专利名称：人肝素酶的rna干扰靶点序列及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及2个人肝素酶的RNA干扰耙点序列， 由于这2个干扰序列经过克隆入载体，转入肿瘤细胞后可使肿瘤细胞中人肝素酶蛋白 在转录后水平表达明显下调，从而f划中瘤在转移，血管生成等各方面受到明显抑制。 因此本发明所涉及的干扰序列可以用于审恪有关抗肿瘤的药物。
背景技术：
1999年，澳大利亚的Parish和以色列的Voldavsky同时首次克隆并鉴定出与肿瘤转 移密切相关的肝素酶基因(HPA) 。 HPA定位于4号染色体q213位置，其cDNA包含的 长度为1629bp的开放阅读框编码含543个氨基酸分子量为61.2KD的多肽。其表达产物 属内P-D-葡萄丰腊酶，能特异性识别、切断硫翻干素蛋白多糖(HSPG)的硫酸肝素(HS) 侧链。HSPG是细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)的主要成分之一，在组织构成、 血管形成和细胞粘附等诸多方面发挥重要的生理作用。高度水化的HS侧链及所带的负 电荷形成结构致密的选择性分子筛，是阻止肿瘤细胞侵袭扩散的首要屏障之一，同时， 伸展的HS侧链还储备着大量生长因子、趋化因子和酶类等生物大分子。肝素S每促肿瘤 转移的机制一方面在于它能糊军HSPG，破坏ECM和BM的完整性，另一方面又间接地 释放和活4toS结合的多种生长因子，如bFGF、 EGF等，促进肿瘤血管形成，为发生转 移的肿瘤细胞在局部定植提供营养。HPA基因mRNA在脾脏、淋巴结、胸腺、夕卜周血 白细胞、骨髓及胎肝等免疫组织中均可检测到，而在除胎盘以外的成熟非免疫组织(如 心脏、骨骼肌及胰腺等)均不表达，但在转移性的恶性肿瘤细胞中普遍存在。包括肝 细胞癌、膀胱癌、大肠癌、胃癌、乳腺癌、口腔癌、食管癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、 急性髓细胞样白血病等等。所有这些研究发现意味着人肝素酶可能是我们在肿瘤治疗 过程中一个新靶点。由于肝素酶在恶性肿瘤中的广泛表达的特性，人们一直在利用各 种方法寻找其抑制剂。通过构建携带反义全长人肝素酶cDNA腺病毒载体，人们发现 人肺癌AS49细胞的体外侵袭能力和体内转移能力都被特异性抑制。同样的发现还有在 黑色素瘤细胞的转移和侵袭方面。RNAi主要;M过在转录后水平阻断基因表达，借此劍门可以研究基因的功能。 同时它为我们提供了一个治疗疾病的新途径。比如，我们可以按拟定的方式来关闭非必需或致病基因的功能。随着人们对多种生物体基因组序列了解的深入，RNAi技术 可以帮助劍门更细致的了解复杂的生理学过程。RNAi技术与基因组学、蛋白质组学 和功能蛋白质组学密切相关，因此，人们可以利用RNAi开发更多的新药。随着RNAi现象的发现及其技术的不断成熟和进步，尤其是应用与哺乳动物后。 相比传统的基因组学技术，RAM更迅速，更直接，更高效，其在构建基因敲减动物 模型和研究遗传疾病中的作用越来越突出。基于上述研究发现，我们通过构建shRNA载体，利用其较长久稳定的基因敲减作 用来研究肝素S每在肝癌HepG2细胞中蛋白表达情况。并且发现经过RNA干扰后，肝 癌HepG2细胞中的HPA蛋白表达明显下调，这表明RNA干扰X寸肝癌HepG2细胞的 肝素酶的具有显著的抑制作用。发明内容本发明的目的在于提供人肝素酶的2个RNA干扰耙点序列，分别为 SEQIDNO: 1 GGCTATCTCTTCTGTTCAA SEQIDNO: 2 CTCAGTTGCTCCTGGACTAo通过这2个耙点的RNAi作用，可明显抑制人肝素酶在肿瘤细胞中的表达，因此， 本发明的另一目的是关于所述RNA干扰耙点序列及由其获得的siRNA在用于制备抗肿 瘤药物中的应用。本发明的上述2条干扰序列，是通过网络在线工具(www.genscript.com)筛选获得， 筛选的原则如下1. 热力学性质热力争性质不稳定的序列被筛除。2. SiRNA耙点长度预先设置为19个碱基每个序列。3. 靶点的GC含量预先设置GC含量在40-60。/。。 GC含量低的革巴序列(<60%)比 GC含量高(>60%)的耙序列的干扰效果更好。对于GC含量高的基因，我们可以调整 GC含量的上限。4. 革巴序列的来源劍门推荐以开放阅读框为激门选取序歹啲来源。在起始密码子 ATG下游50-100nt后选取效果更好。5.生物体人、鼠和兔的基因组是当前可禾鹏的。6. RNA的二级结构计算RNA二级结构和每个耙点的正义链和反义链的最小自由能。7. 重复序列去除串联重复序列。8. 去除能触发机体免疫反。9. BLAST/Smith Waterman搜索每一个候选序列经ilBLAST确保与特定生物体 的mRNA序列同源性小于15bp。10. AE和等级所有的候选序列在GenScript所有的算法和AE的基础上经行排列。 并构建含干扰片段的dsDNA，送生物公司合成，然后克隆入质粒pGenesil-l，测 序鉴定；通过稳定转染(脂质体法，ioche公司DOTAP月旨质体)至肝癌HepG2细 胞，经G418抗性筛选后得到阳性克隆；挑取单个克隆，进行扩大培养，得到的各 组细胞分别含目的干扰序列;Western Blot检测鉴定各组干扰序列对人肝素酶蛋白的 抑制效果。在发明说明书和附图中，使用IUPAC—IUB国际生化命名委员会推荐的方式表示 碱基(或称核苷酸)和氨基酸的縮写 A:腺嘌呤 T:胸腺嘧啶 G:鸟嘌呤 C:胞嘧啶dsDNA:双链脱氧核糖核酸
图l为pGenesi1-l质粒图谱。图2为网络在线工具获取前十位耙点图。图3为pGenesil-Hpal-l (SEQIDNO: 1)测序结果。图4为pGenesil-Hpal-2 (SEQIDNO: 2)测序结果。图5为pGenesil-Hpal-3 (SEQIDNO: 3)测序结果。图6为稳定转染后H印G2细胞的荧光表达的检测，其中图A、 B、 C、 D是HepG2 细胞分别转染pGenesil-Hpal-l、 pGenesil-Hpal-2、 pGenesi1-Hpal-3 、 pGenesil-Hpal-N后可见光视野下的细胞(MX200);图Al、 Bl、 Cl、 Dl分别是与A、 B、 C、 D同视野下荧光表达(FMX200)。图7为抗性筛后阳性克隆的荧光检测，其中图A、 B、 C、 D分别是转染pGenesil-Hpal-l、 pGenesil-Hpal-2、 pGenesil-Hpal-3 、 pGenesil-Hpal-N后经G418抗性筛 选3周后可见光视野下克隆(MX100);图A1、 Bl、 C、 D1分别是与A、 B、 C、 D 同视野下荧光表达(FMXIOO)。图8:为Western Blot检测图。图9为WesternBlot定量分析图,横坐标l、 2、 3、 4、 5分别表示图8中的SEQ IDNO: 2、 SEQIDNO: 1、 SEQIDNO: 3、阴性对照组和正常细胞组。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅用于说明本发明， 而不用于限定本发明的范围。实施例一人肝素酶mRNA序列的获取从国际开放共享基因库NCBI GeneBank中查找出Al干素酶mRNA序列谨因 ID:AF165154)如下<formula>formula see original document page 0</formula>901MGGCTGGTGGAGAAGTGATTGATTCAGTTAGATGGGATGACTACTA丌TGMTGGACGG961ACTGGTACCAGGGMGATTTTCTAMGCCTGATGTATTGGACATTT丌ATTTGATCTGTG则CAAMAG丌TTCCAGGTGGTTGAGAGGACGAGGCCTGGCAAGMGGTCTGGTTAGGAGM1081ACMGGTCTGGATATGGAGGCGGAGCGCCGTTGCTATCCGACACCTTTGCAGCTGGCTTT1141ATGTGGCTGGATMATTGGGCCTGTGAGCCCGMTGGGMTAGMGTGGTGATGAGGCM1201GTA丌G丌TGGAGCAGGAMGTAGCATTTAGTGGATGAMACTTCGATCCTTTACCTGAT1261TATTGGGTATGTC丌GTGTTCMGAMTTGGTGGGGAGGAAGGTGTTMTGGCAAGCGTG1321CMGGTTGMAGAGAAG6MGCT職GTATACCTTGATTGCACAMCACTGACMTCCA訓AGGTATAMGMGGAGA丌TMGTCTGTATGCCATAMCCTCCATMTGTCACCMGTAC1441TTGCGGTTACCCTATCCTTTTTCTMGMGCMGTGGATAMTAGCTTCTMGACCTTTG1501GGACCTGATGGATTAC丌TCGMATCTGTGCMGTCMTGGTGTMCTCTAMGATGGTG1561GATGATCAMCC丌GCCACCTTTMTGGAAAAACCTCTCCGGGCAGGMGTTCACTGGGC1621TTGCGAGC丌TCTGATATAGTIIIIIIGTGATMGAMTGCCAMG丌GCTGCTTGCATC1681TGAAMTAMATATACTAGTCCTGAAAAMAAAAAAAMAAAM干鹏列的设计鹏匿genscript. can网站在线siRNA革巴点设计工具进行分析(具体原则贴)， 得到前10位的耙点(图2)。选择NOl (SEQIDNO: 1) ， N03 (SEQIDNO: 3) ， N06 (SEQIDNO: 2)为的目的序列。再设计一组无关序列作为阴t，照，具体序列 为:5 ， -ACTACCGTTGTATAGGTGT-3，。 实施例三载体的构建构建01igo单链，在正义和反义链之间链接Loop环，在SEQEDNO: 1的A链的 5'端加上BamH I酶切位点，3，端加上终止密码子，并在与其互补的B链5，端加上Hind III酶切位点(如下表所示)。BamH I酶切位点及巡Loop环W慈终丄卜.密码子SEQ ID NO: IB 3'-GCAACTTGTCTTCTC丁ATCGG AGTTCTGC CCGATAGAGAAGACAAGTT AAAAA A 77Q^l-5'然后进行人工合成后，将SEQIDNO: 1的A链与B链、退火连成双链。同样的 方法应用于SEQIDNO: 2和SEQIDNO: 3链及阴性对照链。BamH I和HindIII双酶切质粒pGenesi1-1 (质粒图谱如图1)，然后将双链DNA克隆至质粒pGenesi1-1， 送公司测序鉴定(图3、图4、图5)。各质粒分别命名为pGenesil-Hpal-l (SEQIDNO: 1) 、 pGenesil画Hpal-2 (SEQIDNO: 2) 、 pGenesil-Hpal-3 (SEQIDNO: 3) 、 pGenesil陽 Hpal-N (阴十顿照)。 实施例四稳定转染、抗性筛选及扩大培养将各构建好的载体用脂质体法分别稳定转染至肝癌H印G2细胞，12小时后更换无 血清DMEM培养基为含5%胎牛血清的DMEM高糖培养基。48小时后观察各组细胞荧光表 达情况(图6)，转染效率大约为20%-30%。然后各组细胞均加G418进行抗性筛选(G418 浓度为300ug/ml) ， 3周后形成阳性克隆(图7)。无菌条件下各组均挑取单个克隆于 24孔板中进行扩大培养。各组细胞分别命名为pGenesil-Hpal-l/ H印G2、 pGenesil-Hpal-2/ H印G2、 pGenesil-Hpal-3/ H印G2、 pGenesil誦Hpal-N/ H印G2。 实施例五Western Blot检测各组蛋白的表达情况在100ml培养瓶中培养正常HepG2细胞和分别转染pGenesil-Hpal-l 、 pGenesil-Hpal-2、 pGenesil-Hpal-3、 pGenesil-Hpal-N并经抗性筛选后的HepG2细胞。待细胞 汇合率达到80-90%时，用蛋白提取液分别处理各组细胞，收集总蛋白；BCA法定量 后SDS-PAGE电转膜；免疫抗体反应；最后化学增强发光法(ECL)显带；以GAPDH 为内参照。(图8)用Quantity One软件对Western Blot检测图进行分析。结果发现3条干扰IIX寸人 肝素酶蛋白的表达均有抑制作用，抑制效率分别达到SEQIDNO: 1干扰序列(57%)、 SEQIDNO: 2干iW歹U (71%) 、 SEQIDNO: 3干扰序列(43%)。根据对人肝素酶蛋白的表达抑制效率，选择SEQIDNO: l和SEQIDNO: 2为筛选后的干扰耙点序列。
权利要求
1. 人肝素酶RNA干扰靶点序列，包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO2核苷酸序列。
2.针对权利要求1所述的RNA干J赠巴点序列获得的siRNA。
3.权利要求1戶;M的AI干素酶RNA干J赠巴点序列在制Mi^中fK物中的应用。
4.权利要求2所述的siRNA在制备抗癌药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了人肝素酶的2个RNA干扰靶点序列，分别为SEQ ID NO1 GGCTATCTCTTCTGTTCAA SEQ ID NO2 CTCAGTTGCTCCTGGACTA。通过这2个靶点的RNAi作用，可明显抑制人肝素酶在肿瘤细胞中的表达，抑制效率分别达到了71％和57％。因此，所述RNA干扰靶点序列及由其获得的siRNA可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号A61K48/00GK101255418SQ200710078659
公开日2008年9月3日 申请日期2007年6月27日 优先权日2007年6月27日
发明者杨仕明, 震 熊 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院