专利名称：：免疫调节组合物和其应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明总的涉及调节免疫应答的方法和药物。更具体说，本发明涉及IL-10功能抑制剂和刺激对靶抗原产生初次免疫应答的免疫刺激物在刺激和延长宿主对靶抗原的免疫应答的方法和组合物中的应用。本发明的方法和组合物特别可用于治疗或预防许多疾病，包括致病性感染和癌症。
背景技术：
："抗原原罪"是用来指用两种交叉反应抗原依次刺激宿主时，诱导的免疫应答仅指向第一种抗原的术语，首次在流感感染期间的抗体应答中描述了这种现象(Webster,1966，J./"，w朋/.97:177-183)。虽然与新生病毒发生一定程度的交叉反应可解释精液抗体的持续性，但阻止受感染宿主的免疫系统产生针对新生病毒变种的高亲和力中和抗体的机制尚未明了。在HIV感染的情况下，抗原原罪表示B细胞克隆显性，其中最初反应的B细胞通过称为"欺骗性印记"或"所有组成成分冻结"的方法被"锁定"(Kohlei"等，1994，/mmw冊/.ro^y15:475-478)。这种克隆显性包括针对HIV产生的抗体组的有限多样性，且这种显性显然会减弱免疫应答对新生变体的适应，并有利于病毒持续性。也在CTL应答中观察到抗原原罪(Klenerman和Zinkernagel，1998，Atow"394(6692):482-485)，因为用一株LCMV初免的小鼠对CTL表位变异毒株引起的后续感染发生应答，而其CTL应答是针对初始表位、而非新变异表位的应答。预先存在的T细胞或抗体能与变异抗原或递呈新抗原表位的抗原递呈细胞发生交叉反应，从而能够去除变异抗原，这些T细胞或抗体各自被认为是对变异抗原的新表位产生应答的抑制因素(DaSilva，2001，fWogy290(2):350-60;McMichael，1998，淑,394(6692):421陽422)。近年来，Liu等(2003，乂/m画o/.171:4765-4772)发现，对乳头瘤病毒(PV)衣壳蛋白的在先免疫能抑制诱导原初CD8+T细胞对连接于衣壳蛋白的MHCI类限制表位产生IFN-Y应答，接着用表达I类限制表位的衣壳免疫。此外，Liu等观察到，此种降低的应答需要产生IL-10，局限于PV衣壳递送位点，并且不依赖该衣壳的抗体。虽然得知这些观察结果符合抗原原罪的描述，但这些研究人员提出，需要通过接种病毒或肿瘤抗原诱导新的免疫应答时，IL-10的局部抑制可能是克服先前对载体抗原的免疫力的关键决定因素。在本发明的先导工作中发现:PV衣壳蛋白L1VLP免疫能产生抗原特异性IL-IO分泌性CD4+T细胞，它是抑制VLP初免宿主的CD8+T细胞随后分泌抗原特异性IFN-y所必需的。本发明人还发现，VLP特异性CD4+细胞接触树突细胞后能分泌IL-IO，CD4+T细胞-教导的(educated)树突细胞有利于诱导分泌IL-5、而不分泌IFN-y的CD8+T细胞。此外，已发现，在体外或体内临时中和IL-10能恢复合适免疫之后对VLP产生CD8+IFN-y应答的能力。简化上述发现，以用于刺激对各种病原物，特别是可持续存在并导致慢性疾病的病原物产生更有效的免疫应答的新方法和组合物。发明概述因此，在一个方面，本发明提供了在未接触过靶抗原或以前对耙抗原产生过免疫应答的对象中刺激对该耙抗原产生免疫应答的组合物。这些组合物通常含有能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激物和IL-10功能抑制剂。在一些实施方式中，该免疫刺激物选自对应于靶抗原的至少一部分的抗原、能与靶抗原发生免疫反应的抗原结合分子和能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激细胞。耙抗原一般与感兴趣的疾病或病症有关。在一些实施方式中，靶抗原由病原生物体或癌产生。对应于靶抗原的至少一部分的抗原可以是可溶形式(如肽或多肽或可尤其表达任何一种抗原的构建物)。或者，抗原可以是颗粒或细胞(如病毒、细菌或全细胞)或由抗原递呈细胞(如专性或兼性抗原递呈细胞)递呈。在免疫调节剂是抗原结合分子的实施方式中，这种分子一般结合于靶抗原或与其相互作用，以降低其水平或功能活性(如中和性抗体)。可与IL-10功能抑制剂联用的示范性免疫剌激细胞是免疫效应细胞，包括抗原-特异性T淋巴细胞，例如但不限于溶细胞性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞、T调节细胞和B淋巴细胞。在一些实施方式中，该组合物含有一种以上免疫刺激物，如2、3、4、5或多种免疫刺激物，它们能剌激或增强对该靶抗原或多种耙抗原的免疫应答。适当地，在对象以前对该靶抗原产生过免疫应答和免疫刺激物含有对应于该耙抗原的至少一部分的抗原的实施方式中，相应抗原的氨基酸序列与所述至少一部分的氨基酸序列相同。在对象以前对靶抗原产生过免疫应答且免疫刺激物含有对应于靶抗原的至少一部分的抗原的其它实施方式中，相应抗原的氨基酸序列与所述至少一部分的氨基酸序列不同，区别在于加入、缺失或取代了至少一个氨基酸残基。在这些实施方式的说明性实施例中，所述相应抗原是对象对其产生过免疫应答的天然产生的抗原。在一些实施方式中，IL-10功能抑制剂选自可溶性或缺陷型IL-10受体或其片段、表达IL-10受体或其片段的细胞、能与IL-10或IL-10受体发生免疫反应的抗原结合分子、抑制IL-10基因的表达或IL-10表达产物的功能活性的核酸(如对IL-10基因或其转录物特异的反义分子、核酶或RNAi分子)或者IL-lO的小分子抑制剂。在一些实施方式中，该组合物还含有药学上可接受的运载体或稀释剂。在某些实施方式中，该组合物还含有提高免疫刺激的有效性的佐剂。适当地，佐剂能将抗原递送给I类主要组织相容性(MHC)途径。例如，这种佐剂包括但不限于含皂苷的化合物(如ISCOM)和介导将抗原递送至靶细胞的胞浆的溶细胞素。溶细胞素可连接于或结合于抗原。在一些实施方式中，溶细胞素介导将抗原由膜泡(vacuole)(如吞噬体或内体)转移到抗原递呈细胞的胞浆中，在这种类型的说明性实施例中，溶细胞素是李斯特菌溶细胞素。本发明的另一方面提供了在未接触过靶抗原或以前对靶抗原产生过免疫应答的对象中刺激免疫应答的方法。这些方法通常包括给予该对象有效量的如上所述的免疫刺激物和IL-10功能抑制剂。该组合物的活性成分可以依次、分别或同时给药。在某些实施方式中，免疫应答是T-细胞介导的免疫应答。有利的是，这些方法可用于治疗或预防与对象中靶抗原的存在或异常表达有关的疾病或病症。在某些实施方式中，所述疾病或病症选自致病性感染、特征是免疫缺陷的疾病或癌症。按照本发明，IL-10功能抑制剂将抑制在没有该抑制剂时能产生的IL-IO，从而在随后递送免疫刺激物和任选的IL-10功能抑制剂后维持对象对靶抗原产生CD8+IFN-y应答的能力。因此，在一些实施方式中，本发明方法还包括给予至少一种其它有效量的免疫刺激物和任选的至少一种其它有效量的IL-10功能抑制剂，从而维持或增强对耙抗原的免疫应答。在另一方面，本发明考虑将上述IL-10功能抑制剂和免疫刺激剂用于制备刺激或增强对靶抗原的免疫应答的药物。在另一方面，本发明涉及将上述IL-10功能抑制剂和免疫刺激剂用于制备治疗或预防与靶抗原的存在或异常表达有关的疾病或病症的药物。附图简要说明图1是显示病毒衣壳初免的CD4+T细胞能产生IL-IO，并且为E7特异性IFN-y抑制所必需的图示。图(A)中，在第O天和第14天用含有或不含明矾的L1VLP免疫3-5只C57BL/6J小鼠的小组，或者不进行免疫。在第21天收集淋巴结淋巴细胞，并使其接触10pg/mLLlVLP48小时。用ELISA测定上清液中的IL-IO。图(B)中，用含有明矾的L1VLP免疫动物两次，如同(A)那样使淋巴结和脾淋巴细胞接触VLP，并且加入或不加入15)ig/mL抗-CD4(GK1.5)、抗-CD8(2.43)或同种型对照抗体。用ELISA分析上清液中的IL-IO。结果是单个小鼠脾细胞以及汇集的局部淋巴结细胞的三次实验的平均值土SEM。图(C)中，如同(A)那样用L1VLP免疫动物两次，并从第21天起连续i.p.给予5001mg/mL抗-CD4(GK1.5)或正常大鼠血清(NRS)3天。第25天和第43天通过血液FACS分析监测CD4+T细胞的耗尽和恢复。图(D)中，如同(C)那样用L1E7VLP在第44天和第58天免疫耗尽(aCD4)或模拟耗尽(NRS)CD4+细胞的动物(L1ZL1E7)。通过相似方法用L1E7VLP(L1E7)免疫之前未处理的动物。在第55天用ELISPOT评价在脾和淋巴结中E7特异性IFN-y分泌性CD8+T细胞的诱导。图2是显示来自VLP和明矾免疫的小鼠的CD4+T细胞能在体外抑制E7特异性IFN-Y分泌的图示。图(A)中，使来自C57BL/6J小鼠的105个CD1lc+树突细胞分别接触40吗/mLBPVlL1E7VLP、BPV1L1VLP或HPV6L1VLP18小时。充分洗涤后，加入5xl()S个E7TCR转基因T细胞并培养48小时。用ELISA测定上清液中的IFN-Y。加入311胸苷，通过&掺入评价T细胞增殖。图(B)中，使CDllc+细胞(l()S个)接触BPV1L1E7VLP18小日寸，或在没有抗原的情况下培养。洗涤后，如图所示加入来自BPV1Ll￥1^免疫的小鼠或来自未免疫小鼠的004+T细胞(l()5个)。加入5>(105个E7TCR细胞和终浓度为15pg/mL的GK1.5抗-CD4抗体，如上所述测定T细胞增殖和IFN-Y分泌。图(C)中，使CDllc+细胞(lC)5个)接触BPVlL1E7VLP或BPV1LlVLP18小时。洗涤后，如图所示加入来自BPV1LlVLP和明矾免疫的小鼠或来自OVT(OVA的MHCII限制性肽)和明矾免疫的小鼠，或来自未免疫小鼠的CD4+T细胞(105个)。加入5xl()S个E7TCR细胞，如上所述测定T细胞增殖和IFN-y分泌。结果为三个样品的平均值土SEM。图(D)中，使CDllc+细胞(l()5个)接触BPV1L1E7VLP或BPV1LlVLP18小日寸。洗涤后，如图所示加入来自BPV1LlVLP和明矾免疫的小鼠或来自0VT和明矾免疫的小鼠的CD4+T细胞(1()S个)。收集上清液，用ELISA测定IL-10分泌。结果为三个样品的平均值士SEM。图3是显示IL-10的中和能恢复e7特异性IFN-y分泌的图示。图(A)显示了体外中和。使来自C57BL/6J小鼠的CDllc+细胞(l()5个)接触40ng/mLE7VLP18小时。如图所示加入用L1VLP和明矾免疫小鼠的CD4细胞(105个)和抗-正-10抗体作用18小时。然后加入E7TCR转基因T细胞(5x105个)处理48小时。收集上清液，以进行细胞因子ELISA，通过SH胸苷掺入评价T细胞增殖。图(B)显示了体内中和。在第0天和第14天用L1VLP免疫3只C57BL/6J小鼠的小组。如图所示，在第20天和第21天i.p.给予小鼠0.5mg抗IL-10R或正常大鼠血清，并且在第21天用E7VLP免疫。第34天和第35天，重复IL-10R抗体给药和VLP免疫。第41天，收集脾和局部引流淋巴结，进行E7肽特异性IFN-YELISPOT。图4是显示接触VLP初免的CD4+T细胞的树突细胞(DC)能指导CD8+T细胞响应于抗原而分泌IL-5的图示。图(A)中，使来自C57BL/6J小鼠的CDllc+细胞(l()S个)接角虫40pg/mLLlE7VLP或LlVLP18小日寸。然后，如图所示，对它们不进行处理，或接触用OVT和明矾或LlVLP和明矾免疫的小鼠的CD4+细胞(l(^个)18小时。加入E7TCR转基因T细胞(5x105个)48小时。收集培养物上清进行IL-5ELISA。图(B)中，用40pg/mLL1E7VLP培育CD1lc+细胞，接着不处理(a,b)或接触LlVLP(c,d)或LlVLP和明矾(e,f)免疫的C57BL/6J小鼠的CD4+细胞18小时。随后，通过阳性选择耗尽CD4+细胞(FACS特性-AFTER),加入5><105个E7特异性或不相关T细胞48小时；用ELISA测定T细胞增殖(a,c，e)和IL-5水平(b,d,f)。图5是显示CpG刺激无法克服IL-10分泌性CD4细胞对E7特异性IFN-y分泌的抑制的图示。在第0天和第14天用L1VLP免疫3只C57BL/6J小鼠的小组(L1/Lm7)或不进行免疫(Lm7)。在第21天和第35天，用E7VLP免疫所有小组；也给予一个小组10吗/mLCpG，如图所示。最后一次免疫6天后，收集脾和引流淋巴结，进行E7特异性IFN-YELISPOT实验。结果是各组中3只小鼠的平均值和S.E.M。发明详述J.定乂除非另有定义，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然与本文所述相似或等同的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。出于本发明目的，下面对术语作出定义。本文所用冠词"一个"和"一种"指一个或一个以上(即至少一个)该冠词的语法目标。例如，"一种元素"指一种元素或一种以上的元素。本文所用术语"约"指相对于具体条件，变化高达30%，优选高达20%，更优选高达10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的条件(如量、浓度、时间等)。"抗原"指能够在脊椎动物，尤其是哺乳动物中引发免疫应答的蛋白质、肽或者其它分子或大分子的全部或一部分。这种抗原也能与用该蛋白质、肽或者其它分子或大分子免疫的动物的抗体发生反应。"抗原结合分子"指与靶抗原有结合亲和力的分子。应理解，此术语延及免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和具有抗原结合活性的非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。"自体"指衍生自同一生物体的物质(如细胞、组织等)。本文所用术语"同种异体"指遗传组成不同的细胞、组织、生物体等。"生物活性片段"指保持了全长母体多肽的活性的该全长母体多肽的片段。本文所用术语"生物活性片段"包括具有母体多肽活性的缺失突变体和小肽，如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个毗连氨基酸的片段。这种类型的肽可通过应用标准的重组核酸技术获得或用常规的液相或固相合成技术合成。例如，可参考以下文献所述的溶液合成或固相合成，例如，Atherton和Shephard的题为"i才合成(Pe/^We5>^/犯^/，的第9章，其包括在由BlackwellScientificPublications出版Nicholson编辑的题为"合y^"疫潜fS>W/zW/cFaccz'"e/'的出版物中。或者，可通过用蛋白酶如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本发明多肽产生肽。可采用(例如)高效液相色谱(HPLC)技术纯化消化的片段。本文所用术语"细胞组合物"、"细胞疫苗"或"细胞免疫原"指含有至少一种细胞群作为活性成分的组合物。本文所用术语"顺式作用序列"或"顺式调节区"或类似术语应该指衍生自可表达遗传序列的任何核苷酸序列，其中该遗传序列的表达至少部分受核苷酸序列的调节。本领域技术人员应了解，顺式调节区可能能够激活、沉默、增强、抑制或改变任何结构基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。除非文中另有说明，整个说明书中的术语"包括"、"包含"应被理解为暗指包括所指出的步骤或元件或者步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或者步骤或元件组。"对应于"指编码与靶抗原的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列的抗原。通常，该抗原与靶抗原的至少一部分的相似性至少约为30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、99%。本文所用的"培养"等术语指在己显示能支持细胞体外生长或在体外维持细胞的条件下体外培育细胞群(或单细胞)所用的一组步骤。本领域了解多种形式、培养基、温度范围、气体浓度等培养体系中需要确定的这些参数。这些参数取决于所选形式和实施本文所述方法的个体的特殊需要。然而，培养参数的确定是本领域常规过程。在调节免疫应答或者治疗或预防疾病或病症的情形下，"有效量"指以单一剂量或作为一系列剂量的一部分将这种量的组合物给予需要的个体，以有效实现调节、治疗或预防。有效量将取决于待治疗个体的健康和身体情况、待治疗个体的分类组别、组合物配方、对医学状况的评价和其它相关因素。预计该量将在可通过常规试验测定的相对宽的范围之内。"表达载体"指能够指导合成该载体编码的蛋白质的任何自主遗传元件。本领域技术人员知道这种表达载体。本文所用术语"基因"具有最广泛的含义，包括对应于该基因的基因组DNA区以及对应于外显子的cDNA序列或经工程改造编码一产物的功能形式的重组分子。"衍生物"指，(例如)与其它化学部分偶联或复合或通过本领域所了解的翻译后修饰技术进行修饰，从而由基本序列得到的多肽。术语"衍生物"的范围也包括对母体序列进行的改变，包括提供功能等效分子的加入或缺失。正如本领域所熟知的那样，增强免疫应答("免疫增强")指提高动物对外来或疾病特异性抗原(如癌抗原)反应的能力，即经初免能攻击这种抗原的细胞的数量、活性或检测和破坏这种抗原的能力提高。用标准检测测定免疫应答的强度，这些检测包括用本领域己知的方式直接测定外周血淋巴细胞；天然杀伤细胞细胞毒性实验(参见例如，PravincialiM,等(1992，/m國o/H155:19-24)、细胞增殖实验(参见例如，Volle脂eider，I.禾口Groseurth，P丄(1992，J/mmzmo/.7kfe仇149:133-135)、免疫细胞和亚组的免疫测定(参见例如，Loeffler，D.A.等(1992，C>to,".13:169-174);Rivoltini，L,等(1992，Ca".//wm"m/.//wmmo"wr.34:241-251);或者通过皮肤测试细胞介导的免疫(参见例如，Chang，A.E.等(1993，Omceri".53:1043-1050)。用上述测试测定的免疫应答强度的统计学显著性提高被认为是本文所述的"免疫应答增强"、"免疫增强"或"免疫增效"。免疫应答增强也表现为身体表现如发热和炎症，全身性和局部感染的治愈，和疾病症状减轻，即肿瘤减小、疾病或病症的症状缓解，所述疾病或病症包括但不限于麻风病、结核病、疟疾、naphthous溃疡、疱疹样和乳头瘤样疣、牙龈炎、关节硬化、AIDS并发症如卡波济氏肉瘤、支气管感染等。这种身体表现也限定了本文所用的"免疫应答增强"、"免疫增强"或"免疫增效"。本文提到"免疫缺陷"时，包括体液和/或细胞介导的免疫的产生过程中有缺陷的任何情况。本文提到"免疫相互作用"包括分子之间的任何相互作用、反应或其它形式的结合，尤其当分子之一是免疫系统的组成成分，或模拟了免疫系统的组成成分时。本文所用术语细胞的"失活"指使得细胞不能进行细胞分裂以形成后代。然而，细胞可能能够对刺激发生反应，或能够进行生物合成和/或分泌细胞产物如细胞因子。本领域了解失活的方法。优选的失活方法是用毒素如丝裂霉素C或辐射处理。被固定或通透并且不能分裂的细胞也是失活细胞的例子。"分离"指基本或大体上不含在天然状态下与其并存的组分的物质。如果一种组合物能满足以下条件之一，则称其有"免疫原性"a)能在幼稚(naiVe)个体中产生针对抗原(如肿瘤抗原)的免疫应答；或b)在个体中重建、促进或维持免疫应答，使其超过没有给予化合物或组合物时发生的免疫应答。以单一剂量或多剂量给药时如果能够达到这些标准之一，则该组合物有免疫原性。"调节"指直接或间接提高或降低靶分子的水平和/或功能活性。例如，药物可通过与靶分子以外的分子相互作用间接调节所述水平/活性。在这个方面，间接调节编码靶多肽的基因的范围包括调节第一种核酸分子的表达，其中第一种核酸分子的表达产物调节编码靶多肽的核酸分子的表达。在某些实施方式中，"调节"指所需/选择的应答比抗原单独使用时更有效(如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更高)、更快速(如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更高)、幅度更大(如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更高)和/或更易于诱导(如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更高)。本文所用术语"5'非编码区"具有最广泛的含义，包括衍生自可表达基因的上游区的所有核苷酸序列，而不是编码包含所述基因的多肽产物的氨基酸残基的序列，其中所述5'非编码区能产生或激活或有利于(至少部分)该基因的表达。"获自"指样品，例如核酸提取物或多肽提取物分离自，或衍生自特定的宿主来源。例如，提取物可获自直接从宿主分离的组织或生物液体。本文所用术语"寡核苷酸"指由多个核苷酸单位(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关结构变体或合成类似物)通过磷酸二酯键(或其相关结构变体或合成类似物)连接组成的聚合物。因此，虽然术语"寡核苷酸"一般指核苷酸及其之间的连接是天然产生的核苷酸聚合物，但应理解，该术语的范围也包括各种类似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核酸等。该分子的准确大小可取决于具体应用。寡核苷酸的长度一般相当短，通常约为10-30个核苷酸，但该术语可指任何长度的分子，但术语"多核苷酸"或"核酸"一般用于大的寡核苷酸。本文所用术语"操作性连接"指将结构基因置于启动子的调控下，然后控制该基因的转录，并任选地控制其翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选使遗传序列或启动子与基因转录起始位点之间的距离约等于该遗传序列或启动子和天然状态下其控制的基因(即产生该遗传序列或启动子的基因)之间的距离。如本领域所知，该距离可以容忍一定程度的变化，而不会损失功能。相似地，调节序列元件相对于准备置于其控制下的异源基因的优选定位由该元件在天然状态，即产生它的基因中的定位确定。在本文中术语"患者"、"对象"、"宿主"或"个体"或可互换使用，指需要进行治疗或预防的任何对象，尤其是脊椎动物对象，更具体是哺乳动物对象。属于本发明范围的合适的脊椎动物包括脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类动物、啮齿动物(如小鼠、大鼠、豚鼠)、兔类(如家兔、野兔)、牛(如畜牛)、羊(如绵羊)、山羊(如山羊)、猪、马、犬(如狗)、猫(如家猫)、鸟类(如鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟类如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(如海豚、鲸)、爬行动物(蛇、蛙、蜥蜴等)和鱼。优选对象是需要治疗或预防与感兴趣抗原的存在或异常表达有关的病症或疾病的人。然而应理解，上述术语不暗示出现症状。"药学上可接受的运载体"指可安全地用于局部或全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。本文所用术语"药学相容性盐"指在毒理学上对人和动物给药安全的盐。此盐可选自盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、磷酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、萘磺酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、对苯二甲酸盐、双羟萘酸盐或果胶酸盐(pectinate)。本文所用术语"多核苷酸"或"核酸"指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语一般指长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。术语"多核苷酸变体"和"变体"指与参比多核苷酸序列的序列基本相同的多核苷酸或能够在本文所述的严谨条件下与参比序列杂交的多核苷酸。这些术语也包括加入或缺失了一个或多个核苷酸、或用不同核苷酸取代的多核苷酸。在这个方面，本领域熟知，可对参比多核苷酸进行某些改变，包括突变、加入、缺失和取代，从而使改变的多核苷酸保持参比多核苷酸的生物学功能或活性。术语"多核苷酸变体"和"变体"也包括天然产生的等位基因变体。在本文中，"多肽"、"肽"和"蛋白质"可互换使用，指氨基酸残基及其变体和合成类似物的聚合物。因此，这些术语可用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然氨基酸，如对应天然氨基酸的化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物。术语"多肽变体"指通过加入、缺失或取代至少一个氨基酸由参比多肽变化而来的多肽。本领域熟知，一些氨基酸可改变为具有广泛相似特性的其它氨基酸，这种改变不会改变多肽活性的特性。因此，本文所用多肽变体包括与母体多肽的活性相似的多肽，所述母体多肽选自IFNa、IFN(3、IFNy、B7-l分子或B7-2分子。优选的变异多肽包括保守性氨基酸取代。可按下表对多肽进行示范性保守取代表A<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如果选择保守性低于表A所示取代的取代，则会引起功能的显著改变。其它取代是非保守取代，可耐受的这种取代相对较少。通常，可能对多肽特性产生最大改变的取代是以下取代(a)亲水性残基(如Ser或Asn)被疏水性残基(如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸被任何其它残基取代；(c)侧链带正电的残基(如Arg、His或Lys)被电负性残基(如Glu或Asp)取代；或(d)侧链较小的残基(如Ala、Ser)或无侧链残基(如Gly)被具有大侧链的残基(如Phe或Trp)取代。本文中提到的"启动子"具有最广泛的含义，包括经典基因组基因的转录调节序歹(J，包括准确启动转录所需的TATA框(含有或不含CCAAT框序列)，以及响应于发育和/或环境刺激、或以组织特异性或细胞类型特异性方式而改变基因表达的其它调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。启动子通常，但不一定位于表达受其调节的结构基因的上游或5'。而且，含有启动子的调控元件通常位于该基因转录起始位点的2kb内。本发明优选的启动子可含有一种或多种特异性调控元件的额外拷贝，以进一步提高在细胞中的表达和/或改变与其操作性连接的结构基因的表达时机。本文所用术语"重组多核苷酸"指通过操作使核酸形成在天然情况下通常不存在的形式，从而在体外形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是表达载体的形式。通常，这种表达载体包括操作性连接于核苷酸序列转录和翻译调节核酸。"重组多肽"指用重组技术，即通过表达重组多核苷酸制备的多肽。本文所用的"刺激"免疫或免疫应答指与不用该组合物时相比，给予该组合物能在更高水平上启动、提高或维持宿主免疫系统与靶抗原如外来分子、同种异体细胞或肿瘤细胞反应的能力的组合物。在本文中，刺激"初次"免疫应答指在没有检测到之前反应(例如由于没有接触过靶抗原、对靶点不反应或免疫抑制)的对象中引发特定免疫反应。刺激"再次"应答指在检测到之前反应(例如由于天然免疫、自发免疫或用一种或几种组合物或方法治疗过)的个体中再次启动、提高或维持反应性。"治疗"应包括治疗性和预防性治疗。"载体"指由(例如)质粒、噬菌体或植物病毒产生，可向其中插入或克隆核酸序列的核酸分子，优选DNA分子。载体优选含有一种或多种独特的限制性位点，并能够在确定的宿主细胞(包括靶细胞或组织或者其祖细胞或组织)中自主复制，或能与确定宿主的基因组整合，以便复制克隆的序列。因此，载体可以是自主复制性载体，即以染色体外部分的形式存在的载体，其复制不依赖染色体复制，如线性或闭环质粒、染色体外元件、小染色体或人造染色体。载体可含有保证自身复制的任何元件。或者，载体可以是引入宿主细胞时能整合到基因组中并与所整合的染色体一起复制的载体。载体系统可包含一种载体或质粒、两种或多种载体或质粒，它们一起含有准备引入宿主细胞基因组的总DNA或转座子。载体的选择一般取决于载体与准备引入该载体的宿主细胞的相容性。载体也可包含可用于选择合适的转化子的选择性标记，如抗生素抗性基因。这种抗性基因的例子是本领域技术人员熟知的。2.邀合激本发明至少部分起源于确定在对靶抗原初次应答期间产生的抗原特异性IL-10分泌性CD4+T细胞可损害对象对靶抗原的再次免疫应答，并能阻止幼稚抗原特异性CD8+细胞获得成熟表型(包括细胞毒功能)和分泌IFN-y的能力。本发明者也确定，在体外或体内暂时中和IL-10能恢复对象在适当免疫后对靶抗原产生CD8+IFN-y应答的能力。根据这些观察结果，本发明者提出，可用含有IL-10功能抑制剂和能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫剌激物的组合物实现更有效的初次或再次免疫应答，其维持对象增强或维持对靶抗原的免疫应答的能力。2.1IL-10功能抑制剂IL-10功能抑制剂包括与IL-10或其受体直接或间接地结合或物理连接，并适当地阻断、抑制或对抗其功能或活性(如与白细胞，尤其是淋巴细胞，特别是T淋巴细胞上存在的一种或多种表面分子(如受体)结合或相互作用)中的至少一种的任何分子或化合物。结合或连接可涉及诱导的磁场或顺磁场的形成、共价键形成、离子相互作用如离子晶格中发生的离子相互作用、氢键或者范德华力相互作用如偶极-偶极相互作用、偶极-诱导的偶极相互作用，诱导的偶极-诱导的偶极相互作用或互斥作用，或者上述吸引力的任何组合。在某些实施方式中，IL-10功能抑制剂是能与IL-10的至少一部分发生免疫反应的抗原结合分子。在这些实施方式中，抗原结合分子可与IL-10的活性或失活形式发生免疫反应，不同之处在于活性细胞因子的抗原结合分子更可能识别仅以活性构象存在的表位。说明性抗原结合分子和其生产方法参见美国专利5,837,232;5，837，293和6,239,260。在其它实施方式中，IL-10功能抑制剂是能够特异性阻止IL-10的细胞受体活化的任何分子。例如，这种抑制剂可以是能与IL-10受体发生免疫反应的抗原结合分子，其代表性例子参见美国专利号5,863,7%。或者，此种类型的抑制剂可选自可溶性或缺陷型IL-10受体或可溶性IL-10受体亚基。此种类型的代表性受体参见例如美国专利5,843,697和6,423,500，美国专利申请公开号20040204351和20050064464，Tan等(1995，J5/o/.CAem.270:12906)和GenBank登录号U00672或NM—001558。在其它实施方式中，IL-10功能抑制剂是在细胞(如细菌细胞)表面上表达的IL-10受体，如美国专利申请公开号20020019043所述。在一些实施方式中，IL-10功能抑制剂是抑制IL-10基因表达或其表达产物的功能活性的核酸。在此种类型的说明性例子中，该抑制剂能降低或消除IL-10基因表达，包括但不限于用于抑制刺激IL-10信号传导途径信使RNA的翻译的寡核糖核苷酸序列(包括反义RNA和DNA分子)以及核酶。反义RNA和DNA分子用于通过结合于靶mRNA、阻止蛋白质翻译而直接阻断mRNA的翻译。在反义DNA的情况下，优选衍生自翻译起始位点如-10和+10之间区域的寡脱氧核糖核苷酸。对IL-10基因和其转录物具有特异性的说明性反义寡核苷酸参见美国专利号6,184,372。或者，介导靶基因或基因转录物的RNA干扰(RNAi)的RNA分子可用于减少或消除基因表达。RNAi指通过引入与靶基因转录物同源的单链、一般是双链的RNA(dsRNA)，干扰或破坏靶基因的产物。因此，在一些实施方式中，对应于IL-10基因的至少一部分的dsRNA本身，特别是产生dsRNA的构建物可用于减少或消除其表达。RNAi-介导的基因表达抑制可用本领域报道的任何技术完成，例如将编码茎环或发夹RNA结构的核酸构建物转染入靶细胞的基因组，或表达转染的与趋同启动子之间的耙基因有同源性的核酸构建物，或从单个启动子后头对头或尾对尾复制。可采用任何相似的构建物，只要它能产生具有向后折叠至其本身和产生dsRNA的能力的单链RNA，或者只要它能产生能退火形成与靶基因有同源性的dsRNA的两条单独的RNA转录物。或者，指导切割其对应的特定mRNA的约为21-23个核苷酸的RNA分子(如Tuschl等的美国专利申请号20020086356所述)可用于介导RNAi。此种21-23ntRNA分子可含有3'羟基，可以是单链或双链(为两条21-23ntRNA)，其中该dsRNA分子可以是钝端或含有突出端(如5'、3')。在其它实施方式中，IL-10功能抑制剂是IL-10的小分子调节剂，其说明性例子包括p-alethine、P-丙氨酰牛磺酸、苄氧羰基(3-丙氨酰牛磺酸以及属于美国专利号6,451,853所述化合物的各种其它氨基硫醇和氨基磷酸酯，以及如美国专利号6,723,736所述的取代的异喹啉、异二氢色原酮和异二氢苯并噻喃酮(isothiochromanone)。IL-10功能抑制剂最好对宿主无毒，并且副作用很小或可忽略不计。2.2免疫调节剂2.2./拔嚴本发明考虑将对应于对感兴趣的靶抗原的至少一部分的任意抗原用于本发明的组合物中，用于刺激针对该靶抗原的免疫应答。这种抗原可以是可溶形式(如肽、多肽或可由其表达肽或多肽的核酸分子)或者是全细胞或减毒病原体制剂的形式(如减毒的病毒或细菌)，或者可用下面进一步详述的抗原递呈细胞递呈这种抗原。用于本发明的靶抗原一般是蛋白性分子，其代表性例子包括多肽和肽。这种分子也可包括例如非蛋白性部分，例如但不限于简单的中间代谢物、糖、脂质和激素，以及大分子如复合糖、磷脂和核酸。靶抗原可选自宿主产生的内源性抗原或宿主以外的外源性抗原。合适的内源性抗原包括但不限于癌或肿瘤抗原。癌或肿瘤抗原的非限制性例子包括来自癌或肿瘤的抗原，所述癌或肿瘤选自ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、腺囊瘤、肾上腺皮质癌、特发性髓样化生、脱发、软组织腺泡状肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调-毛细管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、CNS肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、儿童脑瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤纤维肉瘤隆起、结缔组织增生性小圆细胞瘤、导管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、肝外胆道癌、眼癌、眼睛黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠-类癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖细胞肿瘤、妊娠期-滋养层-疾病、神经胶质瘤、妇科癌症、血液恶性肿瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金病、人乳头瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、下咽部癌症、眼内黑色素瘤、岛细胞癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汗斯细胞组织细胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、肾的恶性杆状体肿瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口癌、多发性内分泌瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓发育异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生病、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen断裂综合征、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞月巿癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周-神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多、前列腺癌、罕见癌症和相关疾病、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、罗-汤二氏综合征、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞-癌(肾-骨盆-A输尿管)、滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌、ur叩lakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、肾母细胞瘤。在某些实施方式中，癌症或肿瘤涉及黑色素瘤。黑色素瘤相关抗原的说明性例子包括黑色素细胞分化抗原(如gplOO、MART、Melan-A/MART-1、TRP-1、Tyros、TRP2、MC1R、MUC1F、MUC1R或其组合)和黑色素瘤-特异性抗原(如BAGE、GAGE-1、gplOOIn4、MAGE-1(如GenBank登录号X54156和AA494311)、MAGE-3、MAGE4、PRAME、TRP2IN2、NYNS01a、NYNS01b、LAGE1、p97黑色素瘤抗原(如GenBank登录号M12154)、p5蛋白、gp75、癌胚(oncofetal)抗原、GM2和GD2神经节苷脂、cdc27、p21ras、gpl00Pmel'17或其组合。其它肿瘤特异性抗原包括但不限于etv6、amll、亲环蛋白b(急性淋巴细胞性白血病)；Ig-独特型(B细胞淋巴瘤)；E-钙粘着蛋白、a-联蛋白、(3-联蛋白、"联蛋白、pl20ctn(祌经胶质瘤)；p21ras(膀胱癌)；p21ras(胆管癌)；MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2(乳腺癌)；p53、p21ras(宫颈癌)；p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族、Cripto-l蛋白、Pim-l蛋白(结肠癌)；结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC(结直肠癌症)；癌胚抗原(CEA)(结直肠癌；绒毛膜癌)；亲环蛋白b(上皮细胞癌症)；HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白(胃癌)；甲胎蛋白(肝细胞癌)；Imp曙l、EBNA-1(霍奇金淋巴瘤)；CEA、MAGE-3、NY-ESO-l(肺癌)；亲环蛋白b(淋巴细胞衍生的白血病)；MUC家族、p21ras(骨髓瘤)；HER2/neu、c-erbB-2(非小细胞肺癌)；Imp-l、EBNA-1(鼻咽癌)；MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2、MAGE-A4、NY-ESO-l(卵巢癌)；前列腺特异性抗原(PSA)和其抗原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白(前列腺癌)；HER2/neu、c-erbB-2(肾癌)；病毒产物如人乳头瘤病毒蛋白(宫颈和食道的鳞状细胞癌症)；NY-ESO-l(睾丸癌)；和HTLV-1表位(T细胞白血病)。外来或外源性抗原适合选自致病性生物体的抗原。示范性致病性生物体包括但不限于病毒、细菌、真菌、寄生物、藻类以及原生动物和变形虫。说明性病毒包括产生某些疾病的病毒，这些疾病和病毒包括但不限于麻疹、腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎、甲型肝炎、乙型肝炎(如GenBank登录号E02707)、丙型肝炎(如GenBank登录号E06890)、以及其它肝炎病毒、流感、腺病毒(如4和7型)、狂犬病(如GenBank登录号M34678)、黄热病毒、EB病毒和其它疱疹病毒如乳头瘤病毒、艾波拉病毒、流感病毒、日本脑炎(如GenBank登录号E07883)、登革热(如GenBank登录号M24444)、汉他病毒、仙台病毒、呼吸道合胞病毒、othromyxovims、水泡性口膜炎病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、巨细胞病毒和人体免疫缺陷病毒(HIV)(如GenBank登录号U18552)。衍生自这些病毒的任何合适抗原均可用于实施本发明。例如，衍生自HIV的说明性逆转录病毒抗原包括但不限于抗原如gflg、；o/和em;基因的基因产物、Nef蛋白、逆转录酶和其它HIV组件。肝炎病毒抗原的说明性例子包括但不限于抗原如乙型肝炎病毒的S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒的前S抗原，以及其它肝炎如甲、乙、丙型肝炎的病毒组件如丙型肝炎病毒RNA。流感病毒抗原的说明性例子包括但不限于抗原如血凝素和神经氨酸酶和其它流感病毒组件。麻疹病毒抗原的说明性例子包括但不限于抗原如麻疹病毒融合蛋白和其它麻疹病毒组件。风疹病毒抗原的说明性例子包括但不限于抗原如蛋白E1和E2以及其它风疹病毒组件；轮状病毒抗原如VP7sc和其它轮状病毒组件。巨细胞病毒抗原的说明性例子包括但不限于抗原如包膜糖蛋白B和其它巨细胞病毒抗原组件。呼吸道合胞病毒抗原的说明性例子包括抗原如RSV融合蛋白、M2蛋白和其它呼吸道合胞病毒抗原组件。单纯疱疹病毒抗原的说明性例子包括但不限于抗原如立即早期蛋白、糖蛋白D和其它单纯疱疹病毒抗原组件。水痘带状疱疹病毒抗原的非限制性例子包括抗原如9PI、gpll和其它水痘带状疱疹病毒抗原组件。日本脑炎病毒抗原的非限制性例子包括抗原如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1、NSl-NS2A、80。/。E和其它日本脑炎病毒抗原组件。狂犬病病毒抗原的代表性例子包括但不限于抗原如狂犬病糖蛋白、狂犬病核蛋白和其它狂犬病病毒抗原组件。乳头瘤病毒抗原的说明性例子包括但不限于Ll和L2衣壳蛋白以及与宫颈癌有关的E6/E7抗原，其它病毒抗原的例子请参见FundamentalVirology(基础病毒学)，第二版，Fields,B.N.和Knipe，D.M.编，1991，RavenPress,纽约。真菌的说明性例子包括枝顶孢(Jc"mom、mspp.)、曲霉(J^^g〃/z^spp.)、蛙粪-霉菌06<25/^/060/1spp.)、^X牛及霉(5^o/a〃jspp.)、皮炎芽生菌(5/。Wcw^cesc/erma"cfc1)、念珠菌(C朋(&fospp.)、卡氏支孢并瓦霉(C7a<i。p/"'a—/zoracar'".om7)、CoccoWocfes/,"m/"S、耳H(Com'(iz'o6o/z^spp.)、1^急5求菌(0^ptococci^spp.)、弯包菌(Cwn^/ar/(3spp,)、表皮癣菌CEp/^ermop/z少to77spp.)、聖玩氏夕卜并瓦霉(五xop/z/fl/flye"/we/me/)、-突脐蠕f包菌(￡xwoM,spp.)、紧密着色真菌(F。/潔caeac謹戸"a)、裴氏着色真菌(Fo'，caeapet/ra50/)、尖孢镰刀菌(尸M5W7.Mmoxysporaw)、腐皮镰刀茵CFwsa〃'wmso/am.)、白地霉(Geofr/c/zwmca/W/fi^m)、荚膜组织胞3炙菌荚膜变禾中(///Wop/oswaca/ww/a,z#nvar.capsulatum)、荚膜组织胞浆菌杜氏变禾中(/7yWopAxs""2(2copra/a^7"var.duboisii)、//ortaeawer"ecfo'/、Lacaz/aZo6ch'、座月空双胞菌(丄os/oiiz》/orifa^zeo6ra"7fle)、塞内力H尔钓端球体(丄e/to5p/w^r/"sewega/e"^s7.力、灰色马丰土拉53、支菌(Mflfi^re〃agr&ea)、足马木土拉分木支菌(Afa^^e〃a"mycetoma""、糠禾比马拉色菌(Afa/a5"z/a/w//z^)、小芽胞菌(M/'c/awpon/mspp.)、罗萨梯新龟甲开》菌(脸0細"(^."簡油'0、0"yc/zoco/acamw/譜^、巴西酉良母菌(Paracocc油'oz.(ies6ms77/em7'力、疣状并瓦毒(尸/z/a/op/zoravem/casa)、何德毛结节菌(尸/edra/a/2ortoe)、尸/et/ra/a/zo加e、花斑癣(尸/，/a5^ver57'co/or)、尸sez^fa〃e6^m'a6qy<i//、罗梅罗朿lJ壳抱菌(尸yre"oc/zaetor。mera/)、少根根毒(7/2/zopwsmr/z/zw力、小帝样毒菌(Sco戸/an'o戸'i16/rvZcowfc)、双间柱顶抱(Sqyto/Ww附t/ZmW她w)、申克抱子丝菌(!S^ora决r/x5c/zewc嗣、毛癣菌(7Wc/zop/2y加spp.)、毛抱子菌(7Wc/zasporaMspp.)、接合菌(Z少gomcefe)、伞枝犁头霉(」/7^//<3cor_ym6i/fera)、微小根毛霉(i/z/zowwcor;wj7'〃z^)和少根根霉(i/^o;myfl/r/z/z"力。因此，可用于本发明组合物和方法的代表性真菌抗原包括但不限于念珠菌真菌抗原组件；组织浆菌属真菌抗原如热激蛋白60(HSP60)和其它组织浆菌属真菌抗原组件；隐球菌真菌抗原如荚膜多糖和其它隐球菌真菌抗原组件；球孢子菌真菌抗原如小球体抗原和其它球孢子菌真菌抗原组件；以及癣类真菌抗原如发癣菌素和其它球孢子菌真菌抗原组件。细菌的说明性例子包括产生疾病的细菌，所述疾病包括但不限于白喉(如白喉棒杆菌(Cor》'"e6a"en'""！a^/^/ien'ae))、百日咳(如百日咳博德特菌CSo/Y/"e〃apeWw^/力，GenBank登录号M35274)、破伤风(如破伤风梭菌(C/o^^Z/w"eta"/)，GenBank登录号M64353)、结核病(如结核杆菌(M少co6fl"er&m/"Z^xzJcw/力)、细菌性肺炎(如流感嗜血杆菌C^emc^Mw一画雄))、霍舌L(如霍乱弧菌(,/oc/zo/erae))、炭疽(如炭疽杆菌(Sacz'〃^A7^/zrac/力)、伤寒、鼠疫、志贺菌病(如痢疾志贺菌(57z/ge〃a办se"fer/ae))、肉毒中毒(如肉毒梭菌(C7oWn't/z'wm6c^/z>7wm))、沙门菌病(如GenBank登录号L03833)、消化性溃疡(如幽门螺杆菌(/^//"^"^;^/on'))、军团病、莱姆病(如GenBank登录号U59487)。其它病原菌包括大肠杆菌(focAer/c/^co/z')、产气荚膜梭菌(C/(wzW<i/MWpe;yH"gemO、铜绿假单胞菌(尸^wc/owo"cwwwg/〃05a)、金黄色葡萄球菌(6"top/zy/ococcw5"iz厂gM5)禾口化胺,连王求菌(5Yre/tococcz^pj^g^")。因此，可用于本发明组合物和方法的细菌抗原包括但不限于百日咳细菌抗原如百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素(pertactin)、FM2、FIM3、腺苷酸环化酶和其它百日咳细菌抗原组件；白喉细菌抗原如白喉毒素或类毒素和其它白喉细菌抗原组件；破伤风细菌抗原如破伤风毒素或类毒素和其它破伤风细菌抗原组件，链球菌细菌抗原如M蛋白和其它链球菌细菌抗原组件；革兰阴性杆菌细菌抗原如脂多糖和其它革兰阴性细菌抗原组件；结核杆菌(A<yco^Cter/"m^Z)^cM/(w/力细菌抗原如分枝菌酸、热激蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白、抗原85A和其它分枝杆菌抗原组件；幽门螺杆菌(i/e"co^cter;^/on')细菌抗原组件，肺炎球菌细菌抗原如肺炎链球菌溶血素、肺炎球菌荚膜多糖和其它肺炎球菌细菌抗原组件；流感嗜血杆菌(ifoemo;M^^j^e^)细菌抗原如荚膜多糖和其它流感嗜血杆菌细菌抗原组件；炭疽细菌抗原如炭疽保护抗原和其它炭疽细菌抗原组件；立克次体细菌抗原如rompA和其它立克次体细菌抗原组件。本文所述细菌抗原也包括任何其它细菌、分枝杆菌、支原体、立克次体或衣原体抗原。原生动物的说明性例子包括产生疾病的原生动物，包括但不限于症原虫(如GenBank登录号X53832)、钩虫、盘尾丝虫(如GenBank登录号M27807)、血吸虫(如GenBank登录号LOS198)、弓形体、锥虫、利什曼原虫、贾第鞭毛虫(GenBank登录号M33641)、阿米巴、丝虫(如GenBank登录号J03266)、疏螺旋体(borreliosis)和旋毛虫。因此，可用于本发明组合物和方法的原生动物抗原包括但不限于恶性症原虫(p/wmoJ&m/a/c^^rwm)抗原如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环孢子体抗原、配子母细胞/配子表面抗原、血液期抗原pf155/RESA和其它症原虫抗原组件；弓形体抗原如SAG-1、p30和其它弓形体抗原组件；血吸虫抗原如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和其它血吸虫抗原组件；硕大利什曼原虫和其它利什曼原虫抗原如gp63、脂磷酸聚糖及其相关蛋白和其它利什曼原虫抗原组件；以及克氏锥虫0，朋oro/憩cn/z/)抗原如75-77kDa抗原、56kDa抗原和其它锥虫抗原组件。本发明也考虑将毒素组件用作抗原，其说明性例子包括葡萄球菌肠毒素、中毒性休克综合征毒素；逆转录病毒抗原(如衍生自HIV的抗原)、链球菌抗原、葡萄球菌肠毒素-A(SEA)、葡萄球菌肠毒素-B(SEB)、葡萄球菌肠毒素-3(SEw)、葡萄球菌肠毒素-D(SED)、葡萄球菌肠毒素-E(SEE)以及衍生自支原体、分支杆菌和疱疹病毒的3三3三每索。对应于靶抗原的至少一部分的抗原可从天然来源分离，或可用本领域已知的重组技术制备。例如，可由需要调节免疫应答的细胞群或组织获得的抗原递呈细胞的MHC和其它递呈分子洗脱肽抗原。可采用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化洗脱的肽(Rawson等，2000，CancerRes,6)，4493-4498)。如果需要，可对纯化的肽进行测序，并用如下所述的标准蛋白质合成技术生产合成的肽。或者，可通过分离需要调节免疫应答的细胞群或组织的样品，接着裂解该样品或使该样品处于导致形成凋亡细胞的条件下(如紫外线或Y射线辐射、病毒感染、细胞因子或通过耗尽细胞培养基中的细胞营养、与过氧化氢培育、或者与药物如地塞米松、神经酰胺化疗药和抗-激素药如醋酸亮丙瑞林(Lurpon)或他莫昔芬(Tamoxifen)培育)，来产生粗抗原制剂。接着，裂解物或凋亡细胞可用作的粗抗原的来源，以可溶形式使用或与抗原递呈细胞接触，下面作进一步详述。当抗原己知时，可用下述标准方法方便地制备重组形式的抗原Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)(ColdSpringHarborPress,1989)，具体是第16和17章；Ausubel等，《新编分子生物学方法》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(JohnWiley&Sons，Inc.1994-1998)，具体是第10和16章；以及Coligan等，《新编蛋白质科学方法》(CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE)(JohnWiley&Sons,Inc.1995-1997)，具体是第1、5和6章。一般地，可用包括以下步骤的方法制备抗原(a)提供可由其表达靶抗原或其类似物或模拟物的表达载体；(b)将载体引入合适的宿主细胞；(C)培养该宿主细胞，以由该载体表达重组多肽；和(d)分离该重组多肽。通常，该表达载体含有操作性连接于调节性多核苷酸的的编码抗原的多核苷酸。可从编码对应于感兴趣靶抗原的抗原的任何合适母体多核苷酸构建编码抗原的多核苷酸。母体多核苷酸适合为天然基因或其部分。然而，母体多核苷酸可能不是天然产生的，而是用重组技术工程改造的。调节性多核苷酸适合包含转录和/或翻译控制序列，它们通常是适合用于表达编码抗原的多核苷酸的宿主细胞的序列。一般地，该转录和翻译调节控制序列包括但不限于启动子序列、5'非编码区、顺式调节区如转录调节蛋白或翻译调节蛋白的功能结合位点、上游开放阅读框、转录起始位点、翻译起始位点和/或编码前导序列的核苷酸序列、终止密码子、翻译终止位点和3'非翻译区。本发明也考虑本领域已知的组成型或诱导型启动子。这类启动子可以是天然产生的启动子，或者是组合了一种以上启动子元件的杂合启动子。本发明考虑的启动子序列可能是准备引入的宿主细胞的天然序列，或者可能衍生自另一来源，只要该区域在该宿主细胞中有功能。表达载体也可包含3'非翻译序列，该序列通常指包含含有聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号的DNA节段的基因部分。聚腺苷酸化信号的特征是能影响聚腺苷酸束加到mRNA前体的3'端。通常通过与规范形式5'AATAAA-3'有同源性来识别聚腺苷酸化信号，但也不是没有变化。3'非翻译调节性DNA序列一般包含约50-1，000个核苷酸碱基对，并且除聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号外，还可含有转录和翻译终止序列。在某些实施方式中，表达载体还含有选择性标记基因，以便选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域熟知的，随所用宿主细胞而变。该表达载体也可含有融合伙伴(一般由表达载体提供)，以便该重组多肽与该融合伙伴表达成融合多肽。融合伙伴的主要优点是它们有利于鉴定和/或纯化所述融合多肽。融合伙伴的熟知例子包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六组氨酸(HIS6)，它们尤其可用于用亲和色谱分离融合多肽。出于用亲和色谱纯化融合多肽的目的，亲和色谱的相关基质分别是谷胱甘肽-、直链淀粉-和镍-或钴-偶联树脂。许多这种基质可以"试剂盒"形式获得，如与(HIS6)融合伙伴一起使用的QIAexpressTM系统(Qiagen)和PharmaciaGST纯化系统。优选地，融合伙伴也含有蛋白酶切割位点，如因子Xa或凝血酶的切割位点，它能使相关蛋白酶部分消化本发明的融合多肽，从而由其释放本发明的重组多肽。接着，可用后续的色谱分离法从融合伙伴分离释放的多肽。融合伙伴的范围内也包含"表位标签"，它通常是可获得其特异性抗体的短肽序列。不难获得其特异性单克隆抗体的表位标签的熟知例子包括c-Myc、流感病毒血凝素和FLAG标签。将表达载体引入宿主细胞的步骤可通过包括转染、转导病毒载体和转化的任何合适方法实现，所述病毒载体包括腺病毒、修饰的慢病毒和其它逆转录病毒载体，所述方法的选择取决于所用的宿主细胞。这些方法是本领域技术人员熟知的。可以在适合蛋白质表达的条件下培养用表达载体转化了的宿主细胞，从而产生重组多肽，所述条件取决于选择的表达载体和宿主细胞。本领域技术人员通过常规实验易于确定该条件。适合表达的宿主细胞可以是原核或真核细胞。用于表达本发明多肽的一种优选的宿主细胞是细菌。所用细菌可以是大肠杆菌(五化/2er/cA/flco//)。或者，所述宿主细胞可以是昆虫细胞，如可与杆状病毒表达系统一起使用的SF9细胞。在一些实施方式中，与IL-10功能抑制剂一起给药的抗原是可表达该抗原的构建物或载体的形式。或者，可按照(例如)Atherton和Sheppard(《固相肽合成实践方法》(SolidPhasePeptodeSynthesis:APracticalApproach)，IRLPress,OxfordUniversityPress，Oxford,英国，1989)或Roberge等(1995，&/e"ce269:202)所述的方法，用溶液合成或固相合成方法来合成抗原。合成抗原的氨基酸可以是非天然产生的或天然产生的氨基酸。肽合成过程中非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于采用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本发明考虑的非天然氨基酸的列表见表B。表B<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>Complextableseetheoriginaldocumentpagex</column></row><table>本发明也考虑了用普通分子生物学技术修饰肽抗原，以便改变其对蛋白水解降解的耐受性或优化其溶解特性或使它们更适合用作免疫原性物质。肽抗原可以是可用于剌激或抑制对感兴趣耙抗原的免疫应答的任何合适大小。许多因素可影响肽大小的选择。例如，可选择肽大小，以使其包含或对应于T细胞表位和/或B细胞表位的大小，并满足其加工需要。本领域技术人员了解，I类-限制性T细胞表位的长度一般为8-10个氨基酸残基，如果置于非天然侧接残基旁边，此表位通常需要2-3个天然侧接氨基酸残基，以保证它们能被有效地加工和递呈。II类-限制性T细胞表位的长度通常为12-25个氨基酸残基，可能不需要天然侧接残基就能进行有效的蛋白水解加工，虽然认为天然侧接残基可起到一定作用。II类-限制性表位的另一个重要特征是它们的中部通常含有9-10个氨基酸残基的核心，该核心特异性结合于II类MHC分子，此核心任一侧的侧接序列通过以序列非依赖性方式与II类MHC抗原任一侧的保守结构结合而稳定该结合。因此，II类-限制性表位的功能区的长度一般短于约15个氨基酸残基。线性B细胞表位的大小和影响其加工的因素如II类-限制性表位的变化相当大，虽然这种表位的大小常常小于15个氨基酸残基。综上所述，肽大小宜(但不一定)为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30个氨基酸残基。适当地，肽大小不大于约500、200、100、80、60、50、40个氨基酸残基。在某些优选实施方式中，肽大小足以由抗原递呈细胞递呈肽中所含的T细胞和/或B细胞表位。本领域已知鉴定和选择有效的抗原性肽的标准(如能够引发免疫应答的最小肽序列)。例如，Apostolopoulos等(2000，Cwrr.0;/w.Mo/.TTzer.2:29-36)讨论了根据对抗原递呈分子的三维结构和它与抗原性肽和T细胞受体的相互作用的了解鉴定最小抗原性肽序列的方案。Shastri(1996，Cm".Qpz'n./mm朋o/.8:271-277)公开了如何从通常结合于MHC分子的数千种肽中区分用于激活T细胞的罕见肽。在一些实施方式中，以合成构建物(或含有操作性连接于调节性多核苷酸的编码该抗原的多核苷酸的表达载体)的形式递送抗原。合适地，调节性多核苷酸含有转录和/或翻译控制序列，这些序列与在感兴趣的细胞或组织类型中的表达相容。一般地，转录和翻译调节控制序列包括但不限于启动子序列、5'非编码区、顺式调节区如转录调节蛋白或翻译调节蛋白的功能性结合位点、上游开放阅读框、核糖体结合序列、转录起始位点、翻译起始位点、和/或编码前导序列的核苷酸序列、终止密码子、翻译终止位点和3'非翻译区。本发明也考虑本领域已知的组成型或诱导型启动子。该启动子可以是天然产生的启动子，或者是组合了一种以上启动子元件的杂合启动子。本发明考虑的启动子序列可能是感兴趣生物体的天然序列，或者可能衍生自另一来源，只要该区域在所选生物体中有功能。启动子的选择取决于所用宿主。例如，可用于在哺乳动物细胞中表达的启动子通常包括金属硫蛋白启动子(可响应于重金属如镉而被诱导)、P-肌动蛋白启动子以及病毒启动子如SV40大T抗原启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期(正)启动子、劳氏肉瘤病毒LTR启动子、腺病毒启动子或HPV启动子，尤其是，也可采用HPV上游调节区(URR)。本领域详细描述了所有这些启动子，它们不难获得。或者，启动子可以是谱系特异性启动子，在这种情况下，特别需要上皮特异性启动子，例如但不限于以下基因的启动子1型谷氨酰胺转移酶、外皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、SPR基因和聚丝蛋白(filagrin)以及角蛋白基因(如K10、K14、K5、Kl)。合成构建物也可含有3'非翻译序列。3'非翻译序列指包含含有聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号的DNA节段的基因部分。聚腺苷酸化信号的特征是能影响聚腺苷酸束加到mRNA前体的3'端。通常通过与规范形式5'AATAAA-3'有同源性来识别聚腺苷酸化信号，但也不是没有变化。3'非翻译调节性DNA序列一般包含约50-1,000个核苷酸碱基对，并且除聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号外，还可含有转录和翻译终止序列。在一些实施方式中，合成构建物还含有可筛选标记基因，以便鉴定含有该合成构建物的细胞。可筛选基因(如/^Z、妳等)是本领域熟知的，并且与在特定细胞或组织类型中表达相容。然而应理解，目前己熟知在异源系统中表达编码蛋白质的多核苷酸，本发明不涉及或依赖于任何特定载体、转录控制序列或其生产技术。相反，可将按照本文所述方法制备的合成多核苷酸以任何合适方式与任何合适的合成构建物或载体一起引入所选细胞或组织，或引入其前体或祖细胞，且可用已知启动子以任何常规方式表达该合成多核苷酸。可用多种非病毒或病毒基因递送载体中的任一种将该合成构建物引入合适的宿主细胞中以进行表达。例如，逆转录病毒(具体说是慢病毒载体)为基因递送系统提供了方便的平台。可用本领域己知技术将感兴趣编码序列(如用于基因治疗应用的序列)插入基因递送载体中，并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒，并经体内或离体递送至对象的细胞中。在-一个说明性实施方式中，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便和有效的平台。可用本领域已知技术将编码对应于靶抗原的抗原的所选核苷酸序列插入载体中，并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒，并递送给对象。已经描述了几种说明性逆转录病毒系统，其例子包括美国专利号5,219,740;Miller和Rosman，1989，历orec/zm々wes7:980-990;Miller,A.D.，1990,//wma"Ge"e7Tzera/^1:5-14;Scarpa等，1991，Virology180:849-852;Burns等，1993，尸roc.Ato/.爿cadW.USA卯8033-8037;和Boris-Lawrie和Temin，1993，Cwr(9—.G潔f.Deve/op.3:102-109)。此外，也描述了几种说明性的基于腺病毒的系统。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒保持在染色体外，从而最大程度降低了与插入诱变相关的风险(参见例如，Haj-Ahmad和Graham，1986，J.P7ra/.57:267-274;Bett等，1993，丄Fz.ra/.67:5911-5921;Mittereder等，1994，J7wm朋Ge"er/zera/^5:717-729;Seth等，1994，P7ra/.68:933-940，；Barr等，1994，77zera;^1:51-58;Berkner，K丄.，1988，5/orec/w&wM6:616-629;禾口Rich等，1993，//wmawGe"e777erap_y4:461-476)。已经开发了多种用于递送多核苷酸的腺伴随病毒(AAV)载体系统。不难用本领域熟知技术构建AAV载体。参见例如，美国专利号5,173,414和5,139,941;国际发明者I·H·弗拉泽申请人:昆士兰大学