专利名称：：一种麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的制备方法
技术领域：
：本发明属生物制品领域，具体涉及一种麻渗腮腺炎风渗联合减毒活疫苗的制备方法。
背景技术：
：1、疾病性质和流行情况麻渗、流行性腮腺炎(简称腮腺炎)、风渗是由相应病毒引起的儿童最常见的急性呼吸道传染病。世界卫生组织(WHO)报道全球每年麻渗发病率3000_4000万例，死亡70多万。我国卫生部2005年和2006年两年的全国疫情报告，麻疹发病人数22.27万例，腮腺炎发病56.25万例，风渗发病6.24万例。这三种疾病近几年发病率高，不断在全国局部地区暴发流行，风渗又可^f吏孕妇早期感染而导致嬰儿先天性畸型，即先天性风渗综合征(CRS)。可见这三种传染性疾病仍严重威胁着儿童的身心健康和我国优生优育基本国策。为此，我国政府积极响应WH0的号召，承诺在2012年基本实现消除麻渗的目标，同时今年起将腮腺炎和风渗納入国家新扩大免疫预防的15种疾病之内，财政将出资25亿用于采购针对包括麻渗、腮腺炎、风渗这15种疾病的疫苗和预防接种，而且明确优先使用联合疫苗。2、疫苗开发和使用情况国外于上世纪70年代开发成功麻渗-腮腺炎、麻渗-风渗和麻渗-腮腺炎-风渗联合减毒活疫苗(醒R),以史克和默克两大公司为主的醒R于上世纪90年代中进入中国市场。国内上海生物制品研究所于上世纪60年代初分离麻渗病毒，研究成功沪-191抹麻渗减毒活疫苗。并于1993年对沪-191株毒种的纯化研究，建立了纯化毒种的三级种子库，进一步提高了麻渗疫苗的内在质量。目前已有近40年的生产历史，年产量可达6000万剂量，为全国之最，对预防和控制麻瘆的发病和流行发挥了十分有效的作用。上海生物制品研究所于上世纪80年代初通过国际交往获得腮腺炎疫苗病毒，经研究建立S79腮腺炎减毒抹，是国内第一个开发出细胞培养的腮腺炎减毒活疫苗。目前年产量可达1000万剂量，对控制腮腺炎的发病显示了十分有效的作用。上世纪90年代中由北京生物制品研究所开发成功BRDII抹风渗减毒活疫苗。上海生物制品研究所通过与北京生物制品研究所技术交换，获得BRDn抹风渗病毒，于1998年开发成功BRDII林风疹减毒活疫苗。目前年产量可达1000万剂量，对防止风渗流行和CRS发挥了显著的作用。与此同时，上海生物制品研究所响应WHO开发联合疫苗的倡导，于20G0年开发成功麻渗腮腺炎联合减毒活疫苗，并被纳入《中国药典》三部(2005年版)药品标准。目前在上述的技术基础上，进一步开发麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗(画R),现已完成临床研究及通过国家药审中心的技术审评。3、产品的水平和发展趋势目前国内该产品的质量达到国际公认的WHO标准，生产工艺技术水平也基本相同。但我国主要生产单价疫苗，联合疫苗刚起步，远远不能满足社会需求。发展趋势WHO倡导的"全球儿童疫苗计划"，将开发联合疫苗作为其中的一项主要内容。联合疫苗的优越性在于将多种单价疫苗的功能集于一个制品，发挥出一针防多病，减少针次，便于临床上推广使用，进一步提高计划免疫工作的效果，还可节约预防工作的间接成本。国内近几年才研究病毒类联合疫苗。
发明内容本发明的目的是提供一种国产化、价格低、减少针次、一针防三病，用于儿童预防麻渗、腮腺炎和风渗的联合减毒活疫苗的制备方法。本发明所述的一种麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的制备方法，具体通过以下步骤得以实现1、用10日龄的无特定病原体(SPF)鸡胚制成原代鸡胚细胞，采用IOL瓶旋转培养成单层细胞，分别接种沪-191抹麻渗病毒和S79抹腮腺炎病毒，经培养收集麻疹病毒液和腮腺炎病毒液，再经外源因子等检定合格，通过澄清过滤合并成两种单价病毒原液；2、用MRC-5林人二倍体细胞培养BRDII林风渗病毒，收获病毒液，经外源因子等检定合格，通过澄清过滤合并成单价病毒原液；3、将合格的麻疹、腮腺炎和风渗单价病毒原液按一定比例配制，加入冻干保护剂制成半成品，最后分装冻干制成最终成品。在上述麻瘆腮腺炎风渗联合减毒活疫苗的制备方法中，麻疹、腮腺炎和风渗单价病毒原液配制比例优选为麻疹腮腺炎风疹=1:20:1,冻干保护剂优选5°/。蔗糖、1%明胶、1%谷氨酸钠、0.5%尿素、0.5%人白蛋白。通过本发明制备的麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗，其产品的质量达到三种单价疫苗的国家标准，并且主要质量指标均达到WH0对麻瘆、腮腺炎和风渗联合疫苗的质量标准。才企测项目WHO标准检测结果鉴别试验证明为麻渗、腮腺炎和风渗病毒符合要求无菌试验无细菌生长符合要求滴度麻渗》l()3'。CCID5。/剂麻療^10"CCID5。/剂腮腺炎》10"CCID5。/剂腮腺炎》l(TcCID5o/剂风渗"()3'。CCID5。/剂风渗》10"CCIDs。/剂热稳定性三种病毒滴度下降《1.Olg三种病毒滴度下降0.1—0.7Lg异常毒性对小鼠豚鼠无异常毒性符合要求水分《2.0%1.9%一2.0%牛血清白蛋白《50ng/剂12.5—25ng/剂本产品与国外画R同步进行的临床安全性和有效性比较观察到的局部和全身反应的发生率虽略高于进口产品，但都属于一般活疫苗可接受的临床轻微反应；观察有效性的免疫后抗体阳转率和抗体滴度麻瘆分别为99.5%和57(进口产品94.6°/。和46);腮腺炎分别为85.9°/。和4.2(进口产品89.2%和5.7);风瘆分别为100%和890(进口产品100°/。和825);经统计学处理均无显著性差异，说明该产品达到国际同类产品的质量。具体实施方式以下结合具体的实施例，对本发明做进一步的阐述。这些实施例仅用于对本发明做说明而不是对本发明的限制。实施例1:高滴度的麻疹疫苗病毒原液的生产工艺采用IOL瓶细胞旋转培养取代静止培养的方法，增加单层细胞贴壁面积，以细胞数量的增加提高病毒滴度；改进细胞培养和病毒培养的pH和营养成分等条件，以改善细胞质量提高病毒滴度；减少病毒培养的最终加液量，以增加单位体积中的病毒量提高病每滴度。具体参数和比较结果列表如下参数静止培养转瓶培养备注.细胞培养瓶10L圆;f主并瓦10L圆柱瓶细月包贴壁面积875cm22200cm2增加2.5倍鸡胚使用数3-3.5只/瓶7-7.5只/瓶培养中换液0次1次换液改善pH和营养最终力口液量3000ml/瓶1600ml/瓶由3.4ml/W减至0.7ml/cm:病毒滴度水平4.8-5.21gCCID50/ml5.7-6.21gCCID5o/ml实施例2:高滴度的腮腺炎疫苗病毒原液的生产工艺采用3L瓶细胞旋转培养取代10L瓶旋转培养，进一步控制瓶内空间和pH变化，以改善细胞质量提高病毒滴度；严格控制腮腺炎病毒繁殖的收获时间，掌握细胞病变的最佳程度(细胞病变达80—90%)，以获得高滴度病毒原液；减少病毒培养的最终加液量，以增加单位体积中的病毒量提高病毒滴度。具体参数和比较结果列表如下10L转瓶培养3L转瓶培养备注细胞贴壁面积鸡胚使用数培养中换液最终力口液量2200ctn'8-9只/瓶1次3000ml/并瓦1450cm'7-7.5只/瓶1次600ml/瓶面积比1:0.7换液改善pH和营养由1.4ml/cm2减至0.4ml/cm2病毒滴度水平6.0-6.51gCCID5。/ml6.5-6.81gCCID5。/ml实施例3:高滴度风渗疫苗病毒原液的生产工艺采用进口罗氏瓶，调整细胞浓度和培养液，以改进二倍体细胞质量，提高病毒滴度；探索细胞及病毒培养的最佳条件，如病毒与细胞接种比例、细胞洗涤换液的时间、收液时细胞病变的程度等，以此提高风渗病毒原液滴度；在提高二倍体细胞质量的基础上，通过适当调整pH和控制培养液成分及温度，有效延长细胞维持时间，从而可进行多次收液，提高病毒原液产质量。具体参数和比较结果列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>加病毒后不同培养时间的病毒滴度(lgCCID5。/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>可见病毒接种量高，病变出现早，病毒滴度高峰出现时间早，则细胞维持时间短。而随着病毒接种量减少，病变出现及病毒滴度高峰出现时间后移，细胞维持时间也延长。所以，根据生产需要，采用1:100-1:1000的病毒接种比例较合适。实施例4:三种疫苗病毒原液耳关合配制的最佳比例和避免三种病毒的相互干扰作用1、根据稀释倍数确定单价病毒原液的最低病毒滴度将单价麻療、腮腺炎、风渗三种病毒原液分别用不同体积的M199维持液做配制比例试验，并进行病毒滴度测定，以了解病毒滴度下降幅度，确定三种病毒原液的最低滴度。结果如下不同配制比例的病毒滴度(lgCCID5。/ml)病毒原液原倍1:11:21:31:45.54.94.64.44.0麻渗5.44.94.64.54.05.45.04.74.43.96.45.95.55.34.8腮腺炎6.35.75.45.34.86.45.85.65.45.05.44.84.64.33.9风渗5.34.84.44.43.95.34.94.54.3.3.9可见三种疫苗原液1:1配比病毒滴度下降0.4-0.61gCCID5。/ml，1:2配比病毒滴度下降0.7-0.91gCCID50/ml，1:3配比病毒滴度下降0.9-1.llgCCID5。/ml,1:4配比病毒滴度下降1.4-1.61gCCID5。/ml。考虑国际上固R最低免疫的病毒含量(麻疹和风疹3.31gCCID5。/ml,腮腺炎4.01gCCID5。/ml)，以及加冻干保护剂的稀释和热稳定性的病毒损失等因素，确定三种疫苗原液的最低病毒滴度为麻疹>5.01gCCID5。/ml，腮腺炎>5.51gCCID5/ml,风瘆>5.01gCCID5。/ml。2.观察三种病毒之间的干扰现象及确定三种病毒原液的配比用同一批单价原液配制三批不同比例的画R,并以单价原液用M199维持液作相应配制稀释的对照，分别滴定配制前后的病毒滴度，结果如下麻渗、腮腺炎、风疹三种病毒混合前后的滴度'比较(lgCCID5。/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>批号病毒(麻:腮:风)对照倍数混合前混合后(对照)滴度下降(对照)可见三种疫苗原液配比后相互之间稀释倍数的病毒滴度下降，2、3、4和5倍稀释分别为0.61g、0.8-0.91g、0.9-1.llg和1.4-1.51g而相应稀释倍数的对照病毒滴度下降与匿R配比时基本一致，说明滴度下P争由相互稀释造成，三种病毒之间无明显干扰现象。根据WHO规程要求画R中腮腺炎病毒量至少比其他两种病毒高5-20倍，并兼顾三者相互的稀释作用，最后确定产品的三种病毒含量适宜配比为1:20:1(麻渗腮腺炎风渗)。实施例5:.优化冻干保护剂及冷冻干燥技术:疫苗的冻干保护剂及冻干工艺是在三种单价疫苗的经验基础上，调整冻结、抽真空和保温时间等的冻干工艺曲线，获得较满意的结果。保护剂的优选采用蔗糖、乳糖、山梨醇、味精、明胶、尿素、人白蛋白等成分，按不同种类和浓度配制成20组进行试验，结果第5号保护剂(由蔗糖、明胶、味精、尿素、人白蛋白组成)较优越。以后经过调整冻干工艺进一步证实了该保护剂的适宜性，并推广应用于麻渗腮腺炎联合减毒活疫苗的冻干工艺得到进一步验证,使产品尤其在37°C7天的热稳定性中具有明显的优越性。试制的三批MMR冻干前后的滴度(lgCCID5。/ml)变化如下:冻干前后3Z。C7天热稳定性批号冻干前冻干后滴度下降热稳定性滴度下降麻5.55.10.44.80.320010501腮6.35.70.65.10.6风4.44.00.43.90.1麻5.65.00.64.60.420010502腮6.25.60.64.90.7风4.84.30.54.00.3麻5.65.20.44.80.420010601腮6.45.70.75.10.6风.4.54.10.43.90.2可见冻干前后麻渗、腮腺炎、风疹平均滴度下降分别为0.471g、0.631g和0.431g,37°C7天热稳定性滴度下降分别为0.371g、0.631g和O.201g。所以，该保护剂同样适用于画R。实施例6:匿R制备及检定按上述工艺制备10批产品，以单价麻瘆、腮腺炎、风渗疫苗的制检规程标准检定全部合格,其中的7批由中国药品生物制品检定所;险定，结果也全部达到规程要求。IO批醒R的主要质量项目的检定结果疫苗疫苗滴度和热稳定性(LgCCID5。/ml)水份残余牛血清含量批号4QC37°C7天(%)(ng/ml)20010501麻渗5.14.8腮5.75.12.225风渗4.03.920010502麻疹5.04.6腮腺炎5.64.92.325风渗4.34.020010503麻療5.24.8腮腺炎5.75.11.925风渗4.13.920030801麻渗5.24.4腮腺炎5.95.22.725风渗3.73.520040601麻渗5.14.6腮腺炎5.34.91.625风渗4.94.9<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与同类制品比较研究资料用试制的3批疫苗与北京生物制品研究所生产的2批及进口(默克公司)1批的腦R，进行成品质量同时全检的比较试验。_3批疫苗与同类制品比较的检定结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>以上检测结果表明，本发明所研制的3批疫苗的成品质量与北京所和进口默克疫苗无明显差异，各项指标均达到规j程的要求。权利要求1、一种麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的制备方法，采用10日龄的无特定病原体(SPF)鸡胚制成原代鸡胚细胞，以10L瓶旋转培养成单层细胞，分别接种麻疹沪-191株纯化病毒和S79株腮腺炎病毒，经培养收集麻疹病毒液和腮腺炎病毒液；用MRC-5株人二倍体细胞静止培养风疹BRD-II株病毒，收集风疹病毒液；三种病毒液分别检定合格后通过澄清过滤合并成单价病毒原液，再将合格的麻疹、腮腺炎和风疹单价病毒原液按一定比例配制，加入冻干保护剂制成半成品，最后分装冻干制成最终产品。2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于三种病毒联合配制的最佳活病毒含量比例为麻疹:腮腺炎风疹=1:20:1。3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于冻干保护剂为5%蔗糖、1%明胶、1%谷氨酸钠、0.5°/。尿素、0.5%人白蛋白。全文摘要本发明属生物制品领域，具体涉及一种麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的制备方法。本发明用10L瓶旋转培养单层原代鸡胚细胞，分别接种麻疹沪-191株纯化病毒和S79株腮腺炎病毒，用MRC-5株人二倍体细胞静止培养风疹BRD-II株病毒，三种病毒液分别检定合格后通过澄清过滤合并成单价病毒原液。将合格的麻疹、腮腺炎和风疹单价病毒原液按一定比例配制，加入冻干保护剂制成半成品，最后分装冻干制成麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗。文档编号A61K39/12GK101396557SQ20071004647公开日2009年4月1日申请日期2007年9月27日优先权日2007年9月27日发明者徐闻青,兵王,陈志慧申请人:上海生物制品研究所