一种小分子酸性肽,其提取方法和以其为活性成分的药物组合物的利记博彩app

专利名称：：一种小分子酸性肽,其提取方法和以其为活性成分的药物组合物的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种酸性肽，具体地说是一种对老年痴呆病有明显治疗作用的小分子酸性肽、其提取方法和以该酸性肽为活性成分的药物组合物。
背景技术：
：随着人类社会老龄化步伐的加快，老龄人口正逐年增加。衰老和伴随衰老而发生的严重危害老年人身心健康的重大疾病老年痴呆病的发病率也在逐年增加。阿尔茨海默病(Alzheimer'sDisease,AD，早老性痴呆病)便是一种常见的发生于老年和老年前期的以进行性痴呆为特征的神经系统退行性变性病。其主要临床表现为进行性学习记忆减退，认知障碍，个性改变及皮层分离症，自制力和理解力丧失，晚期则表现为记忆力完全丧失，语言与行为能力丧失。病程一般十年左右，最后发展成为严重痴呆以至植物人状态。早老性痴呆病典型的分子病理学特征是(1)细胞外有f3淀粉样肽沉积而形成老年斑；(2)细胞内有过度磷酸化的tau蛋白沉积形成神经纤维缠结；(3)由于细胞内外tau蛋白和e淀粉样肽的沉积对神经细胞的毒性作用而引起神经细胞凋亡而使神经细胞的数量丢失，造成前脑基底部，海马和大脑皮质的损伤，引起神经系统退行性病变。但是，以认知障碍为特征的早老性痴呆病是从轻度认知障碍(mildcognitiveimpairment,MCI)发展而来的。实际上，当人们超过50岁年龄时，就己经开始常常抱怨自己忘事了。这意味着细胞内外tau蛋白和e淀粉样肽的沉积对神经细胞的毒性作用是一个逐步累积的过程。e淀粉样肽和tau蛋白不断对神经细胞作用而引起神经细胞凋亡就会导致大脑损伤和神经系统病变。因此，对大量"轻度认知障碍"人群的干预及预防和对大量"认知障碍"的痴呆病患者的防治已经成为全球老龄化社会所面临的重大医学问题和社会问题。大量的研究均已证明，AD患者的认知障碍源于突触的退化和神经元的丢失。而突触和神经元的退化和丢失则源于神经细胞的凋亡。神经分子病理学和分子医学的研究证明，由3淀粉样肽在神经细胞外沉积形成的老年斑和由过磷酸化的tau蛋白在神经细胞内形成的神经纤维缠结是引起认知障碍和AD的最关键性的分子因素。尽管大量的研究已经表明细胞内外tau蛋白和e淀粉样肽的沉积对神经细胞的毒性作用而引起神经细胞凋亡，进而使神经细胞的数量丢失，造成前脑基底部，海马和大脑皮质损伤，引起神经系统退行性病变是主要的原因。但是迄今为止，人们对阿尔茨海默病的发病原因和发病机制尚不完全明了，因而尚缺乏有效的早期诊断方法和治疗手段。在发达国家，AD已经成为继心脏病，癌症，中风之后人类第四位的死因。目前对早老性痴呆病的药物治疗主要包括以下几类药物a)胆碱酯酶抑制剂类药物；(2)促代谢类药物；(3)激素类药物；(4)消炎镇痛类药物；(5)抗自由基类药物；(6)钙离子拮抗剂类药物；(7)兴奋性氨基酸受体的拮抗剂类药物；(8)神经生长因子及其基因治疗剂类药物等。除神经生长因子及其基因治疗剂类药物外，上述药物中均不能抑制神经细胞的凋亡。因而，它们不能够阻止早老性痴呆病的发生和发展。神经生长因子及其基因治疗剂类药物能够促进神经细胞增殖和生长，具有抑制神经细胞凋亡的作用。但是，由于它们是大分子物质，不能够透过血脑屏障，因而对早老性痴呆病无法发挥其抗神经细胞凋亡的治疗作用。因此，寻找能透过血脑屏障的抗神经细胞凋亡药物已经成为全球医药学界研究的热点和难点。
发明内容本发明的技术任务是提供一种能透过血脑屏障的小分子酸性肽，该酸性肽对早老性痴呆病具有良好的治疗作用；本发明的另一个技术任务是提供上述酸性肽的提取方法；本发明进一步的技术任务是提供一种用于预防或治疗早老性痴呆病的药物组合物；本发明的第四个技术任务是提供上述酸性肽在制备预防和治疗早老性痴呆病药物中的应用。本发明提供了下述氨基酸序列表示的小分子酸性肽Glu-Glu-Glu(谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸)该酸性肽是以动物大脑的脑蛋白干粉为原料，经Sephadex-G50柱层析、硅胶柱层析提取得到的。上述的动物大脑可选自牛脑、羊脑、猪脑、鸡脑、鸭脑、鹅脑。优选该酸性肽的原料是牛脑蛋白干粉。上述小分子酸性肽的提取方法包括以下步骤a、将动物脑蛋白干粉溶解于生理盐水中，过滤后用Sephadex-G50柱层析，以蒸馏水为洗脱剂，收集含有2种小肽的洗脱液；b、步骤a中所得洗脱液用硅胶柱层析，以氯仿、甲醇、水的混合液为洗脱剂，收集含有1种小肽的洗脱液，其Rf值为0.48，洗脱液冷冻干燥得目标产物(提取物)。上述的动物脑蛋白干粉优选以下述方法制取将新鲜动物脑中加入生理盐水，匀浆、离心处理后，收集上清液，上清液经冷冻干燥得动物脑蛋白干粉。步骤a中收集的洗脱液的Rf值为0.45—0.52。步骤b中所述洗脱剂各组分的体积比为氯仿甲醇水=60:50:10。提取物结构鉴定分析如下1.提取物为白色粉末。2.提取物用氨基酸分析仪分析酸性肽的氨基酸组成(见附图)1)，用氨基酸测序仪测定酸性肽的氨基酸排列方式(见附图2)，用质谱仪测定酸性肽的分子量，可证明该提取物是由3个谷氨酸通过a-羧基和a-氨基连接形成肽键的小分子酸性肽，其分子离子峰为405.9(见附图3)，分子量为405。发明人发现本发明的小分子酸性肽在治疗早老性痴呆病方面具有显著效果，这在动物试验中得到了证实。另外，通过动物实验可以证实，本发明酸性肽无毒性作用、无致畸变性和无致癌性。本发明的用于治疗早老性痴呆病的药物组合物含有治疗有效量的上述本发明小分子酸性肽，以及一种或多种药学上可接受的载体。本发明的小分子酸性肽和药物组合物可用于制备预防或治疗早老性痴呆病的药物。上述药学上可接受的载体是指药学领域常规载体，例如稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油等；崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六垸醇等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇等。另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂、甜味剂等。本发明酸性肽可经口服给药，可将其制成常规的固体制剂，如颗粒剂、胶囊、片剂等；也可制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂，如糖浆等。非经口服给药时可以注射液或输液剂等形式给药。将纯的酸性肽制备成上述制剂时可使用常规的制剂制备技术制备。本发明的小分子酸性肽的给药量因给药途径、疾病的严重程度等的不同而各有不同，其日剂量可以是15100mg/kg体重。本发明的小分子酸性肽不仅具有抑制神经细胞凋亡的作用，而且能够透过血脑屏障，因而以该酸性肽为活性成分制备的药物对早老性痴呆病的疗效优于现有的药物，解决了现有技术中存在的问题。此外，制备本发明小分子酸性肽的原料容易获得，制备工艺简单。因此，本发明的预防或治疗早老性痴呆病的药物具有生产容易、成本低廉、疗效好等优点。附图1是本发明酸性肽的氨基酸组成分析图谱,其中主峰为谷氨酸。附图2是本发明酸性肽的氨基酸序列分析图谱,其中2-a为空白对照(蒸馏水)；2-b为氨基酸标准；2-C为第1个氨基酸残基，2-d为第2个氨基酸残基；2-e为第3个氨基酸残基；2-f-k无氨基酸残基。附图3是本发明酸性肽的质谱分析图谱(酸性肽在酸性条件下时羧基不解离，而a-氨基可接受l个氢离子，因此其分子离子峰为405.9)。附图4是本发明酸性肽透过血脑屏障实验中谷氨酸(Glu)的标准曲线；附图5是本发明酸性肽透过血脑屏障实验中酸性肽(酸性肽)的标准曲线；附图6是本发明酸性肽透过血脑屏障实验中大鼠脑中酸性肽和Glu随灌胃时间而变化的曲线图。具体实施方式下面的实施例、试验实施例、制剂实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例l本发明小分子酸性肽的提取(l)牛脑蛋白干粉的制备取新鲜牛脑200公斤，加入等体积的生理盐水，在匀浆器中匀浆10min。然后3000r/min离心20min，收集上清液，冷冻干燥成牛脑蛋白干粉1400克。'置于冰箱保藏备用。(2)Sephadex-G50柱层析取200gSephadex-G50浸泡过夜，之后装入10cmX50cm层析柱中。取20克上述牛脑蛋白干粉用生理盐水溶解后加入到柱上然后用蒸溜水洗脱。用部分收集仪分部收集洗脱液(每管5ml)，洗脱液分别进行薄层层析和茚三酮显色。收集与猪神经肽RA5值相近且含有2个牛神经肽组份的洗脱液(其中包括Rf值为0.48的本发明酸性肽，和Rf值为0.42的另一组分)。收集的洗脱液置冰箱保存备用。(3)硅胶柱层析取200g硅胶，活化后加入到2cmX40cm的层析柱中,加入50ml上述Sephadex-G50柱层析洗脱液。用V(氯仿)V(甲醇)V(水^60:50:10的洗脱剂洗脱。用部分收集仪分部收集洗脱液(每管5ml)，洗脱液经薄层层析和茚三酮显色检査。收集Rf值为0.48的洗脱液。收集的洗脱液经冷冻干燥所制成的0.2克白色干粉末即为纯的本发明小分子酸性肽。经多次Sephadex-G50柱层析和硅胶柱层析提取可获得实验所需要数量的提纯的本发明小分子酸性肽的干粉。实施例2提取物干粉的结构分析将实施例1所得的小分子酸性肽干粉进行结构分析。(1)氨基酸组成分析称取一定量的提取物干粉溶于lml6mol/l的盐酸溶液中，并密封于水解管中，ll(TC过夜水解后打开水解管，将水解后的样品溶液洗入坩埚中，挥发至干。加水再蒸干，反复多次直到溶液达到中性，定容后备用。取取提取物的水解液10ul注入日立835-50型自动氨基酸分析仪的上样器中进行分析，获得提取物的氨基酸分析图谱(如附图1所示)。提取物的氨基酸分析图谱表明它是一种主要含有谷氨酸的的肽。(2)提取物的氨基酸测序用美国产PEABI491A型蛋白测序仪按下述方法进行氨基酸测序。称取10mg提取物干粉溶于0.1m110。/。(V/V)的三氟乙酸中，经毛细管高效液相色谱纯化，取主峰样品滴到PVDF膜上固定。然后送入蛋白测序仪，依Edman降解法从N末端逐一降解肽链上的氨基酸并经蛋白测序仪自动分析，获得测序图谱(附图2所示)。结果经PEABI491A型蛋白测序仪分析获得酸性肽的肽链分析图谱，证明提取物是由3个谷氨酸连接的本发明的小分子酸性肽。(3)提取物的质谱分析用美国热电Fi皿igan公司Icq-duoESI进行质谱分析，结果发现在405.9处有一个分子离子峰(附图3所示)，其分子量为405。下面通过试验实施例说明本发明酸性肽的活性。试验实施例中所用的酸性肽为实施例1所得小分子酸性肽。试验实施例l本发明酸性肽对血管型痴呆小鼠的治疗作用(1)血管型动物模型的建立84只昆明小鼠(河南省实验动物中心提供)，体重2225g，用标准饲料喂养4d。取12只作为正常组(A组)。其余的小鼠一直用高脂乳剂0.5ml/d灌胃共10d。之后每只小鼠分别用10M水合氯醛(3ml/kg，ip)麻醉，作颈部切开手术，仔细分离双侧颈总动脉，用动脉夹断血流使脑缺血10min，然后打开10min，重复三次。最后用丝线结扎左侧颈总动脉，缝合切口，局部消毒，术后分六组饲养。B组为模型组不作任何治疗，C组为生理盐水治疗组，D组为脑复康药物阳性治疗组，E组为高浓度酸性肽治疗组，F组为中浓度酸性肽治疗组，G组为低浓度酸性肽治疗组。口服给药治疗15天。之后用跳台试验进行学习记忆功能的变化测试。随后处死小鼠，分别取脑，称重，1:9加入生理盐水，离心。取上清液用于脑中蛋白质和NO分析。(2)学习记忆功能测试按照高维娟等介绍的跳台试验方法进行(见高维娟，黄启福，王波等。高脂血症小鼠脑缺血再灌注诱导智能障碍模型研究。中国中医基础医学杂志，1999，5(2):27-29)。第一次测试的结果为学习成绩，24h后第二次的测试结果为记忆成绩。(3)脑蛋白和N0分析采用南京建成生物工程研究所2001/6/2生产的试剂盒和随试剂盒介绍的测定方法进行分析。(4)结果学习记忆成绩的试验结果见表l、表2。表l模型小鼠跳台试验的学习成绩变化(x±s)组别动物数(只)错误次数(次)累积刺激时间(秒)A正常组122.830.5818.254.05B模型组114.64±0.92a45.09±10.01aC盐水组124.33±0.98a43.92±8.10aD脑复康组123.58±0,79abc31.00±7.術bcE酸性肽组(高)123.50±0.67abc32,83±8.術bcF酸性肽组(中)123.58±0.79abc32.50±7，24abcG酸性肽组(低)123.67±0.78abc33.58±7.22abca.与A组比PO.05;b.与B组比PO.01;c.与C组比PO.05_表2模型小鼠跳台试验的记忆成绩变化(x±s)_级别动物数(只)潜伏期(秒)错误次数(次)累积刺激时间(秒)A正常组12183.1719.661.420.675.42±2.87B模型组1145.45±20.66a4.73±0.90a21.18±3.16aC盐水组1242.00±20.75a4.67±0.98a23.00±3.64aD脑复康组12112.08±18.90abc3.67±1.07abc4.83±:3.86abcE酸性肽组(高)12157.33±22.19abcd2.17±0.72abcd8.58i:3.15abcdF酸性肽组(中)12133.58±23.56abce2.92±0.79abcde11.75±3.47abcG酸性肽组(低)12124.83±19.28abce3.17±0.94abce12.83±4.41abcea.与A组比PO.05;b.与B组比PO.01;c.与C组比PO.01;d.与D组比PO.05;e.与E组比P〈0.05。脑蛋白和NO的分析结果见表3和表4。表3模型小鼠脑内蛋白含量的分析结果(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4模型小鼠脑中NO含量的分析结果(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>a.与A组比PO.05;b.与B组比PO.01;c.与C组比PO.01;d.与D组比P<0.05;e.与E组比PO.05。以上结果说明l.与正常对照组比较，模型组的学习记忆能力均显著下降(P〈0.05);与模型组比较，生理盐水组无明显改变(P〉0.05);与模型组比较，脑复康组及酸性肽各浓度组的学习记忆能力均显著升高(P〈0.01);2.与模型组比，脑复康和酸性肽各治疗组小鼠脑内的蛋白水平明显升高(P〈0.01);3.与模型组比，脑复康和酸性肽各治疗组小鼠脑内的NO水平明显降低(P〈0.01)。试验实施例2本发明酸性肽对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠的治疗作用(l)动物及分组雄性SD大鼠105只，812周龄，体重170210g，由河南省实验动物中心提供。将动物随机分7组，饲养l周后造模。除去制作AD动物模型时死亡的动物，每组最后保持12只动物用于实验。I组为正常对照组，II组为AD模型组，III组为AD模型+生理盐水组，IV组为AD模型+脑复康0.3g/kg治疗组，V组为AD模型+酸性肽15mg/kg治疗组，VI组为AD模型+酸性肽30mg/kg治疗组，Vn组AD模型+酸性肽60mg/kg治疗组。(2)AD动物模型的建立大鼠用100g/L的水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于立体定位仪上，剪掉手术区毛发，局部消毒，于头顶正中做一个1.5cm的矢状切口，钝性分离骨膜，参照大鼠脑立体定位图谱，坐标前后径1.4mm，左右径2.4mm，垂直7.4mm，对双侧迈奈特基底核(nbM)进行立体定位后，于双侧颅骨各对应点分别钻一个直径lmm的孔洞，用玻璃微量进样器进行垂直注射。nVH组注射溶于0.1mol/LpH7.4pB液的IBOlu1(5ixg)。每针注射时间5min，留针5min，去针后缝合手术切口，局部消毒，清醒后放回笼中常规饲养。(3)试验方法跳台实验与迷宫实验7组均连续灌胃给药20d，期满后分别做跳台实验与迷宫实验以测试大鼠的学习和记忆能力。统计学处理实验数据以x±s表示，用SPSS10.0软件进行统计学处理，显著性检验采用单因素方差分析，检验水准《=0.05。(4)结果7组大鼠跳台实验及迷宫实验的学习、记忆能力的比较，见表5、6。表57组大鼠学习能力比较(n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a.与I组比PO.01;b.与II组比P〈0.01表67组大鼠记忆能力比较(11=12)组别上台潜伏期/s正确反应次数/次I组17.25±2,1325.75±1.66II组43.17±4.66a15.67±2.15aIII组42.37±3.71a15.67±2.27aIV组27.20±2.65a，b20.08±2,43a，bv组29.78±4.48a，b,c20.92±2.68a,bVI组26.20±3.28a，b，c20.83±2.29a,bvn组22.09±4.43a,b，c20.25±2.05a,ba.与I组比PO.Ol;b.与II组比PO.01;c.与W组相比P<0.05结果表明，与正常对照组比较，模型组的学习记忆能力均显著下降(P〈0.01);与模型组比较，生理盐水组无明显改变(P〉0.05);与模型组比较，脑复康组及酸性肽各浓度组的学习记忆能力均显著升高(P〈0.01)。本实施例中所用的鹅膏蕈氨酸(IBO)为分析纯，批号LO5308，瑞士Alexis公司生产；脑复康东北制药总厂生产，批号001030。试验实施例3本发明酸性肽对凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促进基因Bax表达的影响(1)海马神经元的原代培养取新生(24h内)的SD大鼠，75%乙醇消毒，断头，去除头皮，剥离脑膜，分离出全脑，PBS(生理盐水)中漂洗去除残留血块，分离出双侧海马，剪碎海马组织，0.125X胰酶37。C、5XCO2孵箱30min，用种植液终止胰酶消化，用抛光的巴氏吸管轻轻吹打脑组织，静置5分钟，转移上清单细胞悬液，沉淀再加入3ml种植液，重复吹打，获得单细胞悬液，合并两次单细胞悬液，计数后用种植液调整细胞密度为1X1(^细胞/L，接种于预先铺有0.01%多聚赖氨酸的6孔培养板中，每L2ml。37°C、5%<:02的培养箱中培养。培养到第3天，换无血清培养液进行培养，Neurobasal培养基加B27无血清培养液(B27serumfreesupplementliquid)可抑制胶质细胞生长使神经元生长得以纯化。以后每3天换液一次，每次换液一半。培养至第IO天的海马神经元神经丝蛋白(neurofilamentprotein,NF)用免疫细胞化学染色鉴定。(2)海马神经元的鉴定将细胞以1.0X1(^/L密度接种于加有0.01X多聚赖氨酸预处理的盖玻片的6孔培养板中，每孔2mL。37°C、5%C02的培养箱中培养至第10天，弃去培养基，取出细胞涂片，用多聚甲醛固定，对内源性过氧化物酶的活性使用山羊血清封闭，再分别用神经丝蛋白(neurofilamentprotein,NF)、二抗和三抗标记，DAB显色后用苏木素复染并观察和照相。确定神经元的纯化率在95%以上。细胞培养至第11-12天生物学性状稳定时，才可用于后续实验。(3)实验分组及药物处理取培养至第11天的神经细胞，用不同剂量的由实施例1所获得的酸性肽预处理6h，再加入终浓度为50ummol/L的硝普钠(SNP)，继续培养24h，收集细胞进行实验。每次实验均分为以下五组I组为正常对照组；II组为SNP处理组；m组为SNP+0.0375mg/ml酸性肽组；IV组为SNP+0.075mg/ml酸性肽组；V组为SNP+0.15mg/ml酸性肽组。每组至少重复3次。SNP用PBS溶解，每次临用前配置，锡纸避光，过滤除菌。(4)MTT比色法检测细胞存活率将细胞以0.4X109/L密度接种于预先铺有0.01%多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔100yL。37°C、5%C02的培养箱中培养至第11天，加药干预，每组设8个平行样本。继续培养20h于收获细胞前4h，每孔加入5mg/ml噻唑蓝(thiazoleblue,MTT)20uL，继续培养4h。收获细胞后弃培养基，用无血清培养基洗1次，加入150uL二甲基亚砜(DMSO)，振荡8min，待紫色结晶充分溶解后，置酶标仪上测各孔吸光度值(OD)，以空白孔调零，滤过波长592nm。所有的实验均重复三次，取其均值，然后用OD值求细胞存活率，以对照组存活率为100%，其余各组按细胞存活率=(各浓度组吸光度值/对照组吸光度值)X100%，与对照组比较(5)细胞凋亡的核型观察将细胞以1.0X109/L密度接种于预先铺有0.01%多聚赖氨酸的6孔培养板中，每孔2mL。37°C、5%C02的培养箱中培养至第11天，加药干预，继续培养24h后95X乙醇固定，吖啶橙染色，荧光显微镜下观察并拍照。(6)细胞凋亡的DNA电泳分析将细胞以1.0X109/L密度接种于预先铺有0.01%多聚赖氨酸的6孔培养板中，每孔2mL。37°C、5%C02的培养箱中培养至第11天，加药干预后继续培养24h。提取细胞DNA，琼脂糖凝胶电泳后在紫外透射仪下观察、拍照。(7)Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot分析将细胞以1.0X109/L密度接种于预先铺有0.01%多聚赖氨酸的6孔培养板中，每孔2mL。37°C、5%C02的培养箱中培养至第11天，按实验分组及药物处理中介绍的方法加测试的药物进行干预，继续培养24h。弃去培养基，以冷PBS(pH7.2)洗涤细胞，弃去PBS，并吸干液体。每孔加入50uL裂解液，用细胞刮刀刮下细胞，将粘稠的裂解液收集于1.5mL的EP管中，-20"放置20min，冰上超声破碎细胞(10s/次X3次，间隔15s)，4'C，12000Xg离心5min，收集上清液并用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质浓度。每个电泳泳道的加样池中均加入50ug的破碎细胞的蛋白样品。在破碎细胞的蛋白样品中加入上样缓冲液，煮沸5min，立即上样做12.5X浓度的SDS-PAGE电泳。之后，用电转移法转膜并将NC膜放入塑料袋中，加入封闭液4'C过夜封闭。将NC膜放入另一塑料袋中，分别加入小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗大鼠Bax多克隆抗体和小鼠抗大鼠的e-Actin单克隆抗体，37'C2h杂交。之后，再将膜转入另一塑料袋中，分别加入二抗即辣根过氧化酶标记兔抗鼠IgG和辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG，37'C杂交20min。DAB显色后用蒸馏水洗膜终止反应，拍照并用光密度扫描仪测定Bcl-2、Bax条带的光密度。(8)统计学分析运用SPSS10.0统计软件对数据进行统计处理。试验数据用均数土标准差^士s)表示，多个样本均数间比较采单因素用方差分析，以^=0.05作为有显著性的检验水准。(9)结果神经元培养和鉴定的结果培养12d后，神经元成熟，胞体饱满，呈锥形，周围有光晕，折光感强，轴突、树突粗大明显，网络更加稠密。神经元经免疫组化染色和DAB显色后，阳性细胞表现为细胞浆呈褐色。MTT比色法检测细胞存活率的实验结果，见表7。表7酸性肽对SNP处理的海马神经元凋亡存活率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注与空白对照组比较弁P〈0.01;与SNP处理组比较*P<0.05，**P<0.01细胞凋亡的核型观察结果吖啶橙荧光染色(AO染色)结果显示，正常对照组海马神经元在荧光显微镜下细胞轮廓清晰，呈弥散均匀绿色荧光。SNP处理组可见有大量的细胞发生细胞皱縮，细胞核固縮、凝集、裂解，染色可见致密浓染的黄色荧光及颗粒状碎片，呈现凋亡的形态特征。而酸性肽各浓度组海马神经元细胞核与正常对照组的细胞核形态接近。细胞凋亡的DNA电泳分析结果细胞凋亡的DNA电泳分析显示，SNP处理组的细胞DNA在琼脂糖凝胶电泳上显示清晰的阶梯状DNA条带，而正常对照组和酸性肽各浓度组的海马神经元的DNA没有阶梯状DNA条带的出现。Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot分析结果Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot分析和光密度扫描结果显示，酸性肽各浓度组的Bcl-2蛋白条带随加入的酸性肽的浓度的增加而逐渐增粗，光密度扫描结果显示酸性肽各浓度组的Bcl-2蛋白的表达量也随加入的酸性肽浓度的增逐渐增加。说明随着酸性肽浓度的增加，Bcl-2基因表达也增强，而且Bcl-2基因表达Bcl-2蛋白的水平是可剂量依赖性地依赖酸性肽加入的剂量。相反，酸性肽各实验浓度组中Bax基因表达Bax蛋白的电泳条带则随着酸性肽加入量的增加而逐渐变淡，光密度扫描结果显示酸性肽各浓度组的Bax基因表达Bax蛋白的量也逐渐下降，这说明随着酸性肽浓度的逐渐增加使Bax基因表达Bax蛋白的量也逐渐下降，它们具有剂量依赖性关系(表8)。表8Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot显色条带的辉度扫描结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注与空白对照组比较#<0.01;与SNP处理组比较515〈0.01试验实施例4本发明酸性肽对脑内e淀粉样肽和N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体产生水平的影响和对神经细胞凋亡的影响选取出生后10周龄的健康且经Y-迷宫测定无痴呆症状的雄性SD大鼠70只，体重170210克，由河南省实验动物中心提供。动物合格证号为410117，动物级别为普通级。鼠料合格证号为4104041。(1)实验分组取雄性SD大鼠70只，812周龄，体重170210克，由河南省实验动物中心提供。随机分为7组，每组10只。I组为正常对照组；II组为AD模型组；m组为AD模型+生理盐水组(阴性对照组)；IV组为AD模型+谷氨酸0.3g/kg治疗组；V组为AD模型+酸性肽-15mg/kg治疗组；VI组为AD模型+酸性肽-30mg/kg治疗组；VD组为AD模型+酸性肽-60mg/kg治疗组。(2)动物模型的制作大鼠用10a/。水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于立体定位仪上，剪掉手术区毛发，局部消毒，于头顶正中做一个1.5cm的矢状切口，钝性分离骨膜，参照大鼠脑立体定位图谱，坐标前后径土1.4mm，左右径土2.4mm，垂直7.4mm，对双侧nbM进行立体定位后，于双侧颅骨各对应点分别钻一个直径lmm的孔洞，用玻璃微量进样器进行垂直注射。IIVn组注射溶于0.1MpH7.4PB液的IBOly1(5"g)。每针注射时间5min，留针5min，去针后缝合手术切口，局部消毒，清醒后放回笼中常规饲养。手术后连续灌胃20天。(3)Y-迷宫实验灌胃期满后即做迷宫实验以检测大鼠的学习能力，24h后再做迷宫实验以检测大鼠的记忆能力。将大鼠放入Y型迷宫器中，适应环境3min，以大鼠所在的Y型臂为起步区(安全区)，通入电流70V，0.50.7A，同时所在臂灯亮。如果大鼠跑向左臂，则定右臂为安全区；如果大鼠跑向右臂，则定左臂为安全区。每次均以安全区为起跑区，并使大鼠在安全区停留30秒以巩固记忆。依次改变安全区位置，以大鼠直接跑入安全区为正确反应，否则为错误反应。连续测试30次，记录正确反应次数作为成绩。实验时间固定在上午9U点之间，保持周围环境安静，避免强光刺激。(4)脑组织石蜡切片的制备学习记忆测试结束后，各组大鼠用10%水合氯醛腹腔深度麻醉，迅速开胸暴露心脏，经左心室行主动脉插管，剪开右心耳作为灌注液流出口，在10-20min内经左心室灌注4'C生理盐水200-300ml快速冲洗血液，迅速断头取脑,4%多聚甲醛/0.01M磷酸盐缓冲液固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡切片机连续冠状切片，片厚4um，每切5张取1张切片，备用。(5)NMDAR1、NGF和AP的免疫组化测定(a)切片在二甲苯中脱蜡，乙醇脱水，蒸馏水洗。(b)3%H202室温20分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗2分钟X3次。(c)热修复抗原将切片浸入O.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后再沸腾，冷却后PBS(pH7.2-7.6)洗2分钟X3次。(d)滴加5%血清封闭液，室温20分钟.甩去多余液体，不洗。(e)滴加稀释的一抗(NGF抗体1:100、NMDAR1抗体1:50、Ae抗体1:100),冰箱过夜，PBS洗2分钟X3次。(f)滴加生物素化IgG(二抗)工作液，37。C孵育30分钟。PBS洗2分钟X3次。(g)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温下孵育30分钟，PBS洗3分钟X3次。(h)DAB显色使用DAB显色试剂盒(AR1022)，lml蒸馏水滴加1滴A，1滴B，1滴C，混匀，呈色5min，自来水洗3次。(i)苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。(j)显微镜观察并用BiosensDigitalImagingSystem进行灰度扫描以检测大鼠脑内NMDAR1、NGF、AP的含量。(6)统计学分析运用SPSSll.O软件采用单因素方差分析和两样本均数t检验对数据进行统计学处理。实验数据均以；士s表示，以『0.05作为差异有显著性意义。(7)结果Y-迷宫实验的检测结果见表9。表9Y-迷宫试验的的检测结果(；士s，次)组别例数正确反应次数(次)24小时后检测的正确反应次数(次)正常对照组1020.20±1.6924.89±1.90模型组1012.30±1.42a14.90±1.60a生理盐水组1013.50±1.18a'b15.20±1.03ab谷氨酸组1013.80±1.2315.30±1.06a'b60mg/kg酸性肽组1017.30±150a'c'e'"21.10±2.04a'c30mg/kg酸性肽组1015.80±19919.90±1.10a'c15mg/kg酸性肽组1013.20±169a,M15.00±0.94a'b注a，与I组比PO.01;b，与II组比P〉0.05;c，与II组比PO.01;d，与IV组比PX).05;e，与IV组比PO.01;f，与V组比PO.01;g，与VI组比PX).05大鼠大脑皮层中NMDAR1含量的检测结果见表10。表IO大鼠大脑皮层中NMDAR1含量的检测结果(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注a，与I组比PO.01;b，与I组比P〉0.05;c,与II组比P〉0.05;d，与II组比PO.01;e，与IV组比PX).05;f，与IV组比PO.01;g，与V组比PO.01;h，与VI组比PX).05大鼠基底前脑中NGF含量的检测结果见表ll。表ll大鼠基底前脑中NGF含量的检测结果(^土s)组别例数NGF的灰度扫描值正常对照组1080.77±2.72模型组1069.60±2.41a生理盐水组1069.59±1.73"谷氨酸组1069.62±1.46a'e60mg/kg酸性肽组1080.20±1.75b'd'f'g'h30mg/kg酸性肽组1079.39±2.23bd'f'g15mg/kg酸性肽组1069.73±1.87a'注:a,与I组比PO.01;b，与I组比P>0.05;c，与II组比P〉0.05;d,与II组比P〈0.01;e，与IV组比P〉0.05;f，与IV组比P〈0.01;g，与V组比P〈0.01;h，与VI组比PX).05大鼠大脑皮层中Ae含量的检测结果见表12。表12大鼠大脑皮层中Ae含量的检测结果(x土s)组别例数AP的灰度扫描值正常对照组1067.40±3.06模型组1074.26±1.39'生理盐水组1074.89±8.66a'c谷氨酸组1074.88±1.46"60mg/kg酸性肽组1067.58±2.21"'"'h.30mg/kg酸性肽组1067.66±2.25b'd'f's15mg/kg酸性肽组1074.16±2.48a'c'e注a，与I组比P〈0.01;b，与I组比P〉0.05;c，与II组比P〉0.05;d，与II组比P〈0.01;e，与IV组比PX).05;f，与IV组比PO.01;g，与V组比PO.01;h，与VI组比PX).05本实验在建立了痴呆动物模型和对各组动物用不同药物进行治疗后，用Y-迷宫实验和免疫组化的方法测定了各组动物的学习记忆能力和NMDR1、NGF和AP的含量，并对各组的实验结果进行了比较。结果表明1.与正常组比较①模型组、生理盐水组、谷氨酸治疗组及酸性肽各浓度治疗组的学习记忆能力均显著下降(PO.Ol)。②模型组、生理盐水组、谷氨酸治疗组及酸性肽低浓度治疗组基底前脑NGF的含量显著下降(PO.05);酸性肽中、高浓度治疗组基底前脑NGF的含量虽有降低但并无显著差异(P>0.05)。(D模型组、生理盐水组、谷氨酸组及酸性肽低浓度治疗组大脑皮层NMDAR1、AP显著升高(PO.01);酸性肽中、高浓度治疗组大脑皮层NMDAR1、Ae虽有升高但并无显著差异(P>0.05)。2.与模型组比较①生理盐水组、谷氨酸组及酸性肽低浓度治疗组的学习记忆能力无明显改变(P>0.05);酸性肽中、高浓度治疗组的学习记忆能力均显著升高(PO.01)。②生理盐水组、谷氨酸组及酸性肽低浓度治疗组基底前脑NGF的含量均无明显改变(P>0.05);酸性肽中、高浓度治疗组基底前脑NGF的含量均显著升高(PO.Ol)。③生理盐水组、谷氨酸组及酸性肽低浓度治疗组大脑皮层NMDAR1、AP无明显改变(P>0.05);酸性肽中、高浓度治疗组大脑皮层的NMDAR1、Ae显著降低(PO.Ol)。3.与谷氨酸治疗组比较①酸性肽低浓度治疗组的学习记忆能力无明显改变(P>0.05);酸性肽中、高浓度治疗组的学习记忆能力均显著升高(PO.Ol)。②酸性肽低浓度治疗组基底前脑NGF的含量无明显改变(P>0.05);酸性肽中、高浓度治疗组基底前脑NGF的含量均显著升高(PO.Ol)。③酸性肽低浓度治疗组大脑皮层NMDAR1、Ae无明显改变(P>0.05);酸性肽中、高浓度治疗组大脑皮层NMDAR1、AP显著降低(PO.Ol)。上述结果充分说明本发明酸性肽能明显改善AD大鼠的学习记忆能力，对AD模型大鼠有良好的治疗作用。而其治疗作用则主要是通过促进基底前脑中NGF的产生和分泌以及抑制大脑皮质中NMDAR1和AP产生而实现的。这表明酸性肽是作为神经生长因子的诱生剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体及e淀粉样蛋白的抑制剂或拮抗剂而发挥作用的。试验实施例5本发明酸性肽对神经胶质细胞分泌神经生长因子(NGF)和脑源性生长因子(BDNF)的影响(1)大鼠大脑星形胶质细胞的纯化培养取出生后2天内的SD大乳鼠，在无菌条件下断头取出大脑皮质部分，投入PBS中，仔细剔除中脑、嗅球、海马、脑膜、毛细血管等结构，将皮层剪碎成l-2mm3小块，用吸管吹打l分钟左右，加入0.25%的胰酶放入<:02培养箱中消化10分钟，1000r/min离心10min，收集沉淀，DMEM培养基重悬。用200目的筛网过滤，调整细胞密度至1.0X106/ml，锥虫蓝实验证明细胞存活率大于95%。接种于瓶底为25cn^的培养瓶中，每瓶5ml。一天后换液弃掉非贴壁细胞，而后每三天换液一次，待细胞长满瓶底70%时，传代，传两代后免疫组化染色证明星形胶质细胞纯度大于95%。(2)大鼠大脑星形胶质细胞的鉴定将传两代的星形胶质细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，接种于预先铺有多聚赖氨酸的盖玻片上，三天后，先用0.01mol/LPBS漂洗，再用PBS配制的4%多聚甲醛固定，经含3%&02禾口10。/o甲醇的0.01mol/LPBS处理，按照ABC免疫细胞组织化学染色方法进行胶质纤维酸性蛋白(GF酸性肽)抗血清(1:500，Sigma)反应，显示阳性反应的是星形胶质细胞。(3)实验分组及样品的制备将培养的细胞分四组即含20%血清对照组、无血清对照组、阳性对照组、实验组。含20%血清组和无血清对照组均不施加实验因素，阳性对照组为1000U/ml干扰素，实验组中则分别加入150ug/ml、75ug/ml、37.5ug/ml的酸性肽。对照组和实验组均取24、48及72小时三种不同的作用时间。将长满瓶底的第二代星形胶质细胞消化成单细胞悬液以5X105/ml的浓度等量接种于三块12孔培养板中，每孔lml，继续培养24小时后吸出板内培养液。无血清对照组内均加入不同浓度的酸性肽。每组均取24、48及72小时三种培养时间进行培养。实验时间终止后，分别将上清液移入无菌的EP管中，离心(1000r/min，5分钟)，再将上清夜分别移入另一无菌EP管，-201:冷藏待测。(4)细胞计数和存活率的检测药物作用时间结束后吸出培养上清液放入无菌的EP管中，培养板中加入同等少量体积的质量分数为0.25%的胰蛋白酶，置C02培养箱中消化充分吹打制成细胞悬液，用完全培养基终止消化并补充体积至lml，混匀立即细胞计数。用玻棒蘸一滴细胞悬液，滴于血球计数板上，计数四角四个大方格中的细胞数为N个。则总细胞数:N/4Xl(^个/ml，细胞用PBS缓冲液轻洗两次，每孔滴PBS配制的0.4。/。的苔盼蓝溶液200ul，立即混匀，滴在血球计数板上，上镜观察，3min左右在倒置显微镜下观察，随机计数400个相邻细胞中蓝染(死亡细胞)和未蓝染(存活细胞)的细胞个数，计算细胞死亡百分比。细胞存活率(％)=[(总细胞数-蓝染细胞数)/总细胞数]X100%。(5)噻唑蓝(thiazoleblue,MTT)实验用0.25%胰蛋白酶消化传二代的单层培养的星形胶质细胞，用含10%的胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，细胞浓度为0.5X1()S个/ml，每孔200ul接种于预先铺有多聚赖氨酸的96孔培养板中。细胞传代于96孔培养板中培养24小时后，换液按实验分组加入不同浓度的酸性肽，酸性肽组和阳性对照干扰素均用无血清DMEM培养液稀释，同等条件下再培养72小时，每天在倒置显微镜下观察细胞形态及细胞生长情况。药物作用时间结束后取出96孔板，加入20ul/孔MTT(浓度为5mg/ml)，然后再放入C02培养箱中继续培养4小时，小心吸去培养液，加入DMSO150ul/孔，振荡10min，使颗粒完全溶解，以不加细胞的培养液空白对照孔调零，酶标仪检测492nm的光密度值。用单因素方差分析对数据做统计学处理，并计算细胞增殖率。增殖率=(实验组OD值一对照组OD值)/对照组OD值X100%(6)ELISA-ABC法测定细胞上清液中NGF和BDNF含量每种样品为一组，每组8孔，用碳酸盐缓冲液0.05mol/LpH9.6，包被培养上清液于96孔板，上清液10ul,包被液90ul，总量100ul/孔，4°C过液；PBS國T液漂洗5分钟三次；用150ul封闭液37t:温育l小时；漂洗五分钟三次后；加入稀释的NGF抗体(美国santcruze公司1:500),37'C温育1小时；漂洗；力卩ABC复合物l:1:200(A:B:PBS，用前30分钟配置)，37。C温育l小时；漂洗；加底物显色液100ul/孔，温育30分钟；加入2mol/LH2SO450ul/孔，终止反应；其中空白组不加NGF抗体，仅加入PBS作对照，其余步骤各孔各组均相同。在芬兰WellscanMK2and3型号ELISA检测仪上，于450nm处以空白组调零后测各孔OD值。所得OD值的大小与包被液中NGF的含量成正比，即OD值可间接反映NGF的含量。(7)细胞内NGF的测定药物作用时间结束后吸出培养上清液放入无菌的EP管中，培养板中加入同等体积的质量分数为0.25%的胰蛋白酶，置C02培养箱中消化15分钟。充分吹打制成细胞悬液，用PBS补充体积至lml。吸入无菌的EP管中，放入-8(TC冰箱中。反复冻融，至细胞全部溶解。其余步骤同上(6)。(8)数据处理运用SPSS10.0统计软件采用单因素方差分析和两样本均数t检验对数据进行统计处理。实验数据均用均数士标准差(；±s)表示，以a=0.05作为有显著性的检验标准。(9)结果细胞计数和存活率的检测结果见表13和表14。表13细胞计数的结果分组24小时48小时72小时无血清对照组0.7x107ml0.4x107ral0.27x105/ml20%血清组0.8xioVml1.1x105/ml'1.37x105/ml'酸性肽0.15mg/ml1.25x107ml'2.02x107ml*2.26x107ml'酸性肽0.075mg/ml1.Oxl05/ml'1.73x107ml'1.83x107ml'酸性肽0.0375mg/ml0.5x107ml'0.84x107ml'1.0x107ml'注该细胞计数为三组的平均值，与空白对照组比较*P<0.01表14细胞存活率的检测结果分组24小时48小时72小时无血清对照组83.9%79.8%69.7%2tW血清组82.1%84.9191.6f酸性肽0.15mg/ml97.9f95.9f94.If酸性肽0.075mg/ml90.81.86.0%'83.9%"酸性肽0.0375mg/ml86.3%81.2%79.7%注该数据为三组的平均值，与无血清对照组比较***P《0.001，**P《0.01，*P<0.05。噻唑蓝(thiazoleblue,MTT)实验的结果见表15。表15酸性肽对大鼠星形胶质细胞增殖的影响(；±s，n=8)_<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>注*与对照组比较ELISA-ABC法测定细胞上清液中NGF的含量变化结果见表16和表17。表16酸性肽对培养的星形胶质细胞上清中NGF的OD值(x±s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>与无血清对照组比较*P<0.001表17酸性肽对培养的星形胶质细胞内NGF的OD值(^土s，n=8)分组24小时48小时72小时无血清对照组1.1880.0480.8130.0610.5650.09220°/血清组1.035±0.0791.3020.1081.3470.093干扰素(1000U/ml)组1.177±0.0711.0330.0661.0160.046酸性肽(37.5ug/ml)组1.412±0.165'1.072±0.1920.9550.195酸性肽(75ug/ml)组1.3710.066'0.990±0.1580.888±0.112酸性肽(150ug/ml)组1.792±0.116'0.721±0.0910.636±0.085*P<0.01细胞分泌BDNF的测定结果见表18。表18酸性肽对培养的星形胶质细胞上清液中分泌BDNF的OD值(^±s，n=8)分组24小时48小时72小时无血清对照组1.2710.0230.348±0.0070.225±0.Oil20%血清组1.5780.02"0.489±0.018"0.341±0.008"酸性肽(37.5ug/ml组)1.297±0.0.365±0.or0.234±0.008'酸性肽(75ug/ml)组1.366±0.018"0.398±0.007"0.298±0.008"酸性肽(150ug/ml)组1.536±0.018"0.475±0.006"0.328±0,007"与无血清对照组比较*P<0.05，**P<0.001试验实施例6酸性肽透过血脑屏障实验(1)实验动物SD大鼠，60只，购于河南省实验动物中心；鸡、鸭、兔、牛和羊等动物购于市场。(2)Glu和酸性肽标准曲线的制作分别配制0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的Glu和酸性肽溶液。用微量进样器分别精确吸取4^1浓度为0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的溶液点在5个泳道上。300V电泳lh，取出后立即放在电热鼓风干燥箱中，65'C下烘干lOmin。用剪刀剪下斑点，95%的乙醇洗脱下斑点并用分光光度仪测定各个斑点洗脱液的OD值。以浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，分别绘制Glu、酸性肽的标准曲线。(3)大鼠口服酸性肽对脑内酸性肽含量的影响分析60只SD大鼠(购于河南省实验动物中心)随机分为6组，每组10只。空白对照组每只大鼠灌2ml生理盐水。其余5组大鼠用酸性肽灌胃2ml(100mg/kg)。各组分别在灌胃后lh、2h、3h、4h、5h采用断头处死。处死的大鼠立即剥颅取脑，加4倍重量的生理盐水制成脑匀桨，3000r/min离心10min，取上清液，封闭后在沸水中煮5min，冷却后，取lml，5000r/min离心10min。取上清液4pl点样做纸电泳。300V电泳lh后取出电泳滤纸，放在烘箱中，65'C烘干10min。分别把对应于Glu、酸性肽的斑点剪下，95%的乙醇洗脱，用UV-2000型分光光度计(A570nm)测出洗脱液的OD值。分别测出每组(10只)大鼠的Glu、酸性肽OD值，取其平均OD值，在Glu、酸性肽的标准曲线上找出对应的含量，然后换算出大鼠脑中的Glu、酸性肽含量。(4)数据的统计分析实验结果以^is表示，显著性检验用方差分析及q检验，采用SPSS软件进行统计学分析。(5)实验结果Glu和酸性肽标准曲线的制作结果见表19、20、附图4、5。表19谷氨酸的OD值<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>谷氨酸(Glu)的标准曲线见附图4。表20酸性肽的AP值<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>酸性肽(AP)的标准曲线见附图5。大鼠口服酸性肽对脑内酸性肽含量的影响分析结果见表21、22和附图6。表21谷氨酸(Glu)在各组大鼠脑中的含量(mg/g脑组织)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>方差分析F=197.693PO.Ol表22酸性肽(AP)在各组大鼠脑中的含量(mg/g脑组织)组别例数x士sP对照组灌胃lh灌胃2h灌胃3h灌胃4h灌胃5h合计101010101010601.7789±0.20781.4662±0.15113.8377±0.27783.2253±0.27331.8701±0.18221.7398±0.18222.3197±0.9150<0.01<0.01<0.01>0.05>0.05方差分析F=32.757PO.Ol大鼠脑中酸性肽和Glu随灌胃时间而变化的曲线图如附图6所示。通过上述实验例(对早老型痴呆模型大鼠和血管型痴呆模型小鼠)可证明本发明小分子酸性肽干粉对早老性痴呆病具有疗效。通过药理学研究(包括①酸性肽对脑内蛋白质合成的影响；②酸性肽对凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促进基因Bax基因表达的影响；③酸性肽对脑内一氧化氮(NO),e淀粉样肽和N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体产生水平的影响和对神经细胞凋亡的影响；酸性肽对神经胶质细胞分泌神经生长因子(NGF)和脑源性生长因子(BDNF)的影响；⑤酸性肽能否透过血脑屏障等)以证明其作用机理——1、酸性肽能增加脑内蛋白质的合成，促进大脑损伤的修复；2、酸性肽能促进凋亡抑制基因Bcl-2基因的表达和抑制凋亡促进基因Bax基因的表达；3、酸性肽抑制一氧化氮(NO),e淀粉样肽和N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的产生，从而抑制神经细胞的凋亡。4、酸性肽能够促进星形胶质细胞合成和释放神经生长因子(NGF)和脑源性生长因子(BDNF)，从而促进星形胶质细胞增殖，存活率增加，对神经细胞的生长存活具有营养和保护作用。5、酸性肽为小分子3肽，无抗原性，能够通过血脑屏障。另外，发明人已经对本发明的小分子酸性肽干粉进行过毒理学研究(14天急性毒性实验，90天慢性毒性实验和35周诱癌实验)，可以证实本发明小分子酸性肽的安全性。下面的制剂实施例说明包含由本发明提供的小分子酸性肽的药用制剂。制剂实施例l片剂。按照本领域巳知的方法制备片剂，每片含有下述成份小分子酸性肽100mg乳糖30mg硬脂酸镁O.lmg聚乙烯吡咯烷酮O.lmg制剂实施例2胶囊按照本领域已知的方法制备胶囊，每个胶囊中含有下述成份小分子酸性肽80mg乳糖20mg玉米淀粉10mg硬脂酸镁0.03mg聚乙烯吡咯垸酮0.03mg制剂实施例3口服液按照本领域已知的方法制备口服液，每IO毫升口服液中含有下述成份:小分子酸性肽3.0g果糖l.Og水10mL苯甲酸(防腐剂)O.Olg权利要求1.一种小分子酸性肽，如以下氨基酸序列表示Glu-Glu-Glu。2、根据权利要求1所述的酸性肽，其特征在于该酸性肽是以动物大脑的脑蛋白干粉为原料，经Sephadex-G50柱层析、硅胶柱层析提取得到的。3、根据权利要求2所述的酸性肽，其中所述的动物大脑选自牛脑、羊脑、猪脑、鸡脑、鸭脑、鹅脑。4、根据权利要求2所述的酸性肽，其中所述的动物大脑是牛脑。5、权利要求1所述酸性肽的提取方法，该方法包括以下步骤a、将动物脑蛋白干粉溶解于生理盐水中，过滤后用Sephadex-G50柱层析，以蒸馏水为洗脱剂，收集含有2种小肽的洗脱液；b、步骤a中所得洗脱液用硅胶柱层析，以氯仿、甲醇、水的混合液为洗脱剂，收集Rf值为0.48的洗脱液，洗脱液冷冻干燥得目标产物。6、根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于所述动物脑蛋白干粉由下述方法制得将新鲜动物脑加入生理盐水中，匀浆、离心处理后，收集上清液，上清液冷冻干燥得动物脑蛋白干粉。7、根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于步骤a中收集的洗脱液的Rf值为0.45—0.52。8、根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于步骤b中所述洗脱剂各组分的体积比为氯仿甲醇水=60:50:10。9、用于预防或治疗早老性痴呆病的药物组合物，其特征在于含有治疗有效量的权利要求1所述酸性肽活性成分和药学上可接受的载体。10、根据权利要求1所述的酸性肽在制备预防或治疗早老性痴呆病药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种小分子酸性肽，其氨基酸序列如以下所示Glu-Glu-Glu。本发明还涉及该酸性肽的提取方法，它以动物大脑的脑蛋白干粉为原料，经Sephadex-G50柱层析、硅胶柱层析提取而得。本发明还进一步涉及以该酸性肽为活性成分的药物组合物，以及所述的酸性肽和药物组合物在制备预防或治疗早老性痴呆病药物中的应用。该产品具有生产容易、成本低廉、疗效好等优点。文档编号A61K38/06GK101121745SQ200710118699公开日2008年2月13日申请日期2007年7月12日优先权日2007年7月12日发明者安玉会申请人:安玉会