专利名称：治疗重症肌无力的方法
治疗重症肌无力的方法
技术领域：
本发明涉及结合4傳蛋白C5的药剂在治疗与不适当的补体激活有关 的疾病尤其是在治疗重症肌无力中的用途。
在本文中提及的以及在说明书结尾所列的所有文献通过参考并入本文。
背景技术：
补体系统是身体抵抗外来入侵的天然防御机制的基本组成部分，并且 还参与炎症过程。在血清中和细胞表面有超过30种蛋白质参与补体系统功 能和调节。最近，已经清楚，有 35种已知的补体系统成员可以与有益过 程和病理过程相关联，补体系统本身与至少85种具有不同功能的生物学途 径相互作用，比如血管发生、血小板活化、葡萄糖代谢和精子发生 (Mastellos， D., et al" Clin Immunol, 2005.115(3) p.225画35 )。
外源抗原的存在激活补体系统。存在三种激活途径(l)通过IgM和 IgG复合物或者通过糖类识别激活的经典途径；(2)通过非自身表面(缺 少特异性调节分子)和通过细菌内毒素活化的旁路途径；和(3 )通过结合 甘露聚糖的凝集素(manna-bindinglectin, MBL)与病原表面上的甘露糖 瓶基结合激活的凝集素途径。这三种途径包括并行级联事件，其通过在细 胞表面上形成相似的C3和C5转化酶导致产生补体激活，从而导致急性炎 症介质(C3a和C5a)释放和膜攻击复合物(MAC)的形成。在图1中显 示涉及经典和旁路途径的并行级联。
在某些情形下补体可以被不适当地激活，导致不希望的局部组织破坏。 已显示出不适当的补体激活在许多种疾病和病症中起作用，所述疾病和病 症包括急性m炎、阿耳茨海默氏病、变应性脑脊髓炎、异体移植、哮喘、 成人型呼吸窘迫综合征、烧伤、克罗恩氏病、肾小球肾炎、溶血性贫血、 血液透析、遗传性血管性水肺、缺血再灌注损伤、多系统器官衰竭、多发 性硬化、重症肌无力、缺血性卒中、心旨塞、银屑病、类风湿性关节炎、 感染性休克、系统性红斑狼掩、中风、血管渗漏综合征、移植排斥和心肺 旁路术中不适当的免疫应答。因此，多年以来不适当激活的补体系统被作 为治疗性介入的耙标，耙向补体级^lll应不同部分的多种补体抑制剂正在 开发用于治疗用途。
在缺血性卒中和心肌梗塞中，身体识别脑或心脏中的死组织作为外源 物并且激活补体，从而引起进一步的局部损伤。相似地，在心肺转流术中， 身体将仪器中的塑料表面识别为外源物，激活补体，可导致血管损伤。在
自身免疫疾病中，身体可以餘溪地将自身识别为外源物，激活补体，并引 起局部組织损伤(例如，在类风湿性关节炎中的关节破坏和在重症肌无力 中的肌无力)。
重症肌无力是一种慢性自身免疫病，导致进行性疲劳(progressive fatigue)、肌肉张力丧失和麻痹增加。这些症状是由补体的不适当激活所引 起的，其导致针对烟碱型乙酰胆喊受体(AchR)的免疫应答，其进而导致 神经肌肉传导减少。重症肌无力的发生可与其它疾病相关联，比如胸腺肺 瘤或曱状腺毒症，以及类风湿性关节炎和红斑狼疳。
目前对于重症肌无力还不能治愈。起初通常应用帮助改善神经肌肉传 导和增加肌肉力量的抗胆碱酯酶剂比如溴新斯的明(Prostigmin)和溴吡 斯的明(Mestinon)治疗该病。然而，应用抗胆喊酯酶剂的治疗与由乙酰 胆碱累积引起的有害副作用相关，包括胃肠不适和支气管和口腔分泌物增 加。此外，尽管抗胆喊酯酶剂通常提供症状上的改善，但是它们对该疾病 的病程没有作用。对抗胆碱酯酶剂没有反应的患者还可以应用长期免疫抑 制药物比如皮质类固醇泼尼;f^或者其它免疫抑制药物比如环孢霉素、硫唑 噪呤和环磷酰胺进行治疗。不过，这些免疫抑制药物与严重的副作用有关。
皮质类固醇类的副作用包括体重增加、骨质疏松、高血压和青光眼。硫唑 噤呤和环孢霉素与肝功能障碍和恶性肿瘤风险增加相关。在一些情形中， 推荐胸腺切除术作为药物的替代方案，但是其反应是不可预测的并且在术 后所述疾病症状可持续数月或数年。
通过用纯化的AChR或抗AChR抗体免疫可以在动物模型中诱导实验 性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)，这些模型可用于评价补体抑制剂对所述疾病逸艮的作用。补体 抑制剂可溶性补体受体1 (sCRl)已经显示出延迟体重减少和减轻EAMG 的临床体征，it^明这种分子可用于治疗重症肌无力(Piddlesdenetal.， J. Neuroimmunol.， 1996， 71:173-177)。然而，为达到这些效果必需每天注射 sCRl,并且尽管sCRl降低了体重减轻，但是不能完全地阻止。因此sCRl 不能完全地阻止重症肌无力的症状。
此夕卜，sCRl通过结合补体级^l^应的早期产物C3b和C4b发挥作用
补体系统在防御病原体中发挥重要的和有价值的作用，该级^应的许多 早期副产物在病原微生物的识别和调理作用中是重要的。因此，认为在经 典和旁路途径的较早阶段进行治疗性介入具有增加微生物感染易感性的
风险(Roos， A., et al" Immunobiology， 2002, 205(4-5): p. 595-609 )。 因此，非常需要用于改善目前可用的重症肌无力治疗的药剂。
发明内容
因此，本发明提供了一种治疗或预防重症肌无力的方法，其包括向有 此需要的对象施用治疗或预防有效量的结合补体C5的药剂。
本发明还提供治疗或预防有效量的结合补体C5的药剂在制备用于治 疗或预防重症肌无力的药物上的用途。
优选地，所述药剂具有阻止C5转化酶将补体C5切割成补体C5a和补体 C5b-9的作用。
补体C5蛋白，在本文也被称为C5，由C5转化酶所切割，其本身是 从C3a形成的，C3a是所述旁路途径的一种较早期产物(图1 )。这种切割 产物包括过敏毒素C5a和裂解复合物C5b-9，其也被称为膜攻击复合物 (membrane attack complex, MAC), C5a是一种高活性肽，其涉及许多 病理炎症过程，包括嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞趋化性、嗜中性粒细胞 活化、毛细血管通透性增加和嗜中性粒细胞凋亡抑制(Guo， R.F. and P.A. Ward, Annu Rev Immunol, 2005， 23: p. 821-52 )。
MAC与其它一些重要的病理过程相关，包括类风湿性关节炎 (Neumann, E.， et al" Arthritis Rheum， 2002. 46(4): p. 934-45; Williams, A.S.， et al.， Arthritis Rheum， 2004， 50(9): p. 3035-44 )、增生性肾小球肾炎 (Quigg， R. J.， Curr Dir Autoimmun, 2004. 7: p. 165-80 )、特发性膜性肾病 (idiopathic membranous nephropathy) (Papagianni， A.A., et al" Nephrol Dial Transplant, 2002,17(1): p. 57-63 )、蛋白尿(proteinurea)(He， C， et al.， J Immunol, 2005.174(9): p. 5750-7 )、急性轴突损伤后的脱髓鞘病(Mead， R. J" et al., J Immunol, 2002. 168(1): p. 458-65)并且还引起异种移植后的急 性移植物排斥(Nakashima， S., et al" J Immunol, 2002.169(8): p. 4620-7 )。
C5a已成为补体相关病症领域中特别关注的乾标(Mizuno， M. and D.S.
Cole, Expert Opin Investig Drugs, 2005. 14(7): p. 807-21 )。尽管C5a具有 许多被充分认可的病理学相关性，但是在人体中去除C5a的影响似乎比较 有限。已经开发出结合并抑制C5a或C5a受体的单克隆抗体和小分子来治 疗多种自身免疫疾病。然而，这些分子不能阻止MAC的释放。
相对而言，根据本发明第一方面施用结合C5的药剂既抑制C5a肽又 抑制MAC。意想不到的是，发现对C5a和MAC的抑制完全地减轻了与 重症肌无力有关的临床症状。此外，因为C5是经典和旁路补体途径的晚 期产物，所以对C5的抑制更少可能与并发感染的风险相关，而这种风险 在把向所述级:iill应的较早期产物时是存在的(Allegretti, M., et al., Curr Med Chem， 2005.12(2): p. 217-36 )。
通过本领域已知的标准体外测定，例如在将^上的蛋白质与已标记 的C5 —起孵育之后进行western印迹，可以确定药剂结合C5的能力。优 选地，根据本发明的药剂以小于0.2mg/ml、优选小于O.l mg/ml、优选小 于0.05 mg/ml、优选小于0.04 mg/ml、优选小于0.03 mg/ml、优选0.02 mg/ml、优选小于lfig/ml、优选小于100 ng/ml、优选小于10 ng/ml、更优 选小于1 ng/ml的IC5(>结合C5。
优选地，结合C5的所述药剂来自食血节肢动物。术语"食血节肢动物" 包括所有从适合的宿主摄血为食的节肢动物，比如昆虫、蜱(ticks )、虱 (lice)、跳蚤(fleas)和螨(mites )。优选地，所述药剂来自于蜱、优选 源于毛白純缘蜱(Oi7i///r<w/wYW附仰to")。
根据本发明的一个实施方案，结合C5的所述药剂是一种包含图2中 M酸序列第19至168位氨基酸的蛋白质，或者是此蛋白质的功能等价物。 结合C5的所述药剂可以是由图2中M酸序列第19至168位M酸组成 的蛋白质，或者是此蛋白质的功能等价物。
根据一个替代实施方案，根据本发明此实施方案使用的蛋白质可以包 含图2中Jl^酸序列第1至168位JL&酸或者由其组成，或者是其功能等 价物。在图2中给出的蛋白质序列的前18个M酸形成对于C5结合活性 并非必需的信号序列，因此，可以任选地将其舍弃，例如为了重组蛋白质 生成的效率。
具有图2中给出的M^列的蛋白质，在本文中也被称为EV576蛋白，分离自毛白钝缘蜱的唾液腺。EV576是脂质运载蛋白(lipocalin)家 族的较远成员(outlying member),是第一个显示出抑制补体激活的脂质 运载蛋白家族成员。通过结合C5并阻止C5转化酶将其切割成补体C5a 和补体C5b-9，从而抑制C5a肽和MAC的作用，EV576蛋白抑制旁路、 经典和凝集素补体途径。本文使用的术语"EV576蛋白"是指有或没有信号 序列的图2中给出的序列。
在WO2004/106369中公开了 EV576蛋白和这种蛋白质抑制补体激活 的能力，其中EV576蛋白被称为"OmCI蛋白"。现已发现EV576蛋白在 治疗和预防重症肌无力中出乎意料的有效。本文给出的数据证明，单注射 EV576在至少7天中完全地减轻了 EAMG小鼠的体重降低和肌无力。因 此，EV576比sCRl在治疗和预防EAMG中更加有效，如上所述，sCRl 在每天施用时只减轻重症肌无力的临床症状(Piddlesden et al， J. Neuroimmunol.， 1996， 71:173-177 )。 EV576在治疗重症肌无力中出乎意料
此外，本文给出的数据证明rEV576在早期轻度重症肌无力和晚期严重重 症肌无力危M型中是有效的。
根据本发明的另一实施方案，所述药剂可以是编码EV576蛋白或其功 能等价物的核酸分子。例如，可以应用基因疗法实现在体内或者离体由对 象的相关细胞内源性产生EV576蛋白。另一方法是施用"棵DNA"，其中
治疗基因被直接注入血流或肌肉组织中。
优选地，这种核酸分子包含图2中核苷,列的第53至507位a， 或者由其组成。该核普酸序列编码没有信号序列的图2中的EV576蛋白,
列。或者，所述核酸分子可以包含图2中核酸序列的第1至507位碱基， 或者由其组成，所述核酸分子编码具有信号序列的所述蛋白质。
已证明EV576蛋白在大鼠、小鼠和人血清中结合C5并阻止C5转化 酶对其的切割，其具有约0.02 mg/ml的IC别。优选地，EV576蛋白的功能 等价物保留有结合C5的能力，其IC知值小于0.2 mg/ml、优选小于0.1 mg/ml、优选小于0.05 mg/ml、优选小于0.02 mg/ml、优选小于l照/ml、 优选小于100ng/ml、优选小于10ng/ml、更优选小于lng/ml。
已发现在大鼠中1251标记的EV576的血清p半衰期为30-38小时。优
选地，EV576蛋白和其功能等价物保留大于20小时、优选大于25小时、 优选大于30小时、优选大于40小时、优选大于50小时、优选大于100 小时的半衰期。
在一个方面，本文使用术语"功能等价物"描述EV576蛋白的同源物和 片段，其保留结合C5并阻止C5转化酶将补体C5切割成补体C5a和补体 C5b-9的能力。术语"功能等价物"也表示在结构上相似于EV576蛋白的或 者含有相似或相同三级结构(尤其是在结合C5的EV576蛋白的一个或多 个活性位点环境中)的分子，比如合成的分子。
术语"同源物"意指包括由图2明确所示的EV576序列的旁系同源物 (paralogues )和直系同源物(orthologues ),包括例如来自其它蜱物种的 EV576蛋白序列，所述蜱物种包括具尾扇头蜱(i^i》/c印^/ns
)、嚢状扇头蜱(及.6"r糊)、
美洲钝目艮蜱(j. fl附eWcawM柳)、卡)^钝目艮蜱(」.cfl>wwe/iw )、希伯来钝3艮 蜱(爿.Zre6n^w附)、微'J、牛蜱(w,Vtv/;/ws )、具环牛蜱(及 aw舰/"似s )、 消色牛碑(fifeco/om似s )、 网紋革碑(De環flce"tor rW/cw/fl似s )、安德逊氏革蜂(D. ""rferao",')、边缘革蜂(D.附"rg/""似s )、 变异革蜂(".v""Vi緣's )、铁角血蜂(1Tfl側fl/7/y;s"/i's /"e簡/s )、 /e"c/w7、 ^ ./|"/1""似、小亚璃8艮蜱(母fl/o挑附fl )、骆雜璃目艮
碑(母.</ wfi^/an7 )、边缘璃目艮蜂(场.附flrgi7ia似附maf^/"a似m )、蓖子硬 蜱(/xorfes )、全沟硬蜱(/ /;^sw/c"似s )、肩突硬蜱(/ )、
六角形硬蜱(/ Aexfl^m"s)、波斯锐缘蜱(爿^"s/^m'c"s)、鸽锐缘蜱(A f^/ ems)、 Oi7i/f/w^ww e/r"f/c"s1、 毛白純缘蜂(O.附o"6a似附做办她)、 a附.；wfd"ws、和asflv/gwy/。术语"同源物"意思包括来自蚊物种，所述 蚊物种包括库蚊属(C"/狄)、按蚊属(v4wfl^/^/^)和伊^>^ (j^/w)、尤 其是致乏库坟(Cw/ex:拜Vt《"e/as"'a似s )、埃及伊坟(爿^/es fleg^P")和冈 比亚按:^(爿/io/7/^/m gtf附W"e);浪^刺flea )物种，比如多苗刻Cte"o"/ /^/iVfes )(猫跳蚤)；马蝇(horseflies);白蛉(sandflies);墨蚊(blackflies); 舌錄(tsetse flies);虱(lice);螨(mites);蛭(leeches);和扁虫(flatworms )、 的等价EV576蛋白序列。天然的EV576蛋白被认为以约18 kDa的另外三 种形式存在于毛白钝缘蜱(a w做&to)中，术语"同源物"意思还包括 EV576的这些替代形式。
鉴定图2所示EV576序列的同源物的方法对于本领域技术人员是显而
易见的。例如，可以通it^公共和私人序列数据库的同源搜索鉴定同源物。 便利地是，可以应用公共数据库，但是私人或商用数据库同样是可用的， 尤其是如果它们包含公用数据库所没有的数据时。 一级数据库^1保存一级 核苷酸或tt酸序列数据的网站并且可以是公用或商用的。公用的一级数 据库的实例包括GenBank数据库(http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov/)、 EMBL 数据库(http:〃www.ebi.acuk/)、 DDBJ数据库(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/)、 SWISS-PROT 蛋白质数据库(http:〃expasy.hcuge,ch/) 、 PIR (http:y7pir.georgetown.edu/)、 TrEMBL (http:〃www.ebi.ac.uk/)、 TIGR数据 库(见 http:y7www.tigr.org/tdb/index.html) 、 NRL-3D 数据库 (http:Vwww.nbrfa.georgetown.edu) 、 the Protein Data Base (http:Vwww.rcsb.org/pdb)、 NRDB 数据 库
(ftp:Vncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README) 、 OWL 数据库 (http:〃www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)以及二级数据库 PROSITE (http:〃expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html) 、 PRINTS (http:y7iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html) 、 Profiles
(http:〃ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN—form.html) 、 Pfam
(http:〃www.sanger.ac.uk/software/pfam) 、 Identify
(http:〃dna.stanford.edu/identify/)和Blocks (http:〃www.blocks.fhcrc.org) 数据库。商用数据库或私人数据库的实例包括PathoGenome (Genome Therapeutics Inc.)和PathoSeq (Incyte Pharmaceuticals Inc.)。
典型地，两个多肽之间(优选特定区域比如活性位点)大于30%的一 致性被认为标志着功能上等价，因此标志着两个蛋白质是同源物。优选地， 同源蛋白质具有与图2中确定的EV576蛋白大于60%的序列一致性。更 优选的同源物分别具有与图2中给出的EV576蛋白大于70%、80%、90%、 95%、 98%或99%的一致性。本文所指的一致性百分率是使用2.1.3版 BLAST并采用NCBI(仇e National Center for股otechnology Information; http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数Blosum 62矩阵；缺口罚 分(gap open penalty) =11和缺口延伸罚分(gap extension penalty) =1
所确定的。
图2中给出的EV576蛋白序列的同源物包括含有对野生型序列的M 酸替换、插入或缺失例如l个、2个、3个、4个、5个、7个、IO个或更 多个氨基酸的突变体，前M这样的突变体保留结合C5的能力。因此突 变体包括含有不以有害形式影响所述蛋白质功能或活性的保守氨基酸替
换的蛋白质。该术语意思还包括天然生物学变体(例如，EV576蛋白来源 物种中的等位基因变体或地理变异)。还可以通过在所述蛋白质序列中对 特定残基进行系统性或定向突变来设计具有改善的结合C5能力的突变体。
只要EV576蛋白和EV576蛋白同源物的片段保留结合C5的能力，这 样的片段也包含在术语"功能等价物，，的范围内。片段可以包括例如源于 EV576蛋白序列的多肽，其小于150个氨基酸、小于125个氨基酸、小于 IOO个氨基酸、小于75个氨基酸、小于50个氨基酸、或甚至等于或小于 25个M酸，只要这些片段保留结合补体C5的能力。所包括的这些片段 不但可以是本文图2中明确给出的毛白钝缘蜱(a WM/^i似)EV576蛋白 的片段，还可以是如上所述的此蛋白质同源物的片段。这样的同源物的片 段通常与图2的EV576蛋白序列片段具有大于60%的一致性，更优选的 同源物的片段分别与图2的EV576蛋白序列片段具有大于70%、 80%、 卯％、 95%、 98%或99%的一致性。当然，可以通过对野生型序列的系统 性突变或者片段化接着通过适当的活性测定来合理设计有改善的片段。片 段对C5可以展示出与EV576相似的或更大的亲和性，并且对C5可以具 有相等的或更大的ICSo。
根据本发明使用的功能等价物可以是融合蛋白质，其可通过例如将编 码EV576蛋白的多核普酸框内(inframe)克隆至编码异源蛋白质序列的 序列中获得。本文使用的术语"异源"意指不同于EV576蛋白或其功能等价 物的任何多肽。可包含在可溶性融合蛋白质N-或C-端的异源序列的实例 如下膜结合蛋白质的细胞外结构域、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、多聚 化结构域、细胞外蛋白质结构域、信号序列、输出序列、或允许通过亲和 色谱纯化的序列。许多这些异源序列可在表达质粒中商品化供应，因为这 些序列通常包含在融合蛋白质中以提供其它特性而又不明显损害它们融 合的蛋白质的特定生物活性(Terpe K， Appl Microbiol Biotechnol， 60:523-33， 2003 )。这些其它特性的实例有在体液中持续更长的半衰期、细 胞外定位、或者允许依靠标签(tag)(比如组氨酸或HA标签)进行较容 易的纯化步骤。
可以通过在宿主细胞中表达，以重组形式制备EV576蛋白和其功能等 价物。这样的表达方法对于本领域的技术人员是众所周知的，并且 Sambrook et al (2000)和Fernandez & Hoeffler (1998)进行了详细的描 述。EV576蛋白和其功能等价物的重组形式优选是iMt基化的。
还可以使用蛋白质化学的常规技术制备本发明的蛋白质和片段。例如， 可以通过化学合成制M白质片段。生产融合蛋白质的方法在本领域中是
标准的，并且对于本领域技术人员是公知的。例如，在Sambrook et al. (2000) 或Ausubel et al. (1991)中可以找到大多数常规的分子生物学、微生物学重 组DNA纟支术和免疫纟支术。
按本发明的方法或用逸拖用结合C5的药剂的对象优选是哺乳动物， 优逸人。施用结合C5的药剂的对象还可以患有与重症肌无力相关的其它 疾病比如胸腺肺瘤、甲状腺毒症、类风湿性关节炎和红斑狼疾。
以治疗或预防有效量施用所述药剂。术语"治疗有效量"意指治疗或改 善目标疾病所需的药剂的量。本文4吏用的术语"预防有效量"意指预防目标 疾病所需的药剂的量。
优选地，所述药剂的剂量足以结合对象中尽可能多的可利用C5、更优 选所有可利用的C5。优选地，所提供药剂的剂量是结合对象中所有可利用 C5所需摩尔剂量的至少两倍。所提供药剂的剂量可以是结合对象中所有可 利用€5所需摩尔剂量的2.5倍、3倍或4倍。在一个实施方案中，所述剂 量是从1 mg/kg至15 mg/kg。优选地，所述剂量;i从1 mg/kg (药物质量 比患者质量)至10 mg/kg、优选2 mg/kg至8 mg/kg。
需要施用药剂的频率将取决于所涉及药剂的半衰期。当所述药剂是 EV576蛋白或其功能等价物时，施用剂量可以基于每天一次、每天两次、 或每两天、三天、四天、五天、六天、七天、10天、15天或20天或更多 天一次。
确切的剂量和施用频率还可取决于患者在施用时的状态。确定剂量时 可以考虑的因素包括患者疾病状态的严重程度、患者的#^健康情况、年 龄、体重、性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和患者 对治疗的耐受性或反应。通过常规试验可以确定准确的量，但是最终可取 决于临床医生的判断。
通常所述药剂作为药学可接受载体的一部分来施用。本文使用的术语 "药学可接受载体"包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙 醇酸和无活性病毒颗粒，或者实际上任何其它药剂，只要所述载体本身不 诱导毒性作用或致使产生对接受所述药物组合物的个体有害的抗体即可。
药学可接受载体可另外含有液体比如水、盐水、甘油、乙醇或辅助物质比
如润湿剂或乳化剂、pH緩冲物等。因此，所用的药物载体将取决于施用 途径而有所不同。载体能够使所述药物组合物配制成片剂、丸剂、糖锭剂、 胶嚢、液体、凝胶剂、糖浆剂、骨剂(slurries )、混悬剂，以帮助患者的 摄取。在Remington Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.， N.J. 1991) 中可以找到对药学可接受载体的详细论述。
可以通过任何已知的施用途径递送所述药剂。可以通过胃肠外途径(例 如，通过皮下、皿内、静脉内或肌肉内注射，或者递送至组织间隙)递 送所述药剂。还可以将所述组合物施用至损伤中。其它施用模式包括口服 和肺部施用、栓剂、和透皮或经皮施用、针和无针注射(hypospray)。
结合C5的药剂可以单独施用，或者作为治疗方案一部分施用，所述 治疗方案还包括施用目前用于治疗重症肌无力患者的其它药物。例如，可 以^合抗胆碱酯酶剂(比如新斯的明和吡斯的明)或免疫抑制药物(比如 泼尼松、环孢霉素和硫唑噤呤)施用所述药剂。联合药物治疗对治疗所述 疾病可具有加和或协同作用。
因此，本发明提供(i)结合C5的药剂，优选EV576蛋白或其功能等 价物，和(ii)抗胆喊酯酶剂和/或免疫抑制药物，用于治疗用途。
本发明还提供(i)结合C5的药剂，优选EV576蛋白或其功能等价物， 和(ii)抗胆碱酯酶剂和/或免疫抑制药物在制备治疗重症肌无力药物中的 用途。
可以与其它药物同时、依次或者分别地施用结合C5的药剂。例如， 可以在施用其它药物之前或之后施用结合C5的药剂。
因此本发明提供了结合C5的药剂，优选EV576蛋白或其功能等价物， 在制备用于治疗对象中重症肌无力的药物中的用途，其中所^t象之前已 用抗胆喊酯酶剂和/或免疫抑制药物预先治疗过。4^发明还提供了抗胆喊酯 酶剂和/或免疫抑制药物在制备用于治疗对象中重症肌无力的药物中的用 途，其中所述对象已用结合C5的药剂，优选EV576蛋白或其功能等价物 预先治疗过。
结合C5的药剂还可以作为治疗方案的一部分施用，所述治疗方案还 包括施用目前用于治疗与重症肌无力相关的其它疾病的其它药物，所述其
它疾病比如胸腺胂瘤、甲状腺毒症、类风湿性关节炎和红斑狼疮。可以与
所述其它药物同时、依次或分别地施用结合C5的药剂。例如，可以在施 用所述其它药物之前或之后施用结合C5的药剂。
现将更详细地举例说明本发明的多个方面和实施方案。应当理解，对 本发明细节的修改并不脱离本发明的范围。
图1:补体激活的经典和旁路途径的示意图。暗灰色表示酶组分。过 敏毒素被星状图所围绕。
图2: Ey57，、的一级序列。下划线表示信号序列。粗体表示半胱氨酸
图3:从蜱唾液腺提取物(SGE)纯化EV576。 A)阴离子交换色镨。 B)级分的常规溶血测定。C)还原SDS-PAGE。 D) RP-HPLC。
图4: EV576的作用机制。A)对C3a生成没有作用。B)阻止C5a 生成。C )直接结合C5。
图5:重组EV576。 A)重组EV576 (rEV576)与天然EV576同样有 效地抑制补体。B)EV576的结构。
图6: rEV576在实验性重症肌无力模型中的作用。A)与对照动物相 比，rEV576阻止体重减轻。B)与对照动物相比，用rEV576治疗的动物 的临床评分。C)临床评分的原始数据。
图7: rEV576在慢性实验重症肌无力模型中的作用。A)与对照动物 相比，在具有严重EAMG的动物中，rEV576阻止体重减轻和死亡。B) 与对照动物相比，在具有严重EAMG的动物中，rEV576治疗对临床评分 和握力(grip strength)有明显的改善。C)与对照动物相比，在具有轻度 EAMG的动物中，rEV576阻止体重减轻。
图8: rEV576在慢性实验性重症肌无力模型中的作用。A)在经过治 疗的、未经治疗的、轻度的EAMG或严重的EAMG组之间，AchR抗体 未显示出差异。B)来自表现出严重和轻度EAMG大鼠的大鼠血清中总补 体溶血活性。
图9: rEV576在慢性实验性重症肌无力模型中的作用。A)来自表现 出严重EAMG大鼠的大鼠血清的细胞毒性。B)来自表现出轻度EAMG 大鼠的大鼠血清的细胞毒性。
实施例
1. 作用机制和抑制浓度
如WO2004/106369所公开的，通过对经常规溶血测^Jt现含有补体抑 制活性的唾液腺提取物级分进行SDS-PAGE和RP-HPLC (图3 )，从软蜱 (soft tick)毛白钝缘蜱(OW/i,Viorfrmw附做6"to)的唾液腺提取物中纯化 EV576。
EV576抑制人和豚鼠的经典和旁路途径。它对C3a生成的速率没有影 响(图4A )，但是阻止将C5切割成C5a (图4B )。
EV576抑制经典的和旁路补体途径的能力是由于该分子与补体C5结 合所致，其中C5是C5a和C5b-9的前体。EV576直接结合C5 (图4C )， IQ。约为0.02 mg/ml。确切的结合机制和血清因子所起的辅助作用(如果 有的话)正在研究之中。
去除糖基化位点(否则在酵母表达系统中发生糖基化)的重组EV576 (rEV576)与天然非糖基化蛋白质一样有活性(图5A)。
EV576的结构确认它;O旨质运载蛋白家族的一种较远的成员(图5B)， 与moubatin具有46%的一致性，后者是来自毛白钝缘蜱(a附卵6Wfl) 的一种血小板凝集抑制因子。脂质运栽蛋白是一大组的软蜱蛋白质，除了 很少的几种之外它们的功能是未知的。
2. 半衰期
发现在大鼠中1251标记的rEV576的血清p半衰期约为30-38小时。
3. EV576对实验性自身免疫性重症肌无力的作用 试發J
按照Piddlesden et al.(如上)的方法，在雌性Lewis大鼠中谦导实验 性自身免疫性重症肌无力(EAMG)。
在第0天给Lewis大鼠MJ^内注射1 mg/kg的抗-AchR mAb35,并连 同注射i) 3.25 mg rEV576 (经计算为结合所有可用C5所需要的摩尔剂 量的2,5倍)；或者ii)PBS。在7天中评价大鼠的体重和临床评分的变化。 (图6)
与对照相比，注射3.25 mg的rEV576完全地减轻了 mAb35诱导的体 重减轻和肌无力。
在诱导后72小时所有对照动物都变得濒临死亡并且不得不实施安乐 死，而所有经rEV576治疗的动物都存活下来，体重增加并且在实验期间 (183小时)没有表现出肌无力(图6 )。
因此单次注射rEV576在至少7天中完全地减轻了 EAMG的症状。
试發2
在慢性EAMG模型中进一步对rEV576进行分析。在该模型中，动物 接受完全弗氏佐剂(CFA)中的乙跣胆碱受体蛋白并且在约30天的过程中 产生它们自己的抗体。该模型模拟人的情形，其中症状的发生和J Ubf目对 緩慢。
通过皮下注射纯化的乙酰胆喊受体蛋白(2x100 jil PBS中20照乙酰 胆碱受体蛋白，所述蛋白溶液在等体积的完全弗氏佐剂+灭活的结核分枝 杆菌(Mycobacterium tuberculosis) -0.5 mg中乳化)免疫18只Lewis大 鼠。对照大鼠只注射PBS。
疾病发作(EAMG临床评分1或2并且体重减轻<15% )之后，给9 只大鼠J^M内(i.p.)注射3.25 mg的rEV576，治疗持续10天，每12小 时注射1 mg。在这9只大鼠中，三只大鼠被评价为具有严重的肌无力 (S-EAMG)和六只大鼠具有轻度的肌无力(M-EAMG)。
余下的9只大鼠未经处理。这9只大鼠中，四只大鼠,皮评估为具有严 重的肌无力(S-EAMG),五只大鼠具有轻度的肌无力(M-EAMG)。
在10天中，评价这两组大鼠的体重、握力和临床评分的变化。
在严重EAMG组中的大鼠，它们的体重减轻12%并且在用rEV576 治疗开始时起的24小时内死亡。未经治疗的大鼠在24时内全部死亡。经
rEV576治疗的大鼠显示出在体重减轻方面明显的减少。在第33天开始用 rEV576治疗时，平均临床评分是2.0。 10天的rEV576注射减轻了临床症 状的严重性并且还阻止了体重的减轻(图7A)。这些大鼠还显示出在握力 方面的明显改善(图7B)。
在显示出轻度早期EAMG的大鼠中，在第33天刚开始出现临床征象 并且体重刚开始降低。rEV576治疗阻止大鼠体重的减轻并且大鼠体重平 均增加3.43%。具有同样临床评分的未经治疗的动物体重减轻约4.59%(图 7C)。与表现出轻度早期EAMG的未经治疗的大鼠相比，在经过治疗的大 鼠中握力没有改善(数据未显示)。
从所述大鼠中收集血，用于检测AchR抗体和评价补体溶血活性。在 各实验组之间，通过直接ELISA检测的AchR抗体没有差异(图8A)。来 自经rEV576治疗的显示严重和轻度EAMG大鼠的大鼠血清完全抑制补体 的活性(图8B)。
此外，在横紋肌肉瘤细胞系(ATCC， CCL-136)上应用ToxiLight Bioassay Kit测定来自显示严重和轻度EAMG大鼠的大鼠血清的细胞毒 性。如在图9A和9B中所能看到的，在具有严重EAMG的未经治疗的大 鼠中检测到最高的细胞毒性。用rEV576治疗的动物显示出细胞毒活性明 显降低。
该数据表明rEV576可以有效用于治疗早期轻度重症肌无力和严重晚 期疾病(例如肌无力危象)。
权利要求
1.一种治疗或预防重症肌无力的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗或预防有效量的结合补体C5的药剂。
2. 治疗或预防有效量的结合补体C5的药剂在制备治疗或预防重症 肌无力的药物中的用途。
3. 根据权利要求1的方法或根据权利要求2的用途，其中所述药 剂用于阻止C5转化酶将补体C5切割成补体C5a和补体C5b-9。
4. 根据权利要求1至3中任一项的方法或用途，其中所述药剂以 小于0.2 mg/ml的IC5。结合C5。
5. 根据权利要求1至4中任一项的方法或用途，其中所述药剂来 源于食血节肢动物。
6. 根据权利要求1至5中任一项的方法或用途，其中所述结合C5 的药剂是蛋白质，其包含图2中氨基酸序列的第19至168位氨基酸或 者由其组成，或者是该蛋白质的功能等价物。
7. 根据权利要求1至5中任一项的方法或用途，其中所述结合C5 的药剂是蛋白质，其包含图2中氨基酸序列的第1至168位氨基酸或者 由其组成，或者是该蛋白质的功能等价物。
8. 根据权利要求1至5中任一项的方法或用途，其中所述药剂是 编码如权利要求6或7所述蛋白质的核酸分子。
9. 根据权利要求8的方法或用途，其中所述核酸分子包含图2中 核普酸序列的第53至507位碱基或者由其组成。
10. 根据权利要求9的方法或用途，其中所述核酸分子包含图2中 核苷酸序列的第1至507位碱基或者由其组成。
11. 根据权利要求1至10中任一项的方法或用途，其中所述对象 是哺乳动物，优选人。
12. 根据权利要求1至11中任一项的方法或用途，其中以足以结 合对象中尽可能多的可利用C5、更优选所有可利用C5的剂量施用所述药剂。
13. 根据权利要求1至12中任一项的方法或用途，其中以足以减 少体重减轻和/或肌无力的剂量施用所述药剂。
14. 根据权利要求1至13中任一项的方法或用途，其中以1 mg/kg 至15 mg/kg的剂量施用所述药剂。
15. 根据权利要求1至14中任一项的方法或用途，其中以13 mg/kg 的单剂量腹膜内施用所述药剂。
16. 根据权利要求1至13中任一项的方法或用途，其中以13 mg/kg 的剂量腹膜内施用所述药剂，接着每12小时以4 mg/kg的剂量施用。
17. 根据权利要求1至16中任一项的方法或用途，其中作为治疗 方案的一部分施用所述结合C5的药剂，所述治疗方案还包括施用治疗 重症肌无力的其它药物。
18. 根据权利要求17的方法或用途，其中所述的其它药物是抗胆 碱酯酶剂，比如新斯的明和吡斯的明，或者是免疫抑制药物，比如泼尼 松、环孢霉素、和硫唑嘌呤。
19. 根据权利要求17或18的方法或用途，其中与所述其它药物同 时、依次或分别地施用所述结合C5的药剂。
20. 根据权利要求1至19中任一项的方法或用途，其中所述重症 肌无力是轻度重症肌无力或重度重症肌无力。
全文摘要
本发明涉及结合补体蛋白C5的药剂在治疗与不适当的补体激活有关的疾病尤其是在治疗重症肌无力中的用途。
文档编号A61K38/17GK101340926SQ200680037667
公开日2009年1月7日 申请日期2006年9月5日 优先权日2005年9月9日
发明者温·韦斯顿-戴维斯, 约翰·哈默 申请人:发展技术有限公司