专利名称：一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地，涉及一种中药组合物在 制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用。
背景技术：
心血管疾病每年夺走1200万人的生命，接近世界人口总死亡的1/4，成 为人类健康的头号大敌。对于心肌梗死或心力衰竭，传统的治疗方法，包括 药物、介入和外科手术均不能使缺失的心肌细胞再生，由于心肌缺失造成不 可逆转的心肌重塑过程，终至心力衰竭和死亡。近年来，干细胞再生医学在 心血管疾病治疗中取得了突破性进展，该技术又被称为细胞心肌成形术 (cellular cardiomyoplasty)，即通过移植干细胞或心肌细胞，或者动员外 周循环血干细胞或骨髓干细胞迁移到心肌受损部位来实现损伤心肌的修复。 移植干细胞实施细胞心肌成形术是改善心肌梗死造成的血液动力学和神经 体液紊乱的一种可行的方法。各种前期动物实验表明干细胞具有修复心肌细 胞的能力，能改善梗死区的灌注和心功能[Schuster MD， Kocher M， Seki T， Martens TP， Xiang G， Homma S， et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regenemtion. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 287: H525 - 532. (Schuster MD， Kocher AA, Seki T， Martens TP， Xiang G， Homma S等，骨髓成血管细胞引起的血 管新生导致心肌细胞再生.美国生理杂志心脏和循环分册2004; 287: H525 - 532.)]。尽管干细胞被用于心肌修复的临床研究，但由于缺血/再灌注及炎性因 子等的影响导致在局部缺血心脏的供体细胞死亡，因此细胞心肌成形术的发 展因植入细胞存活率低而受到阻碍。研究表明大量细胞在移植入受损的心脏后死亡，其中绝大部分细胞在移植后24小时内流失，12周后仅剩下15%存活 [Muller-Ehmsen J， Whittaker P， Kloner RA， Dow JS， Sakoda T， Long TI， et ￡iL Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J Mol Cell Cardiol 2002; 34: 107-116. [PMID: 11851351] (Muller-Ehmsen J， Whittaker P， Kloner RA， Dow JS， Sakoda T， Long TI，等.新生大鼠的心肌细胞移植入成年大鼠心肌 后的生存和发育.分子细胞心脏病学杂志，2002; 34: 107 - 116.)]。急性心肌梗死会导致严重的局部心肌缺血、炎症反应、氧化应激和凋亡， 这将明显降低移植细胞的存活率。因此，保护局部移植的干细胞，减少或避 免其死亡对临床应用具有重要意义。目前已有几种可以改善植入细胞存活率 的方法(1)热休克疗法能改善移植细胞对体内缺血/再灌注损伤的耐受性， 提高植入心脏后的存活率[Suzuki K， Smolenski RT， Jayak隨r J， Murt認 B， Brand NJ， Yacoub MH. Heat shock treatment enhances graft cell survival in skeletal myoblast transplantation to the heart. Circulation 2000; 102: III216-221. [PMID: 11082390]) (Suzuki K， Smolenski RT， Jayakumar J， Murtuza B， Brand NJ， Yacoub MH.热休克疗 法增强骨髓成肌细胞移植到心脏后的存活.循环.2000; 102: III216 - 221. ) ]; (2) Akt修饰的骨髓间质干细胞可以进一步改善梗死心 脏功能[Mangi AA， Noiseux N， Kong D, He H， Rezvani M, Ingwall JS， et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med 2003; 9: 1195 - 1201. [PMID: 12910262] (Mangi AA， Noiseux N， KongD, He H, Rezvani M， Ingwall JS等，Akt修饰的间充质干细胞阻止梗死心脏重构和恢复心脏功能.自然医 学，2003; 9: 1195 - 1201.) ]; (3)在局部缺血心肌注射质粒载体使亚 铁血红素加氧酶-l过度表达，减少单核细胞浸润的数量，下调炎症因子的表 达[Tang YL， Tang Y， Zhang C， Qian KP， Shen U3， Phillips I. Improved graft mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia-regulated Heme Oxygenase-1 vector. J Am Coll Cardiol 2005; 46: 1339-1350. [PMID: 1619885]) (Tang Y， Zhang C， Qian KP， Shen LP,Phillips I.亚铁血红素加氧酶-l过度表达的间充质干细胞移植到缺血心脏 后生存改善.美国心脏病学院杂志2005; 46: 1339-1350.)]。但是，以上 方法均建立在供体细胞水平的基础上，而决定移植细胞在心脏中的命运之关 键是梗死局部心肌的微环境，因此针对梗死心肌微环境进行的干预可能更加 有效的促进移植细胞的存活和发挥生物学效应。。本发明是在第01131203.3号中国专利和第200410048292.2号专利申请的基础上进行的改进发明，在此全文引用该两专利文件记载的内容。本发明 提供了 一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化 的药物中的新应用，通过干预性治疗改善局部微环境的质量，进而有效促进 植入细胞的存活和生物效应。本发明目的是提供一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存 活和成心肌分化的药物中的应用，所述中药组合物由如下重量份的原料药制 成人参3-10水蛭3-11 土鳖虫5-10 乳香(制)1-5 赤芍3-9 降香1-5 檀香l-5全蝎3-9蝉蜕3-12蜈蚣1-3冰片1-7酸枣仁(炒)3-10; 优选地，该中药组合物由如下重量份的原料药制成 人参6 水蛭10 土鳖虫7 乳香(制)2 檀香2全蝎7 蝉蜕7 蜈虼l 冰片5赤芍5 降香2 酸枣仁(炒)5;或:或:人参10 檀香2人参6 檀香2水蛭8 全蝎9水蛭11 全蝎3土鳖虫7 蝉蜕7土鳖虫7 蝉蜕7乳香(制)2 蜈蛇1 冰片5赤芍5 降香2 酸麥仁(炒)5;或:人参5. 5 水蛭10. 375 赤芍4. 75降香2. 375'乳香(制)2赤芍5 降香2 蜈蚣1 冰片5酸枣仁(炒)5;土鳖虫6.875乳香(制)2.25 檀香2. 25全蝎6. 875蝉蜕6.875 蜈虼1.375 冰片1. 375酸枣仁(炒)4.625;更优选地，上述中药组合物的活性成分由下列成分组成a平均粒径小于100 Mm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉；b冰片药粉；c由降香和檀香提取的挥发油； d人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏； e提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸枣仁加水煎煮 后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓縮成的水提浸膏。本发明还公开了含有上述中药组合物作为活性组分的药物制剂为胶囊 剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊或滴丸剂。本发明的另一 目的是提供上述中药组合物在制备用自体骨髓间质干细 胞治疗心血管疾病的药物中的应用，优选地，该心血管疾病为心肌梗塞，特 别优选为急性心肌梗塞。本发明中药组合物中，作为活性组分的原料药的拉丁名及其加工方法来 自《中药大辞典》(1977年7月，第一版，上海科学技术出版社)和《中国 药典》(2005年版，化学工业出版社)。本发明中药组合物还可以按常规的制剂工艺，例如，范碧亭《中药药剂 学》(上海科学出版社1997年12月第1版)记载的制备工艺，制成药剂学可 接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊、滴丸等。本发明制剂中，还可以含有任选的制剂领域常规的辅料，例如填充剂、 崩解剂、粘合剂、助流剂、抗氧化剂、矫味剂、甜味剂、助悬剂等。所述辅 料包括例如淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、预胶化淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮等 或中药药剂学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社 1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。本发明制剂优选通过以下制备方法制成将上述配比的水蛭、全蝎、 蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣等五味药洗净，低温烘干，备用；檀香、降香提取挥发 油，药渣及水溶液备用；人参用70%乙醇加热回流提取二次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味；人参药渣与檀香、降香的 药渣以水溶液合并，加入赤芍、酸枣仁(炒)，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至相对密度为1.20-1.25 (60 °C)的清膏，加入上述人参醇提液，混匀，低温干燥，粉碎成细粉；乳香(制) 与水蛭等五味共粉碎成细粉；冰片研细，分别与上述细粉配研，混匀，喷入 挥发油，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成a) 原料药的重量比为人参3-10份、水蛭3-ll份、土鳖虫5-10份、制 乳香l-5份、赤芍3-9份、降香l-5份、檀香1-5份、全蝎3-9份、蝉蜕3-12份、 蜈蚣l-3份、冰片1-7份、炒酸枣仁3-IO份；b) 药材粉碎工艺将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净 选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上; 粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于IOO Mm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；C)提取浓縮和干燥工艺降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓縮成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回 收乙醇后，浓縮成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓縮成水提 浸膏；d)制剂工艺在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入 制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发 油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成a) 原料药的重量比为人参3-IO份、水蛭3-ll份、土鳖虫5-10份、乳 香(制)l-5份、赤芍3-9份、降香1-5份、檀香1-5份、全蝎3-9份、蝉蜕3-12 份、蜈蚣l-3份、冰片l-7份、炒酸枣仁3-10份；b) 药材粉碎工艺将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上； 粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于IOO Wn;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；c) 提取浓縮和干燥工艺降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮， 水提液过滤后，待浓縮成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回 收乙醇后，浓縮成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓縮成水提 浸膏，将浸膏直接喷雾干燥成喷雾粉；d) 制剂工艺-将超微粉碎粉与步骤c)所得喷雾干燥粉一起加到沸腾制粒干燥机中，再 喷溶媒制成颗粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香 提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。本发明组物的用量，按活性组分原料药总重量计，为每次0.8-3克， 每日服用2-4次，优选为每次l. 11-2.22克，每日服用三次。本发明提供大量试验研究数据表明，使用本发明药物组干预对运用自体 骨髓间质干细胞进行细胞心肌成形术起到促进作用。微点阵探测梗塞后心脏 的基因表达剖面发现单一使用低剂量本发明药物组可以使基因表达产生积 极变化，包括对抗炎、抗凋亡、抗纤维化基因的增量调节，因此，认为使用 本发明药物组千预能改善急性心肌梗塞后的局部微环境，从而显著提高植入 的骨髓间质干细胞的存活和分化能力。进而，本发明提供的实验数据还证明， 使用本发明药物组干预可以有效改善急性心肌梗塞后的局部内环境，对运用 自体骨髓间质干细胞进行细胞心肌成形术起到促进作用，从而对骨髓间质干 细胞的移植的临床应用具有重要意义。
图l显微镜下四组实验动物梗死区的苏木素-伊红(HE)染色和马松 (Masson， s)三色染色。图片显示，第一组(对照组)、第二组(单一使 用低剂量本发明药物干预治疗)、第三组(单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗)均存在严重纤维化和炎性细胞浸润，梗死区基本没有心肌细胞存活； 然而，第四组(同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗)梗死 区纤维化和炎性细胞浸润较轻。图片A放大倍数为400X，图片B放大倍数为 40X。图2植入梗死心脏的骨髓间质干细胞的存活能力。图(A)显示，第三 组(单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗)几乎观察不到4'， 6二脒基-2-苯吲哚盐酸(DAPI)标记的移植细胞；第四组(同时使用骨髓间质干细胞移 植和本发明药物干预治疗)可以观察到较多DAPI标记的移植细胞；图(B) 显示，第三组(单一进行骨髓间质干细胞移植千预治疗)与第四组(同时使 用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗)的细胞存活能力存在显著统 计学差异。*P〈0.0001,图(A)的放大倍数为400X。图3植入体内的骨髓间质干细胞分化为心肌细胞和血管结构。图(A)和 图(B)显示，部分DAPI标记的细胞表达a-横纹肌肌动蛋白、心脏肌钙蛋白 T;图(C)显示，部分DAPI标记的细胞参与血管生成，表达血管平滑肌肌动 蛋白和血管内皮细胞特异性的因子WI。图(D)显示，第三组(单一进行骨 髓间质干细胞移植干预治疗)与第四组(同时使用骨髓间质干细胞移植和本 发明药物干预治疗)DAPI标记的细胞在心脏中成心肌分化比率的统计学比 较，两组植入细胞分化成心肌细胞的能力有显著差异。*P〈0.0001，图(A)、 图(B)和图(C)的放大倍数为400X。注图中MSCs为骨髓间充质干细胞， VWF为血管性假血友病因子，SM-actin为血管平滑肌肌动蛋白，Overlay表示前三张视野迭加的显色结果。图4活体内植入细胞的细胞间连接蛋白的表达。图(A)显示，DAPI标记 的细胞表达缝隙连接蛋白43(Cx43)。图(B)显示，第三组(单一进行骨髓 间质干细胞移植干预治疗)和第四组(同时使用骨髓间质干细胞移植和本发 明药物干预治疗)的缝隙连接蛋白43表达存在显著差异。'P〈0.0001,图(A) 的放大倍数为400X。注图中Overlay表示前三张视野迭加的显色结果。图5移植6周后梗死区及梗死周边区的毛细血管密度。移植6周后，第二 组(单一使用低剂量本发明药物干预治疗)、第三组(单一进行骨髓间质干 细胞移植干预治疗)与对照组梗死区及梗死周边区的毛细血管密度无显著差异CP〉0.05, ** P〉0.05)，但均低于第四组(同时使用骨髓间质干细胞移植 和本发明药物干预治疗)(分别为"P〈0.0001， fl#P〈0.0001)。图6用单光子发射计算机断层摄影(SPECT)检测移植一周后和移植六周 后的心肌灌注缺损面积。图(A)显示每组的SPECT代表图形。图(B)移植 一周后初始的SPECT结果显示四组间灌注缺横面积无显著差异0^0. 984)。移 植六周后，第四组(同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗) 灌注缺损面积显著减少至22. 1±9,3%，与对照组、第二组(单一使用低剂量本发明药物干预治疗)、第三组(单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗) 相比有显著差异(n=7, *P<0. 0001)。图7本发明药物的抗凋亡作用。(A)猪心脏梗死周边心肌抗结合蛋白抗 体和脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷(dUTP)缺口末端标记法 (TUNEL)检测胞核内DNA断裂的凋亡细胞。在考察终点，第2组(单一使用 低剂量本发明药物干预治疗)和第4组(同时使用骨髓间质干细胞移植和本 发明药物干预治疗)梗死周边有较少的凋亡胞核(红箭头)。放大倍数X20. (B) 4组间凋亡指数统计。与对照组比较，第2组(单一使用低剂量本发明药 物干预治疗)凋亡心肌明显减少(*P〈 0.0001)。而且第4组(同时使用骨髓 间质干细胞移植和本发明药物干预治疗)凋亡指数明显少于第2组(单一使 用低剂量本发明药物干预治疗)(SP 〈 0.0001)。但是与对照组比较，第3 组(单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗)凋亡指数没有显著性差异 (**P=0. 289)。图8实验终点梗死周边心肌氧化应激水平检测。(A)第2组(单一使用低 剂量本发明药物干预治疗)和第4组(同时使用骨髓间质干细胞移植和本发 明药物干预治疗)超氧化物歧化酶(SOD)活力较对照组显著升高CP 〈 0. 05, #P〈0.05)。但是第3组(单一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗)与对照组 比较没有显著性差异(，=0. 449) 。 (B)第2组(单一使用低剂量本发明药物 干预治疗)和第4组(同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明药物干预治疗) 丙二醛(MDA)含量较对照组显著减少rP 〈 0.05， SP 〈 0.05)。第3组(单 一进行骨髓间质干细胞移植干预治疗)和对照组之间没有显著性差异(P = 0.195)。
具体实施方式
实施例l:本发明药物的制备a) 原料药配方为-人参55克 水蛭103. 75克 土鳖虫68. 75克 乳香(制)22. 5克 赤芍47. 5克降香23. 75克 檀香22. 5克 全蝎68. 75克蝉蜕68.75克蜈蚣13.75克冰片13. 75克 酸枣仁(炒)46.25克；b) 药材粉碎工艺-将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净 选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上; 粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于 30-40 Mm;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；c) 提取浓縮和干燥工艺降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎 煮二次，每次3小时，合并水煎液，水提液过滤后，待浓縮成浸膏；人参用 适量7096的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再 用水提取，醇提液浓縮成相对密度为0.9 1.1(6(TC)醇提浸膏，水提液过滤 与上述所有水提液混匀后浓縮至相对密度为0.9 1.1(6(TC)的清膏，备用；d) 制剂工艺在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入 制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发 油，混匀后由胶囊充填机充填，制成1000粒胶囊。本发明药物的用量，按活性组分原料药总重量计，为每次2-4粒， 每日服用三次。实验例本发明药物在运用骨髄间质干细胞的促进作用 材料与方法实验动物IO月龄的中华小型猪，体重(30kg士5kg)，由中国农业大学实验 动物中心提供。所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。并且，所有实验方案均得到了中国医学科学院实验动物管理委员会和中国协和医科大学阜外心血管病医院实验动物伦理委员会的认可。猪骨髓间质干细胞的分离和培养肌肉注射氯胺酮和地西泮对猪进行麻醉，两种药物剂量分别为25mg/kg 和lmg/kg。在无菌操作下对猪的左髂嵴处备皮、铺单，用含12， 500单位肝素 的注射器抽取约50ml骨髓。所有实验动物在送回饲养间之前均肌肉注射丁丙 诺啡O. 3mg止痛。骨髄间质干细胞的分离和培养按照以前报道的方法略作修改。简要的说， 抽取的骨髓用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍，加入硅石胶态悬浮液(Percoll分 离液，1.077g/ml， Sigma公司)，在4。C条件下，800g离心30分钟分离出单 个核细胞。细胞沉淀物用PBS冲洗2次，后以5Xl(Z/cn/的密度铺于正常培养 基[含低葡萄糖DMEM (Gibco公司)，10%胎牛血清(Gibco) ， 100U/ml青霉素和 链霉素]上，置于37。C、含5%二氧化碳的潮湿培养箱中培养。三天后，通过 更换培养基去除造血细胞、成纤维细胞和其它非贴壁细胞。保留下的贴壁的 纯化骨髄间质干细胞进一步培养增殖。实验过程中每三天更换一次培养基。 经过10天培养，贴壁细胞形成均一的细胞克隆。当贴壁细胞达到80%融合后， 加入0.25%胰酶-0.02% EDTA液(Sigma)使其重新悬浮，以l: 3的比率传代进 行进一步培养。心肌梗塞模型，移植细胞的制备及本发明药物组的促进作用28头中华小型猪平均分为4组第一组为对照组，n=7、第二组(单一使 用低剂量本发明药物组干预治疗，n=7)、第三组(单一进行骨髓间质干细 胞移植干预治疗，n=7)和第四组(同时使用骨髓间质干细胞移植和本发明 药物组干预治疗，n二7)。在细胞达到80%融合后，将其从培养瓶中分离，在含109&胎牛血清的DMEM (GIBCO)培养基中使其重新悬浮，用4'，6二脒基-2-苯吲哚盐酸(DAPI) (50 Ug/ml， Sigma)在37X:条件下标记30分钟。将细胞在PBS液中洗涤6次去除未 结合的DAPI，然后每个实验动物选取3 X1(/个细胞置于温暖的DMEM中保存数 分钟后进行移植。标记过程非常重要，需确保所有的移植细胞核着色。肌肉注射氯胺酮和地西泮对猪进行麻醉，两种药物剂量分别是25mg/kg 和lmg/kg，气管插管，连接机械呼吸机进行人工通气，通过血管内注射氯胺 酮和地西泮维持麻醉。沿胸骨正中线开胸，分离冠状动脉左前降支(LAD)至 第一对角支，并用塑胶套管结扎，确保局部缺血部位的形成。冠脉结扎前静 脉注射利多卡因2mg/kg，后持续静脉内给药直至手术结束，持续剂量为 0. 5mg/min。阻塞冠状动脉左前降支(LAD)90分钟形成心肌梗死/再灌注模型。再灌注后30分钟，在每个实验动物的梗死区及其周边区注入自体骨髓间 质干细胞(3Xl(/个细胞)悬浮液500u 1。对照组动物注入等体积的DMEM液。移植结束后，关闭胸腔，同时放置一个18F纵隔导管以重建胸腔内负压并 引流残留血液和灌洗液。此后，停止使用麻醉剂，在适当时候拔除气管插管 使伤口愈合。在没有气体渗漏或残余血液的时候拔除胸部导管。所有实验动 物术后均接受抗菌治疗，肌肉注射先锋霉素Vl.O，每天两次，连续三天； 同时肌肉注射丁丙诺啡止痛，每天两次，每次0.3mg，连用三天。根据既往实验研究确定的剂量，从实施骨髓间质干细胞移植前三天至移 植后四天喂养本发明药物进行干预治疗，使用剂量为0.05 g*kg d。 核磁共振影像(MRI)在细胞移植一周后和六周后分别采用电影MRI和增强MRI采集实验动物心 功能参数。采用临床使用的配有射频接收线圈的l. 5T磁共振成像扫描机(西 门子，德国(Siemens, Germany))进行核磁共振成像。肌肉注射氯胺酮和 地西泮对实验动物进行麻醉，剂量分别是25mg/kg和lmg/kg。 MRI采用无线心 电门控自旋回波。电影MRI和相应的增强MRI每4mm扫描一层，自二尖瓣水平 开始， 一共6-8层。测定横向和矢向视图以确定短轴的正确位面，每60°确 定一个长轴的影像。联合使用全聚焦稳态快速梯度回波(TrueFisp)脉冲序 列与敏感度编码(TSENSE)平行成像技术获取电影MRI影像。典型成像参数 如下循环时间(TR) =41.7ms，回波时间(TE) =1. 39 ms，带宽(BW)二965 Hz/PX，翻转角度(FA) =48° ，影像矩阵409X 192，空间分辨率=3. 2咖X2. 0 mm，层厚(SL)二6.0mm，平行因素=3。采用TSENSE成像技术的回波成像元件 来获取3-4短轴位的第一次流程灌注图像和一张四室图像(TR=6.0ms， TE= 1.22 ms， FA = 30° ，空间分辨率=2.8咖X2.8mm， SL = 10.0咖，平行因素=2，每次心搏4-5张图像，所有的层面均为一次饱和前脉冲)。第一轮扫描 获取约60个心动周期的图像。将O. 1 ramol Gd-DTPA(先灵公司(Schering)) 用20 mL 0. 9% NaCl冲洗(流速4mL/s)。灌注后静脉注射O. lmmol/kg马根维显 溶液，5分钟后静脉注射0. 2ranol/kg 二亚乙基三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)， 而后直接进行增强MRI摄影。使用反转恢复(PSIR)闪光序列完成T1加权， 运用PSIR技术对T1进行调整。典型图像参数如下TR=700ms， TE=4.8ms, BW:130kHz，平面分辨率二1.8X1. 3mm，图像矩阵二156X256， SL:8咖。移植 干细胞后6周再次拍摄所有电影MRI和增强MRI图像。根据解剖学定位使此次 拍摄的短轴切片与第一次基线拍摄的相对应。另外，为提供健康对照，5只 假手术组动物采用相同的MRI实验设计进行研究。 单光子发射计算机断层摄影(SPECT)为测定心肌灌注缺损面积，在细胞移植一周后与六周后对心肌进行单光99ra子发射计算机断层摄影。静注锝-甲氧基异丁基异腈296MBq(8mCi)， 45-60 分钟后用Y照相机进行心肌断层显像。采用低能耗双探头Y照相机(法瑞克 姆，通用公司(Varicum， GE))，配有20%能量窗口的高分辨率准直器，置 位于到140KeVY峰值。每桢采集40s、 32个影像，采集矩阵64X64，投照范 围从右前斜45。 ~左后斜45° ，共180° 。 SPECT重建采用巴特渥斯 (Butterworth)低滤波，截止频率0.45，类型为5，通过对心脏轴进行调整， 重建心脏短轴、垂直长轴、水平长轴三个轴面的图像数据。采用闪烁法的牛 眼技术计算灌注缺损面积。 组织学分析为检测移植的骨髓间质干细胞成心肌和血管分化潜力，对心肌冰冻组织 切片进行荧光免疫分析，以5nm厚度连续切片。检测的抗体包括血管内皮 细胞特异性的因子M(VWF 1:50, DAK0) 、 a -血管平滑肌肌动蛋白(SM-actin， 1:50，DAK0)、 a-横纹肌肌动蛋白(1:50, DAKO)、心脏肌钙蛋白T(cTn-T， 1:50， Sigma)、缝隙连接蛋白43(1:50， Sigma)。切片经PBS漂洗后，用罗丹明或异 硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠或兔IgG孵育。最后，在激光扫描共聚焦显微镜 下观察拍照。测定体内移植的骨髄间质干细胞的存活和分化能力，自心尖至心底将左心室横断切成8片，每片随机选取5张5-!xm厚的冰冻切片。在荧光显微镜下， 每张冰冻切片随机选取5个视野进行观察并计数对DAPI和cTn-T呈阳性的细 胞。对cTn-T呈阳性的细胞被认为是分化的心肌样细胞。在梗死都位随机逸 取5张切片测定缝隙连接蛋白43的细胞间染色密度，并运用图像分析系统进 行分析。测定梗死区及梗死周边区的毛细血管密度，组织制备方法为Weidner N， Semple JP, Welch WR， Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis -correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 1991; 324:1- 8. [PMID: 1701519] (Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. 侵入性乳腺癌中肿瘤血管发生和转移相关性.新格兰医学杂志，1991; 324:1- 8.)所记载。用VWF抗体(1:200， DAK0)对切片进行染色。从每个试验动 物的梗死区和梗塞周边区域分别选取5张和8张切片，由一名未参与细胞处理 的研究人员进行分析，计数阳性染色的血管。从每张选取的切片中随机选取 5个高倍视野进行计数，结果用每个高倍视野下的毛细血管数目来表达。 脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷(dUTP)缺口末端标记法(TUNEL) 检测细胞凋亡我们用TUNEL分析法(罗氏，德国)检测心肌组织中细胞凋亡情况， 在实验终点时，获取所有动物梗死周边区域的心肌组织切片，石蜡切片用 胰酶消化脱蜡，与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和荧光素标记的dUTP在 37"C湿箱中孵育60分钟。然后与氢化荧光素共轭的碱性磷酸酶特异性抗体 孵育30分钟，T丽EL染色用3， 3 — 二氨基联苯胺(DAB)显色，含有DNA 断裂片断的胞核被染成蓝色。为了检测切片中凋亡胞核的比例，组织用心 肌特异性的结蛋白(Desmin)单克隆抗体复染(1:100， DAK0)，组织切片在 400倍显微镜下观察，最少在8个高倍视野下计数100个以上的心肌细胞， 凋亡指数(apoptotic index)为凋亡的心肌细胞占视野中心肌细胞总数的百 分比。抗氧化酶活性和脂质过氧化物为了检测梗死心肌的氧化应激水平，我们在实验终点时获取梗死周边 心肌组织，超氧化物歧化酶用黄嘌呤氧化法检测(南京建成公司)，脂质过氧化物用硫代巴比妥酸法检测的心肌丙二醛水平表示(南京建成公司)。 统计分析连续变量用均数士标准差表示，用卡方检验(x2)对第三组和第四组分 化率的组间差异进行分析。对数据进行方差齐性检验和正态分布评估，而后 进行方差分析，确定各组在各个分析阶段(移植后一周为基线检测，移植后 六周为终点检测)存在的差异，以移植一周后数据为参照对移植六周后数据进行分析。用最小显著差异法(LSD)检验对两组间的多个参数进行对比。 用巴夫罗尼(Bonferroni)法校正，当/M). 05时，差异有显著意义。所有数 据均使用SPSS13. 0.进行统计分析。 结果在所有参数成功收集以前，对照组、第二组、第三组中各有一只动物死 亡，死亡动物数据未纳入统计分析。 组织学分析细胞移植6周后，HE染色显示，对照组梗死部位严重纤维化并出现慢性炎 细胞浸润，心肌细胞存活很少，第二组和第三组情况也同样如此。相比较而 言，第四组纤维化和慢性炎细胞浸润现象较轻，同时梗死区有心肌细胞存活 (图l)。观察发现，第四组DAPI标记的阳性细胞明显多于第三组(308.9士88.2对 73.2±21.3，代O. 0001)(图2A-B)。移植六周后，第三组和第四组的免疫荧光分析显示DAPI标记的阳性细胞 表达心肌和微血管特有蛋白，包括a-横纹肌肌动蛋白、心脏肌钙蛋白T、血 管性假血友病因子和血管平滑肌肌动蛋白，表明部分植入的骨髓间质干细胞 已经分化成心肌和微血管(图3A-C)。特别是第四组，其植入的骨髓间质干 细胞分化为心肌细胞的效率显著高于第三组(45.8士5. 1%对8.7±2.4%， 代O.OOOl)(图3 D)。此外，通过检测缝隙连接蛋白43的表达研究梗死区DAPI标记的阳性细胞 间的胞间连接。结果表明，第四组缝隙连接蛋白43的表达显著多于第三组 (16. 1±1.4对4. 7土1.8，代O.OOOl)(图4 A B)。 毛细血管密度根据VWF抗体的免疫组化染色测定梗死区及梗死周边区的毛细血管密度， 对照组与第二组、第三组比较，梗死区毛细血管密度无显著差异 (1.8±0.5/HPF对2.0±0.6对1.8±0.8，级05)，然而，与第三组相比， 第四组梗死区的毛细血管密度增加了105y。(3.7士1.0/HPF，代O.OOOl)。第四 组梗死周边区的毛细血管密度为8.9士1.9/HPF，显著高于其它三组 (4.9±1.3/HPF， 5.1 ±0.9， 5.2±1.4,代O. 0001)(图5)。 核磁共振影像与单光子发射计算机断层摄影每组共取36个节段进行分析，计数运动障碍节段以分析室壁增厚率。移 植一周后，对照组、第二组、第三组、第四组的36个节段中运动障碍节段分 别为8. 2±3. 0、 8. 3±3. 1、 8. 7±3. 9、 8. 9±3. 6，分别占各组总数的22. 8%、 23.1%、 24.2%与24.7%，各组间无显著差异(/M). 983)。所有的运动障碍节段 被用来计量局部的室壁增厚率。移植一周后，其它参数，包括局部室壁增厚 率(/M).915)、左心室射血分数(LVEF， /M). 996)、梗死面积(/M). 991)、左 室舒张末期容积(EDV， /M).852)、左室收縮末期容积(ESV， /M). 990)、左室 质量指数(LVmass index, /M). 791)，在4组间比较无显著差异。移植6周后， 与对照组相比，第四组的心功能各项参数除EDV和ESV外均有显著改善 (代O. 0001)。各组左室功能及心室几何结构的改变见表l。表l移植一周后与六周后左室功能和结构的MRI结果分组左室射血 分数(％) EDV障(%)基线终点基线终点基线42.6±43.9± 7.643.3±44.8±43.5±17.97.98.50.057.8±66.2±58.2±65.8±56.8±65.86.85.85.6.933.5±37.3±33.3±36.7±32.7±97.67.57.78.3.68.2±7.7±8.3±7.5±8.7±3.02.43.02.33.9-25.5-27.5-27.2-25.7±1-23.0±17.2±15.7±15.64.0±14.53终点 45.7± 9.6# 63,5±6.3 # 35.0± 9.5 # 7.8±3.4 # -20.2± 12.8 #442.7±7.6* 55.1± 8.2* 32.1± 9.2* 8.9± 3.6* -25.9± 14.1 *终点 50.0± IO.I絲 64.6± 7.5 ** 32.8± 10.1 ** 4.9± 1.8 ## 35.9± 10.8 ##WW: ^动节壁度w S加运碍室厚梗塞面 6.6± 6.7± 7.0± 7.1± 6.8± 7.0± 6.5± 3.3±积(cm2) 2.0 2.1 2.2 2.3 2.1 2.1 # 2.3* 1.8絲左心室 64.7± 77.8±8. 63.2± 76.2± 60.2±7 76.0± 60.8± 66.4±质量指数6.3 1 8.1 8.1 .9 5.4# 8.4* 8.1 ##基线表示移植一周后；终点表示移植六周后；LVEF表示左室射血分数；EDV表示左室 舒张末期容积；ESV表示左室收縮末期容积；运动障碍节段(Dyskinetic segments);室 壁增厚率(Wall thickening);梗死面积(Infarct size));左心室质量指数(LV mass indes);'PX). 05(移植一周后四组间比较)；卞〉0. 05(移植六周后对照组与第二组间比较)； ，〉0.05(移植六周后第二组、第三组的舒张末期容积和收縮末期容积与对照组比较)；w P<0. 0001 (移植六周后第二组、第三组与对照组间比较)图6包含了移植一周后和移植六周后用来检测灌注缺损面积的典型的 SPECT图像。最初的移植一周后的SPECT结果显示四组间无显著差异(分别为 50. 7±14. 5%对52. 7±15. 5%对51.8±16. 5%对49.4±16. 0%, /M). 984)。移植 6周后，实验终点SPECT显示对照组、第二组、第三组的平均灌注缺损面积分 别变为47.8土11.1%、 50. 7± 12.5%、 47. 3±13. 2%(n=6，卢O. 899)，而第四 组的平均灌注缺损面积为22. 1 ±9. 3%，较前三组显著减少(n=7，代O. 0001)。 梗死心肌周围细胞凋亡通过对肌细胞特异标记物结合蛋白和DNA末端标记相伴染色，与对照 组比较本发明药物组，包括第2组和第4组，梗死左心室凋亡细胞显著减 少，(凋亡指数6.1 ± 1.4， 2.4 ± 0.9对10.1 ± 1.8，尸< 0.0001)， 而且第4组的凋亡指数也显著少于第2组(尸〈0. 0001)。然而第3组的凋 亡指数与对照组比较无显著性差异(/M).289)(图7) 氧化应激水平的评估在实验终点，第2组和第4组梗死周边心肌S0D活性显著高于对照组，(98. 7 ± 9. 8, 105. 1 ± 7. 0对83. 4 ± 8. 8 U/mg蛋白，尸< 0. 05)，表明本发 明药物组用药能增强自由基清除能力，然而第3组和对照组之间无显著性差 异(87.4 ± 10.2 U/mg蛋白，尸=0.449).与之对应的是，第2组和第4组梗死心肌MDA含量较对照组明显减少(6. 1 ±0.7， 6.0 ± 0. 6对9. 0 ±0.8 nmol/mg蛋白，户〈0. 05)，提示本发明药物组能显著减轻脂质过氧化及其引起的细胞损害，对照组与第3组之间没有显著性差异(8.5士0.8nmol/mg蛋 白，尸=0. 195)(图8).讨论本试验研究表明(1)急性心肌梗死/再灌注后立即心肌内注射自体骨 髓间质干细胞，移植细胞在活体内存活、分化能力有限，未对梗死后心脏产 生显著的功能学获益；(2)短期内单一使用低剂量本发明药物也不会对梗 死后心脏产生显著的功能学获益，然而，在使用本发明药物组的基础上，急 性心肌梗死/再灌注后立即心肌内注射骨髓间质干细胞，移植细胞在活体内 的生存和分化能力较单纯移植组显著增强，同时本发明药物和干细胞移植联 合还能减少梗死面积、促进血管生成、改善心肌功能、逆转心室重构。本实验最重要的发现是在短期内使用低剂量本发明药物组干预的基础 上，急性心肌梗死及再灌注后立即心肌内注射骨髓间质干细胞，植入细胞在 活体内的生存和分化能力较单一植入的骨髓间质干细胞显著增强，同时对改 善心功能具有显著作用。这表明，干细胞的移植、存活和分化对急性心肌梗 死后的心肌微环境有很强的依赖性。本实验表明，与单纯移植骨髓间质干细胞组相比，联合使用本发明药物 和骨髓间质干细胞移植组植入细胞的存活和分化显著提高，此外，单纯使用 低剂量本发明药物组未显著改善心功能。基于上述实验结果，我们可以推断， 本发明药物组对急性心肌梗死后局部微环境的改善提高了植入细胞的存活 率和生物活性。尽管单纯使用低剂量本发明药物本身不会产生明显的疗效， 但它能显著提高植入的骨髓间质干细胞的存活和分化能力。本实验结果表 明，短期内使用低剂量本发明药物组干预对运用自体骨髓间质干细胞进行细 胞心肌成形术起到促进作用。微阵列基因芯片技术探测梗死后心脏的基因表 达谱发现单一使用低剂量本发明药物组可以使基因表达产生积极变化，包括 对抗炎、抗凋亡、抗纤维化基因的上调(数据未显示)。基于以上研究，我 们认为短期内使用低剂量本发明药物能改善急性心肌梗死后的局部微环境， 从而使植入的骨髓间质干细胞稳定存活和分化。综上所述，我们首次发现短期内使用低剂量本发明药物可以有效改善急 性心肌梗死后的局部微环境，对运用自体骨髓间质千细胞进行细胞心肌成形 术起到促进作用，对骨髓间质干细胞的移植的临床应用具有重要意义。
权利要求
1. 一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成人参3-10 水蛭3-11 土鳖虫5-10 乳香(制)1-5 赤芍3-9 降香1-5檀香1-5 全蝎3-9 蝉蜕3-12 蜈蚣1-3 冰片1-7 酸枣仁(炒)3-10。
2. 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原 料药制成人参6水蛭10土鳖虫7乳香(制)2赤芍5 降香2 檀香2全蝎7 蝉蜕7 蜈蚣1 冰片5 酸枣仁(炒)5。
3. 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原 料药制成人参10水蛭8土鳖虫7乳香(制)2赤芍5 降香2 檀香2全蝎9 蝉蜕7 蜈蚣1 冰片5 酸枣仁(炒)5。
4. 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原 料药制成人参6水蛭11土鳖虫7乳香(制)2赤芍5 降香2 檀香2全蝎3 蝉蜕7 蜈蚣1 冰片5 酸枣仁(炒)5。
5. 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原 料药制成人参5.5 水蛭10.375 土鳖虫6.875乳香(制)2.25赤芍4.75 降香2.375 檀香2.25 全蝎6.875蝉蜕6.875 蜈蛇1.375冰片1.375酸麥仁(炒)4.625。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物的活性 成分由下列成分组成a平均粒径小于100 Mm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉；b冰片药粉；c由降香和檀香提取的挥发油；d人参用乙醇提取后的醇提液经浓縮后的醇提浸膏； e提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸枣仁加水煎煮 后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓縮成的水提浸膏。
7. —种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药 物中的应用，其特征在于含有权利要求l-5中任一项或权利要求6所述中任一 项中药组合物作为活性组分的药物制剂为胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软 胶囊剂或滴丸剂。
8. 如权利要求1-5中任一项或权利要求6所述的应用，其特征在于所述中药 组合物在制备用自体骨髓间质干细胞治疗心血管疾病的药物中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述心血管疾病为心肌梗死。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述心血管疾病为急性心肌梗 死。
全文摘要
本发明公开了一种中药组合物在制备促进骨髓间质干细胞在体存活和成心肌分化的药物中的应用。本发明还涉及该中药组合物在制备用自体骨髓间质干细胞治疗心血管疾病的药物中的应用。
文档编号A61P9/00GK101229241SQ200710002670
公开日2008年7月30日 申请日期2007年1月26日 优先权日2007年1月26日
发明者杨跃进, 钱海燕 申请人:河北以岭医药研究院有限公司