用人类的A549肺
上皮癌细胞(图2A、 2B)或者美地那美犬肾(MDCKII)上皮癌细胞(图2C) 与给定浓度的蛋白酶体抑制剂一起预培育1小时，然后用禽流感病毒株 (A/FPV/Bratislava/79， H7N7)(多重感染，(MOI) = 0.01)感染它们。同时 进行对比实验，将未经处理的细胞感染，确切地说，是仅用二甲亚砜(DMSO) 处理的细胞。所用物质为ps341(10nM和100nM)、ps273(10nM和100nM)、 乳胞素(l pM和lOiiM)以及环氧甲酮四肽(10Nm， 100nM和l(iM)。在病 毒感染开始后8h和24h (图2A)，或8h， 24h和36h(图2B， 2C)，收 集含病毒的培养基上清液，在MDCKII细胞中用空斑法测定病毒滴度。
实验结果表明，蛋白酶体抑制剂有效的抑制了高致病性流感病毒 A/FPV/Bratislava/79的复制并且该效果具有浓度依赖性。
同时，为了考察蛋白酶体抑制剂是否是通过其细胞毒性作用来间接达到 抗病毒的作用，使用抗病毒性最好的蛋白酶体抑制剂ps341、乳胞素以及 Epoxomycin在抗病毒有效浓度条件下处理MDCKII细胞(细胞数2xl06)。 作为对照，采用了高细胞毒性的诱导凋亡的物质星孢菌素(0.3 ^m)。分别 在处理细胞16h和24h后，收集贴壁细胞和已经死亡、脱落的细胞，用PBS 培育，用50pg/ml的碘化丙啶(PI)处理。PI可以插入死亡细胞的DNA链中。 通过流式细胞计数仪(BectonDickinsonFACScan)进行分析。在图3A， 3B和 3C中描述了每组中相对于未处理的对照的死亡细胞的百分比。
实验结果显示，在24小时的观察期间，在抗病毒有效浓度条件下，蛋 白酶体抑制剂没有明显的毒性作用。因此，认为图1中所示的蛋白酶体抑制 剂的抗病毒效果是基于对细胞的毒性作用的观点可以被排除。
实施例3:蛋白酶体抑制剂对流感病毒有抗病毒效果并不依赖于NF-KB作用
为了考察蛋白酶体抑制剂的有抗病毒效果其根源是否是抑制NF-kB信 号途径，考察了蛋白酶体抑制剂存在和不存在的两种条件下，在抑制IkBoc 蛋白(kB的抑制剂)的降解的基础上，通过Western免疫印迹分析NF-kB 的TNFa-诱导活性。为此，将A549细胞(2xl0"或HEK293细胞(4xl0"在不 同浓度的蛋白酶体抑制剂中预培育l小时。然后，将上述细胞用20ng/nl的 TNFa处理15分钟来诱导iKBa的分解。接着这些细胞在lxPBS中培育并且裂 解。其中蛋白质的浓度通过Bradford蛋白质分析法(Biorad)测定，并彼此连 成一条线。用SDS凝胶电泳法将蛋白质分离并转移至硝酸纤维素膜上。并 且通过lKBa特异抗血清(Santa Cruz生物技术)和辣根过氧化物酶连接的二 级试剂(Amersham)，由电化学发光反应使得lKBa-的分解产物具有可视性。
奇怪的是，各种蛋白酶体抑制剂的抗病毒有效浓度不能有效的抑制 TNFa-诱导的lKBa分解，从而抑制NF-kB的活性。例如，PS341 (100 nM) 就无法阻止A549细胞或HEK293细胞中lKBa的降解(如图4B、 4D)。而相 同浓度的PS341在受感染的A549细胞中导致病毒滴度的降低(如图2A， 8h后超过2个对数水平)；同样的，乳胞素(l ^M)降低了病毒滴度(如图2A)， 但没有有效的抑制IkBoc的降解(如图4B、 4D)。
这些都证明了蛋白酶体抑制剂是通过其他的作用机理来达到抗病毒效 果的，而不是抑制NF-kB。
实施例4:在体外和体内，蛋白酶体药理抑制剂MG132干扰了流感病毒诱 导的促凋亡基因的表达和有效抑制流感病毒的复制。
为考察蛋白酶体抑制剂MG132是否干扰流感病毒的复制，研究了人类 的肺上皮细胞株A549在不含以及含有不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132(1， 5, l(VM)的情况下，对高致病性禽流感病毒a/fjw/bratislava/79 (多重感染，
M0I=1)的感染。在抑制剂存在的条件下，将细胞在感染前预培育30分钟。
当细胞感染24小时后，用空斑法检测细胞液中传染性子代病毒的浓度。结 果表明，在MG132存在的条件下，其效果有浓度依赖性，病毒滴度减少了 IO倍(如图5 )。
为了考查病毒滴度的降低是否伴随着促凋亡配体TRAIL以及 FasL/CD95L的减少，分别在不含以及含有不同浓度的蛋白酶体抑制剂 MG132 (10pM)的条件下，将人类的肺上皮细胞株A549感染高致病性禽流感 病毒a/fpv/bratislava/79 (多重感染-l)。感染病毒24小时左右，将细胞用4% 多聚甲醛固定，并加入抗TRAIL和FasL/CD95L的特异性抗体孵育。当该抗 体与荧光染料连接后，将细胞进行流式细胞记数仪分析(FACS)来测定促 凋亡因子的表达。流式细胞记数仪分析谱显示，在存在MG132的条件下， 病毒诱导的FasL和TRAIL的表达情况显现明显减少(如图6 )。
为测试MG132在体内感染模型——小鼠中的抗病毒活性，将C57BL/6 小鼠(IO周大，BFAVTiibinge的品种)进行了适用于小鼠的104感染单位的 高致病禽流感病毒a/fpv/bratislava/79的滴鼻感染。同时将14例未经处理的 小鼠，将其放在隔离笼中，每天5次用lmMMG132的鼻用气溶胶(8例) 进行为期5天的治疗；在第一天感染时间的前l小时开始，每天治疗一次。 测定小鼠的存活率。
结果表明，经过MG132治疗的受感染小鼠其成活率明显比未经治疗处 理的小鼠存活率要大得多(图7)。
实施例5:材料和方法
用蛋白酶体抑制剂治疗小鼠通过呼吸系统来治疗小鼠。为此，将6只 小鼠置于呼吸管中，呼吸管同体积为8.1 x 10—4 m3的中央缸相连，将一个 PARI 的雾化机(Aerosol Nebuliser; Art. no. 73-1963)连接到中央缸。在中央 缸中在1.5bar的压力下雾化蛋白酶体抑制剂或溶剂10min(约2ml)。BALB/c 小鼠每天治疗3次，分别在9:00、 12:00和15:00，持续5天；每天检查小鼠 健康状况两次并测量一次体重。
监测小鼠采用Vital View 的软件和硬件系统(MiniMitterU.S.A.)监
测小鼠的体温和身体活性。该系统能产生小鼠的生理参数，硬件包括一个电 子发射器/接收系统组成。电子发射机收集小鼠的体温和身体活性数据，每隔 5分钟记录一次并传输到PC上。Vital Viex^软件就对这些数据进行分析处
理。 '
为将电子发射器植入小鼠体内，腹膜内注射150W的Ketamin Rompun 麻醉剂麻醉小鼠。将小鼠沿着腹白线在腹部切开一个约1.5厘米的创口，然 后将胃割开，放入电子发射器，伤口用伤口固定器封住(autoclip 9mm; Becton & Dickinson,德国)。将小鼠放回笼中，用Vital ^6 @检测植入是否成功。
细胞的病毒感染将成熟的细胞加入到用感染-PBS稀释了的病毒溶液 中(PBS加1%青霉素/链霉素，l%Ca2+/Mg2+， 0.6%牛血清白蛋白35%)。在 37°C，细胞与特定量的病毒在培养器中培育30分钟，接着重新培养，以将 那些没有结合到细胞中的病毒颗粒除去。
经过该吸附步骤后，细胞加入感染培养液(1%青霉素/链霉素，1% Ca2+/Mg2+)中，将细胞在37'C继续培育直到细胞收获或是测定产生的新一 代子病毒。
检测感染性子代病毒的空斑法为测定病毒溶液中感染颗粒的数量，用 MDCKII细胞进行了空斑分析试验。用一系列500 pl的感染-PBS对数稀释 的病毒溶液感染细胞。在37C下，于培养器中培养30分钟后，将病毒溶液 去除，再将细胞置于培养基和琼脂的混合物中(27 ml ddH20, 5ml的10xMEM, 0.5ml青霉素/链霉素，1.4 ml碳酸氢钠，0.5 ml 1% DEAE-右旋糖苷，0.3 ml 牛血清白蛋白，15 ml 3% oxoid琼脂；500 pi Ca2+/Mg2+)。然后将细胞放置在室 温下，直到培养基/琼脂混合物凝固，然后再将其在37。C时培育2至3天， 直到形成一个可见的溶解细胞的斑块。在培养器中，该斑块用1 ml的中性
红PBD溶液染色1-2小时，使斑块具有可视性。
碘化丙啶的细胞染色碘化丙啶可以渗透死亡细胞的细胞膜并插入的细
胞核的DNA链中。因此，可以用流式细胞计数仪检测垂死和死亡细胞的荧 光来计算它们的数量。用一定浓度的蛋白酶体抑制剂处理MDCK细胞 (2xl06)。用释放细胞凋亡物质Staurosporin(0.3 pM)处理MDCK细胞，以进 行毒性试验。16h或24h后，收集贴壁细胞和其余的细胞，用50)ag/ml的碘 化丙啶染色。再用流式细胞计数仪进行分析检测(BD FACScan)。
SDS凝胶电泳以及Western免疫印迹:将要裂解的细胞先在PBS中培育， 随后再按照每孔加入6孔的量，加入200 的裂解缓冲液RIPA (25 mM tris 缓冲液pH=8, 137 mM NaCl， 10%甘油，0.1% SDS, 0.5%脱氧胆酸钠DOC, 1% NP40, 2 mM EDTA pH8,加入新配置的Pefablock 1:1000，抑肽酶 1:1000， Leupeptin 1:1000,钒酸钠1:100, benzamidine 1:200)。细胞在4° C下振 摇30分钟使其裂解，随后用离心机在4。C ， 14 000转/分钟条件下离心10 分钟，以从细胞碎片中分离出蛋白质。
裂解液中的蛋白质浓度通过Biorad蛋白染料溶液来测定，并且使蛋白含 量相同。随后，将样本替换为5乂的样品缓冲液(10%308,50%甘油，25%|3-巯基乙醇,0.01%溴酚蓝，312 mMtris试剂)。卩-巯基乙醇的作用是通过减少二 硫键使蛋白质变性。因此带有负电荷的蛋白质在电场的作用下向正电极方向 移动，其中较大的蛋白质在凝胶中的滞后效应比较强烈。电泳凝胶包括5% 的结合胶(0.49 ml rotiphoresis凝胶30, 3.25 ml堆叠缓冲液(0.14 M tris pH 6.8, 0.11% temed, 0.11% SDS), 45 ^ 10%过硫酸铵)，其用来浓縮蛋白质，和 10%的分离胶(3.375 ml rotiphoresis凝胶30, 2.5 ml运行缓冲液(1.5 M tris pH 9, 0.4% temed, 0.4% SDS)， 4.025 ml aqua bidest， 200 jil 10% ammonium peroxodisulphate)，其按照分子量大小将蛋白质分离。
凝胶注入两片玻璃板之间，该两片玻璃板通过间隔片保持一定距离，并 保持注入状态。其中先注入分离胶。用异丙醇覆盖，用于聚合，并且在acqua
bidest作用下培育。再在样品室中将结合胶倾注在分离胶上面，注入时不能
有气泡。聚合完毕后，取下样品室，将凝胶放入含有1 x SDS-PAGE缓冲液(5 mMtris，50mM甘油，0.02% SDS)的电泳池中。将变性蛋白质和标记物填入 袋中。以25-40mA的直流电进行凝胶电泳。
之后，将蛋白质从凝胶中通过电场转移到硝酸纤维素膜上。用特异性抗 体来检测固定在硝酸纤维素膜上的蛋白质。这是用一种酶联的二抗识别的， 其中连接的蛋白质可以通过化学发光反应而具有可视性。在这过程中，连接 二抗的辣根过氧化物酶氧化鲁米诺底物，由此，鲁米诺迁移到激发态而发光， 可在X光片上显示。
含有分离蛋白的SDS凝胶从灌注设备上取下，置于两张被印迹缓冲液 (3.9 mM甘氨酸，4，8 mM tris， 0.0037% SDS, 10 %甲醇)浸湿的Whatman纸 上。在加满了印迹缓冲液的湿的印迹槽进行激发之前，将硝酸纤维素膜放在 凝胶上，其间不能有气泡。在400nA的直流电下作用50分钟，蛋白质转移 硝酸纤维素膜上。这时，蛋白质从阴极移向阳极。
根据该印迹程序，室温条件下，用5%奶粉在lxTBST缓冲液(50 pM tris, 0.9% NaCl， 0.05%吐温20， pH 7.6)抑制非特异性结合位点至少45分钟， 来防止抗体和膜非特异性结合。膜随后在一抗(IkBoc，稀释1:1000, Santa Cruz Biotechnologies)中4。C培育晃动过夜。然后用1 x TBST清洗3遍，每 次洗10分钟，洗去非接合的抗体残留物。之后，室温下将膜在二抗中漂洗 1-2小时。
用1 x TBST再清洗三次后，将膜放入含有化学发光增强剂(ECL即增 强化学发光)的环境中，通过添加化学发光基质(250 mM鲁米诺,90mM香 豆酸，1 M tris/HCl pH 8.5， 35% H202);该基质含有的鲁米诺可以用辣根过氧 化物酶来代替和二抗的键合。膜在此种基质中培育1分钟，然后干燥，放置 在X光片盒中，在这其中的化学发光增强剂使其在X光片上显现。
流式细胞记数分析TRAIL和FasL Expression是借助于细胞内荧光染
料与抗体连接的。A549细胞感染病毒株A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (MOI=5) 8小时，其中加入2)iM的莫能菌素以抑制蛋白质的分泌。然后，将细胞置 于4"C的4X多聚甲醛溶液中固定20分钟，然后用渗透缓冲液(0.1%皂素/1% FBS/PBS)洗净。然后用抗TRAIL, FasL的初级抗体孵育或者进行同位素测试 (抗体由BectonDickinson公司提供)。接着细胞用连接生物素-Sp的羊抗鼠 IgG (Dianova)和链酶亲和素-Cy-chrome (Becton Dickinson)染色。用 FACScalibur流式细胞记数仪(Becton Dickinson)在FL3通道内进行荧光测定。 小鼠的感染及治疗10星期大的C57BL/6小鼠(自有品种FLI, Tiibingen) 用于感染和治疗实验。在用5x103至104 pfli浓度的A/FPV/Bratislava/79 (H7N7)病毒株鼻内感染小鼠前1小时内，采用吸入气雾剂形式处理小鼠，2ml 的lmM MG132 (Sigma)稀释液每天一次。MG132溶液气雾化的方法是小 鼠Minivent系统(Hugo Sachs Electronics- Harvard Apparatus)同雾化机(Hugo Sachs Electronics- Harvard Apparatus)连接达至!j雾化作用。
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23. Webster et al., Microbiol Rev, 56, 152-79, 199权利要求
1、一种用于治疗正黏液病毒感染的药物，其特征在于所述的药物含有至少一种蛋白酶体抑制剂和/或至少一种泛素蛋白酶体途径(UPS)抑制剂，上述的抑制剂作为药物制剂中的活性成分。
2、 如权利要求1所述的药物，其特征在于所述的药物含有蛋白酶 体抑制剂和/或泛素连接酶抑制剂和/或泛素水解酶抑制剂，上述的抑制剂作 为UPS抑制剂。
3、 如权利要求1或2所述的药物，其特征在于所述的药物对宿主细胞的26S蛋白酶体具有高特异性。
4、 如权利要求1或2所述的药物，其特征在于所述的药物只与26S 蛋白酶体的卩亚基中具有催化活性的羟基-苏氨酸基团发生相互反应，并只 特异性地抑制蛋白酶体。
5、 如权利要求1或2所述的药物，其特征在于所述的药物在被细胞吸收后，选择性地抑制26S蛋白酶体的单个的酶活性并且额外的选择性地 抑制蛋白酶体的特殊组装模式，优选免疫蛋白酶体。
6、 如权利要求1或2所述的药物，其特征在于所述的药物抑制泛 素连接酶和/或泛素水解酶的活性。
7、 一种如权利要求1 6中任一项所述的药物在制备抗病毒药物和/或 具有抗病毒效用的药物制剂中的应用，其特征在于其能够① 诱导流感病毒感染的细胞的凋亡，从而较佳的导致机体感染细胞的死亡；② 通过抑制流感病毒的组装和成熟，中断感染性病毒颗粒的释放和繁殖。
8、 如权利要求1 6中任一项所述的药物在治疗流感病毒感染中的应用。
9、 如权利要求7或8所述的用途，① 用于病毒感染的治疗；② 用于影响、阻止、调节或抑制耙细胞中泛素/蛋白酶体途径；③ 预防机体中病毒感染的爆发；④ 阻止流感病毒的释放、成熟和复制；⑤ 诱导流感病毒感染细胞的调亡。
10、 如权利要求7 9中任一项所述的用途，其特征在于用于阻止流 感病毒的释放、成熟和复制。
11、 如权利要求7~9中任一项所述的用途，用于抵抗或治疗流感和相 关疾病，特别是人类和动物的全世界流行的和地方流行的流感的爆发。
12、 如权利要求11所述的用途，其可以同已知的抗病毒药物一起使用， 如利巴韦林、白介素、核苷类药物、蛋白酶抑制剂、病毒激酶阻止剂、膜融 合和病毒侵入阻止剂，特别是流感病毒成分阻止剂，如神经氨酸酶阻止剂或 M2离子通道IAV蛋白。
13、 如权利要求11和12所述的用途，用于预防疾病爆发和减少急性 感染了流感病毒的人类和动物体内感染的扩散。
14、 如权利要求7 13中任一项所述的用途，用于抑制特殊靶细胞中的 泛素/蛋白酶体途径，所述的耙细胞是指被流感病毒侵袭的宿主细胞。
15、 如权利要求7 14中任一项所述的用途，以其细胞机制影响靶细胞， 所述的细胞机制是细胞分裂、细胞周期、细胞分化、细胞死亡(凋亡)、细 胞激活、信号传导或抗原处理，特別是NF-kB激活。
16、 如权利要求7所述的用途，用于制备能阻止流感病毒的释放、成 熟和复制的的药物，其特征在于所述的药物含有至少一种蛋白酶体抑制剂 和/或至少一种泛素连接酶抑制剂和/或泛素水解酶抑制剂，上述的抑制剂作 为药物制剂中的活性成分。
17、 如权利要求16所述的用途，用于治疗流感病毒感染，其特征在于 作为蛋白酶体抑制剂的物质，作为较高等的真核细胞的蛋白酶体抑制剂能被吸收，被细胞吸收后，与蛋白酶体的催化亚基反应，从而可逆或不可逆的抑制26S或20S蛋白酶体复合物中的所有或部分蛋白酶体的蛋白水解活性——类胰蛋白酶型、类胰凝乳蛋白酶型和类肽谷氨酰基肽型蛋白酶型水解活性。
18、如权利要求16或17所述的用途，其特征在于所述的药物制剂含有除蛋白酶体抑制剂以外的其他药物，所述的药物影响、调节或阻止细胞 泛素系统，如① 泛素连接酶的活性和/或② 泛素水解酶的活性③ 与泛素反应的细胞因子的活性④ (1)与单泛素反应的细胞因子的活性或(2)与多泛素反应的细胞因子的活性。
19、如权利要求16~18中任一项所述的用途，其特征在于作为蛋白酶体抑制剂使用的物质以各种形式摄入体内，包括有或没有细胞特异性输送修 饰的口服胶囊的形式、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、吸入气雾剂的形式、 或其他方式，由于使用特殊的给药方式和/或剂量，所述物质具有低细胞毒性， 因而没有或只有很小的副作用，以及具有相对较高的代谢半衰期和相对小机 体清除率。
20、如权利要求16~19中任一项所述的用途，其特征在于所述的物质是① 以天然的形式从微生物或是其他天然来源中分离得到，或② 对天然物质进行化学修饰后得到；③ 全合成的物质； 通过基因治疗法在体内合成； 通过基因工程法在体外制造，或 ⑥在微生物中； 所述的物质作为蛋白酶体抑制剂物质。
21、 如权利要求16 20中任一项所述的用途，其特征在于所述的物质 属于下列物质类型① 天然存在的蛋白酶体抑制剂C末端为环氧酮结构的多肽衍生物、 卩-内酯衍生物、阿克拉霉素A (又称阿柔比星)、乳胞素及其化学修饰变异体，如细胞膜渗透性变异体"乳胞素(3-内酯变异体"-，② 合成的蛋白酶体抑制剂化学修饰的醛基肽，如N-苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸(又名MG132或zLLL)，及其硼酸衍生物MG232; N-苄氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-正缬氨酸-H (称为MG115); N-乙酰基-L-亮氨酰 -L-亮氨酰-L-正亮氨酸(称为LLnL); N-苄氧羰基-异亮氨酰-谷氨酰(OBut)-丙氨酰-亮氨酸-H (又名PSI);③ 在C末端具有a，(3-环氧酮结构，优选乙烯基砜的多肽，如 (1)苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-乙烯基砜，或(2 ) 4-羟基-5-碘-3-硝基苯乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-乙烯基 砜，(NLVS)④ 乙二醛基或硼酸残基，如(1) 吡唑基-CONH(CHPhe)CONH(CH-异丁基)B(OH)2)，和(2) 二肽硼酸衍生物或 .⑤ 频哪醇酯，如苄氧羰基(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-频哪醇酯；上述物质作为蛋白酶体抑制剂。
22、 如权利要求16-21中任一项所述的用途，所述的环氧酮是环氧甲酮 四肽(epoxomycin, 分子式为C28H86N407)、禾口/或Eponemycin (eponemicin， 分子式为C2QH36N205);所述的环氧酮作为特别合适的蛋白酶体抑制剂。
23、 如权利要求11 17中任一项所述的用途，其特征在于 ①化合物PS-519，如卩-内酯的和乳胞素的衍生物，即化合物1R-[1S，4R，5S]]-1-(1-羟基-2-甲基丙基)-4-丙基-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]庚烷 -3,7-dione，其分子式为C12H19N04-② 化合物PS-303 (NH2(CH-萘基-CONH-(CH-异丁基)-B(OH)2)和/或③ 化合物PS-321 (吗啉基-CONH-(CH-萘基)-CONH-(CH-苯丙胺 酰)-B(OH)2)和/或 化合物PS-334 (CHrNH-(CH-萘基-CONH-(CH-异丁基)-B(OH)2)和/或⑤ 化合物PS-325 (2-苯酚-CONH-(CH-homo-苯丙胺酰)-CONH-(CH-异丁 基)-B(OH》;)禾口/或⑥ 化合物PS-352 (苯丙胺酰-CH2-CH2-CONH-(CH-苯丙胺 酰)-CONH-(CH-异丁基)-B(OH)2)和/或⑦ 化合物PS-383 (吡啶基-CONH-(CHpF-苯丙胺酰)-CONH-(CH-异丁 基)-B(OH)2是PS系列中特别适合的蛋白酶体抑制剂。
24、 如权利要求16所述的用途，用于影响完整的26S蛋白酶体复合物 和游离的、具有催化活性的、不与调控亚基组装的20S蛋白酶体结构的酶活 性。
25、 如权利要求7~24中任一项所述的用途，UPS抑制剂的给药形式是 整体和局部给药，较佳的是气雾剂形式给药。
全文摘要
本发明涉及用于预防和/或治疗病毒感染的药物，特别是释放流感传染物的流感病毒所造成的感染。本发明的主题是含有作为活性成分的泛素蛋白酶体系统抑制剂的药物，尤其是含有蛋白酶抑制剂的药物。此外，本发明还涉及蛋白酶体抑制剂的整体和局部给药，较佳的是气雾剂的形式给药。本发明的蛋白酶体抑制剂的活性成分可与至少一种具有其他抗病毒活性的物质连用，用于预防和/或治疗由流感病毒引起的感染。
文档编号A61P31/12GK101384301SQ200780005834
公开日2009年3月11日 申请日期2007年2月16日 优先权日2006年2月17日
发明者乌尔里希·舒伯特, 奥利弗·普兰茨, 斯特凡·路德维希 申请人:维乐罗吉克有限公司