专利名称：一种免佐剂具有治疗动脉粥样硬化作用的免疫调节剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术、蛋白分离纯化技术及医学相关领域。更具体地，本发明涉及融合蛋白CTB-p277的构建、表达及分离纯化，融合蛋白CTB-p277和HSP65的化学藕联。在医学领域中，本发明是一种免疫调节剂，能用于预防和治疗人动脉粥样硬化。
背景技术：
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)所导致的心、脑血管疾病是严重危害人类生命健康的疾病之一，其发病率和死亡率均居各种疾病前列，同时动脉粥样硬化也是其他一些严重疾病的致病基础，例如高血压及慢性肾功能衰竭等，欧美等发达国家已将心血管疾病列为危害人类身体健康的主要杀手之一。而在我国，据统计，每年因心血管疾病死亡的人数约260万，而且患者人数呈逐年上升趋势，年龄呈年轻化趋势。如何防治动脉粥样硬化是人们今后要面临的一个难题。
传统观点认为，动脉粥样硬化是由多种因素促成的，如脂质代谢紊乱、高血压、吸烟、肥胖、糖尿病及糖耐量减低，高凝状态，纤溶功能减低，高同型半胱氨酸血症、高尿酸血症、遗传、性别及某些基因的多态性等。但近年来Ross以新的论据在他的损伤反应学说的基础上，明确提出“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病而不是单纯的由于脂质沉积所致”，其他学者又对此进行了补充。动脉粥样硬化斑块的形成可能是机体对各种损伤(物理、化学、生物)的一种本能的保护性反应，持续存在的损伤因素促成了粥样硬化斑块和血栓的形成。实际上，炎症反应在动脉粥样硬化的发生、发展到最后斑块表面破裂并发血栓形成的所有阶段均发挥了作用。
临床研究发现，系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)、抗磷脂抗体综合征、风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)和血管炎患者均有加速形成AS。近年来的大量研究表明AS是一种自身免疫性疾病。
动脉粥样硬化的危险因素如感染、低密度脂蛋白的氧化、氧化应激、高血压、生物力学应激等可引起内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞内的热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)过度表达，而且感染的微生物(如肺炎衣原体等)也可释放出HSP60，具有免疫原性。同时发现正常定位在细胞内的HSP已变成一种可溶形式存在于血液中，这种可溶形式与人类动脉粥样硬化呈正相关。动脉硬化患者的抗HSP的自身抗体的滴度明显的升高，在动脉粥样硬化的斑块里已发现T淋巴细胞对HSP的特异反应。
一般情况下，自身免疫性疾病可通过免疫疾病相关的自身抗原来治疗。动脉硬化患者的抗HSP的自身抗体水平很高，通过免疫HSP65诱导免疫耐受可以达到治疗该病的目的。
p277多肽是存在于人HSP60蛋白上的24个氨基酸的多肽(SEQ ID NO.1)。有文献报道p277是一种在炎症部位激活抑制炎症因子的Th2型细胞因子可关闭Th1细胞对附近其他抗原的反应的抗原表位，即p277是较好的治疗动脉粥样硬化这类炎症性疾病的抗原表位。不过，p277的免疫原性是比较弱的，为了克服这个缺点，我们引入了霍乱毒素B亚单位(Choleratoxin B subunit，CTB)。
CTB是霍乱毒素(Cholera toxin，CT)上的一个亚基，霍乱毒素是一个85KD大小的寡聚蛋白，由一个A亚基(CTA，28KD)和五个完全相同的B亚基(CTB，11.6KD)组成，形成AB5结构。A亚基又由A1亚基(CTA1，22KD)和A2亚基(CTA2，5KD)构成。CTA1亚基具有ADP-核糖基转移酶活性，是发挥毒性的部分，CTA2是连接肽，连接CTA1和CTB之间的桥梁，它通过二硫键与CTA1亚基共价连接，通过非共价键与CTB相连。CTB是霍乱毒素上的无毒部分，它能与大多数哺乳动物细胞表面都有的神经节苷脂GM1特异性结合，每个CTB和GM1都有很高的亲和力。当CTB识别粘膜的M细胞和粘膜上皮细胞表面的GM1神经节苷酯，通过A2将有毒性的A1亚基牵引进入粘膜M细胞和粘膜上皮细胞，这样就会引发严重腹泻。
越来越多的研究表明，CTB作为载体蛋白与相应的抗原融合表达，可以有效地增强抗原的粘膜免疫原性。Kim等用CTB基因和鼠轮状病毒肠毒素基因(NSP4)融合(CTB-NSP4)，转入马铃薯细胞表达，实验表明，该融合蛋白可以引发强烈的粘膜免疫反应。George-Chandy等证明CTB和相应的抗原连接后，CTB就成为一种很有效的粘膜载体分子，是一种免疫增强剂。Arêas等用CTB与肺炎球菌表面粘附素A基因(PsaA)融合，表达形成CTB-PsaA，发现该蛋白可以在小鼠中诱导粘膜免疫反应。Eriksson等发现用化学藕联的OVA-CTB既可以增强机体对OVA对B细胞和T细胞的反应，也能优先诱导Th2反应。从上述研究的中可以看出，CTB是一种有效的粘膜免疫载体蛋白。
人们意识到，针对自身免疫性疾病的治疗性疫苗，如果能从粘膜免疫是较理想的，但粘膜多肽疫苗研究面临一个难题就是粘膜途径的疫苗免疫原性往往较弱，因而粘膜治疗性疫苗成功的关键是如何提高疫苗的粘膜免疫原性。
p277多肽是治疗动脉粥样硬化的抗原，CTB又是具有很强免疫原性的载体蛋白，两者融合表达形成融合蛋白，通过粘膜免疫的方式，就可以有效地增强p277的抗炎作用，从而达到治疗动脉粥样硬化的效果。
作为自身免疫性疾病的动脉粥样硬化症，免疫HSP65是一条有效的治疗途径。通过HSP65和CTB-P277在体外的化学藕联，形成藕联蛋白，再用其进行免疫，便可以大大增强药效。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有治疗动脉粥样硬化作用的免疫调节剂。
本发明的又一目的是提供生产该免疫调节剂的方法。
本发明的再一目的是提供了该免疫调节剂的免疫途径。
本发明的最终目的是公开该免疫调节剂的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种具有治疗动脉粥样硬化作用的免疫调节剂。作为本发明的一个具体实施方式
，该免疫调节剂的获得是先将p277融合于CTB的C端形成融合蛋白，其氨基酸序列见SEQ ID NO.2。p277分子量小，免疫原性弱，直接用p277作免疫原很难在体内激发免疫反应，产生相应的抗体。为增强多肽疫苗的免疫原性，必须采用大分子蛋白作为免疫载体，与p277在体内融合表达。CTB是霍乱毒素B亚单位，是很好的免疫载体蛋白。p277与CTB融合表达就可以有效的增强p277的免疫原性，起到抗动脉粥样硬化的作用。为了便于叙述，将这种融合蛋白表示为“CTB-p277”。HSP65是指源于用作卡介苗的分枝杆菌来源的热激蛋白，国际基因库登录号是M17705。HSP65已被证实具有活化巨噬细胞和释放诸多细胞因子的功能，不但具有较强的免疫原性，而且具有防治自身免疫性疾病的作用。HSP65是一种良好的免疫佐剂，将融合蛋白CTB-p277与HSP65进行化学藕联，能强化多肽疫苗的免疫原性，不需添加佐剂就能激发机体产生强烈免疫应答，从而达到治疗动脉粥样硬化的效果。将具有治疗动脉粥样硬化作用的免疫调节剂表示为“HSP65-CTB-p277”。
在本发明的第二方面，提供了生产该免疫调节剂的方法，其技术路线详述如下1.HSP65基因的设计与获得在不改变HSP65氨基酸序列的前提下，选用原核和真核生物均适用的密码子，借助于计算机设计两条寡聚核苷酸链，从市售的卡介苗提取的DNA中通过PCR法获得HSP65基因的核苷酸序列，5’端添加了Nco I的识别位点，3’端添加了HindIII或Bgl II的识别位点。
2.p277基因的设计与获得p277是人HSP60上的一段(437-460位VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED)氨基酸序列。我们将442和447位的C(半胱氨酸)用V(缬氨酸)来置换，以增强肽段的稳定性，两者具有相同的免疫特性。根据多肽p277氨基酸序列，选择原核和真核生物均适用的密码子，借助于计算机设计两条寡核苷酸链，分别作为上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸内切酶BamHI的酶切位点，下游引物5’端加上终止密码子和限制性核酸内切酶HindIII的酶切位点，两条引物互补序列为20个碱基，通过聚合酶链式反应(PCR)法获得p277多肽基因的核苷酸序列。
3.CTB基因的设计和获得以pET28a-CTB质粒为模板。为了便于载体的构建，利用计算机辅助设计上、下游引物，上游引物添加Pag I识别位点，下游引物添加Nhe I识别位点，通过PCR方法，获得所需的目的基因。
4.pED-HSP65重组工程菌的构建Hsp65基因经Nco I、HindIII切割插入经Nco I、HindIII切割的pED质粒载体中，组成融合表达的重组质粒pED-HSP65，重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。
5.pED-p277重组基因工程菌的构建p277基因经BamHI、HindIII切割插入经BamHI、HindIII切割的pED质粒载体中，组成融合表达的重组质粒pED-p277，重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。
6.pET28a-HSP65-p277重组基因工程菌的构建HSP65基因经Nco I、Bgl II切割插入经Nco I、BamHI切割的pED-p277质粒中，BglII和BamHI为同尾酶，组成融合表达的重组质粒pET28a-HSP65-p277(结构示意图见附图1，5600bp)，重组质粒转化大肠杆菌BL21获得重组基因工程菌。
7.pET28a-CTB-p277重组基因工程菌的构建CTB基因经过Pag I、Nhe I切割插入经Nco I、Nhe I切割的pET28a-HSP65-p277质粒中，Pag I和Nco I是同尾酶，组成融合表达的重组质粒pET28a-CTB-p277，重组质粒转化大肠杆菌BL21获得重组基因工程菌。
8.工程菌发酵及HSP65-CTB-p277藕联蛋白的获得1)CTB-p277的获得以LB为基础培养基，玉米浆培养基为发酵培养基，发酵参数如下温度36-38℃，pH6.8-7.2。发酵后离心收集工程菌，反复冻融裂解菌体，获得包含体，包含体经过洗涤、裂解、复性，获得复性蛋白，再经DEAE阴离子交换柱层析纯化，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(用非还原上样缓冲液)，判断纯化的CTB-p277纯度。HSP65为本实验室保存。
2)HSP65-CTB-p277藕联蛋白的获得把HSP65和纯化后的CTB-p277放在一起，PBS充分溶解，用0.3％的戊二醛溶液进行化学藕联，搅拌过夜后，再滴加1M的甘氨酸终止多余的戊二醛溶液，装入透析袋中透析。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(用非还原上样缓冲液)，判断HSP65-CTB-p277藕联情况。
在本发明的第三方面是提供了该免疫调节剂的免疫途径。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的热休克蛋白65(MT-HSP65)采用粘膜免疫途径可以起到抗动脉粥样硬化的效果。在本发明的免疫调节剂中，CTB是强烈的粘膜免疫载体蛋白，与p277融合后形成CTB-p277，也具有很强的粘膜免疫原性，HSP65和CTB-p277两者藕联后更进一步增强了疫苗的免疫原性，不需添加佐剂就能激发机体产生强烈免疫应答，因而可以通过粘膜给药来治疗动脉粥样硬化。利用鼻粘膜给药进行粘膜免疫简便易行，药物经鼻粘膜部丰富毛细血管吸收后直接进入体循环，使药物不良反应的发生机率大为降低，体液免疫是粘膜免疫效应的主要过程，即产生分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，sIgA的多聚体结构能增强其对抗原的亲和力，而且sIgA表面特殊的糖成分或糖链有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。通过鼻粘膜给药还可免受胃肠道中酶的破坏和肝脏对药物的首过清除效应，有利于提高生物利用度和血药浓度，可极大地减少药物用量。同时IgG，IgM，IgE等免疫球蛋白在粘膜反应中也起着不可忽视的重要作用。
在本发明的第四方面是该免疫调节剂的用途。将该免疫调节剂直接免疫动物，能激发机体的免疫应答，产生p277的特异性抗体。在医学上，该免疫调节剂能用于治疗人动脉粥样硬化。
图1载体质粒pET28a-HSP65-p277结构框架图。
图2重组质粒pET28a-CTB-p277结构框架图。
图3重组质粒pET28a-CTB-p277C端部分基因测序结果。
图4 SDS-PAGE电泳显示CTB-p277的融合表达和纯化以及HSP65-CTB-p277藕联蛋白的情况。1.标准分子量蛋白；2.载荷pET28a质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；3.载荷pET28a-CTB-p277质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；4.经复性纯化后的CTB-p277融合蛋白(用非还原上样缓冲液)；5.HSP65-CTB-p277藕联蛋白(用非还原上样缓冲液)。
图5 ELISA测定结果显示HSP65-CTB-p277藕联蛋白经粘膜免疫能诱发新西兰大白兔产生抗p277的抗体。图列 正常组 PBS组 OVA组 HSP65组■HSP65-CTB-p277组图6 Western-blotting检测结果显示HSP65-CTB-p277能诱发新西兰大白兔产生抗p277抗体。A蛋白转膜后用丽春红染色显示相应的蛋白条带；B杂交后显色结果。1.标准分子量蛋白；2.还原态rhVEGF-P277；3.氧化态rhVEGF-p277；4.还原态rhVEGF；5.氧化态rhVEGF。
图7各组新西兰大白兔第一次免疫后的第八周血清中总胆固醇含量。结果显示除正常组外，HSP65-CTB-p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫组的总胆固醇水平要显著低于PBS组和OVA组，HSP65给药组总胆固醇的水平也有一定程度的降低。
具体实施例方式
(1)菌株，细胞系和质粒宿主菌E.coliBL2l(Escherichia coliBL21)是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
质粒pET28a购自Novagen公司。
卡介苗由上海生物制品公司生产，该制品中含有牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)。
质粒pET28a-HSP65、pET28a-HSP65-p277由本实验室构建并保存，HSP65蛋白也由本实验室分离纯化。
(2)酶和试剂分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品PCR回收试盒和琼脂糖胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。
(3)培养基LB培养基，配方见参考文献Salmbrook J，Fristsh EF，Maniatis T.MolecularCloningA Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
玉米浆培养基含有玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(4)Cellouse-DEAE DE-52为Whatman公司产品。
(5)辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗为武汉博士德公司产品。
(6)3、3’、5、5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢尿素和牛血清白蛋白(BSA)为美国西格马(sigma)公司产品。
(7)96孔酶标板为美国康宁(Corning)公司产品。
(8)硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品。
(9)测定血清中血糖浓度的仪器为Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。
方法分子生物学操作方法质粒提取、聚合酶链反应、限制性核酸内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYColdspringHarborLaboratoryPress，1989，pp.16-340。
重组蛋白表达量的测定参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。
实施例1CTB-p277多肽基因的设计、合成和克隆1.CTB基因的获得在不改变CTB基因的前提下，以pET28a-CTB质粒为模板，利用计算机辅助设计上游引P1和下游引物P2。由上海博亚生物技术有限公司合成。pET28a-CTB质粒由中国药科大学微生物教研室惠赠。
上游引物P15’GGGTCATGACACCTCAAAATATTACTG 3’PagI下游引物P25’AAAGCTAGCATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGC 3’NheI上游引物P1中引入PagI酶切位点，下游引物P2中引入NheI酶切位点。
以pET28a-CTB质粒为模板，P1和P2分别为上下游引物进行PCR扩增。
PCR反应条件为94℃预变性5min；然后以94℃变性1min，52℃退火50s，72℃延伸1min，循环数30个；最后再72℃延伸10min。其产物用PCR产物纯化试剂盒纯化，获得CTB基因。
2.质粒pET28a-CTB-p277的构建将纯化后得CTB基因用PagI和NheI限制性内切酶进行酶切，酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化。采用碱裂解法对pET28a-HSP65-p277进行抽提，抽提得到的质粒用NcoI和NheI进行双酶切。酶切反应结束后用胶回收纯化试剂盒回收大片段。
将上述酶切回收后得到的CTB片段和pET28a-HSP65-p277质粒大片段进行连接。连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，通过PCR验证，筛选含CTB-p277融合蛋白基因的重组质粒，称pET28a-CTB-p277(结构示意图见附图2，4520bp)。将该质粒委托上海博亚生物技术有限公司进行核酸的序列分析，进一步验证CTB-p277融合蛋白基因及其读码框的正确性，其测序结果见附图3。
实施例2CTB-p277基因在大肠杆菌中的表达将重组质粒pET28a-CTB-p277转化大肠杆菌BL21。从生长有不同转化子平板上挑取单菌落接种含有50ug/ml卡那霉素LB液体培养基，于37℃恒温振荡培养过夜，按1％比例转接种入新鲜的玉米浆液体培养基(50ug/ml卡那霉素)中，37℃培养4小时后，加入终浓度为0.5mmol/L的α-乳糖诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶，继续培养从而表达融合蛋白CTB-p277。诱导后6小时取少量菌液，离心回收菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了CTB-p277多肽基因的融合表达。融合蛋白占细菌总蛋白的40％左右，结果见图4泳道3。
实施例3重组蛋白CTB-p277的分离纯化诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，每10g湿菌体悬浮于50ml的50mmol/L Tris-HCl缓冲液中，每克湿菌加80μl溶菌酶(10mg/ml)，再加入Triton X-100至终浓度为0.5％，于37℃振摇过夜。每克湿菌加0.5μl Dnase I(1mg/ml)，于37℃继续振摇45min。10000r/min，离心15min，目标蛋白形成包含体，出现在沉淀中，弃上清。
按每克包含体湿重加入10ml洗涤液I，使沉淀重新悬浮均匀后，离心后弃上清，沉淀再加入洗涤液II按同样的方法洗涤，最后用蒸馏水洗去残留的洗涤液II，沉淀备用，取部分沉淀用15％SDS-PAGE检测。洗涤液I50mmol/L Tris-HCl缓冲液，0.2％ Triton X-100；洗涤液II2mol/L的尿素。
洗涤后的包含体沉淀，按每克湿重加入10ml的8mol/L的尿素溶液，再加入β巯基乙醇至终浓度为1％，用磁力搅拌子搅拌6h以上，使沉淀重新溶解和悬浮于尿素溶液中。离心后弃沉淀，收集上清。
将上述收集的上清液依次对6mol/L，4mol/L，2mol/L，1mol/L，0.5mol/L的尿素溶液(以50mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解)透析，透析液中加入还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽至终浓度分别为2mmol/L和0.4mmol/L。每隔8h换一次液，共透析48h。
复性后透析液进行阴离子交换柱层析，DEAE纤维素DE-52柱(2.6×40cm)，用离子交换缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0)/NaCl梯度洗脱，分段收集进行SDS-PAGE电泳检测，CTB-p277在100-120mM NaCl的洗脱峰中，用SDS-PAGE电泳(用非还原上样缓冲液)检查制备样品的纯度，结果见附图4泳道4。
实施例4HSP65-CTB-p277藕联蛋白的获得将本实验室保存的HSP65和纯化后的CTB-p277放在一个小烧杯中用PBS充分溶解，缓慢滴加0.3％的戊二醛溶液进行化学藕联，于4℃层析柜中搅拌过夜后，再滴加1M的甘氨酸终止多余的戊二醛溶液，30min后，装入透析袋中透析36小时。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(用非还原上样缓冲液)检查样品的藕联情况。结果见附图4泳道5。
实施例5HSP65-CTB-p277藕联蛋白的免疫原性研究选用5周龄的雄性新西兰大白兔，随机分成五组，每组八只，分别是HSP65-CTB-p277藕联蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫组，PBS空白对照组，卵清蛋白滴鼻对照组，正常对照组。除正常组外，其余各组都喂饲高胆固醇食物。分别于第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19d免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐剂，每次免疫剂量为200μg/只。在第一次给药时耳缘静脉取第一次血，后每隔两周取血一次，共五次。血量为1.0-1.5ml，离心，取血清冷冻保存。
用纯化的重组人血管内皮生长因子121和p277的融合蛋白(rhVEGF-p277)4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100μl含50μg融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭一小时。免疫后取血所得抗血清用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀释100倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1小时。用PBST(含0.1％Tween-20)和自来水间隔洗涤6次后加入100μl以1∶20000稀释的羊抗小鼠IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1小时。PBST和自来水间隔洗涤6次，每孔加入100μl过氧化氢尿素和3，3’-5，5’一四甲基联苯胺(TMB)溶液于37℃显色30分钟后，加入50μl 2M H2SO4终止反应，并于450nm波长下，测定各孔吸光度值。从结果中可以看出，HSP65-CTB-p277鼻腔粘膜给药组新西兰大白兔体内能产生特异性的抗p277抗体值明显优于其他组。结果见附图5。
实施例6抗p277特异抗体的Western检测将纯化后的rhVEGF、还原态rhVEGF-p277和氧化态rhVEGF-p277用15％ SDS-PAGE电泳后，于30V电压电泳过夜转移到硝酸纤维素膜上，然后以5％BSA溶液室温封闭2小时。实施例5和例6中所得抗血清稀释20倍后，与硝酸纤维素膜上的抗原于37℃作用1小时后，以pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀释400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根过氧化物酶标记)二抗，于37℃作用1小时，再以pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。具体操作方法参考Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。氧化态rhVEGF-p277(泳道3)由于其链间二硫键的作用，部分蛋白质形成二聚体，在PAGE胶上表现为分子量分别为17kD和34kD的双条带，还原态rhVEGF-p277(泳道2)为单体，在胶上表现为分子量为16kD的单条带。由于新西兰大白兔血清中有抗p277抗体的存在，因此可以分别和膜上16kD和32kD的rhVEGF-p277蛋白带杂交，但不和rhVEGF杂交(泳道4和5)，证实了HSP65-CTB-p277实验组能诱发新西兰大白兔体内产生特异的抗p277的抗体。结果见附图6。
实施例7HSP65-CTB-p277藕联蛋白的药效学研究选用5周龄的雄性新西兰大白兔，随机分成五组，每组八只，分别是HSP65-CTB-p277藕联蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫组，PBS空白对照组，卵清蛋白滴鼻对照组，正常对照组。除正常组外，其余各组都喂饲高胆固醇食物。分别于第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19d免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐剂，每次免疫剂量为200μg/只。在第一次给药后的第八周进行耳缘静脉取血，血量为1.0-1.5ml，离心，取血清5小时内用全自动生化分析仪测定总胆固醇的含量。结果见附图7。从测得的总胆固醇水平来看，除正常组外，HSP65-CTB-p277给药组总胆固醇的水平最低，效果最好，更利于治疗动脉粥样硬化。HSP65对动脉粥样硬化也有一定的治疗作用。
SEQUENCE LISTING<110>中国药科大学<120>一种免佐剂具有治疗动脉粥样硬化作用的免疫调节剂<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp1 5 10 15Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp20<210>2<211>133<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>
<400>2Met Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr1 5 10 15
Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu20 25 30Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile35 40 45Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys50 55 60Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu65 70 75 80Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala85 90 95Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Ala Ser Ala Asp Pro Val Leu Gly100 105 110Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr115 120 125Pro Ala Asn Glu Asp130
权利要求
1.一种免佐剂具有治疗动脉粥样硬化作用的免疫调节剂，其特征在于该免疫调节剂是将源于HSP60的抗原表位多肽p277基因与霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit，CTB)基因融合形成的融合蛋白。该融合蛋白与热休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)化学藕联形成藕联蛋白。
2.按照权利要求1所述的免疫调节剂，其特征在于该免疫调节剂中含有一段源于人HSP60的抗原表位多肽p277，p277的氨基酸序列是VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。
3.根据权利1、2和3所述的免疫调节剂，其特征在于该调节剂是一段SEQ ID NO.1结构的序列融合到霍乱毒素B亚单位C端所形成的多肽，具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
4.按照权利1所述的治疗粥样硬化作用的免疫调节剂，可以表示为HSP65-CTB-p277。其特征在于HSP65携带有CTB-p277融合蛋白。
5.一种免佐剂具有治疗动脉粥样硬化作用的免疫调节剂的制备方法，包括用PCR法合成CTB的编码序列DNA，将这些DNA分步插入表达载体，在大肠杆菌中表达出CTB-p277融合蛋白，经包含体的洗涤、裂解、复性、阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化，再经融合蛋白与HSP65的化学藕联，得到治疗人动脉粥样硬化的免疫调节剂。
6.按照权利要求5所述得到的免疫调节剂，其特征在于不需添加佐剂，通过粘膜免疫途径能诱发机体产生HSP65和p277特异的免疫应答。
7.按照权利要求5所述得到的免疫调节剂，其特征在于能显著抑制动脉粥样硬化的发生，能够起到治疗动脉粥样硬化的作用。
8.根据权利要求5所述得到的免疫调节剂，其特征在于可与药物载体或药物活性成分组合制成药物组。
全文摘要
本发明提供了一种能用于治疗动脉粥样硬化的免疫调节剂。针对抗原多肽的弱免疫原性，将源于人HSP60的一段抗原表位多肽(SEQ ID NO.1)插入霍乱毒素B亚单位(Cholera toxinB subunit，CTB)的下游，实现了抗原表位多肽与CTB的融合表达。产生的融合蛋白(CTB－p277)与热休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)化学藕联，无需使用佐剂，直接用于免疫。该藕联蛋白通过粘膜免疫途径可激发机体产生高滴度针对p277的抗体，显著抑制新西兰大白兔动脉粥样硬化的发生，能够起到治疗动脉粥样硬化的作用。
文档编号A61P9/10GK101036786SQ20071001991
公开日2007年9月19日 申请日期2007年2月2日 优先权日2007年2月2日
发明者刘景晶, 李建平, 熊祺焱, 陈庆梅, 吴洁, 曹荣月 申请人:中国药科大学