专利名称：松果菊苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及松果菊苷的用途，尤其涉及在制药领域的新用途。
背景技术：
肉灰蓉(HeraCistaneMs)是中医补益药物中的常用品种，属列当科肉苁 蓉属植物，药用品为其干燥带鳞叶的肉质茎，又名大芸、精笋、纵蓉、肉松 蓉、地精，始载于《神农本草经》，列为"上品"，具有补肾益精、润肠通便 之功效，主治男子阳痿、女子不孕等证。
松果菊苷是从管花肉苁蓉(Cistanche tubulosa)中分离、纯化的一种化 合物。以往的研究表明松果菊苷可以提高多种中枢神经递质的含量，具有很 强的抗氧化作用，还可延长动物寿命和抗衰老作用。目前用于治疗抗衰老或 老年性痴呆。
帕金森病(PD)是中老年人神经系统常见疾病。其特征性病理改变是中 脑黑质多巴胺能神经元变性减少，导致纹状体内多巴胺浓度明显下降，目前 治疗主要依赖多巴胺替代疗法。尽管神经科学家采取包括左旋多巴制剂在内 的各种治疗方法，但目前所有的研究都提示无法阻止多巴胺能神经元变性减 少的进展。
发明内容
本发明的目的在于提供松果菊苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用。 松果菊苷是从肉苁蓉中提取的一种化合物，其公知的化学结构式为<formula>formula see original document page 3</formula>本发明提供了松果菊苷在制备治疗帕金森病药物中的应用。 上述的松果菊苷在制备治疗帕金森病药物中可与矫味剂、溶剂或辅剂— 起制成口服液剂、片剂、丸剂、冲剂、胶囊剂、注射剂、滴丸剂、糖浆剂、膏剂。
由于采用了上述的技术解决方案，松果菊苷可以用来制备治疗帕金森病 的药物，给帕金森病患者的治疗带来了新的希望。
图1松果菊苷对MPP+介导的帕金森病细胞模型的保护作用；
图2 GADD153的mRNA在不同组别中的表达电泳图3松果菊苷对MPP+介导的细胞损伤模型GADD153 mRNA表达的影响；
图4 GADD153的蛋白在不同组别中的表达电泳图5松果菊苷对MPP+介导的SH-SY5Y细胞GADD153蛋白表达的影响。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明的实质，下面将用药理试验及结果来说明其在用 来制备治疗帕金森病的药物的新的用途。
松果菊苷可以采用目前公开的文献的记载制备方法制备。如可以采用如 下方法制备
将管花肉苁蓉(产地为新疆和田)的干燥肉质茎10kg粉碎后，用体积分 数为95%的乙醇回流提取3次，每次2h。将提取液合并，减压浓縮至膏状， 加少量水制成混悬液。以石油醚、乙酸乙醋、水饱和正丁醇依次分别萃取3 次，萃取液浓縮备用。取正丁醇萃取物10 g，用约2倍的水溶解之，随后 注人D101大孔吸附树脂柱(柱床体积约1000ml)，先以3000ml去离子水洗 脱，弃去水洗脱液，再以3倍柱床体积的体积分数为5%的甲醇水溶液洗脱， 即约3000ml，弃去。最后采用体识分数为20%的甲醇水溶液作洗脱液，以 500ml为一个馏分，用聚酞胺薄层色谱检识，以质量分数为5%的三氯化铁乙 醇溶液作显色剂，收集并合并有目标点的馏分进行减压浓縮。浓縮物经葡聚 糖凝胶LH-20柱色谱，用体积分数为10%的甲醇水溶液等度洗脱。将含有较高纯度的馏分合并，减压浓縮至干，得到2g样品(所有减压浓縮的水浴锅温
度均低于6(TC)。以HPLC测定—峰面积比ff，松果菊昔的相对含量为87%。将 上述粗品配制成0. 15kg/L的甲醇溶液，采用半制备型高效液相色谱法纯化。 进样量为120juL，收集保留时间为13.6min的组分。将其减压浓縮(在6(TC 以下)至有少量液体时取出，冷冻干燥，最后得灰白色无定形粉末220mg， 此即为松果菊苷的标准品。松果菊苷公知的化学结构式为
1、松果菊苷对1甲基-4苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)介导的SH-SY5Y多巴胺能细胞系损伤的保护作用试验
由于帕金森病的病因是多巴胺能神经元减少，SH-SY5Y多巴胺能细胞是 研究帕金森病的典型细胞模型。以往的研究表明1甲基-4苯基-批啶离子 (1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)处理SH-SY5Y多巴胺能细胞 后使SH-SY5Y多巴胺能细胞细胞存活率随MPP+的浓度增加而降低。本试验以 lmM的l甲基-4苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+) 介导的损伤的SH-SY5Y多巴胺能细胞系为研究帕金森病的细胞模型。
1.1细胞培养及分组
SH-SY5Y细胞每2 3d用10%DMEM培养液换液1次。待细胞增长至80% 融合时，用0. 25%胰酶消化细胞，按1x105分瓶传代，置于5%C02的细胞培 养箱中。试验用细胞分为对照组、MPP+组和松果菊苷不同浓度组。用DMEM 培养液将MPP+按1: 10梯度稀释成400mM，按1: 100体积比例加入96孔板 或6孔板中，使MPP+终浓度分别为0.25mM， 0. 5函，lmM， 2mM， 4mM。松果 菊苷用DMEM培养液按1: 10梯度稀释成lmg/ml与10ug/ml两个工作浓度。 按1: 100加入96孔板或6孔板中，使终浓度分别为l/ig/ml， lOpg/ml, 100iiig/ml。六孔板每孔总体积为2ml， 96孔板每孔总体积为200/n。每项相 同实验均重复3次。
1. 2检测细胞活性MTT(四氮唑蓝)为荷兰Duchefa公司产品。MPP+对SH-SY5Y细胞存活 率的影响1x104密度S—FFSY5Y细胞200ul接种于96孔板，24h后换含MPP+ 终浓度分别为0. 25mM， 0. 5mM， lraM， 2mM, 4mM的培养液，每浓度3复孔， 置于5%C02培养箱37。C孵育，分别于6h， 12h， 24h， 48h时各孔加入MTT20/xl， 继续孵育4h取出培养板。吸弃培养液，每孔加入DMSO 150M1，充分震荡 10min，待蓝色颗粒完全溶解后用全自动酶标仪(Biorad产品)570nm处测定 吸光度值。松果菊苷对MPP+介导的SH-SY5Y细胞损伤的影响终浓度lmM MPP+与松果菊苷分别为lMg/ml， 10Mg/ral， 100Mg/ral同时加入96孔板置 5%C02培养箱37。C孵育48h。余同上。
1. 3试验结果
图1:松果菊苷对MPP+介导的细胞损伤模型具保护作用。三种浓度的松 果菊苷处理的SH-SY5Y多巴胺能细胞存活率均比MPP+组明显增高(P〈0. 01)
MPP+ lmM处理的SH-SY5Y多巴胺能细胞48小时存活率为45. 3±3. 21%， 1/xg/ml，而松果菊苷处理上述细胞的细胞存活率对应为85.97±3.41%， 10ptg/ml为129. 97±4. 84%, 100ptg/ml为164. 1±3. 91%。松果菊苷三种浓度与 MPP+ lmM对照处理比较，细胞存活率具有明显差异(P〈0.01)。因此松果菊
苷不仅有较好的神经保护作用，而且还可能有促进细胞增殖作用。l蹄/ml， 10|Lig/ml， 100Mg/ml松果菊苷的SH-SY5Y多巴胺能细胞存活率均比MPP+组明 显增高(P〈0.01)，而且细胞存活率与松果菊苷浓度呈剂量依赖关系。因此试 验结果表明松果菊苷对MPP+介导的损伤具有显著的保护作用。
2、 松果菊苷对介导的损伤的SH-SY5Y多巴胺能细胞的保护作用的机制
试验
GADD153是内质网应激以及其它应激状态的共同通路，同时又会引起细 胞凋亡的重要分子，它在帕金森病这一目前存在着多种发病机制的疾病的研 究中有着重要的地位。
2.1 RT-PCR检测GADD153的mRNA表达
反转录试剂盒(RevertAidTM First Strand c薩Synthesis Kit)购自 MBI公司。
终浓度lraM MPP+与松果菊苷分别为l|Ug/ml， lO/xg/ml, lOO/^g/ml同时加入6孔板置5%C02培养箱37。C孵育48h。取出6孔培养板，PBS冲洗，按 Trizol法提取总RNA。取—>gRM7按反—转录试剂盒说明进行逆转录。聚合 酶链反应总体积为25ul ，引物序列为GADD153 (上引物 5'-GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC-3，和下引物5，-GTCTACTCCAAGCCTTCCCCC TGCG -3，) . /3-Actin (上引物5，- ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3，，下引物 5，-TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGGC-3，)。扩增目的产物的长度分别为422bp ， 244bp。94。C预变性5min，循环参数为95。C变性0. 5 min， 60。C退火0. 5 min, and 72 °C延伸1 min共35个循环。取PCR产物4ul，电泳后拍照。 2. 2 Western Blot检测GADD153蛋白表达
终浓度lraM MPP+与松果菊苷分别为lMg/ml， 10nig/ml, 100Mg/nil同时 加入6孔板置5%C02培养箱37。C孵育48h。取出6孔培养板，PBS冲洗，加 入60mL蛋白裂解液裂解，超声震荡，IOCTC变性10min。用lowry法测定样 品蛋白浓度。电泳积层胶60V 30min，分离胶120V 90min; PVDF膜转膜 110V 100min。加1:50小鼠抗人GADD153单克隆抗体，4。C过夜。TBST溶液 洗涤3次，每次10min,加含服P的兔抗小鼠二抗室温孵育2h，化学发光法 显影X胶片。每个样本的免疫印迹条带均与同一样本的/3-actin比较后作统 计学分析。
图2:在对照组(Con)， MPP+组(M)， ljug/ml松果菊苷组(El)， 10/ig/ml 松果菊苷组(CE2)， 100/xg/ml松果菊苷组(CE3)中的GADD153的mRNA的表达。
图3: MPP+ lraM处理SH-SY5Y细胞后GADD153 mRNA水平较对照组明显 升高(P〈0.01)。而加入松果菊苷组的GADD153 mRNA水平较MPP+组明显下降 (P<0. 01)。
图4:在对照组(Con)， MPP+组(M)， lpg/ml松果菊苷组(El)， 1(^g/ml 松果菊苷组(CE2)， 100/xg/ml松果菊苷组(CE3)中的GADD153蛋白的表达。
图5: MPP+组的GADD153蛋白的表达较对照组有显著的增长，而不同浓 度的松果菊苷组的GADD153蛋白的表达与MPP+组相比明显降低。(P<0. 01)
通过RT-PCR和Western-Blot，发现GADD153的表达与对照组相比也明 显降低。其中在松果菊苷最高浓度组(100mg/L) GADD153 mRNA水平降到了最低(P<0. 01)，而Western Blot的结果也发现GADD153的蛋白表达同时将到 了最低(P<0. 01)。基于上述结果厂可以iX为松果菊苷对MPP+介导的SH-SY5Y 细胞损伤模型的保护作用可能是通过调控GADD153来实现的。
上述试验结果表明松果菊苷对MPP+介导的细胞损伤具有显著的保护作 用。而松果菊苷对MPP+介导的SH-SY5Y细胞损伤模型的保护作用是通过调 控GADD153来实现的。松果菊苷可以用来制备治疗帕金森病的药物。
使用方法
松果菊苷50mg/kg小鼠体重的剂量灌胃，成人体重按60kg计算，为每 日20mg 口服。 实施例
上述松果菊苷可以和药剂学上可接受的辅剂(如果需要的话)，按照常 规制药方法，制成口服剂和注射剂。
实施例1 制成片剂、丸剂、冲剂、糖浆剂、膏剂。
除松果菊苷外可根据需要添加矫味剂，或辅剂如增强营养或免疫力的维 生素、蛋白质和矿物质，或能协同作用能治疗帕金森病的药物。该片剂、丸 剂、冲剂、糖浆剂、膏剂成分包括
松果菊苷 5%-90% (重量比)
矫味剂 0.1-1% (重量比)
辅剂 适量
上述矫味剂可选自a -环糊精(a -CD)、 P -环糊精(P -CD)、 N-LOK变 性淀粉、蔗糖、木糖醇、高果糖、甜蜜素、甜菊糖和蛋白糖中的一种或多种。
辅剂可选自人体需要的维生素或氨基酸，如维生素B，维生素C，赖氨 酸，谷氨酸等。
实施例2制成胶囊剂。该胶囊剂成分包括
松果菊苷15%-30% (重量比)
矫味剂 0.5-10% (重量比)
上述矫味剂主要有羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙二醇(PEG)、丙烯 酸树脂等。也可添加辅剂，辅剂可选自人体需要的维生素或氨基酸，如维生 素B，维生素C，赖氨酸，谷氨酸等。实施例3制成注射剂、滴丸剂。该注射剂、滴丸剂成分包括 松果菊苷 20%-30°/T(重量比)—溶剂 适量以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域 的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换 或变型，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要 求所限定。
权利要求
1、松果菊苷在制备治疗帕金森病药物中的应用，其中，所述松果菊苷是从肉苁蓉中提取的，其化学结构式为
2、如权利要求1所述的松果菊苷在制备治疗帕金森病药物中可与矫味 剂、溶剂或辅剂一起制成口服液剂、片剂、丸剂、冲剂、胶囊剂、注射剂、 滴丸剂、糖浆剂、膏剂。
全文摘要
本发明涉及松果菊苷在制备治疗帕金森病药物中的应用。本发明公开了松果菊苷对MPP+介导的细胞损伤具有显著的保护作用。由于松果菊苷可以用来制备治疗帕金森病的药物，给帕金森病患者的治疗带来了新的希望。
文档编号A61P25/16GK101313912SQ200710041519
公开日2008年12月3日 申请日期2007年5月31日 优先权日2007年5月31日
发明者唐红敏, 李文伟, 杨云柯, 越 范, 蔡定芳, 虹 赵, 顾喜喜 申请人:复旦大学附属中山医院