专利名称：猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种白介素-12的应用，具体涉及一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备 方法。
背景技术：
迄今为止，许多传染性疾病尚未得到有效防治，现行的灭活疫苗或弱毒疫苗等传统疫苗 或免疫效力低下，或存在安全性问题，促使人们开发安全有效的新型疫苗。基于重组DNA技 术的基因工程疫苗安全可靠、易于鉴别诊断，具有很大的应用前景，但其抗原性一般较弱， 需要有效的免疫佐剂以增强其保护效力。
发明内容
本发明的目的在于针对pIL-12在猪各种疾病中的免疫调节作用，以及开发治疗免疫功能 紊乱的免疫调节剂及某些炎性疾病的抗炎防治剂，提供了一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂 及制备方法。
本发明的技术方案为 一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂，pIL-12包括两个亚基的编码 基因p35和p40， p35编码基因大小为720bp， p40为1044bp,分别编码223个氨基酸和325 个氨基酸的多肽。
一种猪疫苗使用的PIL-12基因佐剂的制备方法，从LPS活化的猪外周血单个核细胞 (PBMC)提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-12两个亚基的编码基因p35和p40，然 后将p35基因和p40基因分别亚克隆到原核表达载体pET30c、 pET30b中，克隆pIL-12基因。
优选的是，所述的RNA的提取过程为从猪前腔静脉采血，然后用淋巴细胞分离液分离 外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640培养基进行培养，并加LPS于细胞培养液，分别 取诱导2小时和12小时的细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA。
4优选的是，所述的RPMI1640培养基含有10U/ml青霉素、10U/ml链霉素和10%胎牛血清。
优选的是，所述的RT-PCR方法为分别取诱导2小时和12小时的细胞所提取的总RNA， 加入适量下游引物P2、 P4，然后分别加入dNTP、 10Xbuffer、 RNasin、 AMV反转录酶，再 加入适量的Ex.Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，组成2个反转录扩增体系，合成p35和p40 的PCR产物p35 cDNA和p40 cDNA。扩增结束后取5mL混合物，利用2%琼脂糖凝胶进行 电泳。将p35和p40的PCR产物分别用BamHI和EcoRI酶切鉴定。
优选的是，所述的扩增体系包括p35扩增体系和p40扩增体系，p35扩增体系的反应条 件为预加热95。C5min，然后94°C lmin， 54°C lmin， 72°C lmin， 30个循环，最后72。C延 伸10min; p40扩增体系及反应条件与p35相似，不同之处是退火温度为56°C。
优选的是，所述的克隆pIL-12基因的过程为取和Sa/I酶切处理的原核表达载体 pET30c、 pET30b和p35或p40的PCR产物，分别加入T4 DNA连接酶和10Xbuffer,组成两 个连接反应体系，16'C进行12小时连接反应，连接产物转化￡工0// JM109感受态细胞，挑 取阳性菌落，提取质粒。
优选的是，所述的克隆的鉴定为将提取的质粒用PCR和SacI、 Sa/I双酶切进行鉴定并 筛选阳性克隆。
本发明的有益效果为白细胞介素-12 (IL-12)又名NK细胞刺激因子(NKSF)或细胞 毒淋巴细胞成熟因子(CLMF),能诱导T细胞和NK细胞产生IFN- Y ，并增强其细胞毒活性， 它的关键作用是能诱导ThO细胞分化为Thl细胞以激发细胞免疫进程。IL-12是启动保护性 细胞免疫的有效佐剂，在调节机体非特异性和特异性免疫方面具有重要作用，其调节方式主 要通过刺激NK细胞和细胞毒淋巴细胞来完成。IL-12能调节免疫反应的方向，这为细胞因子 佐剂应用于灭活疫苗提供了理论基础。按预期反应类型来调节保护性免疫，即调控疫苗诱导 的免疫反应，使之朝细胞免疫为主的方向发展而不是体液免疫为主的方向发展，这在开发以 细胞免疫为主的感染性疾病的有效疫苗方面很有意义。
图l为本发明具体实施例p35/pET30c的构建示意图；图2为本发明具体实施例p40/pET30b的构建示意图3为本发明具体实施例P35亚基的基因序列及预测蛋白的氨基酸序列图4为本发明具体实施例P40亚基的基因序列及预测蛋白的氨基酸序列图。
具体实施例方式
如图1至4所示，本发明的具体实施例， 一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂，pIL-12 包括两个亚基的编码基因p35和p40, p35编码基因大小为720bp， p40为1044bp，分别编码 223个氨基酸和325个氨基酸的多肽，序列分析显示，pIL-12的p35亚基基因序列与GenBank 发表的完全一致，而p40亚基基因与GenBank发表的只有微小差异，提示p40基因可能存在 多态性。然后将p35基因和p40基因分别亚克隆到原核表达载体pET30c、 pET30b中，用IPTG 诱导培养，分别表达出了预期分子量大小的重组蛋白。
一种猪疫苗使用的PIL-12基因佐剂的制备方法，从LPS活化的猪外周血单个核细胞 (PBMC)提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-12两个亚基的编码基因p35和p40，然 后将p35基因和p40基因分别亚克隆到原核表达载体pET30c、 pET30b中，克隆pIL-12基因。
RNA的提取过程为从猪前腔静脉采血，然后用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞 (PBMC)，用RPMI1640培养基进行培养，并加LPS于细胞培养液，分别取诱导2小时和 12小时的细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA。所述的RPMI1640培养基含有10U/ml青霉素、 10U/ml链霉素和10%胎牛血清。
RT-PCR方法为分别取诱导2小时和12小时的细胞所提取的总RNA，加入适量下游 引物P2、 P4，然后分别加入dNTP、 10Xbuffer、 RNasin、 AMV反转录酶，再加入适量的Ex.Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，组成2个反转录扩增体系，合成p35和p40的PCR产物p35 cDNA 和p40cDNA。扩增体系包括p35扩增体系和p40扩增体系，p35扩增体系的反应条件为预 加热95。C5min，然后94。C lmin， 54°C lmin， 72°C lmin， 30个循环，最后72'C延伸10min; p40扩增体系及反应条件与p35相似，不同之处是退火温度为56°C。扩增结束后取5pL混合 物，利用2%琼脂糖凝胶进行电泳。将p35和p40的PCR产物分别用BawHI和EcoRI酶切 鉴定。
克隆pIL-12基因的过程为取和酶切处理的原核表达载体pET30c、 pET30b 和p35或p40的PCR产物，分别加入T4 DNA连接酶和lOXbuffer，组成两个连接反应体系，16'C进行12小时连接反应，连接产物转化E.0^ JM109感受态细胞，挑取阳性菌落，提取 质粒。
克隆的鉴定为将提取的质粒用PCR和SacI、 Sfl/I双酶切进行鉴定并筛选阳性克隆。
权利要求
1. 一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂，其特征在于pIL-12包括两个亚基的编码基因p35和p40，p35编码基因大小为720bp，p40为1044bp，分别编码223个氨基酸和325个氨基酸的多肽。
2. —种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于从LPS活化的猪外周血 单个核细胞(PBMC)提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-12两个亚基的编码基 因p35和p40,然后将p35基因和p40基因分别亚克隆到原核表达载体pET30c、 pET30b 中，克隆pIL-12基因。
3. 如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于所述的 RNA的提取过程为从猪前腔静脉采血，然后用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640培养基进行培养，并加LPS于细胞培养液，分别取诱导2小 时和12小时的细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA。
4. 如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于所述的 RPMI1640培养基含有10U/ml青霉素、10U/ml链霉素和10%胎牛血清。
5. 如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于所述的 RT-PCR方法为分别取诱导2小时和12小时的细胞所提取的总RNA，加入适量下游引 物P2、 P4，然后分别加入dNTP、 lOXbuffer、 KNasin、 AMV反转录酶，再加入适量的 Ex.TaqDNA聚合酶进行PCR扩增，组成2个反转录扩增体系，合成p35和p40的PCR 产物p35 cDNA和p40 cDNA。扩增结束后取5pL混合物，利用2%琼脂糖凝胶进行电 泳。将p35和p40的PCR产物分别用Ba/wHI和EcoRI酶切鉴定。
6. 如权利要求5所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于所述的 扩增体系包括p35扩增体系和p40扩增体系，p35扩增体系的反应条件为预加热95t: 5min，然后94°C lmin， 54°C lmin, 72°C lmin， 30个循环，最后72。C延伸10min; p40 扩增体系及反应条件与p35相似，不同之处是退火温度为56°C。
7. 如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于所述的 克隆pIL-12基因的过程为取和Safl酶切处理的原核表达载体pET30c、 pET30b 和p35或p40的PCR产物，分别加入T4 DNA连接酶和10Xbuffer，组成两个连接反应 体系，16'C进行12小时连接反应，连接产物转化E,co// JM109感受态细胞，挑取阳性 菌落，提取质粒。
8. 如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于所述的 克隆的鉴定为将提取的质粒用PCR和S"cI、 S"/I双酶切进行鉴定并筛选阳性克隆。
全文摘要
本发明涉及一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备方法，pIL-12包括两个亚基的编码基因p35和p40；从LPS活化的猪外周血单个核细胞(PBMC)提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-12两个亚基的编码基因p35和p40，然后将p35基因和p40基因分别亚克隆到原核表达载体pET30c、pET30b中，克隆pIL-12基因。IL-12是启动保护性细胞免疫的有效佐剂，在调节机体非特异性和特异性免疫方面具有重要作用，其调节方式主要通过刺激NK细胞和细胞毒淋巴细胞来完成。IL-12能调节免疫反应的方向，这为细胞因子佐剂应用于灭活疫苗提供了理论基础。
文档编号A61K39/39GK101468202SQ200710306038
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月29日 优先权日2007年12月29日
发明者温建新, 峰 邵 申请人:邵 峰;温建新