专利名称：用于抑制b型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合物的利记博彩app
技术领域：
本发明是关于一种用于抑制病毒的化合物，尤其是关于一种自牛樟芝
(jmra&acam^zorato)萃取物中分离纯化而得且可用于抑制B型肝炎病毒的 环己烯酮化合物。
背景技术：
B型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)属于肝病毒-+ (//e; "d"wW^^ )， 其是可以造成持续非细胞病变性(noncytopathic )肝脏感染的小型脱氧核糖核 酸类病毒体，并具有蛋白外套膜(envelope),也是目前人类肝炎病毒中唯一的 DNA病毒；B型肝炎病毒的外膜约含25。/。脂质以及75。/。糖蛋白，糖蛋白的主 要成分为B型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen; HbsAg ),而B型肝炎 病毒核心颗粒中含有B型肝炎外套膜抗原(hepatitis B envelop antigen; HbeAg),其中，B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)是一种分泌性蛋白(secretory protein),早期即可通过胎盘进入胎儿体内，此时胎儿免疫系统尚未成熟，因 此毒杀性T淋巴细胞会对B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)产生耐受性，导致 人体免疫系统无法清除B型肝炎病毒，使病毒可大量复制，故B型肝炎外套 膜抗原(HbeAg)也被-现为是一种耐受原(tolerogen)，因此，B型肝炎表面抗 原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)含量的侦测结果，可作为评 估B型肝炎病毒复制与分泌情况的指标。世界卫生组织的调查中显示，全世 界约有超过二十亿的人口曾被B型肝炎病毒感染，是个流行率相当高的病毒， 主要通过亲代垂直感染，感染后会引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、甚至是 肝癌。在台湾地区，三十岁以上的男子约有百分之九十的人曾受B型肝炎病 毒感染，其中15%~20%的人会变成终身带原者，并有可能转变成肝硬化、肝 癌而死亡，故台湾是B型肝炎感染严重的地方，同时也是肝癌好发的地区。
由前述可知，B型肝炎病毒的感染与肝脏疾病以及肝癌的形成关系密切， 因此，如何干扰并抑制病毒复制，彻底根除慢性感染，是抗病毒治疗的主要研
究目标；此外，近年来不论是使用干扰素、抗病毒药物或疫苗来防治B型肝 炎病毒感染已有不错的成效，但在慢性B型肝炎带原者的治疗上，仍无法彻 底根除病毒，此为造成B型肝炎病毒引发肝脏相关疾病并造成高致死率的主 因，因此，开发出可有效抑制B型肝炎病毒的抗病毒药物刻不容緩。
牛樟芝(^^ra^acawp/zorato),又称樟芝、牛樟菇或红樟芝等，属于非褶 菌目(^; /iy〃o^orafey )、多孔菌科(尸o/;^ora"w)的多年生蕈菌类，为台湾 特有种真菌，仅生长于台湾保育类树种-牛樟树(C/朋awowm Ara/^/n'ra/Hay ) 的中空腐朽心材内壁上。由于牛樟树分布数量极为稀少，加上人为的盗伐，使 得寄生于其中方能生长的野生牛樟芝数量更形稀少，且由于其子实体生长相当 緩慢，生长期也仅在六月至十月之间，因此价格非常昂贵。
牛樟芝的子实体为多年生，无柄，呈木栓质至木质，其具强烈的樟树香气， 且形态多变化，有板状、钟状、马蹄状或塔状。初生时为扁平型并呈鲜红色， 之后其周边会呈现》文射反巻状，并向四周扩展生长，颜色也转变为淡红褐色或 淡黄褐色，并有许多细孔，且其是牛樟芝药用价值最丰富的部位。
在台湾民俗医学上，牛樟芝具有解毒、减轻腹泻症状、消炎、治疗肝脏相 关疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食药用的蕈菇类，具有"i午多复杂的成分， 已知的生理活性成分中，包括三碎类化合物(triterpenoids )、多糖体 (polysaccharides,如(3-D-葡聚糖)、腺苷(adenosine)、维生素(如维生素B、 烟碱酸)、蛋白质(含免疫球蛋白)、超氧歧化酶(superoxide dismutase, SOD )、 微量元素(如钙、磷、锗)、核酸、固醇类以及血压稳定物质(如antodiaacid) 等，此些生理活性成分被认为具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗过敏、抗病菌、 抗高血压、降血糖及降胆固醇等多种功效。
牛樟芝众多成分中以三萜类化合物被研究的最多，三萜类化合物是由三十 个碳元素结合成六角形或五角形天然化合物的总称，牛樟芝所具的苦味即主要 来自三辟类此成分。1995年时，Chemg等人发现牛樟芝子实体萃取物中含有 三种新的以麦角甾烷(ergostane )为骨架的三萜类化合物antcin A、 antcin B 与antcin C ( Cherng, I. H.， and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from 」w的&a J. Nat. Prod. 58:365-371 )。 Chen等人以乙醇萃取樟芝子实
体后发现zhankuic acid A、 zhankuic acid B及zhankuic acid C等三种三萜类化
合物(Chen, C. H., and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from cz'wwamcw ea， 一 a fUngus parasitic on CV"wawomwm wn'crawAwm. J. Nat. Prod. 58:1655-1661 )。此外，Chiang等人于1995年也由子实体萃取物中发现另外三 种分别为倍半裕内西旨(sesquiterpene lactone )与两种双酚类书f生物的新三碎类 化合物，此即 antrocin, 4,7- 二甲氧基-5-曱基-1,3-苯并二氧环
(4,7-dimethoxy-5-methy-l,3画benzodioxole )与2,2',5，5'-四曱氧基-3，4，3',4,-双匿 亚曱二氧基画6，6'-二曱基联苯 (2，2'，5，5'-teramethoxy-3,4,3'，4'-bi- methylenedioxy画 6,6'画dimethylbiphenyl) ( Chiang, H. C., Wu, D. P., Cherng， I. W" and Ueng, C. H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from
Phytochemistry. 39:613-616)。到了 1996年，Chemg等人以同样 分析方法再度发现四种新的三辟类化合物antcinE、 antcinF、 methyl antcinate G、 methyl antcinate H ( Cherng, I. H., Wu, D. P" and Chiang, H. C. 1996. Triteroenoids from爿w^W/a c/朋麵謹肌Phytochemistry. 41:263-267 );而Yang 等人则发现了二种以麦角甾烷为骨架的新化合物zhankuic acid D、 zhankuic acidE和三种以羊毛甾烷(lanostane)为骨架的新化合物15 a-乙酰-去氢硫 色多孑L菌酸 (15 a -acetyl画dehydrosulphurenic acid )、 去氲齿孑L酸
(dehydroeburicoic acid )与去7JC石克色多孑L菌酸(dehydrasulphurenic acid) ( Yang， S. ^V" Shen， Y. C., and Chen， C. H. 1996. Steroids and triterpenoids of ^wf/x^Z/a czVmamomea 一 a fbngus parasitic on CVw打awowww w/crow决ww. Phytochemistry. 41:1389-1392 )。
虽然由目前诸多的实验可得知牛樟芝萃取物具有前述功效，且其所含成分 也陆续被分析出，但究竟牛樟芝萃取物中何种有效成分可抑制B型肝炎病毒 感染并治疗与B型肝炎病毒相关的肝脏疾病，仍有待进一步实验研究来厘清， 故若能找出牛樟芝萃取物中所含真正有效抑制B型肝炎病毒的成分，对于急 性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等与B型肝炎病毒相关肝脏疾病的治疗 将产生莫大的帮助。
发明内容
为明了牛樟芝萃取物中究竟是何成分可有效抑制B型肝炎病毒感染，本 发明由牛樟芝萃取物中分离纯化出具式(1)结构式的化合物； <formula>formula see original document page 7</formula> ( 1 )
其中，X是氧(O)或硫(S), Y是氧或硫；R,是氢基(H)、曱基(013)
或(CH2)m-CH3， R2是氢基、曱基或(CH2)m-CH3， 113是氢基、甲基或(CH2)m-CH3,
m = 1 ~ 12; n = 1 ~ 12。
如式(1)结构式的化合物中，较佳者为如下所示式(2)的化合物
<formula>formula see original document page 7</formula> ( 2 )
式(2)的化合物，其化学名为4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三 曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,ll-trimethyl-dodeca-2，6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone )，分子式为C24H3804， 外观为淡黄色粉末状，分子量为3卯。
本发明中式(1 )、式(2 )的化合物是分离纯化自牛樟芝水萃取物或有机 溶剂萃取物，有机溶剂可包括醇类(例如曱醇、乙醇或丙醇)、酯类(例如乙 酸乙酯)、烷类(例如己烷)或卣代烷(例如氯曱烷、氯乙烷)，l旦并不以此为 限，其中较佳者为醇类，更佳者为乙醇。
通过前述化合物，本发明将其应用于抑制B型肝炎病毒感染上，使能进 一步用于治疗B型肝炎病毒所致相关肝脏疾病的医药组合物中，增益急性肝 炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等与B型肝炎病毒相关的肝脏疾病的治疗效 果。结果显示，当以本发明式(1)和/或式(2)的化合物处理可分泌具感染 能力的B型肝炎病毒的肝癌细胞株HepG2 2.2.15时，其可有效抑制该肝癌细 胞株的细胞相对存活率，并降低由B型肝炎病毒所生成的B型肝炎表面抗原 (HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量，达到抑制B型肝炎
病毒复制及分泌的目的，进而可将由天然成分所萃取出的该化合物利用于与B
型肝炎病毒相关的肝脏疾病的治疗上。
另一方面，本发明中也可将式(1)和/或式(2)的化合物利用于治疗B 型肝炎病毒所致相关肝脏疾病的医药组合物的成分中，藉以4中制B型肝炎病 毒的复制及分泌，进而减緩急性或慢性肝炎感染，并降低肝炎带原者转变为肝 硬化或肝癌而死亡的发生率。前述医药组合物除包括有效剂量的式(1)和/ 或式(2)的化合物外，还可以包括药学上可接受的载体。载体可为赋形剂(如 水)、填充剂(如蔗糖或淀粉)、黏合剂(如纤维素衍生物)、稀释剂、崩解剂、 吸收促进剂或甜味剂，但并不仅限于此。本发明医药组合物可依一般悉知药学 的制备方法生产制造，将式(1)和/或式(2)有效成分剂量与一种以上的载 体相混合，制备出所需的剂型，此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶嚢或其它 液体制剂，^旦未以此为限。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例用以 阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发 明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附 的权利要求所界定者为准。
图1是本发明实施例所分离出的4-羟基-2，3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对人类肝癌细胞HepG2 2.2.1存活率的 影响结果。(A)图是4-羟基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7,11-三甲基-2,6，10-十 二碳三烯)-2-环己烯酮；(B)图是牛樟芝粗萃取物。垂直线代表三次独立试 验的标准偏差值；
图2是本发明实施例所分离出的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三曱基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成 量的影响结果。(A)图是4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7,ll-三曱基-2,6,10-十二碳三烯) -2-环己烯酮； (B)图是牛樟芝粗萃取物。垂直线代表三次独立 试验的标准偏差值；
图3是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生
成量的影响结果。(A )图是4-羟基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5( 3,7,11 -三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮；(B)图是牛樟芝粗萃取物。垂直线代表三次独立试验的标准偏差值。
具体实施例方式
首先取牛樟芝(Antrodia camphorata)菌丝体、子实体或二者的混合 物，利用悉知萃取方式，以水或有机溶剂进行萃取，藉以耳又得牛樟芝水 萃取物或有机溶剂萃取物。其中，有机溶剂可包括醇类(例如曱醇、乙 醇或丙醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、烷类(例如己烷)或卣代烷(例如 氯甲烷、氯乙烷)，但并不以此为限。其中较佳者为醇类，更佳者为乙醇。
经萃取过后的牛樟芝水萃取物或有机溶剂萃取物，可进一步通过高 效液相层析加以分离純化，之后再对每一分液(fraction)进4亍抑制B型 肝炎病毒复制的相关生化测试。最后，则针对具抑制B型肝炎病毒复制 效果的分液进行成分分析，再进一步分别做相关的生化测试，例如各 分液中所含有效成份对于肝癌细胞林HepG2 2.2.15的细刀包毒性的影响以 及检测B型肝炎表面抗原(HbsAg)与B型肝炎外套膜抗原(HbeAg) 含量等测试。最终即发现本发明中如式(1) /式(2)的化合物具有抑制 B型肝炎病毒复制的效果。
为方便说明本发明，以下将以式(2)的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-曱 基-5 ( 3,7,11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮化合物进行说明。 此外，为证实4-羟基-2，3-二曱氧基-6-甲基-5 (3，7，11-三甲基-2，6，10-十二 碳三烯)-2-环己烯酮化合物对肝癌细胞HepG2 2.2.15生长的细胞毒性影 响，并研究该牛樟芝环己烯酮化合物是否可有效抑制B型肝炎病毒的复 制，本发明中以MTT分析法，根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)抗肿瘤药物筛检模式，对肝癌细胞HepG2 2.2.15进行细胞 存活率的测试，并利用半定量酶联免疫分析法侦测由B型肝炎病毒所分 泌的B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg) 的含量。由这些测试证实，牛樟芝环己烯酮化合物可降低肝癌肿瘤细胞 HepG2 2.2.15的存活率，并有效抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B
型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的形成，进而达到抑制B型肝炎病毒复制 与分泌的目的。兹对前述实施方式详尽iJt明如下
实施例1:
4-羟基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环
己烯酮的分离
将100克左右的牛樟芝菌丝体、子实体或二者的混合物，置入三角 锥形瓶中，加入适当比例的水与醇类(例如70%以上的醇类水溶液)， 于20 25。C下搅拌萃取至少1小时以上，之后以滤纸及0.45 (im滤膜过滤， 收集萃取液。
将前述收集的牛樟芝萃取液，利用高效液相色语仪(High Performance Liquid chromatography ), 以RP18的色谱柱(column )进行 分析，并以曱醇(A)及0.1%~0.5%醋酸水溶液(B )做为移动相(mobile phase)(其溶液比例是0 10分钟，B比例为95% ~20°/。； 10~20分钟， B比例为20%~10%; 20~35分钟，B比例为10% 10%; 35~40分钟，B比 例为10%~95%)，在每分钟1 ml的速度下冲提，同时以紫外-可见光全 波长侦测器分析。
将25分钟至30分钟的冲提液收集浓缩即可得淡黄色粉末状的固体 产物，此即4-羟基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三甲基-2，6,10-十二碳 三烯)-2-环己烯酮。经分析，其分子式为C24H38 04，分子量390，熔点 (m.p.)为48。C 52。C。核磁共振(NMR )分析值则如下所示 !H-NMR(CDCl3)S(ppm): 1.51、 1.67、 1.71、 1.75、 1.94、 2.03、 2,07、 2.22、 2.25、 3.68、 4.05、 5.07与5.14。 13C-NMR(CDCl3)S(ppm): 12.31、 16.1、 16.12、 17.67、 25.67、 26.44、 26.74、 27.00、 39.71、 39.81、 4.027、 43.34、 59.22、 60.59、 120.97、 123.84、 124.30、 131.32、 135.35、 135.92、 138.05、 160.45与197.12。
实施例2:
牛樟芝环己烯酮化合物体外对肝癌肿瘤细胞的毒性测试
为进一步测试实施例1中的牛樟芝环己烯酮化合物对肝癌肿瘤细胞
的抑制效果，本实施例是根据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)抗胂瘤药物筛枱r才莫式进行的，首先取实施例1中所分离的 4-羟基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环 己烯酮，加入HepG2 2.2.15人类肝肺瘤细胞培养液中，进行肿瘤细胞存 活性的测试。细胞存活性的测试可采用悉知的MTT分析法进行分析，而 HepG2 2.2.15是人类的肝癌肿瘤细胞系，且该细胞系可分泌具感染能力 的B型肝炎病毒。
MTT分析法是一种常见用于分析细胞增殖(cell proliferation)、存 活率(percent of viable cells )以及细胞毒性(cytotoxicity)的分析方法。 其中，MTT ( 3-[4，5- dimethylthiazol國2-yl]2,5画diphenyltetrazolium bromide ) 为黄色染剂，它可被活细J!包吸收并被线4立体中的琥珀酸四唑还原酶 (succinate tetrazolium reductase )还原成不溶水性且呈蓝紫色的 formazan，因此通过曱腾(formazan )形成与否，即可判断并计算细胞的 存活率。
首先将人类肝癌细胞HepG2 2.2.1置于含有10。/。胎牛血清以及200 pg/ml抗生素G418的仅含12种必需氨基酸、谷氨酸胺和8种维生素的 J氐P艮量基石出培养基(minimum essential medium, MEM) ( Gibco Co., USA ) 中培养24小时。将增殖后的细胞以PBS清洗一次，并以l倍的胰蛋白酶 -EDTA处理细胞，随后于1,200 rpm下离心5分钟，将细胞沉淀并丟弃上 清液。之后加入10 ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮，再将5000 个细胞分置于96孔微量培养板内。测试时，分别于每一孔内加入以二曱 基硫酸(dimethyl sulfoxide, DMSO )所配制的0.1、 1、 10 (ag/ml牛樟芝 粗萃取物(对照組，未经纯化分离的牛樟芝乙醇总萃取物)以及4-鞋基 -2，3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮 (实验组)，并以完全不添加任何物质者为对照组，于37。C、 5% C02下 培养22小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT, 反应2小时后，移除培养基，并加入50 jil 二曱基硫酸(DMSO)溶解结 晶。最后以酶免疫分析仪在570nm吸光波长下测定其吸光值，并将此测
得数值与未经处理的对照组的细胞数值相比较，藉以计算得细胞相对的 存活率(％ ),其结果如图1所示。
请参阅图l，该图是本发明实施例所分离出的4-羟基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对人类肝癌细胞 HepG2 2.2.1存活率的影响结果。由图l中可知，相对于对照组牛樟芝粗 萃取物的细胞相对存活率结果，4-羟基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮可有效降低人类肝癌细胞HepG2 2.2.1的存活率，且经浓度为10 )ig/ml牛樟芝环己烯酮化合物处理后的癌 细胞存活率可低至约81%以下，因此可证实分离自牛樟芝萃取物的4-羟 基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯 酮确实能够利用于肝癌肺瘤细胞HepG2 2.2.1生长的抑制。
实施例3:
牛樟芝环己烯酮化合物体外对B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝 炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的影响
为测试实施例1分离纯化出的牛樟芝环己烯酮化合物对B型肝炎病 毒所产生的B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原 (HbeAg)生成量的影响，本实施例先培养人类肝癌细胞HepG2 2.2.1, 并于此细胞的培养基中加入牛樟芝环己烯酮化合物，再以半定量的酶联 免疫分析法(enzyme-linked immunoabsorbent assy， ELISA ) 4全测培养基中 B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成 量，通过此两病毒指针来评估牛樟芝环己烯酮化合物可否有效抑制B型 肝炎病毒。其中，H印G2 2.2.1细胞系利用包含B型肝炎病毒基因组(HBV genome)的质体(plasmid )转染人类肝肿瘤细胞抹HepG2，并经过抗生 素G418筛选所得可分泌B型肝炎表面抗原(HbsAg) 、 B型肝炎外套膜 抗原(HbeAg)、核蛋白衣壳(nucleocapsid)以及病毒颗粒(virion)的 细胞林(Sells, M. A.， Chen， M. L. and Acs, G. 1987. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1005-1009 )。
首先将人类肝癌细胞HepG2 2.2.1置于含有10%胎牛血清以及200 吗/ml抗生素G418的MEM培养基(GibcoCo., USA)中培养24小时。 将增殖后的细胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞， 随后于1,200 rpm下离心5分钟，将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入 10 ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮，再将5000个细胞分置于 96孔微量培养板内。测试时，分别于每一孔内加入以二曱基硫酸(dimethyl sulfoxide, DMSO)配置且浓度分别为0.1、 1、 10 pg/ml的牛樟芝粗萃取 物(对照组，未经纯化分离的牛樟芝乙醇总萃取物)以及4-幾基-2,3-二 甲氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮，并以 完全不添加任何物质者为对照组，于37。C、 5% C02下培养22小时。 再取适量的各培养液，通过抗人类B型肝炎病毒表面抗原的单抹抗体 (monoclonal antibody)及抗人类B型肝炎病毒外套膜抗原的多源抗体 (multiclonal antibody )的酶联免疫检验试剂分析试剂盒(general biologicals corp., Taiwan, ROC.),利用抗体一抗原一抗体酶接合体的三 明治复合体，以含过氧化氬的邻苯二胺(O-phenylenediamine， OPD )溶 液使之显色，再以酶联免疫分析仪于450 nm的波长下，测得培养液中B 型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的含量， 其阴性判定是依照以下公式cutoff value = O.D.negativec。ntr。l + 0.025,其中 若OD45o的吸光值超过此值则为阳性，其结果如图2与图3中所示。
请参阅图2，该图是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎表面 抗原(HbsAg)生成量的影响结果，由图中结果显示，相对于对照组牛樟 芝粗萃取物的B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量结果，4-羟基-2,3-二曱 氧基-6-曱基-5 ( 3,7,1 l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮可有效抑 制B型肝炎表面抗原(HbsAg)的生成，且随着牛樟芝环己烯酮化合物 施予浓度的增加，B型肝炎表面抗原(HbsAg)的生成量便随之下降，经 前述各浓度牛樟芝环己烯酮化合物处理后的B型肝炎表面抗原(HbsAg) 生成量可降低至60%以下，其中又以浓度为10 jug/ml牛樟芝环己烯酮化 合物对B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量的抑制效果为最佳，其B型
肝炎表面抗原(HbsAg)生成量可低至28%以下，因此可证实由牛樟芝 萃取物中分离出的4-羟基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7,11-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够有效降低B型肝炎表面抗原(HbsAg ) 的生成量，这也显示牛樟芝环己烯酮化合物具有抑制B型肝炎病毒繁殖 的功效。
请参阅图3,该图是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二曱氧基 -6-甲基-5 ( 3,7,1 l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎外 套膜抗原(HbeAg)生成量的影响结果。由图中结果可知，相对于对照组
牛樟芝粗萃取物的B型肝炎外套膜抗原(1^6八§)生成量结果，4-幾基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 ( 3,7,1 l-三曱基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮可有 效抑制B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成，经牛樟芝环己烯酮化合物 处理后的B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量可低至84%以下，其中 又以浓度为1 pg/ml的牛樟芝环己烯酮化合物对B型肝炎外套膜抗原
(HbeAg)生成量的抑制效果为最佳，其B型肝炎外套膜抗原(HbeAg) 生成量可低至57%以下，因此可证实由牛樟芝萃取物中分离出的4-羟基 -2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮 确实能够有效降低B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量。
另一方面，相对于前述4-羟基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三曱 基-2，6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对HepG2 2.2.15细胞毒性测试的结果
(请参阅图1)可观察到，该牛樟芝环己烯酮化合物抑制B型肝炎表面 抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的数值相对高 于该牛樟芝环己烯酮化合物抑制人类肝癌细胞HepG2 2.2.15存活率的数 值，这表示4-羟基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳 三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜 抗原(HbeAg)生成量的抑制效果并非因其对细胞具毒性所致。
综上所述，本发明自牛樟芝萃取物中所分离出的新4-羟基-2,3-二甲 氧基-6-曱基-5 (3，7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮可有效抑 制人类肝癌肿瘤细胞HepG2 2.2.15的存活率，且可抑制B型肝炎表面抗 原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的形成，因此这些化合
物可用于抑制B型肝炎病毒的复制与分泌，同时可利用于与B型肝炎病 毒相关的肝脏疾病的治疗上。另外，也可将其制备成医药组合物，此医 药组合物除包含有效剂量的4-羟基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3，7,11-三曱 基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮外，还可以包括药学上可接受的载体。 载体可为赋形剂(如水)、填充剂(如蔗糖或淀粉)、翻合剂(如纤维 素衍生物)、稀释剂、崩解剂、吸收促进剂或甜味剂，但并不仅限于此。 本发明医药组合物可依一般悉知药学的制备方法生产制造，将有效成分 剂量的这些牛樟芝化合物与 一种以上的载体相混合，制备出所需的剂型， 此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶嚢或其它液体制剂，但未以此为限。
权利要求
1.一种用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合物，具有下列结构式 其中，X是氧(O)或硫(S)，Y是氧或硫；R1是氢基(H)、甲基(CH3)或(CH2)m-CH3，R2是氢基、甲基或(CH2)m-CH3，R3是氢基、甲基或(CH2)m-CH3，m＝1～12；n＝1～12。
2. 根据权利要求1所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物，其中，所述化合物由牛樟芝的有机溶剂萃取物中分离制得。
3. 根据权利要求2所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物，其中，所述有机溶剂选自酯类、醇类、烷类或卣代烷所组成的组中。
4. 根据权利要求3所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物，其中，所述醇类是乙醇。
5. 根据权利要求1所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物，其中，所述化合物由牛樟芝的水萃取物中分离制得。
6. 根据权利要求1所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物，其中，所述化合物是4-羟基-2，3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,ll-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone )。
7. 根据权利要求1或6所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮 化合物，其中，所述化合物通过降低B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型 肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量而抑制B型肝炎病毒。
8. 根据权利要求7所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物，其中，所述化合物降低B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量的较佳使用浓 度为10 pg/ml。
9. 根据权利要求7所述的用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己歸酮化合 物，其中，所述化合物降低B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的较佳使用 浓度为1 pg/ml。
10. —种用于治疗B型肝炎病毒所引起疾病的医药组合物，其至少包括 有效剂量的权利要求1所述的化合物以及医学上可接受的载体。
11. 一种用于治疗B型肝炎病毒所引起疾病的医药组合物，其至少包括 有效剂量的权利要求6所述的化合物以及医学上可接受的载体。
12. 根据权利要求10或11所述的用于治疗B型肝炎病毒所引起疾病的 医药组合物，其中，所述B型肝炎病毒所引起疾病包含急性肝炎、慢性肝炎、 肝硬化以及肝癌。
全文摘要
本发明是关于一种用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合物，尤其是关于一种由牛樟芝萃取物中所分离出的4-羟基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5[3，7，11-trimethyl-dodeca-2，6，10-trienyl]-cyclohex-2-enone)，并可有效抑制B型肝炎病毒。本发明中，牛樟芝环己烯酮化合物对于能分泌B型肝炎病毒的人类肝癌细胞株HepG2 2.2.15具细胞毒性，并可降低B型肝炎病毒颗粒的生成量，且可有效抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)，藉以达到抑制B型肝炎病毒的目的。
文档编号A61P31/12GK101362679SQ20071014028
公开日2009年2月11日 申请日期2007年8月8日 优先权日2007年8月8日
发明者刘胜勇, 温武哲, 郭茂田 申请人:国鼎生物科技股份有限公司