专利名称：超临界二氧化碳梯度提取当归和川芎混合物中的总有效部位的方法
技术领域：
本发明涉及传统中草药领域，具体涉及超临界C02梯度提取当归和川 芎混合物中的总苯酞类、总有机酸类和总生物碱类的方法。
背景技术：
当归为伞形科植物当归」"^//<^>5/"6^'^(01^.)01618的干燥根。当 归归肝、心、脾经，药性甘、辛、温，具有补血活血，调经止痛，润肠通 便的作用。用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，闭经痛经，虚寒腹痛， 肠燥便秘，风湿痹痛，跌打损伤，痈疽疮疡。当归是传统中药，临床应用 广泛，有效部位及药理作用明确。当归发挥药效的主要有效部位为总苯酞 类、总有机酸类。
川芎为伞形科植物Z/gwWcMwc/ma";c/o"gHort.的干燥根茎，具有行气 活血、祛风止痛的功效。为活血化瘀常用中药。其化学成分的研究，国内 外报道较多。川芎发挥药效的主要有效部位为总苯酞类、总有机酸类、总 生物碱类。
由于当归、川芎同属一科，有着伞形科植物共同的植物分类学特征， 有着相似的化学成分，有着相似的功能主治，常在活血和血的处方中同时出 现，常作为药对来应用，且应用十分广泛，2005版药典所载513首复方成 方制剂中有49首当归与川芎同用的处方。
现有技术采用单一的方法从当归与(或)川芎中提取某一个有效部位。 然而，当归与川芎混合药材的超临界提取物的药效不是来自于单一的活性
化学成分，而是来自多种活性成分之间的协同作用，甚至是与某些非活性 成分的协同效应或相生相克作用。任何一种成分都不能代表其全部功效。 将当归与川芎的三个有效部位依次提取，可以发挥尽可能大的药效。
发明内容
为解决现有技术的提取当归与川芎混合药材的有效部位不完全且纯 度不高的问题，本发明进行了合提与分提的比较研究后，采用将此药对混 合进行超临界C02提取，依次从当归和川芎的混合药材中提取总苯酞类、 总有机酸类、总生物碱类三个有效部位，并以总苯酞类、藁本内酯、总有 机酸类、阿魏酸、总生物碱类、川芎嗪的含量与转移率作为评价指标，优 选三个有效部位梯度提取的最佳工艺条件。经该工艺得到的提取物中总有
效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为80 96%。
本发明的技术方案如下
一种超临界C02梯度提取当归和川芎混合物中的总有效部位的方法， 所述总有效部位为总苯酞类、总有机酸类和总生物碱类，所述方法包括
a) 将当归与川芎的混合药材粉末投入超临界萃取装置的萃取釜中；
b) 药材先经第一梯度超临界C02提取总苯酞类成分；
C)取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界C02提取总有机酸
成分；
d) 取经第一、第二梯度提取后的药渣进行第三梯度超临界C02提取总
生物碱成分；
e) 合并第一、二、三梯度的超临界提取物。
其中，所述第一梯度超临界C02提取总苯酞类成分的条件为萃取温 度为40 5(TC，萃取压力为20 30MPa， C02流速为20 40L/h，萃取时 间为1.5 3.0h，分离釜I温度30 50°C，压力5.0 8.0Mpa，分离釜II温度 20 40°C，压力5.0 6.5Mpa;优选地，所述萃取温度为45。C，萃取压力 为25MPa， C02流速为30L/h，萃取时间为2.0h，分离釜I温度40°C，压 力6.0Mpa，分离釜II温度30°C,压力5.0Mpa。
所述第二梯度超临界C02提取总有机酸成分的条件为萃取温度为 60 8(TC，萃取压力为30 40MPa，CO2流速为20 45L/h，萃取时间为1.0 2.0h，夹带剂为甲醇或70% 100%乙醇，分离釜I温度40 50。C，压力6 10Mpa，分离釜II温度30 5(TC,压力5.0 6.5Mpa;优选地，所述萃取温 度为7(TC，萃取压力为35MPa， CO2流速为30L/h，萃取时间为1.5h，夹带 剂为90%乙醇，分离釜I温度5(TC，压力8 Mpa，分离釜II温度4(TC，压力 5扁pa。
第二梯度超临界CO2提取中的夹带剂的用量为50 200ml/100g生药， 优选为150ml/100g生药。
所述第三梯度超临界C02提取总生物碱成分的条件为萃取温度为
60 80°C ，萃取压力为30 40MPa， CO2流速为20 50L/h，萃取时间为1.0 2.0h，夹带剂为70% 100%乙醇，碱化剂为1 30%氨水溶液，分离釜I温 度40 55。C，压力6 10Mpa，分离釜II温度30 40。C ，压力5.0 6.0Mpa; 优选地，所述萃取温度为7(TC，萃取压力为35MPa， CO2流速为40L/h，萃 取时间为1.5h，夹带剂为无水乙醇，碱化剂为15%氨水溶液，分离釜I温度 45°C，压力8Mpa，分离釜II温度35。C，压力5.0Mpa。
第三梯度超临界CO2提取中的夹带剂的用量为50 200ml/100g生药， 优选为150ml/100g生药；碱化剂的用量为20 100ml/100g生药，优选为 50ml/100g生药。
另一方面，本发明提供经本发明方法得到的提取物，其中总有效部位 (总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为80 96%。 总苯酞类的含量采用分光光度法测定，方法如下 空白溶液的配制精密吸取10ml甲醇，置于10ml棕色容量瓶中，作
为空白溶液。
对照品溶液的配制与标准曲线的制备精密称取藁本内酯对照品lmg， 置于10ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.4ml、 0.6ml、 0.8ml、 l.Oml、 1.2ml、 1.5ml，置于另一 10ml棕色容量瓶中，用甲 醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，于322nm波长处测定吸光 度A。以对照品溶液的浓度为横坐标(X)，以相应的吸光度A为纵坐标(Y)， 得回归方程Y=50.911X-0.0027，相关系数Y =0.9997。藁本内酯的标准曲 线如图1所示。
供试品溶液的配制精密称取当归+川芎超临界提取物100mg，以甲 醇为溶剂，配制成浓度适宜的溶液，定容，摇匀，作为供试品溶液。
含量测定取空白溶液、供试品溶液于322nm波长处测定吸光度A。 计算超临界提取物中总苯酞类的含量。
总有机酸的含量采用电位滴定法(返滴定)测定，方法如下
柠檬酸(枸橼酸)溶液的配制精密称取柠檬酸5.2535g，置于250ml
6 容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。
拧檬酸对照品滴定曲线的制备精密吸取柠檬酸(枸橼酸)溶液25ml
置100ml烧杯中，连接好电位计、磁力搅拌器及待测溶液，用滴定管盛装 0.1mol/L氢氧化钠滴定液，进行滴定，滴定方向为"_"。滴定时记录滴 定过程中用去的氢氧化钠溶液的体积数及其相对应的pH值，在滴定终点 附近，应减小滴定剂的加入量。采用一阶导数法确定滴定终点以pH变 化值(ApH)和体积变化值(A V)的比值(ApH/AV)为纵坐标，pH值变化前 后所用去的氢氧化钠溶液的体积的平均值(平均V)为横坐标，结果见图2。 由图2可知，曲线的最高点为滴定终点，pH = 9.00，消耗氢氧化钠的体积 为64.8ml， lmlNaOH(0.1mol/L)相当于8.107mg柠檬酸。
供试品溶液的制备与测定精密称取当归与川芎混合物的超临界提取
物约lg于100ml烧杯中，精密加入0.1mol/L氢氧化钠25ml，充分混和， 连接好电位计、磁力搅拌器及待测溶液，用滴定管盛装0.1mol/L盐酸滴定 液，滴定方向为"+ "，滴定至终点。滴定的同时进行空白校正。按下式 计算超临界提取物中总有机酸的含量。
_ s (v0-v)x8.107
总有机酸的含量= ——^- xioo%
w
式中，v。一空白消耗的盐酸的体积，v—供试品溶液消耗的盐酸的体 积，w—供试品的重量。
总生物碱的含量采用酸性染料比色法测定，方法如下 标准曲线的制备
对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的川芎嗪对照品40mg，置 于20ml具塞试管中，氯仿定容至10ml ，再加入磷酸盐缓冲液(pH5.8)5ml ， 溴麝香草酚兰lml，振摇，静置使分层，分别吸取下层液4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0ml，氯仿定容至10ml。空白溶液的制备取20ml具塞试管，不 加川芎嗪对照品，加氯仿10ml，再加入磷酸盐缓冲液(pH5.8)5ml，溴麝 香草酚兰lml，振摇，静置使分层，取下层氯仿层液作空白对照。
取上述对照品溶液及空白溶液，于415nm波长处测定其吸光度值。以 对照品溶液的浓度为横坐标(X)，以相应的吸光度A为纵坐标(Y)，得回归 方程Y=0.3304X-0.1523，相关系数y=0.9995。川芎嗪的标准曲线如图3
所示。
供试品溶液的制备精密称取超临界提取物100mg，置于10ml棕色 容量瓶中，用氯仿稀释至刻度，精密吸取5ml，置于15ml具塞试管中，用 氯仿定容至10ml，再加入磷酸盐缓冲液(pH5.8)5ml，溴麝香草酚兰lml， 振摇，取下层氯仿层液，作为供试品溶液。
含量测定分别取空白溶液、供试品溶液，于415nm波长处测定其吸 光度值，以标准曲线法计算超临界提取物中总生物碱的含量。
本发明对理化性质相差很大的三个有效部位总苯酞类、总有机酸类、 总生物碱类采用超临界梯度提取。第一梯度中，由于总苯酞类成分亲脂性 强，因此总苯酞类成分一般采用纯的超临界C02在低温低压的条件下提 取，这具有其他提取方法不可取代的优势；第二梯度中，由于在高温高压 下超临界提取有一定极性的总有机酸(阿魏酸)需采用适宜的夹带剂，以 改变超临界C02的极性，以利于目标成分的提出，优化的条件萃取温度和 压力较高，分离温度也较高；第三梯度中，对于极性较大的总生物碱则需 加入夹带剂及碱化剂，在高温高压下超临界提取，同时采用相对较高的 (302流速。
本发明采用超临界梯度提取，依次从当归与川芎的混合药材中提取总 苯酞类、总有机酸类、总生物碱类，得到总有效部位的提取物，其中总有 效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为80 96%。本发 明所采用的提取方法工艺简单，省时，得到的提取物纯度较高。该提取物 可作为当归与川芎混合药材的总有效部位进一步开发制剂产品。
图1是藁本内酯的标准曲线；
图2是枸橼酸ApH/AV 平均V滴定曲线；
图3是川芎嗪的标准曲线。
具体实施方式
实施例1:
将当归与川芎的混合药材(l:l)粉末(40目)200g投入超临界萃取装
置的1L的萃取釜中，用超临界C02进行梯度萃取。
药材先经第一梯度超临界C02提取总苯酞类成分，萃取条件为萃
取温度为45°C，萃取压力为25MPa， (302流速为30L/h，萃取时间为2.0h， 分离釜I的温度和压力分别为5(TC和8MPa，分离釜II的温度和压力分别 为3(TC和6MPa。
取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界C02提取总有机酸成
分，采用的夹带剂为90。/。乙醇300ml，萃取条件为萃取温度为70。C，萃 取压力为35MPa， C02流速为30L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度 和压力分别为45"C和8MPa，分离釜II的温度和压力分别为40"C和6MPa。
取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入100ml 15%的氨水溶液碱化 lh后，进行第三梯度总生物碱的提取，采用的夹带剂为无水乙醇300ml， 萃取条件为萃取温度为7(TC，萃取压力为35MPa， C02流速为40L/h， 萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为45"和8MPa，分离釜II 的温度和压力分别为35"C和5.0MPa。
合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度 法测定总苯酞类的含量得到总苯酞类的含量为38%，采用如上文所述的酸 碱滴定(返滴定)法测定总有机酸的含量得到总有机酸的含量为6%，采 用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量得到总生物碱的含 量为52%，因此得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类) 的含量为96%。
实施例2:
将当归与川芎的混合药材(1:2)粉末(40目)200g投入超临界萃取装 置的1L的萃取釜中，用超临界C02进行梯度萃取。
药材先经第一梯度超临界C02提取总苯酞类成分，萃取条件为萃 取温度为40°C，萃取压力为30MPa， (302流速为45L/h，萃取时间为1.5h， 分离釜I的温度和压力分别为4(TC和7.0MPa，分离釜II的温度和压力分 别为2(TC禾卩6.5MPa。
取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界C02提取总有机酸成
分，采用的夹带剂为80。/。乙醇200ml。萃取条件为萃取釜温度60。C，压
力40MPa;分离釜I温度55t:，压力9MPa;分离釜II温度40°C ，压力6.0MPa; C02流速为35L/h;萃取时间为l.Oh。
取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入80ml 1%的氨水溶液碱化lh 后，进行第三梯度总生物碱的提取，夹带剂为80。/。乙醇200ml。萃取条件 为萃取釜温度75'C，压力30MPa;分离釜I温度50。C，压力10MPa;分 离釜II温度4(TC，压力6.0MPa; (302流速为50L/h;萃取时间为1.0h。
合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度 法测定总苯酞类的含量，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总 有机酸的含量，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量， 得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为92%。
实施例3:
将当归与川芎的混合药材(1:0.5)粉末(40目)200g投入超临界萃取装 置的1L的萃取釜中，用超临界C02进行梯度萃取。
药材先经第一梯度超临界C02提取总苯酞类成分，萃取条件为萃 取温度为50°C，萃取压力为20MPa， C02流速为20L/h，萃取时间为3.0h， 分离釜I的温度和压力分别为3(TC和6.0MPa，分离釜II的温度和压力分 别为40。C和5.5MPa。
取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界C02提取总有机酸成
分，采用的夹带剂为无水乙醇400ml。萃取条件为萃取釜温度75X:，压 力30MPa;分离釜I温度45°C，压力6.0MPa;分离釜II温度30°C，压力 5細Pa; CO2流速为20L/h;萃取时间为2.0h。
取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入200ml30。/。的氨水溶液碱化 lh后，进行第三梯度总生物碱的提取，夹带剂为90。/c乙醇400ml。萃取条 件为萃取釜温度6(TC，压力40MPa;分离釜I温度4(TC，压力7MPa; 分离釜II温度3(TC，压力5.5MPa; CO2流速为30L/h;萃取时间为2.0h。
合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度 法测定总苯酞类的含量，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总 有机酸的含量，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量， 得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为89%。
实施例4
将当归与川芎的混合药材(l:l)粉末(40目)200g投入超临界萃取装 置的1L的萃取釜中，用超临界C02进行梯度萃取。
药材先经第一梯度超临界C02提取总苯酞类成分，萃取条件为萃 取温度为45°C，萃取压力为25MPa， 〔02流速为30L/h，萃取时间为2.0h， 分离釜I的温度和压力分别为5(TC和5MPa，分离釜II的温度和压力分别 为3(TC和5MPa。
取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界C02提取总有机酸成
分，采用的夹带剂为甲醇100ml，萃取条件为萃取温度为8(TC，萃取压 力为35MPa， C02流速为35L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压 力分别为50。C和10MPa，分离釜II的温度和压力分别为50。C和6MPa。
取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入40ml 15%的氨水溶液碱化 lh后，进行第三梯度总生物碱的提取，采用的夹带剂为甲醇100ml，萃取 条件为萃取温度为80。C，萃取压力为35MPa， C02流速为20L/h，萃取 时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为55匸和10MPa，分离釜II的 温度和压力分别为35"C和5.0MPa。
合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度 法测定总苯酞类的含量，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总 有机酸的含量，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量， 得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为90%。
将当归与川芎的混合药材(1:2)粉末(40目)200g投入超临界萃取装 置的1L的萃取釜中，用超临界C02进行梯度萃取。
药材先经第一梯度超临界C02提取总苯酞类成分，萃取条件为萃 取温度为45°C，萃取压力为25MPa， 0)2流速为30L/h，萃取时间为2.0h， 分离釜I的温度和压力分别为5(TC和5MPa，分离釜II的温度和压力分别 为3(TC和5MPa。
取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界C02提取总有机酸成 分，采用的夹带剂为90。/。乙醇350ml，萃取条件为萃取温度为7(TC，萃 取压力为35MPa， C02流速为30L/h，萃取时间为1.5h,分离釜I的温度 和压力分别为45T和6MPa，分离釜II的温度和压力分别为4(TC和6MPa。
取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入150ml 15%的氨水溶液碱化 lh后，进行第三梯度总生物碱的提取，采用的夹带剂为无水乙醇350ml， 萃取条件为萃取温度为60。C，萃取压力为35MPa， C02流速为40L/h， 萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为45。C和8MPa，分离釜II 的温度和压力分别为35。C和5.0MPa。
合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度 法测定总苯酞类的含量，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总 有机酸的含量，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量， 得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为94%。
权利要求
1. 超临界CO2梯度提取当归和川芎混合物中的总有效部位的方法，所述总有效部位为总苯酞类、总有机酸类和总生物碱类，所述方法包括a)将当归与川芎的混合药材粉末投入超临界萃取装置的萃取釜中；b)药材先经第一梯度超临界CO2提取总苯酞类成分；c)取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界CO2提取总有机酸成分；d)取经第一、第二梯度提取后的药渣进行第三梯度超临界CO2提取总生物碱成分；e)合并第一、二、三梯度的超临界提取物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一梯度超临界C02 提取总苯酞类成分的条件为萃取温度为40 5(TC，萃取压力为20 30MPa， C02流速为20 40L/h，萃取时间为1.5 3.0h，分离釜I温度30 5CTC，压力5.0 8.0Mpa，分离釜II温度20 40°C ，压力5.0 6.5Mpa。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述萃取温度为45"C，萃 取压力为25MPa，C02流速为30L/h，萃取时间为2.0h，分离釜I温度40°C， 压力6.0Mpa，分离釜II温度30°C，压力5.0Mpa。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二梯度超临界C02 提取总有机酸成分的条件为萃取温度为60 8(TC，萃取压力为30 40MPa， CO2流速为20 45L/h，萃取时间为1.0 2.0h，夹带剂为甲醇或 70% 100%乙醇，分离釜I温度40 50。C，压力6 10Mpa，分离釜II温度 30 50°C，压力5.0 6.5Mpa。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述夹带剂的用量为50 200ml/100g生药。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述萃取温度为7(TC，萃 取压力为35MPa， CO2流速为30L/h，萃取时间为1.5h，夹带剂为90%乙醇， 分离釜I温度50。C，压力8Mpa，分离釜II温度40。C，压力5.0Mpa。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述夹带剂的用量为 150ml/100g生药。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三梯度超临界C02提取总生物碱成分的条件为萃取温度为60 80'C，萃取压力为30 40MPa， CO2流速为20 50L/h，萃取时间为1.0 2.0h，夹带剂为70% 100%乙醇，碱化剂为1 30%氨水溶液，分离釜I温度40 55。C，压力6 10Mpa，分离釜II温度30 40。C，压力5.0 6.0Mpa。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述夹带剂的用量为50 200ml/100g生药，所述碱化剂的用量为20 100ml/100g生药。
10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述萃取温度为70。C，萃 取压力为35MPa， CO2流速为40L/h，萃取时间为1.5h，夹带剂为无水乙醇， 碱化剂为15%氨水溶液，分离釜I温度45。C ，压力8 Mpa，分离釜II温度35'C ， 压力5.0Mpa。
11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述夹带剂的用量为 150/100g生药，所述碱化剂的用量为50ml/100g生药。
12. 由权利要求1-11所述方法所得的当归和川芎的提取物。
13. 如权利要求12所述的提取物，其特征在于，其中总有效部位的含 量为80 96%。
全文摘要
本发明提供一种超临界CO<sub>2</sub>梯度提取当归和川芎混合物中的总有效部位的方法，所述总有效部位为总苯酞类、总有机酸类和总生物碱类，所述方法包括a)将当归与川芎的混合药材粉末投入超临界萃取装置的萃取釜中；b)药材先经第一梯度超临界CO<sub>2</sub>提取总苯酞类成分；c)取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界CO<sub>2</sub>提取总有机酸成分；d)取经第一、第二梯度提取后的药渣进行第三梯度超临界CO<sub>2</sub>提取总生物碱成分；e)合并第一、二、三梯度的超临界提取物。经该方法得到的提取物中总有效部位的含量为80～96％。
文档编号A61K36/236GK101380344SQ20071004568
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者杨义芳, 玫 许 申请人:上海医药工业研究院