一种降低免疫细胞表面抗原位点免疫原性的方法及应用的利记博彩app

专利名称：：一种降低免疫细胞表面抗原位点免疫原性的方法及应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及生物技术，主要涉及降低免疫细胞表面MHC-II抗原位点免疫原性的方法，可在排斥反应中的应用。
背景技术：
：通过组织，细胞或者器官的移植，来代替丧失功能的组织，细胞和器官是现代医学治疗的重要手段之一。提供移植物的个体称作供者，而接受移植物的个体称为受者。根据供者和受者的组合，可以有以下三种移植类型自体移植，是指把来自移植受者本身的组织或者器官移植给受者。同种同基因移植，是指遗传结构完全相同或非常相似的个体之间的移植。同种异基因移植，是指同一动物种内遗传结构不同个体之间的移植。异种移植，是指不同动物种的个体之间的移植，如猪与人之间的移植。前两种的移植不会发生排斥反应。当前，无论是从国际还是国内的具体实情出发，同种异基因移植(同种异源移植)是临床上主要的也是可行的移植方法。研究表明，在同种异基因移植中，受者对移植物的排斥是移植成功的主要障碍，而发生排斥反应的主要机理也已经得到学界的共识，即是由受者T细胞介导的，针对同种异型抗原的免疫应答。目前，接受器官移植的患者正在逐年增加，但是移植后器官的急性排斥反应的发生率很高，影响了移植的成功率和患者的存活率。现有的抗免疫排斥反应的主要方法仍依赖于各种免疫抑制剂，不仅价格昂贵，而且由于免疫抑制作用，感染，肿瘤的发生机会也明显增加。另外，通过依靠体外培养，冷冻，外部放射疗法，动物过继移植等手段来降低移植物免疫原性从而延长移植器官生存时间的方法取得了一定的效果，但在器官移植中却并无实际的应用价值，例如，外放射疗法使供器官内外接受的发射线往往不均匀，计量过小达不到预期效果，计量过大则可能对供器官造成广泛损害。因此，迄今为止，尚未找到临床使用性强且确切有效的手段。20世纪发现，在不同种属或同种不同系别的个体间进行组织移植时，会出现排斥反应，其本质是细胞表面的同种异型抗原诱导的一种免疫应答。这种代表个体特异性的同种异型抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中能引起强而迅速排斥反应的抗原称主要组织相容性抗原，引起较弱排斥反应的抗原称次要组织相容性抗原。主要组织相容性抗原是一个复杂的抗原系统，编码这一系统的基因位于同一染色体片段上，是一组紧密连锁的基因群，称为主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)。不同种属的动物其MHC有不同的命名，如小鼠的MHC称H-2复合体，猪的MHC称SLA复合体，人的MHC称HLA复合体等。MHC基因包括经典MHC-I和MHC-I1基因，分别合成MHC-I和MHC-II类分子抗原，其在分子结构，组合分布和功能上有各自特点。l类分子由重链和Pm链组成，分布于所有有核细胞表面，主要识别和提呈内源性抗原肽，与辅助受体CD8+细胞结合，对CTL细胞的识别起限制作用。ll类分子由a链和P链组成，仅表达于淋巴样组织中的各种细胞表面，如专职抗原提呈细胞(包括B细胞，树突状细胞，巨噬细胞等)，胸腺上皮细胞和活化的T细胞等，主要识别和提呈外源性抗原肽，与辅助受体CD4+结合，对Th的识别起限制作用。MHC分子抗原参与T细胞介导的免疫排斥应答途径有两条一直接识别途径，受者T细胞直接识别移植物上的由供者APC细胞提呈的完整的同种异型MHC分子和肽的复合物，是急性移植排斥反应的主要原因。二间接识别途径，受者T细胞识别由受者APC提呈和加工处理后的从移植物上脱落的供者的同种异型MHC分子肽和受者MHC分子的复合物，与慢性排斥有关。动物实验证实导致急性移植免疫排斥反应发生的抗原一MHC-II类分子主要是来自移植物中的过客白细胞，其中主要是成熟的树突状细胞，成熟的淋巴细胞和单核巨噬细胞，同时在血管内皮细胞表面和部分的T淋巴细胞表面也有表达，实验中在移植前把携带MHC-II的细胞去除，能使MHC-I错配的移植物排斥减慢减轻，甚至不发生，而重新输入携带MHC-II类分子的供者细胞能重建排斥反应，其机制在于携带同种异型MHC-II分子的过客白细胞能激活受者CD4+Th细胞，活化的Th细胞分泌细胞因子，辅助同种异型应答的CD8+CTL细胞充分生长和分化，从而激发排斥反应。如在移植前除去过客白细胞，则同种异型应答的CD8+CTL难以扩增和分化，排斥反应就减弱，因此，应用抗MHC-II单抗可以定向的和靶细胞表面的MHC-II抗原相结合，下调供体的免疫原性，有效降低移植术后发生排斥反应的机会。^Re是"Tc的同族元素，"Tc目前的应用较为普遍，而柳Re作为一种新兴的核素，与"Tc相比具有更良好的核物理性质，发射2.12MeV的3——射线，155MeVY射线，半衰期16.9小时，可以迅速从体内排除，不会在体内蓄积。组织中的最大射程为0.97cm，既能有效杀灭与之相结合的过客白细胞，又不会对其他的组织细胞造成大范围的损伤，具有良好的效应和安全性。
发明内容本发明的目的是提供一种即降低免疫细胞表面MHC-II抗原位点免疫原性，又降低其对反应性细胞中的T细胞的刺激增殖作用的方法。本发明方法通过将188Re标记至2E9/13单抗上经透析，纯化，浓縮，过滤后制备成188Re-2E9/13F(ab)2，应用于体外单向混合淋巴细胞反应模型中实现，具体步骤为(1)通过木瓜蛋白酶水解2E9/13单抗后提取其中的F(ab)2片段，并经过过滤，纯化，浓縮，置于-2(TC冰箱中保存；(2)从188W-188Re发生器中获取^ReCV洗脱液，按直接制备法将188Re标记于F(ab)2片段上，制备成做Re-2E9/13F(ab)2片段。(3)分别设生理盐水对照组，单抗组和同位素标记抗体组，每组实验动物若干进行肝移植实验，在供肝取下后体外分别灌注生理盐水，单抗和同位素标记单抗30分钟后大量生理盐水冲洗，洗静灌注物，然后植入实验动物受者体内；(4)分别观察不同时间各组的肝肾功能指标，血清细胞因子水平的变化，最后观察肝脏组织病理切片；(5)结果显示经^Re-2E9/13F(ab)2片段离体灌注后的供肝在受者体内发生早期急性移植排斥反应的几率和程度与单纯的抗体和生理盐水灌注相比有较明显的降低。本发明的另一个目的是该方法在体外单向混合淋巴细胞反应模型中应用。本发明方法将生物学和核医学两种方法结合起来，率先引入了"SRe标记的抗MHC-II分子的单克隆抗体2E9/13F(ab)2片段，首次成功应用于动物实验中。机理是通过2E9/13F(ab)2片段封闭免疫细胞表面MHC-II抗原位点，降低其免疫原性的同时，利用^Re的射线灭活表达该抗原的免疫细胞，遏制其MHC-II抗原和协同刺激因子的再分泌，永久性的下调过客白细胞的免疫原性，进一步降低其对反应性细胞中的T细胞的刺激增殖作用。本发明具有以下特点本发明集生物学和核医学两种方法为一体，在动物实验同种肝移植中引入了^Re标记的抗MHC-ll单克隆抗体2E9/13F(ab)2片段于体外供肝区域性灌注技术，解决了永久性下调同种异体MHCII类抗原的免疫原性问题，该灌注技术方法可行性强，与直接体内灌注或移植后再灌注等方法相比较，具有更安全，对受者影响较小，作用更加充分等优点，该核素抗体和灌注方法的使用较其他延长移植物的生存时间的纯生物学手段而言，具有更强的实用性和有效性。动物实验己经证实该方法在肝移植中的作用，在其他器官移植领域和人类的临床应用方面也必将有重要的临床实用价值和广阔的发展前景。图1为对照组和实验组术前和术后血清总胆红素水平变化折线图。图2为对照组和实验组术前和术后血清谷草转氨酶水平变化折线图。图3为实施例4中4种细胞因子的PCR电泳图。具体实施例方式本发明通过实施例作进一步的说明。实施例11.通过木瓜蛋白酶水解2E9/13单抗后提取其中的F(ab)2片段，并经过过滤，纯化，浓縮，置于-2(TC冰箱中保存；2.从188W-188Re发生器中获取^ReCV洗脱液，按直接制备法将188Re标记于F(ab)2片段上，制备成鄉Re-2E9/13F(ab)2片段。3.进行同种异体移植实验分别设生理盐水对照组，单抗组和同位素标记抗体组，每组实验动物若干进行肝移植实验，在供肝取下后体外分别灌注生理盐水，单抗和同位素标记单抗30分钟后大量生理盐水冲洗，洗静灌注物，然后植入实验动物受者体内；4.分别观察不同时间各组的肝肾功能指标，血清细胞因子水平的变化，最后观察肝脏组织病理切片；5.总结以上各部实验的结果，得出了以下结论经^Re-2E9/13F(ab)2片段离体灌注后的供肝在受者体内发生早期急性移植排斥反应的几率和程度与单纯的抗体和生理盐水灌注相比有较明显的降低。实施例21.抗体制备-(1)通过木瓜蛋白酶水解2E9/13单抗后提取其中的F(ab)2片段，并经过过滤，纯化，浓縮，置于-2(TC冰箱中保存。(2)Na化8ReCU的还原取柠檬酸-酒石酸混合溶液(pH4.4，柠檬酸0.015M，酒石酸0.15M)0.5mL，加入新配的SnCl2溶液(SnCI2'2H2O20g/L)，加入新从188W-18aRe发生器上淋洗下来的Na"8ReCU的生理盐水溶液0.3mL(1.3mCi，50，000kBq)，于室温下反应40min即得188Re还原液。(3)2E9/13抗体的还原取2E9/13F(ab)2溶液(1mg/mL)0.3mL,加入抗坏血酸的PBS溶液(pH5.2，40mgVc/mL)0.2mL，于室温下反应30min，即得2E9/13F(ab)2抗体还原液。2.2E9/13F(ab)2抗体的^Re标记合并上述步骤1、2中的188Re还原液和2E9/13F(ab)2抗体还原液，于室温下反应2h，即得188Re标记2E9/13F(ab)2单抗溶液，活度计(FJ-391-A2型)测量标记溶液的放射性活度。3.放射化学纯度的测定.-采用纸层析法，取^Re标记2E9/13F(ab)2单抗溶液适量，滴在新华1号滤纸上，以生理盐水为展开剂，照上行法展开10cm。取出晾干，于薄层色谱扫描仪(BioscanAR-2000)下检测层析纸上的放射性分布。188Re标记2E9/13F(ab)2单抗的Rf-0.0，计算原点处放射性占放射性总量的百分比，即为188Re标记2E9/13F(ab)2单抗的放射化学纯度。4.标记结果共制备了三批"SRe标记2E9/13F(ab)2单抗，其放射性活度和放射化学纯度如下表所示(其中放射性活度均计算至制备后17小时)制备时间放射性活度放射化学纯度06.6.1213,200kBq97.4%06.6.1915,400kBq96.9%06.6.2615,700kBq98.3%实施例3幼猪肝移植实验供肝切取及修整腹部纵行大切口进腹，游离肝周韧带，解剖出胆总管、肝动脉及门静脉，经脾静脉插入灌注管至门静脉主干，腹主动脉灌注管。全身肝素化，经门静脉及腹主动脉灌注4GC乳酸林格氏及^CUW液，经胆总管断端插管冲洗胆道。灌注过程中肝脏表面不断覆冰屑以助肝脏降温，至流出液清澈无血，肝脏冷却，表面呈均匀黄色后，离断肝周血管，切取供肝，置4。CUW液中修整。修剪肝上及肝下下腔静脉，切除胆囊，清除肝门部、门静脉及肝动200710071467.5说明书第6/7页脉周围结缔组织及淋巴结，各管道修整完后，注水检査，漏液处要结扎或缝合修补后，将供肝置于4GCUW液中保存，本组供肝无热缺血，冷保存时间控制在3小时内。对照组供肝在体外经门静脉及肝动脉灌注乳酸林格氏500ml;单纯抗体组:500ml乳酸林格氏加入300ug抗MHC-II单克隆抗体(2E9/13单抗F(ab)2片段)；同位素标记抗体组500ml乳酸林格氏加入同位素标记的300ug抗MHC-II单克隆抗体(188Re-2E9/13单抗F(ab)2片段)，并且夹闭供肝所有流出道，各自保留灌注半小时。三组手术时间、无肝期、冷缺血时间等均无明显差别。受体手术腹部正中纵切口，先行膀胱造痿，然后游离肝周韧带和血管，离断肝动脉，用血管阻断钳分别阻断门静脉、肝上及肝下腔静脉紧贴肝脏离断门静脉、肝上及肝下腔静脉移出肝脏，修整各血管断端，将供肝原位置入受体动物腹腔，以5-0Plolene针线连续缝合，端端吻合肝上腔静脉，6-0Plolene针线连续吻合门静脉，恢复肝血流，以5-0Plolene针线连续吻合肝下腔静脉，开放肝下腔静脉血流。吻合肝上腔静脉时从门静脉灌注4GC乳酸林格氏以防肝升温。用7-0Plolene针线吻合肝动脉，胆总管置入细输液管固定于腹壁，引流出体外。冲洗腹腔后关腹。手术开始，无肝期，新肝期和术毕、术后第1-9天每天抽取静脉血5ml，测谷草转氨酶(AST)、谷氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(totalbilirubin),电解质，肌苷，尿素氮。实验结果参见图1和图2。图中术前所包括的四点分别指手术开始，无肝期，新肝期和术毕四期，术后代表术后1-9天，对照组:代表生理盐水对照组；实验组L代表单纯抗体组；实验组2:代表同位素标记单抗组。总结以上各部实验的结果，得出了以下结论在动物实验中，经188Re-2E9/13F(ab)2片段离体灌注后的供肝在受者动物体内发生早期急性移植排斥反应的几率和程度与单纯的抗体和生理盐水灌注相比有明显的降低，这就为进一步的临床研究提供了重要依据，为在人体中采用该新技术方法打下了坚实的基础。实施例4在建构体外单向混合淋巴细胞培养(MLR)模型中应用取实施例1制备的188Re标记2E9/13F(ab)2单抗①分别设阳性对照组A(生理盐水处理后的刺激细胞+反应细胞)，单抗组B(单抗处理后的剌激细胞+反应细胞)，同位素标记单抗组C(同位素标记单抗处理后的刺激细胞+反应细胞)和阴性对照组D(反应细胞)，每个组又设为48，72，96，120小时(H)不同反应时间，收获细胞后做MTT测试；②分组如上，每组设72和120小时不同反应时间，收获细胞后做RT-PCR，并进行对比分析。结果1.MTT结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注阳性对照组A，单抗组B，同位素标记单抗组C，阴性对照组D，各组与阳性对照组相比，*尸<0.05，**尸<0.012.RT-PCR结果参见图3，其中A为IL-2，条带长度337;B为IL-IO，条带长度526;C为TNF-a，条带长度385;D为IFN-Y，条带长度410;条带l为阴性对照组(反应细胞)；条带2为抗体组(抗体处理后刺激细胞+反应细胞)；条带3为同位素标记抗体组(同位素标记抗体处理后剌激细胞+反应细胞)；条带4为阳性对照组(生理盐水处理后剌激细胞+反应细胞)；条带M为maker;上层光带为目的基因；下层光带为P-actin基因。权利要求1.一种降低免疫细胞表面抗原位点免疫原性的方法，通过将188Re标记至2E9/13单抗上经透析，纯化，浓缩，过滤后制备成188Re-2E9/13F(ab)2，应用于体外单向混合淋巴细胞反应模型中实现，具体步骤为(1)通过木瓜蛋白酶水解2E9/13单抗后提取其中的F(ab)2片段，并经过过滤，纯化，浓缩，置于-20℃冰箱中保存；(2)从188W-188Re发生器中获取188ReO4-洗脱液，按直接制备法将188Re标记于F(ab)2片段上，制备成188Re-2E9/13F(ab)2片段。(3)分别设生理盐水对照组，单抗组和同位素标记抗体组，每组实验动物若干进行肝移植实验，在供肝取下后体外分别灌注生理盐水，单抗和同位素标记单抗30分钟后大量生理盐水冲洗，洗静灌注物，然后植入实验动物受者体内；(4)分别观察不同时间各组的肝肾功能指标，血清细胞因子水平的变化，最后观察肝脏组织病理切片；(5)结果显示经188Re-2E9/13F(ab)2片段离体灌注后的供肝在受者体内发生早期急性移植排斥反应的几率和程度与单纯的抗体和生理盐水灌注相比有较明显的降低。2.根据权利要求1所述的一种降低免疫细胞表面抗原位点免疫原性的方法在体外单向混合淋巴细胞反应模型中的应用。全文摘要本发明提供一种降低免疫细胞表面抗原位点免疫原性的方法，通过将¹⁸⁸Re标记至2E9/13单抗上经透析，纯化，浓缩，过滤后制备成¹⁸⁸Re-2E9/13F(ab)₂，应用于体外单向混合淋巴细胞反应模型中实现。本发明集生物学和核医学为一体，在动物实验同种肝移植中引入了¹⁸⁸Re标记的抗MHC-II单克隆抗体2E9/13F(ab)₂片段于体外供肝区域性灌注技术，解决了永久性下调同种异体MHCII类抗原的免疫原性问题，该方法具有更安全，对受者影响较小，作用更加充分等优点，具有更强的实用性和有效性。文档编号A61K51/02GK101168067SQ20071007146公开日2008年4月30日申请日期2007年9月28日优先权日2007年9月28日发明者俊倪,杰刘,曹利平申请人:浙江大学