专利名称：用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球及制法和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明属于明胶衍生物材料的制备领域，特别涉及明胶与钙磷酸盐和
一种鹿茸多肽生物活性组织或骨形态发生蛋白(BMP)合成出的复合多孔 微球材料，该材料是一种具有良好的生物相容性和诱导成骨活性的骨修复 生物材料。
背景技术：
明胶是胶原降解的产物，它不仅很好地保持了胶原作为生物材料所特 有的一些优点，而且与胶原相比，明胶无抗原性，植入体内无排异反应； 明胶价廉易得；易溶于水；其物理化学性质的检测手段已经发展得比较成 熟、规范。因此，明胶与钙磷酸盐复合物材料也是目前骨修复材料研究中 的一个热点。
传统的明胶与钙磷酸盐复合物材料大多为颗粒型或形状不规则的块 体(B. S. Chang， C. K. Lee， K. S. Hong， et al. Osteoconduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations. Biomaterials， 2000, 21: 1291 1298.)，这种传统材料在作为骨修复材 料使用时，会引起患者体内的炎症反应，而且新骨形成的速率较低，成骨 量较少。另外，传统的明胶与钙磷酸盐复合物材料在力学性能及降解速率 方面都存在着严重的缺陷，使得该复合物材料在应用于骨修复时仍存在着 许多的问题。
研究表明将明胶和羟基磷灰石(HAP)以某种形式复合成微球形态， 改善了骨修复材料的力学性能和降解速率，利用该种复合微球材料良好的 柔韧性，填充骨缺损造成的各种不同形状的空穴。最重要的是，以研制球 形形态的骨修复材料，增加了种植体与其周围骨组织的接触面积，大大促 进了界面与界面之间的紧密度，能更好地发挥材料的成骨性作用。鹿茸是哺乳类动物唯一可以再生的骨类组织，在药典记载己有几千年
历史。鹿茸中存在着多种己知的生长因子，如胰岛素样生长因子I(IGF-1)、 生长激素(GH)以及与骨生长和骨重建有关的多细胞生长因子TGFP1和 TGF 0 2等，并认为正是这些生长因子的共同存在和综合效应使鹿茸快速生 长。我们从鲜鹿茸中提取的鹿茸多肽为主要活性成分，与明胶和钙磷酸盐 合成为一体的多孔微球，这无论在材料的制备技术上还是材料本身，对骨 修复及治疗功效上都是一大提高。 .
清华大学颜永年等应用钙磷盐粉体和甲壳素/壳聚糖纤维制成复合物 (专利申请号200410034109.3)，其中也添加了少量胶原(明胶)，及骨 形态蛋白，经细胞和动物实验证实该材料具有良好的生物活性和诱导成骨 活性。崔福斋等(专利申请号01136246.4)在酸溶胶原液中，通过沉淀 法制备得到胶原/钙磷酸盐无定型粉体材料，其成分与天然骨类似。
天津大学(专利申请号200410019979.3)提出一种富含海藻酸钠和 羟基磷灰石的复合微球的制备方法，该法采用羟基磷灰石粉体与海藻酸钠 共同加入的方法，通过乳化作用形成粒径在200um 300um左右复合微球。
本发明通过在明胶乳液中使可溶性钙盐与磷盐共沉淀的方法，制备成 复合多孔微球，反应中添加适量鹿茸多肽或骨形态发生蛋白，制得骨修复 复合材料及该复合材料的制备方法还未见有文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物相容性好，含有特定促骨活性物质(如 鹿茸多肽或骨形态发生蛋白)、容易批量制备、形貌可控、价格低廉的用 于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球。
本发明的再一目的是提供用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微 球的制备方法。
本发明的另一目的是提供用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微 球在用于骨修复材料方面的用途。
本发明的用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球是一种在明胶 微球中均匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽或骨形
态发生蛋白；其中，活性物质鹿茸多肽或骨形态发生蛋白是明胶重量的1°; 5%;形成转磷酸盐的可溶性钙盐为每克明胶的0.0003 0.03mo1，可 溶性磷酸盐的量使得Ca元素与P元素的比例为1: 1 2: 1，优选Ca元素 与P元素的比例为1.5:1。
所述的明胶微球中进一步均匀分散有交联剂，所述的交联剂的量为在 反应中交联剂的添加量为每克明胶添加30ul 1000ul的交联剂，优选是 每克明胶添加500ul的交联剂，交联剂的质量浓度为5%。 15%。
所述的用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球的直径在500nm 500um。
所述的用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球上的孔的直径在 10nm 20um。
本发明的用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球的制备方法包
括以下步骤
1) 首先称取一定量的明胶粉体，加入一定量的去离子水，加热至30
7(TC，制备质量浓度为5% 30%的明胶溶液，然后向明胶溶液中添加可 溶性钙盐，其添加量为每克明胶粉体加入O. 0003 0. 03mol的可溶性钙盐； 随后，再加入可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽或骨形态发生蛋白，鹿茸 多肽或骨形态发生蛋白的添加量均为明胶重量的1%。 5。％;
2) 将步骤1)制得的混合液倒入含有表面活性剂的油中，搅拌形成明 胶溶液的油包水乳化液；表面活性剂在油中的含量是lg/200ml油 lg/20ml油；所用油的量为每克明胶5ml 250ml;
3) 将步骤2)制得的明胶溶液的油包水乳化液加热，温度控制在30 。C 7(TC，优选温度是45。C，并持续搅拌0.5 3小时，优选搅拌1小时， 搅拌速度为100转/分钟 6000转/分钟；然后加入可溶性磷酸盐溶液，可 溶性磷酸盐溶液的质量浓度为5% 15%，磷酸盐的加入量使混合液中的 Ca元素与P元素的比例控制在1: 1 2: 1，优选Ca元素与P元素的比例 为1.5:1;
4) 将步骤3)制得的混合液在3(TC 7(TC温度下搅拌1 5小时，继 续搅拌下，用冰浴冷却20 80分钟；形成明胶微球中均匀分散有钙磷酸 盐及可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽或骨形态发生蛋白；
5) 向步骤4)制得的混合液中加入交联剂，交联剂的质量浓度为5%。 15%，交联剂的添加量为每克明胶添加30ul 1000ul的交联剂，优选是 每克明胶添加500ul的交联剂，继续搅拌20分钟 100分钟；
6) 取步骤4)或5)制得的混合液，加入丙酮，加入量为混合液中水 份体积的2 8倍，优选是混合液中水份体积的3倍，继续搅拌0.5 6小 时后，优选继续搅拌1 2小时后，过滤，得到复合多孔微球的粗品；
7) 将步骤6)得到的复合多孔微球的粗品用丙酮反复洗涤后，得到用 于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球。
所述的可溶性钙盐选自氯化转、硝酸钙或醋酸钙等中的一种或大于一 种的混合物。
所述的可溶性磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或磷酸氢胺等中的 一种或大于一种的混合物。
所述的表面活性剂是油包水型表面活性剂，包括司班(SPAN)系列(如 SPAN80、 SPAN60、 SPAN20)或琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT)表面活性剂之中 的一种。
所述的油选自硅油、豆油、橄榄油、茶油、菜籽油或调和油中的一种。 所述的交联剂选自戊二醛、甲醛、双醛葡萄糖等中的一种或大于一种 的混合物。
本发明制备的用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球，经细胞实 验和动物实验都表明该复合多孔微球材料具有良好的生物相容性和诱导 成骨活性，是一种可靠的体内可降解的组织修复及治疗材料，能够作为生 物组织(如骨、软骨、牙)修复中的材料，具有广泛的应用价值。
本发明以传统粉体明胶制得明胶溶液，而后分散在油浴中变为明胶溶 液的油包水乳化液作为反应介质，通过向明胶溶液的油包水乳化液中添加 可溶性的钙盐和磷酸盐，使可溶性钙盐和磷酸盐在明胶微球内部进行沉淀 反应，反应过程中适量添加各种促骨生长活性物质(鹿茸多肽或骨形态发 生蛋白)，最终得到用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球，该复合 多孔微球表面有孔洞，便于细胞的攀附和生长。
本发明在制备出形态较好的复合多孔微球的基础上又添加活性鹿茸 多肽或骨形态发生蛋白，这对于促进骨髓间质细胞分化，软骨细胞、表皮细胞及成纤维细胞增殖等作用，具有明显的加速骨组织再生、周围神经组 织再生及创伤特别是溃疡疮面愈合等功效。该复合多孔微球材料可用于
骨、牙缺损的修复；可作为骨水泥的固相原料；可直接作为骨创手术中的 骨缺损部位的填充物。
具体实施例方式
实施例1.
1、 准确称取1克明胶粉体放入100ml的烧杯中，加入5ml去离子水，将
其置于5o士rc水浴中搅拌溶解，随后向烧杯中加入形成钙磷酸盐所需的 0.0025mol硝酸钙固体，而后加入鹿茸多肽3mg，配成混合溶液。
2、 在转速为500转/分钟的搅拌下，将上述溶液缓慢地滴加到50ml溶 1^双iflHfrr土力'morAi、 ou，丄g/3um丄,tj、j立niKH卞，7r,;j乂"力/jx滑很trjiffl'ti/jv字L 化液，反应温度保持在45 ± rc，并继续搅拌2小时，再向乳液体系中
滴加质量浓度为5%的阪2朋04溶液(Ca/P摩尔比为5: 3)。
3、 反应结束后，45 ± rc的反应物迅速移入至冰水浴中，并保持搅拌，
冷却40分钟，使得含有钙磷酸盐的明胶微球凝胶化，形成明胶微球中均 匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽。
4、 向冷却后的反应体系中，加入质量浓度为8X的戊二醛交联剂600ul 进行交联，搅拌30分钟，再向体系中加入丙酮30ml，对复合物微球进行 脱水。
5、 反应物停止搅拌，将浆液抽滤、滤饼为复合多孔微球粗品，将其用 30ml丙酮重复洗涤3次，得到的最终产物为浅黄色明胶与f丐磷酸复合多孔 微球的粉末。
该粉末粒径为25um士5um，表面孔径为lum士50nm。复合多孔微球粉 末由钙磷酸盐、鹿茸多肽和交联后的明胶组成，该复合多孔微球材料用于 骨、牙缺损的修复；作为骨水泥的固相原料；直接用于骨创手术中的骨缺 损部位的填充物。
实施例2.
1、准确称取1克明胶粉体放入100ml的烧杯中，加入5ml去离子水，将 其置于5o士rc水浴中搅拌溶解，随后向烧杯中加入形成钙磷酸盐所需的0.003mol氯化韩固体，而后向其中加入20mg鹿茸多肽，配成混合溶液。
2、 在转速为500转/分钟的搅拌下，将上述溶液缓慢地滴加到100ml溶 有表面活性剂(SPAN 60-lg/50ml)的橄榄油相中，形成明胶溶液的油包水 乳化液，反应温度保持在45 ± 1 °C，并继续搅拌2小时，再向乳液体系 中滴加质量浓度为10XNa2HP04溶液(Ca/P摩尔比为5: 3)。
3、 反应结束后，45i:士rc的反应物迅速移入至冰水浴中，并保持搅拌，
冷却40分钟，使得含有钙磷酸盐的明胶微球凝胶化，形成明胶微球中均 匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽。
4、 向冷却后的反应体系中，加入丙酮30ml，继续搅拌40分钟，对复合
物微球进行脱水，
5、 反应物停止搅拌，将浆液抽滤、滤饼为复合多孔微球粗品，将其用 30ml丙酮重复洗涤4次，得到的最终产物白色明胶/磷酸钙复合多孔微球 的粉末。
该粉末粒径为25um士5um，表面孔径为lum土50nm。复合多孔微球粉 末由钙磷酸盐、鹿茸多肽和交联后的明胶组成，该复合多孔微球材料用于 骨、牙缺损的修复；作为骨水泥的固相原料；直接用于骨创手术中的骨缺 损部位的填充物。
1、 准确称取1克明胶粉体放入100ml的烧杯中，加入5ml去离子水，
将其置于4o士rc水浴中搅拌溶解，随后向烧杯中加入形成钙磷酸盐所需
的0.01mol氯化钙固体，配成含有一定钙离子浓度的明胶溶液，而后向其 中加入20mg鹿茸多肽，并将其分散均匀。
2、 在转速为200转/分钟的搅拌下，将上述溶液缓慢地滴加到75ml溶 有表面活性剂(琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT) -lg/50ml)的茶油相中，形成 明胶溶液的油包水乳化液，反应温度保持在45 ± 1 °C，并继续搅拌2 小时，再向乳液体系中滴加质量浓度为10XNa2HP04溶液(Ca/P摩尔比为 1.5: 1)。
3、 反应结束后，45 ± rc的反应物迅速移入至冰水浴中，并保持搅拌，
冷却30分钟，使得含有钙磷酸盐的明胶微球凝胶化，形成明胶微球中均 匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽。4、 向冷却后的反应体系中，加入质量浓度为4X甲醛600ul交联，搅拌 20分钟，再向体系中加入丙酮30ml，对复合物微球进行脱水。
5、 反应物停止搅拌，将浆液抽滤、滤饼为复合多孔微球粗品，将其用 30ml丙酮重复洗涤3次，得到的最终产物为浅黄色明胶/磷酸钙复合多孔 微球的粉末。
该粉末粒径为45um士5um，表面孔径为5um士50nm。复合多孔微球粉 末由钙磷酸盐、鹿茸多肽和交联后的明胶组成，该复合多孔微球材料用于 骨、牙缺损的修复；作为骨水泥的固相原料；直接用于骨创手术中的骨缺 损部位的填充物。
实施例4.
1、 准确称取1克明胶粉体放入100ml的烧杯中，加入5ml去离子水， 将其置于50 ± 1。C水浴中搅拌溶解，随后向烧杯中加入形成钙磷酸盐所 需的0.004mo1醋酸钙固体，配成含有一定钙离子浓度的明胶溶液，而后 向其中加入骨形态发生蛋白3mg，并搅拌均匀。
2、 在转速为200转/分钟的搅拌下，将上述溶液缓慢地滴加到150ml溶 有表面活性剂(SPAN 80-lg/50ml)的调和油相中，形成明胶溶液的油包水 乳化液，反应温度保持在45 ± 1 'C，并继续搅拌2小时，再向乳液体系 中滴加质量浓度为5XNaH2P04溶液(Ca/P摩尔比为2: 1)。
3、 反应结束后，45 ± rc的反应物迅速移入至冰水浴中，并保持搅拌，
冷却50分钟，使得含有钙磷酸盐的明胶微球凝胶化，形成明胶微球中均 匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生长的活性物质骨形态发生蛋白。
4、 向冷却后的反应体系中，加入质量浓度8X戊二醛600ul交联，搅拌 50分钟，再向体系中加入丙酮30ml，对复合物微球进行脱水。
5、 反应物停止搅拌，将浆液抽滤、滤饼为复合多孔微球粗品，将其用 30ml丙酮重复洗涤3次，得到的最终产物为浅黄色明胶/磷酸钙复合多孔 微球的粉末。
该粉末粒径为45um士5um，表面孔径为5um士50nm。复合多孔微球粉 末由钙磷酸盐、鹿茸多肽和交联后的明胶组成，该复合多孔微球材料用于 骨、牙缺损的修复；作为骨水泥的固相原料；直接用于骨创手术中的骨缺 损部位的填充物。实施例5.
1、 准确称取1克明胶粉体放入100ml的烧杯中，加入5ml去离子水，
将其置于50土 rc水浴中搅拌溶解，随后向烧杯中加入形成钙磷酸盐所需
的0.0008mol硝酸f丐固体，配成含有一定钙离子浓度的明胶溶液，而后向 其中加入骨形态发生蛋白20mg，并搅拌均匀。
2、 在转速为2000转/分钟的搅拌下，将上述溶液缓慢地滴加到200ml 溶有表面活性剂(SPAN 80-lg/50ml)的菜籽油相中，形成明胶溶液的油包 水乳化液，反应温度保持在45 ± 1 。C，并继续搅拌2小时，再向乳液体 系中滴加质量浓度为10%(丽4)2朋04溶液(Ca/P摩尔比为1.5: 1)。
3、 反应结束后，45 ± rc的反应物迅速移入至冰水浴中，并保持搅拌，
冷却60分钟，使得含有钙磷酸盐的明胶微球凝胶化，形成明胶微球中均 匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生长的活性物质骨形态发生蛋白。
4、 向冷却后的反应体系中，加入质量浓度8%甲醛500ul交联，搅拌 60分钟，再向体系中加入丙酮25ml，对复合物微球进行脱水。
5、 反应物停止搅拌，将浆液抽滤、滤饼为复合多孔微球粗品，将其用 30ml丙酮重复洗涤3次，得到的最终产物为浅黄色明胶/磷酸钙复合多孔 微球的粉末。
该粉末粒径为15um士5um，表面孔径为200nm士30nm。复合多孔微球 粉末由钙磷酸盐、鹿茸多肽和交联后的明胶组成，该复合多孔微球材料用 于骨、牙缺损的修复；作为骨水泥的固相原料；直接用于骨创手术中的骨 缺损部位的填充物。
权利要求
1. 一种用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球，其特征是在明胶微球中均匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽或骨形态发生蛋白；其中，活性物质鹿茸多肽或骨形态发生蛋白是明胶重量的1‰～5％；形成钙磷酸盐的可溶性钙盐为每克明胶的0.0003～0.03mol，可溶性磷酸盐的量使得Ca元素与P元素的比例为11～2∶1。
2. 根据权利要求1所述的复合多孔微球，其特征是所述的明胶微球中均匀分散有交联剂。
3. 根据权利要求2所述的复合多孔微球，其特征是所述的交联剂的量为在反应中交联剂的添加量为每克明胶添加30ul 1000ul的交 联剂，交联剂的质量浓度为5%。 15%。
4. 根据权利要求2或3所述的复合多孔微球，其特征是所述的 交联剂选自戊二醛、甲醛、双醛葡萄糖中的一种或大于一种的混合物。
5. 根据权利要求1所述的复合多孔微球，其特征是所述的可溶性磷酸盐的量使得Ca元素与P元素的比例为1. 5:1。
6. 根据权利要求1或5所述的复合多孔微球，其特征是所述的 可溶性磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢胺中的一种或大 于一种的混合物。
7. 根据权利要求1所述的复合多孔微球，其特征是所述的可溶性钙盐选自氯化钙、硝酸钙、醋酸钙中的一种或大于一种的混合物。
8. 根据权利要求1所述的复合多孔微球，其特征是所述的用于 骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球的直径在500nm 500um。
9. 根据权利要求1或8所述的复合多孔微球，其特征是所述的 用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球上的孔的直径在10nm 20um。
10. —种根据权利要求1 9任一项所述的复合多孔微球的制备方 法，其特征是，该方法包括以下步骤1) 取明胶粉体，加入去离子水，制备明胶溶液，然后向明胶溶液中添加可溶性钙盐，其添加量为每克明胶粉体加入0. 0003 0. 03mol 的可溶性l^盐；随后，再加入可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽或骨 形态发生蛋白，鹿茸多肽或骨形态发生蛋白的添加量均为明胶重量的1 %0 5%;2) 将步骤l)制得的混合液倒入含有表面活性剂的油中，搅拌形 成明胶溶液的油包水乳化液；表面活性剂在油中的含量是lg/200ml 油 lg/20ml油；所用油的量为每克明胶5ml 250ml;3) 将步骤2)制得的明胶溶液的油包水乳化液加热，温度控制在 30。C 7(TC，并持续搅，搅拌速度为100转/分钟 6000转/分钟；然 后加入可溶性磷酸盐溶液，磷酸盐的加入量使混合液中的Ca元素与P元素的比例控制在l: 1 2: 1;4) 将步骤3)制得的混合液在30。C 7(TC温度下搅拌，继续搅拌 下，用冰浴冷却；形成明胶微球中均匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生 长的活性物质鹿茸多肽或骨形态发生蛋白；5) 向步骤4)制得的混合液中加入交联剂，交联剂的质量浓度为 5%。 15%，交联剂的添加量为每克明胶添加30ul 1000ul的交联剂， 继续搅拌；6) 取步骤4)或5)制得的混合液，加入丙酮，加入量为混合液 中水份体积的2 8倍，继续搅拌，过滤，得到复合多孔微球的粗品；7) 将步骤6)得到的复合多孔微球的粗品用丙酮反复洗涤后，得 到用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球。
11. 根据权利要求IO所述的方法，其特征是所述的表面活性剂 是SPAN系列或琥珀酸二辛酯磺酸钠表面活性剂之中的一种。
12. 根据权利要求10所述的方法，其特征是所述的油选自硅油、 豆油、橄榄油、茶油、菜籽油或调和油中的一种。
13. —种根据权利要求1 9任一项所述的复合多孔微球的用途，其特征是所述的用于骨修复的明胶与钙磷酸盐复合多孔微球能够作为骨、牙的修复中的材料。
全文摘要
本发明属于明胶衍生物材料的制备领域，特别涉及明胶与钙磷酸盐和一种鹿茸多肽生物活性组织或骨形态发生蛋白(BMP)合成出的复合多孔微球材料。本发明的复合多孔微球是一种在明胶微球中均匀分散有钙磷酸盐及可促使骨生长的活性物质鹿茸多肽或骨形态发生蛋白；其中，活性物质鹿茸多肽或骨形态发生蛋白是明胶重量的1‰～5％；形成钙磷酸盐的可溶性钙盐为每克明胶的0.0003～0.03mol，可溶性磷酸盐的量使得Ca元素与P元素的比例为1∶1～2∶1。所述的复合多孔微球材料还可含有交联剂。该复合多孔微球材料是一种具有良好的生物相容性和诱导成骨活性的骨修复生物材料。
文档编号A61L27/00GK101444646SQ200710178158
公开日2009年6月3日 申请日期2007年11月27日 优先权日2007年11月27日
发明者史京京, 孙瑞雪, 宇 宋, 邓旭明, 郭燕川, 陈丽娟 申请人:中国科学院理化技术研究所