硫辛酰胺在防治老年性视网膜黄斑变性中的应用的利记博彩app

专利名称：：硫辛酰胺在防治老年性视网膜黄斑变性中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于药学领域，更具体的，本发明涉及硫辛酰胺在防治细胞损伤中的应用。
背景技术：
：细胞是构成机体的基本单位，细胞的损伤可导致机体多方面损伤或疾病。许多外在因素(如甲醛，丙烯醛)或内在因素都可引起机体的细胞损伤，细胞损伤常常表现为DNA损伤，蛋白质氧化，线粒体功能下降，细胞内氧化还原平衡破坏等，从而导致多种疾病的发生，如视黄斑疾病等。已有报导显示，在许多组织和细胞，如肝、肺、脑和中国仓鼠细胞中发现丙烯醛能导致线粒体功能障碍。己有证据表明，线粒体随着人体衰老而积累氧化损伤，而线粒体的功能障碍又将造成衰老和退行性疾病。很多视觉组织，如视网膜和色素上皮细胞都需消耗大量能量而依赖氧化供能，因此，线粒体功能衰退一直被作为眼疾病发病的信号。视网膜色素上皮细胞(RPE)受到氧化剂的攻击会造成线粒体DNA损伤，从而改变线粒体的形态、膜电位和呼吸作用，因此，线粒体是RPE细胞内受到氧化损伤的重要靶点。许多环境不友好的物质是造成细胞损伤的罪魁祸首，例如烟雾。烟草中主要的有毒物质是一氧化碳、尼古丁和焦油。一氧化碳能引起组织缺氧和血管疾病；尼古丁能进入脑部造成患者心理和生理上的依赖。而焦油是种极复杂的混合物，包含多种致癌物，如一些能引起肺癌的芳香烃类化合物。焦油还含有一些氧化性的物质，如丙烯醛和甲醛，这些刺激性物质能造成慢性支气管炎和肺气肿等疾病。丙烯醛是烟雾中危害性最高的毒物，它主要产生于香烟烟雾中(每支香烟大概含有25140pg的丙烯醛)，其它一些空气污染也能生产丙烯醛。一些研究表明，丙烯醛比甲醛、乙醛等毒素毒性更大(约101000倍)，更易于造成细胞损伤。随着工业的发展，环境中的有害物质越来越多，极大地损害了人们的健康。因此，本领域迫切需要开发一种对于细胞损伤有效的物质。
发明内容本发明的目的在于提供一种对于防治细胞损伤有效的物质。在本发明的第一方面，提供一种硫辛酰胺的用途，用于制备预防或治疗细胞损伤相关疾病的制剂。在另一优选例中，所述的细胞损伤选自-细胞活性下降、细胞中线粒体膜电位下降、细胞中线粒体复合物活性降低、细胞质中钙离子浓度升高、细胞中活性氧水平升高、细胞中氧化歧化酶SOD活性降低、细胞中谷胱甘肽水平降低、细胞总抗氧化能力的下降、细胞中的DNA损伤、细胞中蛋白质的氧化损伤、细胞中谷胱甘肽转移酶活性下降、细胞耗氧下降、细胞中线粒体数量下降、细胞中线粒体DNA数量下降、细胞中线粒体电子传递链复合物的表达下降、细胞中过氧化物酶体增生物激活受体Y辅助激活因子la(PGC-1a)的表达下降、或细胞中线粒体转录因子A(mtTFA)或核呼吸因子1(NRF-1)的转录下降。在另一优选例中，所述的细胞选自肝细胞、肺细胞、脑细胞、视网膜细胞。在另一优选例中，所述的细胞是视网膜色素上皮细胞。在另一优选例中，视网膜色素上皮细胞损伤相关疾病是视网膜黄斑变性。在另一优选例中，所述的视网膜黄斑变性是老年性视网膜黄斑变性。在另一优选例中，所述的制剂是眼内注射制剂。在本发明的第二方面，提供一种预防或治疗细胞损伤相关疾病的方法，所述方法包括给予需要预防或治疗的对象有效量的硫辛酰胺。在另一优选例中，所述的细胞损伤相关疾病是视网膜黄斑变性。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图l显示硫辛酰胺能有效的保护细胞免收丙烯醛造成的细胞活性的下降。图1A为采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性的量化结果；**p<0.01，同对照组相比较；湘p〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验；图1B为采用倒置荧光显微镜拍摄的细胞形态的照片。图2显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的线粒体膜电位的下降。图2A为线粒体膜电位检测的量化结果；**p<0.01，同对照组相比较；湘p〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验；图2B为采用荧光显微镜拍摄的jc-l染色的照片。图3显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的线粒体复合物I和II的活性的降低。图3A为线粒体复合物I活性检测的量化结果；图3B为线粒体复合物I活性检测的量化结果；**p<0.01，*p<0.05，同对照组相比较；tt#p<0.01，ttp<0.05，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图4显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的细胞质中钙离子浓度的升高；**p<0.01，同对照组相比较；ttp<0.05，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图5显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的细胞内活性氧水平的提高；**p<0.01，同对照组相比较；#ttp〈0.01,同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图6显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的S0D活性降低。**p〈0.01，同对照组相比较；ttp<0.05，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图7显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的细胞内古谷胱甘肽水平的降低；**p<0.01，同对照组相比较；ttttp〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图8显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的细胞内总抗氧化能力的降低；*p<0.05，同对照组相比较；tt#p〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图9显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的DNA损伤。图9A为单细胞电泳实验的荧光显微镜观察情况；图9B为根据显微镜观察计算出来的拖尾细胞占总细胞的比例；**p<0.01,同对照组相比较；貼p〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图10显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的蛋白质的氧化损伤。图10A为氧化性蛋白的电泳检测结果；图IOB为总蛋白的电泳检测结果；图10C为氧化性蛋白与总蛋白的电泳结果的光密度之比；**p<0.01，同对照组相比较；ttttp〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图ll显示硫辛酰胺能有效的保护丙烯醛造成的谷胱甘肽硫转移酶活性的降低；**p<0.01,同对照组相比较；#ttp<0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。图12显示硫辛酰胺能促进细胞耗氧；*p<0.05，同对照组相比较。实验数据为平均值土标准误，三次独立实验用于数据统计，每次实验含3个平行。图13显示硫辛酰胺能促进线粒体数量的增加。图13A为不同浓度硫辛酰胺处理后线粒体数量检测的结果；**p<0.01，同对照组相比较；多于三次的实验结果用于统计检验；图13B为流式细胞仪检测不同浓度硫辛酰胺处理后线粒体数量。图14显示硫辛酰胺能促进线粒体DNA数量的增加；**p<0.01，同对照组相比较；四次的实验结果用于统计检验。图15显示硫辛酰胺能促进线粒体电子传递链复合物的表达。其中，A，复合物I;B，复合物II;C，复合物III;D,复合物IV;E，复合物V;统计图为多于三次实验的光密度分析，*p<0.05，**p<0.01，同对照组相比较。图16显示硫辛酰胺能促进PGC-la的表达；统计图为多于三次实验的光密度分析，*p<0.05，同对照组相比较。图17显示硫辛酰胺能上调mtTFA(图17A)和NRF-1(图17B)的转录；*p<0.05，**p<0.01。图18显示了硫辛酰胺比硫辛酸对细胞活性的保护作用更强。图18A为釆用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞活性的量化结果；AAp<0.01，同对照组对比；**p<0.01，同丙烯醛对比；#p<0.05，同LA预处理组对比(LA+A);图18B为采用倒置荧光显微镜拍摄的细胞形态的照片，其中a,对照；b，单独LM处理；c，单独LA处理；d，单独丙烯醛(A)处理；e，LM+A;f，LA+A。图19显示了硫辛酰胺比硫辛酸对线粒体膜电位的保护作用更强。图19A为线粒体膜电位检测的量化结果；aap<0.01，同对照组对比；**p〈0.01，同丙烯醛(A)对比；ttp<0.05，同LA预处理组(LA+A)对比；图19B为釆用荧光显微镜拍摄的染色照片。其中a，对照；b，单独LM处理；c，单独LA处理；d，单独丙烯醛(A)处理；e，LM+A;f，LA+A.图20显示了硫辛酰胺对丙烯醛造成的ATP水平下降的保护作用比硫辛酸更强。图21显示了LM对ATP下降的保护显著的高于LA。A<0.01，同对照对比；**p<0.01，同丙烯醛对比。图22显示了硫辛酰胺对丙烯醛造成的蛋白质氧化的保护作用强于硫辛酸。图22A为氧化性蛋白与总蛋白的电泳检测结果；图22B为图22A的光密度分析；AAp<0.01，同对照组对比；**p<0.01，同丙烯醛(A)对比；ttttp<0.01，同LA预处理组(LA+A)对比；图23显示了硫辛酰胺对丙烯醛造成的DNA损伤的保护作用强于硫辛酸。图23A为单细胞电泳实验的荧光显微镜观察情况；图23B为根据显微镜观察计算出来的拖尾细胞占总细胞的比例；多于100个细胞核用于计算，AAp<0.01，同对照组对比；**p<0.01，*p<0.05，同丙烯醛(A)对比；#p<0.05，同LA预处理组(LA+A)对比。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次出乎意料地发现，硫辛酰胺(Lipoamide，LM)可有效地保护细胞，使之免受有毒有害物质的侵害及氧化损伤。更特别的是，硫辛酰胺可极其有效地保护视网膜色素上皮细胞免受损伤，从而可用于预防或治疗视网膜黄斑变性疾病。在此基础上完成了本发明。硫辛酰胺(Lipoamide,LM)是一种至今被研究很少的化合物，一般被用作维生素类补充剂。硫辛酰胺熔点128-131°C;分子式C8HI5N0S2;分子量205.343。硫辛酰胺具有如下的化学结构式此外，硫辛酰胺的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体也被包括在本发明中，只要它们具有与硫辛酰胺相同或接近的防止细胞损伤的功能。所述的"药学上可接受的盐"是指硫辛酰胺或其类似物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)(l)与如下硫辛酰胺无机酸形成的盐如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。所述的"前体"指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在哺乳动物体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物或其类似物。所述的硫辛酰胺或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体可通过化学合成的方式获得。防止细胞损伤的用途本发明提供了硫辛酰胺的用途，用于制备预防或治疗哺乳动物细胞损伤相关疾病的制剂。为了论证硫辛酰胺的上述用途，本发明人应用硫辛酰胺，通过其在丙烯醛损伤的视网膜色素上皮细胞模型干预性研究，观察到硫辛酰胺对于使视网膜色素上皮细胞免受有毒物质侵害和氧化损伤的保护作用；在细胞实验中证明了硫辛酰胺保护细胞免受丙烯醛造成的DNA损伤，蛋白质氧化，线粒体功能的下降，细胞内氧化还原平衡的破坏。并揭示了硫辛酰胺通过激活PGC-1，NRF-1，NRF-2的通路，促进视网膜色素上皮细胞线粒体生成，保护线粒体功能和抵抗氧化损伤的机制。作为本发明的优选方式，硫辛酰胺的主要应用如下防止细胞活性的下降；防止线粒体膜电位下降；防止线粒体复合物I和II活性的降低；防止细胞质中钙离子浓度升高；防止细胞内活性氧水平的提高；防止SOD活性降低；防止细胞内谷胱甘肽水平降低；防止细胞内总抗氧化能力的降低；防止DNA损伤；防止蛋白质氧化损伤；防止的谷胱甘肽硫转移酶活性降低；促进细胞耗氧；促进线粒体数量的增加；促进线粒体DNA数量的增加；促进线粒体电子传递链复合物的表达；促进PGC-la的表达；以及上调mtTFA和NRF-l的转录。现有技术已经证明，在许多组织和细胞，如肝、肺、脑和中国仓鼠细胞中，丙烯醛能导致线粒体功能障碍。而本发明的实施例充分地证明，在发生线粒体功能障碍之后，硫辛酰胺能够有效地修复线粒体氧化损伤，促进线粒体的生长，促进线粒体传递链复合物的表达等，因而硫辛酰胺能够良好地防治线粒体功能障碍。防治视网膜黄斑病的用途作为本发明的特别优选的方式，所述的硫辛酰胺可特别有效地防止视网膜色素上皮细胞(RPE)的损伤，从而可用于视网膜黄斑变性(MacularDegeneration)的预防和治疗。视网膜色素上皮细胞在人眼成像中扮演重要角色，它的功能包括l)在视网膜和毛细血管中运输营养和代谢废物；2)调节视网膜周围电解液成分及体积；3)吞噬脱落的组织碎片；4)参与维生素A及其类似物的代谢循环。尽管AMD的发病机理包括不同的临床症状，在发病的早期阶段都经常观察到RPE细胞的衰退。最初的AMD发病机理包括异常的RPE形态和色素沉着及RPE细胞内的脂褐质积累。动物实验表明，在动物模型(RCS大鼠)内RPE细胞吞噬功能的受损会导致视网膜的衰退和视力丧失。老年性视黄斑疾病(Age-RelatedMacularDegeneration,認D)是老年人易得的几种视觉障碍疾病之一，其中约50%左右的患者最终失明。AMD主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。由于黄斑部结构与功能上的特殊性，此种改变更为明显。玻璃膜疣也见于正常视力的老年人，但由此继发的种种病理改变后，则导致黄斑部变性发生。该病大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高，是当前老年人致盲的重要疾病。烟雾同老年性视黄斑疾病(AMD)有密切关系，一些环境和与氧化损伤相关的营养因素也与AMD相关，如太阳射线照射、空气污染、吸烟和抗氧化营养素的低量摄取等。甲醛、乙酲、丙烯醛也可导致视网膜色素上皮细胞的损伤，特别是丙烯醛毒性最大。本领域至今尚无有效治疗和根本性的预防措施。近年来多数学者主张对渗出性者应及早施行激光光凝新生血管，避免病情恶化。氩激光能有效的封闭视网膜下新生血管，所以目前应用较多。但对神经上皮层有一定损害，而且激光光凝仅是为了封闭已经存在的新生血管，并不能阻新的新生血管形成，是一种对症治疗。同时激光稍一过量，本身可以使脉络膜产生新生血管。临床上也用口服微量元素锌和抗氧化剂(维生素C和E)用于辅助治疗。本发明首次意外地发现，硫辛酰胺可特别有效地防止视网膜色素上皮细胞的损伤，从而可用于(1)预防和治疗老年性视网膜黄斑变性；(2)通过修复视网膜色素上皮细胞线粒体氧化损伤而改善老年性视网膜黄斑变性。(3)通过促进视网膜色素上皮细胞线粒体的生成而改善老年性视网膜黄斑变性。组合物本发明提供了一种药物组合物，含有(a)有效量的硫辛酰胺或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明中，术语"含有"表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语"主要由...组成"和"由...组成"包含在术语"含有"中。本发明中，"药学上可接受的"成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。"药学上可接受的载体"是用于将本发明的硫辛酰胺或其生理上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中硫辛酰胺可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。当用于预防或治疗视网膜细胞损伤相关疾病时，优选的是进行眼内给药(如玻璃体内给药)。因此，所述的药物组合物可以是一种眼内给药的剂型，如眼内注射剂。适用于眼内注射的任何药学载体均是可用的。本发明的硫辛酰胺及其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在本发明的药物组合物中，硫辛酰胺作为活性成分占总重量的0.0001-50%(较佳地0.001-20%,更佳地O.01-10%)，其余为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。本发明的主要优点在于(1)首次发现了硫辛酰胺在防治细胞损伤方面的新用途。(2)首次发现硫辛酰胺对于视网膜色素上皮细胞的损伤具有极其有效的缓解和治疗作用，其药理作用非常明显，并且没有发现对视网膜色素上皮细胞有任何毒副作用，具有极好的药用前景。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法材料细胞培养基DMEM/F12,丙酮酸钠购买自Invitrogen公司；胎牛血清购买自Hyclone公司；青霉素、链霉素，鱼藤酮，AntimycinA，NaN3,CoQl，ATP，TritonX-100购买于Sigma公司；NaHC03，EDTA，DMS0，无水乙醇，吐温-80，丙烯醛购买于中国医药集团上海化学试剂公司；低熔点琼脂糖，Tris，H印es购买于Amresco公司；Jc-l，DCF-DA购买于MolecularProbe公司；DCPIP购买于Merk公司；氧化性蛋白检测试剂盒购买于Chemicon公司；硫辛酰胺购买于Fluka公司；蛋白裂解液购买于碧云天生物技术研究所；谷胱甘肽GSH检测试剂盒，总抗氧化能力检测试剂盒，钙离子检测试剂盒，超氧化物歧化酶SOD检测试剂盒购买于南京建成生物技术研究所。方法细胞培养、硫辛酰胺和丙烯醛对ARPE-19细胞的处理ARPE-19(成人视网膜色素上皮细胞，ATCC保藏号CRL-2302)，培养在37°C，5%二氧化碳饱和湿度的培养箱中，培养基为DMEM/F12，加入10%FBS，0.5mM丙酮酸钠，15mMH印es，0.2438%Na线，100U/L青霉素和100mg/L硫酸链霉素。硫辛酰胺溶解在20%无水乙醇和80%吐温-80中，储存液为100mM。硫辛酸溶解在去离子水中。除非另外说明，进行实验时的处理方法如下细胞生长达到大约60%的密度时，分别加入硫辛酰胺或硫辛酸处理细胞48小时后，弃除含硫辛酰胺或硫辛酸的培养基，加入75uM丙烯醛，处理细胞24小时，进行实验检测。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性细胞培养在96孔板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，加入50txl的5mg/mlMTT，置于细胞培养箱中温育3个小时后，弃去MTT，加入200y1DMSO溶解紫色产物，于酶标仪(MolecularDevice,SpectraMax340)读取550nm吸光值。细胞形态照片拍摄于倒置荧光显微镜OlympusTH4-200。线粒体膜电位检测细胞培养在96孔细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，加入含20uMJc-1染料的培养基，在细胞培养箱内温育30分钟，弃去含染料的培养基，每孔用200"1PBS洗一次，再加入200ylPBS于荧光酶标仪度数，激发波长488nm，检测发射波长530nm和590nm，荧光强度比值(590nm/530nra，红光比绿光)，作为线粒体膜电位的指标。Jc-1染色的照片拍摄于荧光显微镜01卿usEX-UCB。细胞内活性氧的检测细胞培养在6孔细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，加入含25iiMDCF-DA(MolecularProbes,Eugene,OR)染料的培养基，在细胞培养箱内温育30分钟，弃去含染料的培养基，用冷的PBS洗三次，加入细胞裂解液(10mMTrispH=7.5，150mMNaCl，0.ImMEDTA,0.5%TritonX-100)，在冰上裂解10分钟，刮下细胞，15000rcf、4。C离心10分钟，取上清用荧光酶标仪(FlexStationII384,MolecularDevices)读取荧光值(激发波长488ntn，发射波长530nm)，BCA方法测定蛋白浓度，单位浓度蛋白的荧光值作为细胞内活性氧的高低的指标。超氧化歧化酶SOD活性的测定细胞培养在100mm细胞培养板中，按如上方法处理后，用PBS洗一次，用生理盐水刮下细胞，用玻璃匀浆器手动研磨20次，3000rcf、4'C离心IO分钟，取上清，按照超氧化物歧化酶SOD检测试剂盒的说明书进行SOD活性测定，该试剂盒原理为通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧自由基，后经氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，用酶标仪读取吸光值。当被测样品中含有SOD时，对超氧自由基有专一的抑制作用，使亚硝酸盐减少，吸光值降低。还原型谷胱甘肽含量的测定细胞培养在100mm细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，用PBS洗一次，用生理盐水刮下细胞，用玻璃匀浆器手动研磨20次，3000rcf、4t:离心10分钟，取上清，按照谷胱甘肽GSH检测试剂盒说明书进行GSH含量测定，该试剂盒的原理为二硫代二硝基苯甲酸和巯基化合物反应产生一种黄色化合物，从而进行比色测定。细胞总抗氧化能力的测定细胞培养在100mm细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，用PBS洗一次，用生理盐水刮下细胞，超声裂解细胞，按照总抗氧化能力检测试剂盒说明书进行总抗氧化能力测定，该试剂盒的原理为抗氧化物质可以使三价铁离子还原为二价铁离子，后者与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出样品抗氧化能力的高低。单细胞电泳实验细胞培养在6孔细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，用0.25%的胰酶将细胞消化下来，均匀重悬于37t:的0.75%低熔点琼脂糖中，并滴在载玻片上，用盖玻片压平，在4'C环境下，低熔点琼脂糖形成凝胶后，将玻片置于细胞裂解液中(2.5MNaCl,100mMEDTA，10mMTrispH10.0，1%TritonX-100and10%DMS0)，放置两个小时，然后在电泳液(300mMNa0H，lmMEDTA)中放置20分钟，之后进行电泳(300毫安，25伏特，20分钟)。电泳后的玻片浸入中和液(O.4MTris，pH7.5)中和，取出后在凝胶上滴上DAPI(2ug/ml)染细胞核，于荧光显微镜下观察，在紫外光激发下，观察细胞核是否在电泳中出现拖尾，数出总细胞中带拖尾细胞的百分比，作为DNA损伤的指标。氧化性蛋白检测细胞培养在100mm细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，用PBS洗一次，细胞用含lmM的蛋白裂解液收取后，按照OxyblotProteinOxidationDetectioni式齐U盒(ChemiconInternational,CA)的说明进行，该试剂盒原理为:用2,4-Dinitrophenylhydrazine(DNPH)标记氧化性蛋白，以抗DNPH的抗体进行蛋白免疫印迹实验检测，用考马斯亮蓝染色聚丙烯酰胺蛋白电泳凝胶，作为蛋白量的内参。胞浆内钙离子浓度的测定细胞培养在IOO,细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，用PBS洗一次，用生理盐水刮下细胞，用玻璃匀浆器手动研磨20次，3000rcf、4'C离心10分钟，取上清，按照钙离子检测试剂盒说明书进行钙离子浓度的测定，该试剂盒的原理为钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝(MTB)结合，生成蓝色络合物，通过比色可比较钙离子浓度的高低。线粒体复合物I和II活性的检测细胞培养在100mm细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，用PBS洗一次，刮下细胞，在低渗溶液中用玻璃匀浆器手动研磨20次，800rcf、4'C离心5分钟，收取上清，11000rcf、4'C离心30分钟，所得沉淀为线粒体，用于复合物I和II的活性测定。复合物I的测定方法为在反应液(50mMTrispH8.1,0.1%BSA，1uMAntimycinA，0.2mMNaN3，0.05mMCoQl,0.4mMDCPIP)中加入终浓度为50ug/ml的线粒体，用终浓度为0.2mM的NADH启动反应，于600nm测定吸光度的降低速度，以此作为活性的反映。复合物II的测定方法为在反应液(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.8，2mMEDTA，0.1%BSA，3uM鱼藤酮，1uMAntimycinA,0.2mMNaN3,0.05mMCoQl，0.2mMATP,0.4mMDCPIP)中加入终浓度为100ug/ml的线粒体，于600nm测定吸光度的降低速度，以此作为活性的反应。谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性的检测细胞培养在lOOmm细胞培养板中，硫辛酰胺、硫辛酸或丙烯醛处理后，用PBS洗一次，用生理盐水刮下细胞，超声裂解细胞，13000rcf、4'C离心5分钟，取上清测定GST酶活性。测定方法为在lmMGSH,lmMCDNB3mg/mlBSA中加入终浓度为20yg/ml的蛋白样品，于340nni测定吸光度的增加，以此作为活性的反映。细胞氧气消耗的检测细胞氧气消耗的检测使用了BD公司的OxygenBiosensorSystem(BDBiosciences)。细胞用胰酶消化并重悬于培养基中，转移到96孔的耗氧测定板。在荧光酶标仪(FlexStationII384，MolecularDevices)读数两个小时，间隔一分钟，激发波长485nm，发射波长630nm(Schieke等，2006)。数据采用荧光变化的最大斜率，细胞密度采用血球计数板计数，并计算出单位细胞密度的荧光变化。线粒体数量的检测线粒体数量通过Mitotracker(MolecularProbes，Eugene，OR)染色检测。Mitotracker可以特异性的结合到线粒体上。细胞用含100nMMitotracker的培养基37'C温育30分钟，离心弃去含染料的培养基，用流式细胞仪检测，激发波长488mn，发射波长530mn。荧光强度的均值用于表示线粒体数量。实时定量PCR的方法检测线粒体DNA，mtTFA和NRF-1mRNA表达总DNA使用DNA提取试剂盒提取(U-geneBiotechCo.LTD,China)。实时定量PCR使用MasterPremix(T0Y0B0CO.,LTDOsaka,Japan)。总RNA使用Trizol试剂盒提取(Invitrogen)。采用的引物如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>PCR条件95°C，10min，然后进行40循环95°C，lmin，55°C，lmin，72°C，lmin。NRF-1和mtTFA的褪火温度分别改为65°C，30s和60。C，30s,其它反应条件不变。数据表示为2—Aet，ACt=Ct-Ct18S。免疫印迹实验线粒体复合物I、II、III、IV、V表达用蛋白免疫印迹(WesternBlot)检测。所用抗体为Invitrogen公司制造(MolecularProbes)。一抗(分别是抗复合物I-V的抗体)浓度分别为1:2000，1:5000，1:5000，1:1000和1:5000。二抗使用辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠抗体。检测PGOla和NRF-2的抗体来自santacruz公司，一抗浓度为1:1000,二抗使用辣根过氧化酶标记的山羊抗兔抗体。统计和数据分析数据表示为均值士标准误，t检验用于统计分析。p〈0.05被认为具有显著性差异，p〈0.01被认为具有极显著性差异。实施例1硫辛酰胺可防止细胞活性的下降ARPE-19细胞分别由40uM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40uM硫辛酰胺+75uM丙烯醛(LM+A)处理后，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图l。如图1A显示，单加入丙烯醛(Acraldehyde，A)24小时后细胞活性下降至对照(Control，0的13%，而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+八)活性显著高于丙烯醛处理组，同对照组比较没有明显变化。**p<0.01，同对照组相比较；tt#p<0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。利用倒置荧光显微镜拍摄的照片如图IB所示，在细胞形态上，单加入丙烯醛24小时后细胞皱縮变圆，预先加入硫辛酰胺保护的细胞形态同对照组比较没有明显变化。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护ARPE-19细胞免受丙烯醛造成的细胞活性的下降。实施例2硫辛酰胺可防止线粒体膜电位下降ARPE-19细胞分别由40uM硫辛酰胺(LM)、75yM丙烯醛(A)和40yM硫辛酰胺+75iiM丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行线粒体膜电位检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图2。由图2A所示，加入丙烯醛(A)24小时后，线粒体的膜电位下降到对照组(C)的37%,而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)的线粒体的膜电位显著高于丙烯醛处理组，与对照组比较没有明显变化。**p<0.01,同对照组相比较；賊p〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。采用荧光显微镜拍摄的照片如图2B，可以看出加入丙烯醛24小时后，多数染料不能进入线粒体内，呈现绿色，而预先加入硫辛酰胺保护组，染料大多进入线粒体内，呈现很强的红色。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地防止由丙烯酸造成的线粒体膜电位的下降。实施例3硫辛酰胺可防止线粒体复合物I和II活性的降低ARPE-19细胞分别由40iiM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40uM硫辛酰胺+75"M丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行线粒体复合物I和II的活性检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图3。由图3A和图3B可见，加入丙烯醛(A)24小时后，线粒体的复合物I和II的活性分别降低到对照组(C)的34%和38%,而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)的线粒体复合物I和II的活性显著高于丙烯醛处理组，甚至超过了对照组的水平。**p<0.01,*p<0.05，同对照组相比较；ttttp<0.01，#p<0.05，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的线粒体复合物I和II的活性的降低。实施例4硫辛酰胺可防止细胞质中钙离子浓度升高ARPE-19细胞分别由40uM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40uM硫辛酰胺+75uM丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行胞浆内f丐离子浓度检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图4。胞质内钙离子浓度的上升反映了线粒体功能的损伤。由图4可见，加入丙烯醛(A)24小时后，细胞质中钙离子浓度的升高到对照组(C)的4倍，而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)的细胞质中钙离子浓度显著低于丙烯醛处理组，同对照组比较没有明显变化。**p<0.01，同对照组相比较；ftp<0.05，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的细胞质中钙离子浓度的升高。实施例5硫辛酰胺能防止细胞内活性氧水平的提高ARPE-19细胞分别由40ixM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40uM硫辛酰胺+75uM丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行细胞内活性氧检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图5。由图5可见，加入丙烯醛(A)24小时后，细胞质中活性氧水平提高至对照水平的11倍，而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)活性氧水平显著低于丙烯醛处理组，同对照组(C)比较没有明显变化。**p<0.01，同对照组相比较；ttttp<0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的细胞内活性氧水平的提高。实施例6硫辛酰胺可防止SOD活性降低ARPE-19细胞分别40uM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40yM硫辛酰胺+75uM丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行超氧歧化酶SOD活性的检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图6。由图6可见，加入丙烯醛(A)24小时后，SOD活性降低至对照组(C)水平的69%，而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)的SOD活性显著高于丙烯醛处理组。**p<0.01,同对照组相比较；ttp〈0.05，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的超氧歧化酶SOD活性降低。实施例7硫辛酰胺可防止细胞内谷胱甘肽水平降低ARPE-19细胞分别由40uM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40uM硫辛酰胺+75uM丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行还原型谷胱甘肽含量的检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图7。由图7可见，加入丙烯酸(A)24小时后，细胞内谷胱甘肽水平的降低至对照组(C)的13%，而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)的谷胱甘肽水平显著高于丙烯醛处理组，并且高出对照组约一倍。**p<0.01，同对照组相比较；ttftp〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的细胞内谷胱甘肽水平的降低。实施例8硫辛酰胺可防止细胞内总抗氧化能力的降低ARPE-19细胞分别由40uM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)禾B40uM硫辛酰胺+75uM丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行细胞总抗氧化能力的检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图8。由图8可见，加入丙烯醛(A)24小时后，细胞内总抗氧化能力降低至对照组的57%，预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)的总抗氧化能力显著高于丙烯醛处理组，甚至还超出了对照组(C)水平。*p<0.05，同对照组相比较；貼p〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的细胞内总抗氧化能力的降低。实施例9硫辛酰胺可防止DNA损伤ARPE-19细胞分别由40uM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40uM硫辛酰胺+75uM丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行单细胞电泳试验，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图9。荧光显微镜下观察的照片见图9A，可见丙烯醛(A)处理的细胞大多有拖尾，而硫辛酰胺(LM)、硫辛酰胺+丙烯醛(LM+A)处理后的细胞与对照组(C)类似，很少发生拖尾现象。由图9B可见，加入丙烯醛(A)24小时后，细胞核损伤的(有拖尾的)占总细胞数的90%，预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯酲处理的细胞(LM+A)的细胞核损伤的(有拖尾的)占总细胞数的1.5%。**p<0.01，同对照组相比较；,<0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的DNA损伤。实施例10硫辛酰胺可防止蛋白质氧化损伤ARPE-19细胞分别由40uM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40iiM硫辛酰胺+75iiM丙烯酸(LM+A)处理24小时后，进行氧化性蛋白检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图10。由图10A-C可见，加入丙烯醛(A)24小时后，细胞氧化性蛋白水平比对照组(C)高出21倍，而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)氧化性蛋白水平比加入丙烯醛组降低了4倍，而单单加入硫辛酰胺的细胞的氧化性蛋白水平比对照组还低。**p<0.01，同对照组相比较；將p〈0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的蛋白质的氧化损伤。实施例11硫辛酰胺可防止的谷胱甘肽硫转移酶活性降低ARPE-19细胞分别由40uM硫辛酰胺(LM)、75uM丙烯醛(A)和40uM硫辛酰胺+75uM丙烯醛(LM+A)处理24小时后，进行谷胱甘肽转移酶(GST)活性的检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图ll。由图11显示，加入丙烯醛24小时后，谷胱甘肽硫转移酶活性降低至对照组(C)水平的29y。，而预先加入硫辛酰胺保护的用丙烯醛处理的细胞(LM+A)谷胱甘肽硫转移酶活性显著高于丙烯醛处理组，同对照组比较没有明显变化。**P<0.01,同对照组相比较；tt%K0.01，同丙烯醛组相比较，多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能有效地保护丙烯醛造成的谷胱甘肽硫转移酶活性的降低。实施例12硫辛酰胺可促进细胞耗氧ARPE-19细胞由40uM硫辛酰胺(LM)处理48小时后，进行细胞氧气消耗的检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见图12。由图12显示，用硫辛酰胺(LM)处理的细胞的耗氧速率是对照组(C)的2.51倍。*p<0.05，同对照组相比较。实验数据为平均值士标准误，三次独立实验用于数据统计，每次实验含3个平行。由上述结果可见，硫辛酰胺可显著促进细胞耗氧。实施例13硫辛酰胺可促进线粒体数量的增加ARPE-19细胞用5-80uM硫辛酰胺处理48小时后，检测细胞线粒体的数量，结果见图13。由图13A-B显示，随着硫辛酰胺的加入，线粒体数量有所增加，其中40uM硫辛酰胺处理的细胞线粒体显著多于未处理的对照组(即硫辛酰胺浓度为0)。**p〈0.01，同对照组相比较；多于三次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能显著促进线粒体数量的增加。此外，在以3T3-Ll前脂肪细胞(购自于ATCC公司，Cat.No.CL-173)作为试验对象时，也显示硫辛酰胺能显著促进3T3-L1前脂肪细胞中线粒体数量的增加。实施例14硫辛酰胺能促进线粒体DNA数量的增加ARPE-19细胞用5-80uM硫辛酰胺处理48小时后，检测细胞线粒体DNA的数量，结果见图14。由图14显示，硫辛酰胺的各个处理浓度均使线粒体DNA数量有所增加，其中40uM硫辛酰胺处理的线粒体DNA显著多于未处理组。**p<0.01，同对照组相比较；四次的实验结果用于统计检验。由上述结果可见，硫辛酰胺能促进线粒体DNA数量的增加。实施例15硫辛酰胺可促进线粒体电子传递链复合物的表达ARPE-19细胞用5-80ixM硫辛酰胺处理48小时后，利用蛋白免疫印迹检测细胞线粒体电子传递链复合物的表达，e-肌动蛋白(P-actin)或微管蛋白(tubulin)用于校正蛋白上样量，结果见图15A-E(A，复合物I;B，复合物II;C，复合物III;D,复合物IV;E，复合物V)。由图15A-E显示，所有处理浓度均使线粒体电子传递链各个复合物的表达有所增加。统计图为多于三次实验的光密度分析，*p<0.05，**p〈0.01，同对照组相比较。由上述结果可见，硫辛酰胺能促进线粒体电子传递链复合物的表达。此外，在以3T3-L1前脂肪细胞作为试验对象时，同样显示硫辛酰胺能显著促进增加线粒体电子传递链复合物的表达。实施例16硫辛酰胺可促进PGC-1a的表达ARPE-19细胞用5-80uM硫辛酰胺处理48小时后，提取总蛋白检测PGC-1a的表达，e-肌动蛋白用于校正蛋白上样量，结果见图16。由图16显示，各个处理浓度均使PGC-1a的表达上调，大于20uM的硫辛酰胺处理，使PGC-la的表达有了显著的增高。统计图为多于三次实验的光密度分析，*p〈0.05，同对照组相比较。由上述结果可见，硫辛酰胺能促进PGC-la的表达。实施例17硫辛酰胺可上调mtTFA和NRF-1的转录ARPE-19细胞用5-80uM硫辛酰胺处理48小时后，用实时定量PCR的方法检测mtTFA和NRF-l的转录水平，结果见图17。由图17A和图17B显示，各个处理浓度均使mtTFA和NRF-l的转录上调。*p<0.05，氺承p〈0.01。由上述结果可见，硫辛酰胺能上调mtTFA和NRF-l的转录。实施例18硫辛酰胺与硫辛酸的比较1.硫辛酰胺比硫辛酸(LipoicAcid，LA)对细胞活性的保护作用更强ARPE-19细胞分别用40uM的LM或40uM的LA进行预处理48小时后，用75uM丙烯醛处理24小时，然后观察硫辛酰胺、硫辛酸对细胞活性的保护作用，以不加入硫辛酰胺、硫辛酸和丙烯醛的细胞作为对照。结果见图18。图18A显示，以对照组细胞具有100%细胞活性为参照，LM保护了98.2。/。的细胞活性，而LA保护了72.3y。的细胞活性，LM对细胞活性的保护显著的高于LA(p<0.05)，而单独用LM或LA处理细胞，对细胞活性没有明显影响。AAp<0.01，同不加入硫辛酰胺、硫辛酸和丙烯醛的对照组对比；**p<0.01，同丙烯醛(A)对比；#p<0.05，同LA预处理组对比(LA+A)。图18B显示，细胞形态上的变化非常明显，未经任何处理的细胞(a)形态蜷缩，大量死亡；经LA预处理的细胞(c)，也部分发生了形态改变和死亡；用LM预处理的细胞(b)，细胞形态基本保持正常水平。图中，a，对照；b，单独LM处理；c，单独LA处理；d，单独丙烯醛处理；e,LM+A;f，LA+A。由上述结果可见，硫辛酰胺与硫辛酸均可保护细胞活性，其中硫辛酰胺保护作用更强。2.硫辛酰胺比硫辛酸对线粒体膜电位的保护作用更强ARPE-19细胞分别用40uM的LM或40yM的LA进行预处理48小时后，75uM丙烯醛处理24小时，观察细胞线粒体膜电位的变化，结果见图19。图19A显示，LM完全保护了线粒体膜电位，而LA保护了82.3%的线粒体膜电位，LM对线粒体膜电位的保护显著地高于LA(p〈0.05)，而单独用LM或LA处理细胞，对线粒体膜电位没有明显影响。AAp<0.01，同不加入硫辛酰胺、硫辛酸和丙烯醛的对照组对比；**p<0.01，同丙烯醛(A)对比；#p<0.05，同LA预处理组(LA+A)对比。从图19B可以明显看出线粒体膜电位的变化，未经任何处理的细胞和用LA预处理的细胞红色荧光强度很低，说明线粒体膜电位降低；用LM预处理的细胞，线粒体膜电位达到正常对照水平。图中，a，对照；b，单独LM处理；c，单独LA处理；d，单独丙烯醛处理；e，LM+A;f，LA+A。由上述结果可见，硫辛酰胺与硫辛酸均可保护细胞线粒体膜电位，其中硫辛酰胺保护作用更强。3.硫辛酰胺对丙烯醛造成的ATP水平下降的保护作用比硫辛酸更强ARPE-19细胞分别用40iiM的LM或40uM的LA进行预处理48小时后，75nM丙烯醛处理24小时，观察细胞ATP水平的变化，结果见图20。图20显示，丙烯醛造成ARPE-19细胞内ATP水平下降，而LM对ATP下降的保护显著的高于LA。AAp<0.01，同不加入硫辛酰胺、硫辛酸和丙烯醛的对照对比；**p<0.01，同丙烯醛组对比。由上述结果可见，硫辛酰胺与硫辛酸均可避免细胞ATP水平下降，其中硫辛酰胺保护作用更强。4.硫辛酰胺对丙烯醛造成的细胞内活性氧产生的抑制作用比硫辛酸更强ARPE-19细胞分别由40yMLM、40uMLA、75uM丙烯醛(A)、40uMLA+75uM丙烯醛(A)和40uMLM+75uMA处理24小时后，进行细胞内活性氧检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞为对照。结果见图21。图21显示，丙烯醛处理造成细胞内活性氧水平大幅提高，LM预处理可以有效的抑制活性氧的产生，而相同浓度的LA的预处理不能显著抑制活性氧产生。Ap<0.05，同对照组对比；*p<0.05，同丙烯醛(A)对比；#p<0.05，同LA预处理组(LA+A)对比。5.硫辛酰胺对丙烯醛造成的线粒体酶活性的降低的保护比硫辛酸更强ARPE-19细胞分别由40uMLM、40uMLA、75uM丙烯酸(A)、40uMLA+75uM丙烯醛(A)和40uMLM+A处理24小时后，进行细胞内活性氧检测，以不加入硫辛酰胺、丙烯醛的细胞(C)为对照。结果见表2。表2所列数据显示，丙烯醛处理使得线粒体复合物I，II的活性显著降低。40一LM预处理对酶活性的保护要显著的高于同浓度LA的预处理。aap<0.01，同对照组(C)对比；*p<0.05，**p<0.01，同丙烯醛(A)对比，#p<0.05，##p<0.01，同LA预处理组(LA+A)对比。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>6.硫辛酰胺对丙烯醛造成的蛋白质氧化的保护作用强于硫辛酸丙烯醛处理造成ARPE-19细胞蛋白质的羰基化。图22A显示，40jxMLM的预处理可以显著的保护蛋白质免受氧化，并且其保护程度显著高于40-LA预处理组。图22B是A图的光密度分析。总蛋白的考马斯亮蓝染色用于总蛋白量参照，AAp<0.01，同对照组对比；**p<0,01，同丙烯醛(A)对比；##p<0.01，同LA预处理组(LA+A)对比。7.硫辛酰胺对丙烯醛造成的DNA损伤的保护作用强于硫辛酸图23A的单细胞电泳实验显示丙烯醛处理造成ARPE-19细胞基因组DNA的断裂。40-LM的预处理可以显著的保护DNA免受损伤，并且其保护程度显著高于同浓度的LA预处理组。图23B是定量分析，带有尾巴的细胞核视为DNA损伤，多于100个细胞核用于计算，AAp<001，同对照组对比；**p<0.01，*p<0.05，同丙烯醛(A)对比；#p<0.05，同LA预处理组(LA+A)对比。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表〈110〉中国科学院上海生命科学研究院<120〉硫辛酰胺在防治老年性视网膜黄斑变性中的应用<130〉073091<160〉8<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉1cccactaggataccaacaaac21<210〉2<211〉21<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc_feature<223>引物〈400〉2ccagatgtcggatacagttca21<210〉3<211〉21<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<■〉3cattcgaacgtctgccctatc21<210>4<211〉18<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature〈223〉引物<400>4cctgctgccttccttgga18〈210><211〉<212〉<213〉<220〉<221〉〈223〉518DNA人工序列misc一feature引物<400〉5gccgtcggagcacttact18〈210〉<211〉<212〉<213〉<220〉<221><223〉619DNA人工序列misc—feature引物<400〉6ctgttccaatgtcaccacc19<210〉<211〉<212><213><220〉〈221〉<223>20腿人工序列raise—feature引物<■〉7attccaagaagctaagggtg20<210〉<211〉<212〉〈213〉<220〉〈221〉<223〉819DNA人工序列misc—feature引物<400>8cttcccaagacttcatttc19权利要求1.一种硫辛酰胺的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗细胞损伤相关疾病的制剂。2.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的细胞损伤选自细胞活性下降、细胞中线粒体膜电位下降、细胞中线粒体复合物活性降低、细胞质中钙离子浓度升高、细胞中活性氧水平升高、细胞中氧化歧化酶SOD活性降低、细胞中谷胱甘肽水平降低、细胞总抗氧化能力的下降、细胞中的DNA损伤、细胞中蛋白质的氧化损伤、细胞中谷胱甘肽转移酶活性下降、细胞耗氧下降、细胞中线粒体数量下降、细胞中线粒体DNA数量下降、细胞中线粒体电子传递链复合物的表达下降、细胞中过氧化物酶体增生物激活受体Y辅助激活因子la的表达下降、或细胞中线粒体转录因子A或核呼吸因子1的转录下降。3.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的细胞选自肝细胞、肺细胞、脑细胞、视网膜细胞。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的细胞是视网膜色素上皮细胞。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，视网膜色素上皮细胞损伤相关疾病是视网膜黄斑变性。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的视网膜黄斑变性是老年性视网膜黄斑变性。7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的制剂是眼内注射制剂。8.—种预防或治疗细胞损伤相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予需要预防或治疗的对象有效量的硫辛酰胺。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的细胞损伤相关疾病是视网膜黄斑变性。全文摘要本发明属于药学领域，公开了一种硫辛酰胺的新用途，用于制备预防或治疗细胞损伤相关疾病的制剂。本发明首次揭示硫辛酰胺在防治细胞损伤方面的新用途；并且首次揭示硫辛酰胺对于视网膜色素上皮细胞的损伤具有极其有效的缓解和治疗作用，其药理作用非常明显，没有任何毒副作用，具有极好的药用前景。文档编号A61P27/02GK101352435SQ200710044180公开日2009年1月28日申请日期2007年7月25日优先权日2007年7月25日发明者刘中博,刘健康,李雪森申请人:中国科学院上海生命科学研究院