专利名称：聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶偶合物及制备工艺的利记博彩app
聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶偶合物及制备工艺技术领域涉及一种治疗痛风和高尿酸氧化酶的药物制剂，尤其是一种能够明显降低免 疫原性，减少用药次数，具有长效作用的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶偶合 物以及其制备工艺。
背景技术：
2001年、2002年，用于高尿酸血症的预防和治疗(肿瘤化疗高尿酸血症的 治疗和预防)的基因重组的尿酸氧化酶，先后在欧洲和美国上市。和传统的治疗 药物相比，该药物具有起效快、药效明显、副作用小、药物相互反应限制少、治 疗周期短等特点。但是，尿酸氧化酶作为异源蛋白，多次应用人体会产生抗体， 导致过敏反应和疗效降低。特别是尿酸氧化酶不能用于与高尿酸血症密切相关的 痛风患者的治疗。痛风病程颇长，未累及肾脏者经过有效防治，预后良好， 一般不影响寿命， 且可和正常人一样工作生活，但如防治不当，不仅急性发作有很大痛苦，且易导 致关节畸形、肾结石、肾损害等严重后果，肾功能不全者预后较差。因此，对于 痛风患者应该积极给于治疗。为了解决黄曲霉尿酸氧化酶在临床治疗上的不足，多家生物制药公司致力于 开发免疫原性低和半衰期长的尿酸氧化酶。其主要手段是通过对尿酸氧化酶进行 聚乙二醇修饰。国外，文献报道的聚乙二醇化重组哺乳动物的尿酸氧化酶已经进入二期临 床，我们认为不管是猪尿酸氧化酶还是黄曲霉尿酸氧化酶，对人体来说都是异源 蛋白，还未见到二者免疫原性高低的报道。鉴于猪尿酸氧化酶在大肠杆菌以包涵 体的形式表达，而黄曲霉尿酸氧化酶以可溶形式高效表达，所以选择对黄曲霉尿 酸氧化酶进行修饰以降低免疫原性，期望用于痛风病人的长期治疗。聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)是一种无毒、无免疫原性的水溶性 高分子物质，可以通过共价件键结合方式修饰蛋白质。聚乙二醇修饰蛋白质药物 不仅可以降低免疫原性和毒性、而且能明显延长血浆半衰期，提高蛋白质药物的 稳定性。国内外未见用于黄曲霉尿酸氧化酶的半胱氨酸的巯基进行修饰的报道。本发 明提供了一种聚乙二醇分子与重组黄曲霉尿酸氧化酶的半胱氨酸的巯基结合，且 一个重组黄曲霉尿酸氧化酶结合3个聚乙二醇分子的聚乙二醇化重组黄曲霉尿 酸氧化酶的制备方法。发明内容本发明所要解决的首要技术课题是提供一种能明显减少用药次数、用于难治性痛风临床治疗的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特征在于聚乙二醇化重组 黄曲霉尿酸氧化酶药物是由聚乙二醇和重组黄曲霉尿酸氧化酶(rU0X)以共价键 连接。根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特征在 于所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物是由聚乙二醇和重组黄曲霉尿 酸氧化酶的半胱氨酸的巯基通过共价键连接。根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特 征在于每个重组黄曲霉尿酸氧化酶分子连接3个聚乙二醇分子。根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特 征在于所述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(monomethoxy polyetnylene glycol, mPEG-MAL)活化分子，其分子量在5000 40 000之间; 优选的分子量为20000。根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特 征在于聚乙二醇与重组黄曲霉尿酸氧化酶(rlIOX)发生共价结合反应的摩尔比 为0.25-20，优选比例在l-9之间。本发明所要解决的再一个技术课题是提供一种上述聚乙二醇化重组黄曲霉 尿酸氧化酶的生产工艺。包括以下过程(1) 提供pH6. 0 9. 0、 10-100mmol/L的盐浓度的缓冲体系；(2) 重组黄曲霉尿酸氧化酶与单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺在(l)步骤提供 的体系中反应0. 5 12小时，温度控制在4 37°C;(3) 经步骤(2)反应得到的产物经过分于筛色谱分离纯化，收集聚乙二醇与 重组黄曲霉尿酸氧化酶的偶合物，过滤除菌，冷冻干燥后即得。与现有技术相比，本发明所具备的突出的实质性特点和显著的技术进步。主要表现在以下3个方面 本发明所述的重组黄曲霉尿酸氧化酶是采用基因工程的方法经大肠杆菌发 酵、纯化后获得，纯度大于98%，且保持较高的生物活性；本发明采用对重组黄曲霉尿酸氧化酶的半胱氨酸的巯基进行选择性高的修 饰方法，即聚乙二醇马来酰亚胺和重组黄曲霉尿酸氧化酶的全部半胱氨酸的巯基 通过共价键方式连接，使产物的均一性得到大大提高，容易纯化，纯化产物的活 性能够较好地保留；本发明所提供的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶的优点是提供在体内更 长时间的血液水平，具有明显的长效性，减少注射次数而使患者容易接受。附图概述
图1是重组黄曲霉尿酸氧化酶与聚乙二醇(PEG)在25。C， pH8.0的条件下 不同比例的修饰反应结果的SDS-PAGE图，图中l， 2， 3， 4分别表示重组黄曲霉 尿酸氧化酶与单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比例为1:0.33， 1:1， 1:3， 1:9;图中5， 6， 7， 8分别重组黄曲霉尿酸氧化酶与单甲氧基聚乙二醇马来酰亚 胺的摩尔比例为1:0.33， 1:1， 1:3， 1:9;图中9表示未修饰的重组黄曲霉尿酸 氧化酶，M表示低分子量标准。图2是重组黄曲霉尿酸氧化酶与聚乙二醇(PEG)在4°C， pH8. 0的条件下不 同比例的修饰反应结果的SDS-PAGE图，图中l， 2， 3， 4分别表示重组黄曲霉尿 酸氧化酶与单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比例为1:0.33， 1:1， 1:3， 1:9; 图中5， 6， 7， 8分别重组黄曲霉尿酸氧化酶与单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的 摩尔比例为1:0.33， 1:1， 1:3， 1:9;图中9表示未修饰的重组黄曲霉尿酸氧化 酶，M表示低分子量标准。实施例1在本实施例中使用的重组黄曲霉尿酸氧化酶的纯度大于98%，且保持有较 高的生物活性；将重组黄曲霉尿酸氧化酶溶于100mM的磷酸盐缓冲液(PBS)中，按重组黄 曲霉尿酸氧化酶与聚乙二醇(PEG) 1:3 (摩尔比)的比例加入；单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-maleimide， mPEG-MAL-20000)加入搅 拌溶解，室温(20-25°C)反应2-12小时。 实施例2在本实施例中使用的重组黄曲霉尿酸氧化酶的纯度大于98%，且保持有较 高的生物活性；将重组黄曲霉尿酸氧化酶溶于100mM的磷酸盐缓冲液(PBS)中，按重组黄 曲霉尿酸氧化酶与聚乙二醇(PEG) 1:3 (摩尔比)的比例加入；单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-maleimide， mPEG-MAL-5000)加入搅 拌溶解，室温(20-25°C)反应2-12小时。
权利要求
1、一种聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特征在于聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物是由聚乙二醇和重组黄曲霉尿酸氧化酶(rUOX)以共价键连接。
2、 根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特征在于所述 的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物是由聚乙二醇和重组黄曲霉尿酸氧化酶的半胱氨酸 的巯基通过共价键连接。
3、 根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特征在于-每个重组黄曲霉尿酸氧化酶分子连接3个聚乙二醇分子。
4、 根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特征在于-所述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(monomethoxy polyetnylene glycol, mPEG-MAL)活化分子，其分子量在5000 40 000之间；优选的分子量为20000。
5、 根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物，其特征在于-聚乙二醇与重组黄曲霉尿酸氧化酶(rUOX)发生共价结合反应的摩尔比为0.25-20，优选比 例在1-9之间。
6、 根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物的生产工艺，包括以 下过程(1) 提供P服 9、 10-100mmol/L的盐浓度的缓冲体系；(2) 重组黄曲霉尿酸氧化酶与单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺在(l)步骤提供的体系中反 应2 10小时，温度控制在4 37。C;(3) 经步骤(2)反应得到的产物经过分于筛色谱分离纯化，收集聚乙二醇与重组黄曲霉尿 酸氧化酶的偶合物，过滤除菌，冷冻干燥后即得。
7、 根据权利要求6所述的聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶药物的生产工艺，其特征 在于聚乙二醇与重组黄曲霉尿酸氧化酶发生共价结合反应的缓冲体系优选的PH值在 6.5-8.5之间，优选的温度在25'C-37'C,优选的时间为4-12小时。
全文摘要
本发明公开了聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶制剂及其制备工艺，相比未修饰的黄曲霉尿酸氧化酶，在人体内具有更长的半衰期，能够明显减少用药次数，降低毒副作用，特别适合于难治性痛风的临床治疗，临床上具有广泛的应用前景。
文档编号A61K38/44GK101327327SQ20071011122
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月18日 优先权日2007年6月18日
发明者于之伦, 玲 付, 侯利华, 张晓鹏, 张金龙, 易绍琼, 冰 李, 李建民, 杨秀旭, 赵兴卉, 薇 陈 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所;北京天圣泰生物科技有限公司