用于生产白喉毒素的发酵方法

专利名称：：用于生产白喉毒素的发酵方法用于生产白喉毒素的发酵方法
技术领域：
：本发明涉及白喉抗原尤其是毒素(包括白喉毒素的突变形式，例如CRM197)领域和制备大批这样的抗原培养物的发酵方法。白喉毒素是白喉才奉杆菌(Co^y"e6a"en'MWczj^Aen'a)产生的蛋白质外毒素。其以单一多肽的形式产生，该多肽易于被剪接，在190、192或193残基处裂解，结果形成由二硫键连接的两个亚基A片段和B片段(Moskaug等Biol.Chem.264:15709-15713，1989)。A片段为催化活性部分，是依赖NAD的ADP-核糖基转移酶，其特异性耙向蛋白质合成因子EF-2,藉此使EF-2失活，使细胞中的蛋白质合成停止。在感染期间可自然获得对细菌毒素例如白喉毒素的免疫力，或可通过注射去毒形式的毒素(类毒素)人工获得免疫力(Germanier,er，BacterialVaccines,AcademicPress,Orlando,Fl.，1984)。传统上一直通过化学修饰天然毒素来制备类毒素(Lingood等Brit.J.Exp.Path.44;177，1963)，化学修饰使得天然毒素无毒，同时保留抗原性，保护接种的动物可抵抗后来的天然毒素攻击。作为选择，业已阐述了几种已减毒的突变型白喉毒素(US4709017，US495074t))。CRM197为白喉毒素的无毒形式，但其在免疫上与白喉毒素没有区别。CRM197由不产毒噬菌体(3197tox感染的白喉棒杆菌产生，而卩197tox是通过对产毒棒状噬菌体进行亚硝基胍诱突创造的(Uchida等NatureNewBiology(1971)233;8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但其结构基因不同，其中有单义烕基变化。这导致52位的氨基酸从甘氨酸变为谷胺酰胺，使A片段不能结合NAD,因此无毒(Pappenheimer1977,AnnRev,Biochem.46;69-94,RappuoliAppliedandEnvironmentalMicrobiologySept1983p560-564)。白喉类毒素和减毒突变形式CRM197是很多提供抗白喉棒杆菌免疫力的疫苗中的组分。已知几种联合疫苗可预防百日咳博德特氏菌(Borafefe〃a;eWw^z》、石皮伤风4炎菌(C7osW^wwfetom')、白喉棒杆菌和任选的乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus)和/或B型流感嗜血杆菌(i7ae淤o//n7wz'"ywe"zae)(例如参见WO93/24148和WO97/00697、WO02/055105)。白喉毒素和包括CRM197在内的突变形式作为安全有效的糖类T细胞依赖性载体也已用于疫苗。目前CRM197用于B型流感嗜血杆菌寡糖CRM197缀合疫苗(HibTitre;LederlePraxisBiologicals、Rochester,N.Y.)。本领域已熟知制备白喉类毒素(DT)的方法。例如，通过从白喉棒杆菌培养物纯化毒素，接着通过化学去毒，可生产DT，或可通过纯化重组或遗传上去毒的毒素类似物来制备DT(例如US4，709，017、US5，843，711、US5,601,827和US5,917,017阐述的CRM197或其它突变体)。白喉棒杆菌在有氧条件下培养。Rappuoli等(BiotechnologyFebruary1985，pl61-163)建议，通过充入空气和氧气的混合物，将p02调节到25%，空气和氧气可自动调节以维持所需p02。由于蛋白质丰度低，妨碍了用于疫苗的大量白喉毒素例如CRM197的生产。这一问题先前通过将更多拷贝的编码白喉毒素或突变形式的基因引入白喉棒杆菌业已得到解决(US4，925，792;US5,614,382)。这样的方法导致产率增加至约3倍。为了可高水平生产这些有价值的抗原，以可再现的方式进一步改进白喉毒素产率的方法将是有益的。因此，本申请提供改进的发酵方法，其包括在发酵罐中的培养基里培养白喉棒杆菌菌抹的发酵步骤，其在足以维持均质培养物的搅动和限量通气以便培养物中的p02在发酵步骤的大部分时间内降低到低于4%的条件下进行。在有氧但限量通气条件下进行发酵，以便在发酵的大部分时间内(即在其中白喉棒杆菌密度相对低而p02水平可以较高的初始期之后)氧气一进入培养物就被利用。发明人业已发现，与在较高p02时实施的发酵方法相比，在这样的条件下培养导致白喉毒素或突变体更有效和/或更一致地表达。本发明方法比高水平氧气下的发酵更旺盛，使得即使在培养基中含有添加的铁或在使用质量不定的复合原料时，也保持白喉毒素高产率。本发明第二方面提供制备白喉毒素或其突变体制剂的方法，其包括实施本发明发酵方法和从培养物分离白喉毒素或其突变体。尽管本文阐述的是白喉毒素和突变体，但应该想象用本发明方法可分离任何白喉棒杆菌抗原。与保持5%p02或更高例如20%p02比较，〗吏用这样的方法导致白喉毒素或突变体(例如CRM197)产率更高。本发明第三方面提供通过本发明方法分离的白喉毒素或其突变体。本发明第四方面提供包含本发明白喉毒素或其突变体和药学可接受栽体的药物组合物。本发明另一方面提供用于治疗的白喉毒素或其突变体，尤其是用于细菌性疾病例如白喉棒杆菌病的预防治疗。本发明另一方面提供本发明白喉毒素或其突变体在制备用于治疗或预防细菌性疾病尤其是白喉棒杆菌病的药物中的用途。本发明另一方面提供治疗或预防细菌感染尤其是白喉棒杆菌感染的方法，其包括将本发明药物组合物给予患者。附图简述图1-显示充氧曲线(oxygenationprofile)和其在测定发酵KLa中应用的图。A图表示从氮气转换到空气后的充氧时程。B图表示ln(100-pO2)对时间所作的图，其使得可通过测定线,殳的斜率来评估KLa。图2-白喉棒杆菌发酵方法概述。图3-表示典型的白喉棒杆菌培养物生长动力学的图。带圆标的线表示在不同培养时间后的650nrn处的OD值。带方块的线表示培养物的pH。图4-培养物上清液的SDS-PAGE凝胶。第1道为分子量标记；第2道为l吗CRM197标准品；第3道为0.5吗CRM197标准品；第4道为0.25昭CRM197标准品；第5-11道为白喉棒杆菌发酵上清液。A凝胶第5道表示CDT082的上清液，第6-8道表示CDT198的上清液(第6道为22.5小时时取出的上清液；第7道为24小时时取出的上清液；第8道为28小时时取出的上清液)，第9、lO和ll道表示CDT199的上清液(第9道为22小时45分钟时取出的上清液；第10道为24小时45分钟时取出的上清液；第11道为随后微孔过滤和过滤后的上清液)。B凝胶第5道表示CDT082的上清液，第6-9道表示CDT205的上清液(第7道为发酵21小时43分钟后的上清液；第8道为发酵23小时后的上清液；第9道为发酵24小时后的上清液)，第10-13道表示CDT206的上清液(第10道为发酵22小时10分钟后的上清液；第11道为发酵23小时49分后的上清液；第12道为发酵24小时30分钟后的上清液；第13道为微孔过滤和过滤后的上清液)。图5-表示150升发酵罐在每分钟23升的通气条件下不同搅动速度的KLa。发明详述在各种情况下，对于本文术语"包含"、"包括"，本发明者意欲可任选分别被术语"由…组成"来代替。本发明一方面为发酵方法，其包括在发酵罐中的培养基里培养白喉棒杆菌菌抹的发酵步骤，其在足以维持均质培养的搅动(例如足以产生小于30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1秒的混合时间)和限量通气以便培养物中的p02在发酵步骤的大部分时间内降低到低于5%、4°/。、3%、1%或0.5°/。的条件下进行。在优选实施方案中，p02降低到接近零，优选在发酵步骤的大部分时间内接近零。举例而言，从白喉棒杆菌生长到密度足以当氧气一进入培养物就马上大部分被消耗(潜伏期，例如在发酵开始后至少1、2、3、4、5或6小时)，一直到p02浓度再次上升接近发酵步骤结束时的发酵点(例如在潜伏期后16、18、20、22或24小时)，培养物内的p02降到低于5%、4%、3%、1%或0.5%。通常当p02上升超过限量通气条件时，发酵结束，收获培养物。应该注意，在不同的接种条件下，例如当用大得多的白喉棒杆菌培养物接种发酵罐时，从发酵开始后不久(例如在发酵开始后1、5、10、20、30、40或60分钟)就开始限量通气条件。当在34.5。C和0.5巴压力时向培养基通入压缩空气后，用氧气饱和培养基(其中无培养物)时，存在的氧气量为100%p02。对于150升发酵罐，通气速率和搅拌速度应该设定为23升/分钟和240rpm,而对于20升发酵罐，通气速率和搅拌速度应设定为3升/分钟和300rpm。在接种之前，它可设定为在完全充气的发酵培养基中所存在的氧气量。均质培养物为其中细菌均匀^:于整个发酵罐以便在最上端100/0的培养基中存在至少3%、4%、5%、60/。、7°/。、8%、9%或10%的细菌的培养物。发酵步骤定义为其中在发酵罐中培养白喉棒杆菌的步骤。在将预培养物引入发酵罐时开始发酵步骤，当p02在本文所述限量通气条件下最终增加到超过10%时结束。发酵步骤通常持续超过12、14、16、18、20或24小时，例如16-40小时，或例如22-28小时。搅动可任选通过搅拌发酵罐中的培养物来进行，但可以任何其它合适方式，例如通过搅动、振动混合器和/或通气。搅动足以导致培养物的混合时间不低于20、15、10、8、7、6、5、4、3、2或1秒。可在玻璃发酵罐中测量培养物的混合时间。其为引入彩色水溶液后该彩色水溶液均匀分散到整个培养基中所花的时间。发酵罐是适于工业生产细菌培养物的任何设备。然而，该术语并不包括通常用于小规模培养细菌的培养瓶。发酵步骤的大部分时间定义为超过发酵步骤总长度的50%、60°/。、70%、80%或90°/。的时间。发酵通常在限量通气条件下持续12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26或28小时。限量通气阐明了这样的通气条件，其使得白喉棒杆菌可使用有氧呼吸，然而限制可利用的氧气量，以便在培养物密度增加后(例如在至少发酵l、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时后)氧气进入培养物后很快就被消耗，由此p02低于50/0、4%、3%、2%、1%或0.5%。应该注意，通过增加用于接种发酵罐的培养物的量，在接种后很快(例如在发酵开始l、5、10、20或30分钟后)就可能达到限量通气条件。这样的限量通气条件导致毒素例如白喉毒素或其突变体的旺盛表达。通过通气速率和搅动来将p02降低到接近零，以便引入培养物的氧气在进入培养物后很快就被培养物呼吸耗尽，因此尽管对培养物通气，但在氧气监控器上p02读数为零或接近零。在发酵步骤期间，对于给定设置的搅动和通气速率而言，p02将以较高水平开始。这是因为培养物中的细菌密度在发酵步骤开始时低，在发酵步骤期间增加。通常需要一段时间(例如长达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时)pO2才降低到小于5。/。。从这一时间点以后，p02保持低于5%、4%、3%、2%、1%或0.5%,优选接近零的水平，直至接近发酵步骤结束，例如直到收获发酵罐。在整个发酵步骤过程中，任选以恒定KLa来实施发酵步骤。或者，以一种或多种KLa来实施发酵步骤，以便在发酵步骤的大部分时间(至少50%、60%、70%、80%、卯％、95%)内以存在的KLa值来达到限量通气。KLa是对进入培养物的氧气量的度量。KLa越高，则引入培养物的氧气速率越高。包括培养基体积和组成、搅动、通气、压力、温度和发酵罐的可移部分的位置和特性在内的几种因素都会影响具体发酵步骤的KLa。通常通过将压缩空气通入培养物中来将氧气引入到发酵培养物中。在引入到培养物中的空气中存在不同浓度的氧气时，应该考虑到这点来调整流量。例如，在100%氧气供给被引入到培养物中时，流量将相应地低一些。在将含氧量低于空气的气体引入到培养物中时，应该采用较高的流量。可用实施1所述方法测量KLa。该方法涉及i殳定测量KLa采用的发酵罐的培养基体积、温度、压力、搅动和通气条件，其通过用氮气取代空气来吹出气体，通过恢复通入空气来吹进气体，测量p02回到其稳态水平时的速率。ln(100-pO2)=-KLa.T十C通过ln(100-pO2)对时间作图，直线斜率(或角系数)为KLa。发酵步骤的KLa受到多种因素影响，所述因素包括培养物的搅动量和培养物的通气速率。当例如降低培养物搅动并增加通气速率，或正好相反时，可维持恒定的KLa。然而，在实施方案中，在发酵步骤期间培养物的搅动和通气速率二者都恒定。举例而言，发酵步骤以下面的KLa来实施10-200h-l、10-150h-l、10-100h-l、10-80h-l、10-50h-l、10-40h曙l、10-30h-l、20-150h-l、20-100h-l、20-50h國l、20-60h-l、20-80h-l、20-30h-l、20-40h-l、30-60h-l、60-80h-l、60-150h-l或60-200h曙l。本发明发酵方法的KLa可变化，其视发酵培养物的多少而定。对于10-30升培养物而言，可用10-30h-l、15-30、20-30或22-28h-1的KLa。对于30-250升培养物，可用30-60或40-50h-l的KLa。对于250-800升培养物，可使用30-50、40-50、40-60、30-60、30-80或60-150h-l的KLa。对于800-3000升培养物，可使用30-50、40-50、40-60、30-60、30-80、60-150或60-200h-l的KLa。对于10-30升量的发酵培养物，例如通过用l-5升/分钟的空气流量或通气速率和200-400rpm的搅拌速度，例如用2-4升/分钟的通气速率和250-350rpm的搅拌速度，可达成10-30h-l的KLa。对于30-250升的发酵培养物，例如通过用15-25升/分钟的空气流量和150-250rpm的搅拌速度，例如通过用20-25升/分钟的空气流量和200-250rpm的搅拌速度，例如通过用15-20升/分钟的空气流量和200-250rpm的搅拌速度，可达成30-60h-l的KLa。在发酵步骤期间，在CY培养基中的白喉棒杆菌培养物的pH视培养物通气和搅动条件而定(Nikolajewski等J.BiologicalStandardization,1982,10;109-114)。在发酵步骤开始时，CY培养基的pH为7.4。在低通气或低KLa情况下，pH降到大约5。在高通气情况下，pH上升到大约8.5。在本发明一个实施方案中，在CY培养基或SOC培养基(SambrookJ等1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)或相似培养基中培养白喉棒杆菌。通过通气程度任选无需加入酸或碱，发酵罐中的pH可维持在7,0-7.8。本发明方法可使用任何白喉棒杆菌菌抹。这样的菌抹可产生野生型白喉毒素、包含白喉毒素或其片段的融合蛋白(例如揭示于US5863891中的融合蛋白)或白喉毒素突变形式或片段，优选减毒毒素。这样的突变毒素的实例有CRM176、CRM197、CRM228、CRM45(Uchida等J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107和由Nicholls和Youle在GeneticalyEngineeredToxins,Ed:Frankel,MaecelDekkerInc，1992中阐述的其它突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gin或Ser和/或Ala158变为Gly和揭示于US4709017或US4950740的其它突变；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中至少一个或多个残基突变和揭示于US5917017或US6455673的其它突变；或揭示于US5843711的片段。在实施方案中，白喉棒杆菌菌抹产生CRM197。在实施方案中，以下白喉棒杆菌菌株用于本发明方法ATCC39255、ATCC39526、ATCC11049、ATCC11050、ATCC11051、ATCC11951、ATCC11952、ATCC13812、ATCC14779、ATCC19409、ATCC27010、ATCC27011、ATCC27012、ATCC296、ATCC43145、ATCC51280或ATCC51696。用于本发明的培养基可含有一种或多种以下组分5-20g/L、10-16g/L或10g/L酪蛋白氨基酸或酪蛋白水解物；5-20g/L、7-15g/L或9-12g/L大豆蛋白胨；和/或10-40g/L、14-32g/L或18-22g/L酵母膏。已知生长培养基的铁含量可影响白喉棒杆菌的生长，并影响毒素的生产(参见WO00/50449)。铁对于细菌生长必不可少，然而，业已证明高浓度的铁抑制毒素的产生。在本发明方法中，培养基的铁含量下限为10、50、75、100、120或150ppb,上限为200、300、400、500、600、700、細、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000ppb。举例而言，培养基中的铁浓度为50-1000ppb、100-1000pb、200-1000ppb、400-1OOOppb、500-1500ppb、700-1300ppb、50-2000ppb、100-2000ppb、200-2000ppb、400-2000ppb、700-2000ppb、50画3000ppb、100-3000ppb、200-3000ppb、400-3000ppb、700-3OOOppb、1000-3000ppb、1500-3000ppb、1700-3000ppb、50-4000ppb、100画4000ppb、200画4000ppb、400-4000ppb、700画4000ppb、1000-4000ppb、1500-4000ppb、1700-4000ppb或2000-4000ppb。铁可呈Fe2+和/或Fe3+的形式。在实施方案中，本发明方法足以耐受培养基中的铁盐存在，以致在使用前无需处理培养基来除去所需要的铁。发酵步骤在适于培养白喉棒杆菌的温度下进行，例如25-45°C、25-40。C、30-38。C或34-35。C。发酵步骤易产生大量泡沫。为了控制泡沫形成，任选将消泡剂加入到发酵罐。任选在发酵罐中例如使用泡沫探测器或机械消沫器以及消泡剂。本发明第二方面为用于制备抗原(例如白喉毒素或其突变体或其片段)制剂的方法,其包括实施上述本发明发酵方法和从培养物分离抗原(例如白喉毒素或其突变体或其片段)的步骤。本发明第三方面为通过本发明方法分离的白喉毒素或其突变体或其片段(例如CRM197)。白喉毒素的毒性任选通过化学处理来减毒，包括用交联剂处理形成类毒素。提及毒素包括类毒素。本发明另一方面为药物组合物，其包含本发明白喉毒素或其突变体(例如CRM197)或片段和药学可接受载体。本发明药物组合物任选进一步包含联合疫苗中的另外的抗原。在实施方案中，与上述白喉毒素、其突变体或其片段联合的抗原包括以下中的一种或多种破伤风类毒素、全细胞百日咳(Pw)、无细胞百日咳(Pa)(如下所述)、乙型肝炎表面抗原、甲肝病毒、B型流感嗜血杆菌多糖或寡糖、奈瑟氏球菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌(TV.mem力g/^fe))多糖或寡糖、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B蛋白、任选作为外膜嚢泡的部分、肺炎球菌多糖或寡糖、肺炎球菌蛋白质或下面所列出的任何抗原。可将细菌多糖缀合到载体蛋白。举例而言，用本发明方法制备的白喉毒素或类毒素或白喉毒素突变体例如CRM197或片段，可用作载体蛋白。然而，也可使用其它栽体蛋白例如破伤风类毒素、破伤风类毒素C片段、肺炎球菌溶血素、D蛋白(US6342224)。特定药物组合物任选含有缀合到不同载体蛋白的多种多糖或寡糖。用本发明方法制备的白喉毒素或其突变体例如CRM197或其片段，可与来源于以下一种或多种细菌的荚膜多糖或寡糖调配脑膜炎奈瑟氏J求菌(iVe&sen'fl附em'"g衍cfc)、B型流感嗜血沐干菌(//0^切0//7^5i'w/we打zaeb)、肺炎链球菌(iSfre/fococcMSp"ewmom'ae)、A组链球菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌CSto//^/ococa^m/rew力或表皮葡萄球菌OStop/^/ococcwse;zVifenm'cfo)。例如，药物组合物或免疫原性组合物可包含来源于脑膜炎奈瑟氏球菌A、C、W-135和Y血清群中一种或多种的荚膜多糖。例如，血清群A和C;A和W、A和Y;C和W、C和Y、W和Y;A、C和W;AC和Y;A、W和Y;C、W和Y或A、C、W和Y可与CRM197调配。在另一实例中，免疫原性组合物包含来源于肺炎链球菌的荚膜多糖。肺炎球菌荚膜多糖抗原优选来自血清群1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最优选来自血清群1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另外的实例含有B型流感嗜血杆菌的PRP荚膜多糖(或寡糖)。另外的实例可含有金黄色葡萄球菌的5型、8型、336、PNAG或dPNAG荚膜多糖。另外的实例可含有表皮葡萄球菌的I型、II型、III型或PIA荚膜多糖。另外的实例可含有B组链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。另外的实例可含有A组链球菌的荚膜多糖，任选进一步包含至少一种M蛋白，更优选包含多种类型的M蛋白。用于本发明的细菌多糖可为已纯化的全长天然多糖。或者，将多糖筛分(size)2-20次，例如2-5次、5-10次、10-15次或15-20次，以便多糖大小小一些从而更易处理。寡糖通常含有2-20个重复单位。这样的荚膜多糖可不缀合或缀合载体蛋白，例如破伤风类毒素、破伤风类毒素C片段、白喉类毒素或CRM197(例如二者都由本发明方法制备)、肺炎球菌溶血素或D蛋白(US6342224)。破伤风毒素、白喉毒素和肺炎球菌溶血素通过遗传突变和/或通过化学处理去毒。可通过任何已知的偶联技术制备多糖或寡糖缀合物。例如可通过硫醚键来偶联多糖。这种缀合方法依靠用四氟硼酸l-氰基-4-二曱氨基吡啶镜(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。由此活化的多糖可直接或通过间隔基团偶联于载体蛋白上的氨基。任选氰酸酯与己二胺偶联，用涉及形成硫醚键的异源连接(heteroligation)化学让氨基衍生化的多糖缀合于栽体蛋白。这样的缀合阐述于PCT申请公开说明书WO93/15760UniformedServicesUniversity中。通过如US4365170(Je皿ings)和US4673574(Anderson)所述的直接还原胺化方法也可制备缀合物。其它方法阐述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。另外的方法涉及溴化氰活化的用己二酸肼(ADH)衍生化的多糖通过碳二亚胺缩合偶联到蛋白载体(ChuC.等Infect.Immunity,(1983)245;256)。在具体实施例中，让白喉毒素或其突变体片段(例如CRM197)缀合于药物组合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种另外的抗原。在一个实施方案中，其与多糖组分缀合，例如细菌多糖，包括上面所列的那些细菌多糖。本发明药物组合物或免疫原性组合物可进一步包含另外的蛋白质组分。其任选与提供抗破伤风和百日咳博德特氏菌感染中一种或多种的保护作用的抗原一起调配。百日咳组分可为杀死的全细胞百曰咳博德特氏菌(Pw)或无细胞百曰咳(Pa)，后两者含有来自PT、FHA和69kDa百日咳杆菌粘附素(pertactin)中的至少一种抗原(优选2种或所有3种)。某些其它无细胞百日咳制剂也含有凝集原，例如Fim2和Fim3，这些疫苗也涵盖用于本发明中。通常提供抗破伤风保护作用的抗原为破伤风类毒素，其为化学失活毒素(例如用甲醛处理后)或通过引入一个或多个点突变而被失活。本发明药物组合物或免疫原性组合物任选包含肺炎球菌蛋白抗原，例如那些暴露于肺炎球菌外膜的肺炎球菌蛋白(在至少部分肺炎球菌生活周期中能够被宿主免疫系统所识别)，或由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。举例而言，所述蛋白可为毒素、粘附素、双组分信号转导物或肺炎链球菌的脂蛋白或它们的片段。这样的蛋白实例包括但不限于肺炎球菌溶血素(优选通过化学处理或突变去毒)[Mitchell等NucleicAcidsRes.1990Jul11;18(13):4010"Comparisonofpneumolysingenesandproteinsfrom5^re/tococcwsp"ewwow/aetypes1and2."、Mitchell等BiochimBiophysActa1989Jan23;1007(1):67-72"ExpressionofthepneumolysingeneinEsc/zeWc/n'aco//:rapidpurificationandbiologicalproperties."、WO96/05859(A.Cyanamid)、WO卯/06951(Paton等)、WO99/03884(NAVA)];PspA和其横-争膜缺失变异体(US5804193-Briles等.)；PspC和其横跨膜缺失变异体(WO97/09994-Briles等)；PsaA和其横跨膜缺失变异体(Berry和Paton，InfectImmun1996Dec;64(12):5255-62"SequenceheterogeneityofPsaA,a37-kilodaltonputativeadhesinessentialforvirulenceofSVreptococcwspwewwcra'ae");肺炎^求菌胆石咸结合蛋白和其4黄跨膜缺失变异体；CbpA和其横跨膜缺失变异体(WO97/41151;WO99/51266);甘油醛3-磷酸脱氬酶(InfectImmun，199664:3544);HSP70(WO96/40928);PcpA(Sanchez-Beato等FEMSMicrobiolLett1998，164:207-14);M样蛋白(EP0837130)和粘附素18627(EP0834568)。包含在免疫原性组合物中的其它肺炎球菌蛋白抗原为阐述于WO98/18931、WO98/18930和PCT/US99/30390中的抗原。与本发明免疫原性组合物一起调配的奈瑟氏球菌蛋白的实例包括TbpA(WO93/06861;EP586266;WO92/03467;US5912336)、TbpB(WO93/06861;EP586266)、Hsf(W099/31132)、NspA(W096/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(也称为D15)(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PldA(PCT/EP99/06718)、FrpB(W096/31618,参见SEQIDNO:38)、FrpA或FrpC或这两种共有的至少30、50、100、500、750个氨基酸的保守部分(W092/01460)、LbpA和/或LbpB(PCT/EP98/05117;Schryvers等Med.Microbiol,199932:1117)、FhaB(WO98/02547SEQIDNO:38)、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、MltA(W099/5728O)和ctrA(PCT/EP00/00135)。奈瑟氏球菌蛋白任选作为纯化蛋白或作为外膜制品的部分加入。本发明药物组合物或免疫原性组合物任选包含可保护宿主4氐抗不可分型流感嗜血杆菌、RSV的一种或多种抗原，和/或可保护宿主抵抗流感病毒的一种或多种抗原。不可分型流感嗜血杆菌蛋白抗原实例包括Fimbrin蛋白(US5766608)和包含来自其中的肽的融合蛋白(例如LB1融合蛋白)(US5843464-OhioStateResearchFoundation),OMP26、P6、D蛋白、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap和D15。流感病毒抗原实例包括全病毒、活病毒或灭活病毒、片段流感病毒(splitinfluenzavirus)(其在鸡蛋或MDCK细胞或Vero细胞中培养)或全流感病毒颗粒(如R.Gluck，Vaccine,1992,10，915-920所述)或其纯化蛋白或其重组蛋白，例如HA、NP、NA或M蛋白或其组合。RSV(呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus))抗原实例包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。应该了解，本发明抗原组合物可包含来自一种细菌的一种或多种荚膜多糖。抗原组合物也可包含来自一种或多种细菌的荚膜多糖。本发明另一方面包括免疫原性组合物或疫苗，其包含由本发明方法制备的白喉毒素、其片段或其突变体(例如CRM197)和药学可接受载体。答的量的佐剂。合适的佐剂包括但不限于铝盐、角豈烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苦衍生物、分枝杆菌细胞壁制备物、单磷脂酰脂质A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、QuilA、霍乱毒素B亚单位、聚磷療(polphosphazene)及衍生物和免疫刺激复合物(ISCOM),例如由Takahashi等(19卯)Nature344:873-875阐述的免疫刺激复合物。对于兽医应用和在动物体内产生抗体，可使用弗氏佐剂的促细胞分裂组分。对于所有免疫原性组合物或疫苗，免疫原的免疫有效量应该凭经验决定。要考虑的因素包括免疫原性、免疫原是否与佐剂或载体蛋白或其它载体形成复合物或共价连接、给药途径和待给予的免疫剂的次数。这样的因素为疫苗领域所知。不必经过过多实验就可作出这些决定，这完全在免疫学者的技术范围内。在本发明药物组合物或疫苗中活性剂可以不同浓度存在。通常，该物质的最低浓度为达成其计划应用所需的量，而最高浓度为保留在溶液或均质悬浮在初始混合物中的最大量。例如，治疗剂的最小量优选将提供单一治疗有效剂量的量。对于生物活性物质，最低浓度为重建时生物活性所需要的量，最高浓度为不能保持均一悬浮液的那一点。在单剂量单位情况下，该量为单一治疗应用的量。通常预期每剂将包含l-100吗蛋白抗原，优选5-50|ig,最优选5-25jig。优选的细菌多糖剂量为10-20jxg、10-5)ig、5-2.5吗或2.5-ljxg。该物质的优选量随物质的不同而变化，但其易于由本领域技术人员确定。或治疗易感染的哺乳动物(例如人类患者)。这些给予可包括通过肌肉、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或通过粘膜给予口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。尽管本发明疫苗可作为单一剂量给予，但其组分也可同时一起给予，或在不同时间给予(例如若疫苗中存在多糖，则为了彼此之间免疫应答最佳协调，其可同时分开给予，或在给予细菌蛋白组合后1-2周单独给予)。除了单一给药途径外，可用2种不同给药途径。例如，可ID(皮内)给予病毒抗原，而可IM(肌肉内)或IN(鼻内)给予细菌蛋白。若存在多糖，则其可IM(或ID)给予，而细菌蛋白可IN(或ID)给予。另外，本发明疫苗的初次剂量可经IM给予，而加强剂量可经IN给予。疫苗制剂在VaccineDesign("Thesubimitandadjuvantapproach"(PowellM.F.和NewmanM.J.编辑)(1995)PlenumPressNewYork)中有全面阐述。Fullerton的US4,235,877阐述可在脂质体内包封。本发明另一方面为制备药物組合物的方法，其包括下述步骤用本发明发酵方法制备白喉毒素或其片段或其突变体(例如CRM197)，和将其与药学可接受载体混合，任选加入任何上述额外抗原。这样的方法还可包括将白喉毒素或其片段或其突变体(例如CRM197)与药物组合物中的一种或多种额外组分(优选如上所述细菌多糖或寡糖)缀合的步骤。本发明另一方面为本发明白喉毒素或其片段或其突变体(例如CRM197)在制备用于治疗或预防细菌性疾病尤其是白喉棒杆菌病的药物中的用途。本发明另一方面为预防或治疗细菌感染(尤其是白喉棒杆菌感染)的方法，其包括将本发明药物组合物、免疫原性組合物或疫苗给予患者。本专利说明书所引用的所有参考文献或专利申请在此引作参考。本发明在附随实施例中阐明。除非另外详述，否则用本领域技术人员熟知和常规的标准技术实施以下实施例。实施例为说明性的，并非限制本发明。实施例实施例1:测量KLa为了测量发酵步骤的KLa，将所需体积的水装入发酵罐，应用发酵参数(例如温度、压力、搅动和通气)使系统达到稳态。p02探针校准为100%。将通气快速转换为氮气，同时保持同样的流量。跟踪p02直至p02降到小于5%。当达到该点时，将通气快速转换为空气，同时保持同样的流量。跟踪p02水平，在几个时间点记录以初始稳态100%水平的百分数记录p02水平。通过1og(100-pO2。/。)对时间作图计算KLa。图形线性部分的角系数对应于KIa。通常只考虑20%-80%p02的数据。结果在不同时间点的p02读数示于以下表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>作图结果如图1所示，从图IB中线的角系数测定KLa。实施例2:以150升^f莫发酵白喉棒杆菌菌林ATCC39255制备CRM197(交叉反应材料)所用的细菌为按照A.Pappenheimer方法(NatureNewBiol.233:8-11,1971)用亚硝基胍处理得到的白喉棒杆菌突变菌抹。其表达去毒白喉毒素(aa52:甘氨酸到谷氨酸突变)。其从ATCC获得，在ATCC其被称为39255。发酵方法概要示于图2。从冰箱(—70。C)取回含有Uxl0^cfu/ml的工作种子，在室温解冻。解冻后立即旋涡振荡管形瓶，用带针头的lml注射器取出250pd种子。将该体积注射到100ml无菌盐溶液(0.9%)中。搅动烧瓶。用带针头的2ml注射器取出2ml悬浮液，用于接种含有500mLUS4，925，792中所述培养基的3-L锥形瓶。在34.5°C±0.5"于250rpm搅拌速度下温育该烧瓶，直至光密度(650nm)达到4.0-6.0(温育后16-19h)。将150升发酵罐灭菌，将100L培养基无菌转入发酵罐。将500mLH3P0425%(V/V)装入酸瓶；培养基pH开始大约为7.4,不调整。在接种的前一天准备发酵罐，保持在34.5。C温度、0.5巴压力、顶部空间空气流量23NL/分钟、搅拌速度50rpm的待用状态16-20h直至接种。在接种之前，将发酵罐设定到培养条件-34.5。C温度、0.5巴压力、喷射入培养基的空气流量23NL/分钟和搅拌速度240rpm。240rpm的搅动提供1.76m/s的端速(tipspeed),理论混合时间为3.9秒。不调节溶解氧，仅对其进行监测，打开泡沫控制系统，使pH达到7.8，此后通过加入H3P04来维持pH。在接种之前，将p02探测器设定在100%。撹拌速度设为240rpm,其对应于1.76m/s的外周速度。240rpm的搅拌速度结合23-L/分钟的通气速率，导致KLa(20-80%、水30°C、0.5巴)估计为42h-l(参见图6)。通过接种端口将400ml上述种子培养物接种到发酵罐。继续发酵直到以下两个条件都得到满足。20小时发酵时间，溶解氧水平增加到10%。总发酵期通常为22-28h。在发酵结束时，改变温度到设为20°C,关闭pH调节，为了限制起泡将空气流转移到顶部空间，关闭泡沫控制系统，其它参数不变。将微孔过滤系统连接到发酵罐上，当悬浮液温度达到2rc时，开始微孔过滤。微孔过滤分两个阶段操作浓缩和渗滤。在浓缩阶段，参数为入口压力0.6巴；出口压力约0.1巴；渗透物流量用校准的蠕动泵(渗透压力约0.3巴)保持在2L/分钟的恒速。浓缩悬浮液直到首次出现以下事件之一。入口压力达到0.9巴或回收了75升渗透物。在渗滤阶段，使用以下参数入口压力保持在浓缩阶段结束时达到的压力(最大为0.9巴)；以2升/分钟加入水；加入的总水量为截留物的3倍体积。将截留物在0.22pm膜上过滤，贮存在+4。C。在+4。C或在室温(+2(TC〈RT〈3。C)储存长达4天后测定这样的悬浮液中的CRM197的稳定性。通过ELISA定量或在SDS-page上未观察到降解和差别。于36。C在BAB琼脂上温育进行试验，以确i正无生长。结果用上述发酵方案进行了两次150-L规;漠的发酵(CDT199和CDT206)。预培养条件和培养条件示于表2和3中，CRM197产率示于表4中。图3所示为典型的预培养物生长动力学图。当O.D.(650nm)为4.0-6.0时，很明显培养物处于指数生长期，pH仅稍有变化。表2预培养条件<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在发酵期间，观察到不同阶段。第一阶段的特征为溶解氧降低直到达到0%(持续时间大约6-7h)。在该阶段pH保持稳定或稍微降低(约0.1pH单位)。在第二阶段pH升高，达到约pH7.8的稳定水平。在该水平，触发pH调节，然而，在这些发酵条件下通常根本不必加入酸。在该pH稳定水平期间，观察到溶解氧水平升高超过0%,接着降到0%。第三阶段特征为pH降低到约7.4。最后，在发酵的22和24h之间，观察到p02升高。这是收获信号。用质谱仪分析发酵罐的排出气体。观察到典型的C02产生曲线(profile),为了评估CRM197产生的动力学，在收获信号后延长了所存在的2次发酵。我们观察到，在达到收获信号后CRM197水平没有增加，但泡沫产生增加。为了限制消泡剂的消耗，优选在收获信号时停止发酵。然而，CRM197似乎并没有受到过量起泡的影响，不发生降解。孩么孔过滤展示了CDT206微孔过滤的数据。当入口压力达到0.9巴时收获74.3L渗透物。在整个浓缩步骤中出口压力为0.15-0.10巴。在整个浓缩步骤中渗透压为0.3-0.4巴，浓缩步骤持续36分钟。对于渗滤阶段，逐渐加入(2L/分钟)75-L水，同时以同样的流量提取渗透物。在渗滤开始时入口压力为0.9巴，结束时降到0.7巴。出口压力稳定在O.l巴。渗滤步骤持续时间为39分钟。CRM197定量低通气条件下CRM197表达水平通常是高通气条件(其中在整个发酵期间p02保持在5%或更高)所达到水平的2-4倍。培养物上清液的染色SDS-page在还原条件下进行培养物上清液的SDS-PAGE凝胶电泳(图4),以便可能检测出任何降解条带(在剪下后可检测出分别为35kD和23kD的2个亚基)。随后用考马斯蓝对其染色。结果来自2次发酵的样品的考马斯染色凝胶示于图4A(CDT199)和4B(CDT206)中。CRM197出现在预期的分子量位置(理论MW:58.4kD)。CRM197未被降解，因为在发酵结束信号后采集的样品中未观察到模式有变化(图4A第9和10道)。CRM197量不受微孔过滤和在0.22pM上最终过滤的影响，因为在图4A的第9和11道显示出等量的CRM197。温度可能对CRM稳定性有负面影响(图4B的第12道)。当样品阀温热时采集该样品，该样品中存在的CRM197量降低了。实施例3:以20升，发酵白喉棒杆菌菌林ATCC39255除了使用20升发酵罐外，用与实施例2所述相似的方法发酵白喉棒杆菌。以300rpm搅动培养物，空气流量设为3升/分钟。在发酵期间不需要加入酸或碱，因为在整个发酵方法中pH保持在大约中性。培养物生长到最终OD(650nm)-18.3。通过对染色凝胶的光密度测定评估，发现CRM197产率为103mg/升。实施例4:以不同规模发酵白喉棒杆菌菌林ATCC39255在恒定KLa条件下培养白喉棒杆菌的发酵方法可用于其它大小和不同设计的发酵罐中。按照表5中所示的发酵罐大小、空气流量和搅动速度条件，达到了高产率的CRM197生产。在不同设计的发酵罐中进行了三次150L规模的发酵。<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表5所示，重要的是KLa,而不是空气流量和搅动速度条件的具体选择。因此，为了产生相似的KLa，较低的空气流量可由较高的搅动速度来弥补，仍可达到很好的CRM197产率。搅动速度应该足以产生均一悬浮液，限制通气以保持低p02。N.B.使用不同发酵罐进行20升发酵。不同几何形状的不同发酵罐导致的kLa值范围示于表5。然而，对于不同的发酵规模，最佳KLa条件不同。因此，对于在20升发酵罐中发酵，较低的22-28h-l的KLa为最佳。最佳KLa条件为允许限量通气使培养物内的p02落在低水平。对于特定大小和几何形状的发酵罐而言，本领域技术人员应该能够容易地确定这样的条件。实施例5:在不同p02时铁浓度对发酵产率的影响按照实施例3提出的方法，进行了一系列20升M^莫的白喉棒杆菌菌抹ATCC39255发酵，使p02在整个发酵的大部分时间4艮低，或以恒定的5。/op02。所存在的Fe3+量变化为不加Fe3+、加入250ppbFe3+、加入500ppbFe3+和力口入500ppbFe2+。通过SDS-PAGE凝月交光密度测定法测定发酵结束时的CRM197产率。该方法给出的结果往往大约比ELISA得到的结果低20%。结果表6<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如表6所示，当白喉棒杆菌在5%p02发酵时，加入^t失导致产率降低。然而，当降低p02水平时，在如实施例3所述的恒定Kla时在低p02条件下进行发酵，得到较高产率，并且该产率不受加入Fe3十的影响。实施例6:在低通气条件下铁浓度对DT或CRM197产率的影响在微孔板中测定不影响CRM197表达的铁浓度范围。微孔板模拟存在于本发明发酵方法中的限量通气条件。在与上述发酵中所用相同的培养基中(在与CY培养基相似的培养基中)实施微孔板培养。从含lg/1Fe3+离子的FeCl3.6H20储液中加入Fe3+。将培养基装入^f效孔板孔中，以8E5细菌/mL进行培养。在表达CRM197的白喉棒杆菌和表达白喉毒素的白喉棒杆菌两种情况下，微孔板于34.5。C在250rpm搅动下培养46h。将样品通过0.22jnm滤器过滤。在用考马斯蓝(来自Pierce的Gelcodeblue染色液)着色的SDSpage(XTCriterion4-12%bistris,来自BioRad)上用光密度测定法测量表达。用于定量的参比是ListBiologicalLaboratoriesINC的白喉毒素CRM突变体，其以不同浓度加到凝胶上。结果表7所示为在微孔板孔中白喉棒杆菌在限量通气条件下于不同铁浓度下生长时的CRM197表达。CRM197表i^JtFe3+所致的抑制并不很敏感，没有明显受到加入lppm或2ppmFe3+的影响。只有在3ppm时CRM197表达出现显著降低。即使是在该Fe3+水平，CRM197表达仍然为不加Fe3+时所达到水平的79%。表7表达CRM197的白喉棒杆菌<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>CRM197产率以不加额外Fe3+达到的产率的百分比表示。在指定条件下于微孔板孔中培养的白喉棒杆菌的DT表达结果示于表8中。在限量通气条件下DT生产对Fe3+所致的抑制也不很敏感。随着Fe3+浓度增加，DT表达增加，在700ppb时达到最大DT产量。只有当Fe3+浓度增加到3ppm时，DT表达才开始下降。表8表达白喉毒素的白喉棒杆菌力口入的Fe3+光密度DT(ppm)46hpH(%)04,168，66100200ppb4,728,42106300ppb4,68，47107400ppb4,98，51125500ppb4,228，59155600ppb4,488,51148700ppb4,048，63167800ppb4，288,52164900ppb4,588,62168lppm4,488,641662ppm4，78,681763ppm4，28，68141DT产率以不加额外Fe3+达到的产率的百分比表示。权利要求1.一种发酵方法，其包括在发酵罐中的培养基里培养白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的发酵步骤，该步骤在足以维持均质培养物的搅动和限量通气以便培养物中的pO2在发酵步骤的大部分时间内降低到低于4％的条件下进行。2.权利要求l的发酵方法，其中所述p02在发酵步骤的大部分时间内降低到接近零。3.权利要求1或2的方法，其中从白喉棒杆菌生长到因快速消耗氧气而足以使p02降低到小于4%的密度时直到发酵步骤完成，保持所述p02小于4%。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述发酵步骤在恒定KLa下进行。5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述发酵步骤在恒定搅动速度和通气速率下进4亍。6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述发酵步骤在可变kLa条件下进行。7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述发酵步骤在10-50h-l的KLa下进行。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述发酵步骤在10-30h-lKLa下于10-30升发酵罐中进行。9.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述发酵步骤在30-60h-l的KLa下于100-250升发酵罐中进行。10.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述发酵步骤在60-150h-l的KLa下于250-800升发酵罐中进行。11.权利要求8的方法，其中所述发酵步骤在l-5L/分钟的压缩空气气流和200-400rpm的搅动速度下进行。12.权利要求9的方法，其中所述发酵步骤在15-25L/分钟的压缩空气气流和150-250rpm的搅动速度下进行。13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养基为CY、SOC或相似培养基，发酵罐中的pH通过通气程度保持在7.0-7.8,而无需力口入酸或碱。14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述白喉棒杆菌菌林产生白喉毒素或其突变体，特别是CRM197。15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述白喉棒杆菌菌林为ATCC39255。16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法足够耐受培养基中的铁盐存在，以致在使用前无需处理培养基来除去铁。17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养基含有10-權0ppb的铁。18.权利要求17的方法，其中所述培养基含有100-3000ppb或1700-3000ppb的4失。19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养基含有5-20g/L酪蛋白氨基酸或酪蛋白水解物。20.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述培养基含有5-20g/L大豆蛋白胨或其它植物蛋白胨。21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养基含有10-30g/L酵母膏。22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述发酵步骤在25-40。C温度下进行。23.前述权利要求中任一项的方法，其中将消泡剂加入到发酵罐中。24.前述权利要求中任一项的方法，其中在发酵罐中使用泡沫探测器或机械消沫器。25.—种制备白喉棒杆菌抗原制剂的方法，其包括实施权利要求1-24中任一项的发酵方法和从培养物分离白喉棒杆菌抗原的步骤。26.权利要求25的方法，其中所述白喉棒杆菌抗原为白喉毒素或其片段或其突变体。27.权利要求26的方法，其中所述抗原为CRM197。28.权利要求25-27中任一项的方法，其包括将一种或多种另外的抗原加到白喉棒杆菌抗原中的步骤。29.权利要求28的方法，其进一步包括让白喉毒素或其片段或其突变体与一种或多种另外的抗原缀合。30.权利要求29的方法，其中所述一种或多种另外的抗原包含细菌多糖或寡糖。31.—种制备药物组合物的方法，其包括让通过权利要求25-30中任一项的方法制备的抗原或白喉毒素或其突变体(缀合的或未经缀合的)与药学可接受载体混合的步骤。32.通过权利要求25-31中任一项的方法制备的抗原、白喉毒素或其突变体在制备用于治疗或预防细菌性疾病的药物中的用途。33.权利要求32的用途，其中所述细菌性疾病为白喉棒杆菌病。34.—种预防或治疗细菌感染的方法，其包括将用权利要求31的方法制备的药物组合物给予患者。35.权利要求34的方法，其中所述细菌感染为白喉棒杆菌感染。全文摘要本发明涉及发酵方法，其包括在发酵罐中的培养基里培养白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的发酵步骤，该步骤在足以维持均质培养物的搅动和限量通气以便培养物中的pO2在大部分发酵步骤中降低到低于4％的条件下进行。文档编号A61K39/00GK101180313SQ200680017793公开日2008年5月14日申请日期2006年3月21日优先权日2005年3月23日发明者M·R·F·奥尔瓦尔,O·M·S·G·拉卢瓦,P·M·H·德霍泰,S·德苏伊申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司