专利名称：：具有磷脂酰丝氨酸结合结构域的嵌合蛋白的利记博彩app具有磷脂,氨酸结合结构域的嵌合蛋白关于，赞助SW^f发的声明。[oooi坏适用。发明背景在多种情况下，止血(弓IElfiL液凝结以停止出血的过程)可能会异常而可會脆及生命，然而仍需要在特定条件下诱导止血的改良方法。止血由血小板引发，血小板是引ML管创口卩腺的血细胞。在Jtbl程中，血小板被"激活"。^活的一方面表现在，脂,氨,)^^膜内侧转移勤卜侧。一旦该过程发生，某些血液凝结蛋白就结合到血小板表面，并在该过程中相互作用，该过程称为"血液凝结"。该过程的最终结果是形成WL歐也称为Da因子)。凝血酶有多种重要作用。首先，它将血蛋白TF维蛋白原转化为纤维蛋白。每个纤维蛋白结合多个其它纤维蛋白分子，形成纤维蛋白凝块，所述凝块支撑血小板，用于卩M:出血。其次，敝酶也撒活血小板，增加参与她过程的血小板数量。再次，凝血酶以加Ml液凝结生化过程的方式影响其它血浆蛋白，例如XI因子。ffll小树或其它PS夕卜露的细胞)表面相互作用的第一个蛋白是组织因T(tf)，^^活形式的vn因T(称为vna因子)，和x因子。MifiL酶的产生，是由血,氨酸蛋白酶Vila因子与其蛋白辅因子TF相互作用而引发。TF是膜结合蛋白，雜与血流,的细面并不彭去，直至它们被撒活。在^ii后，tf结合vn因刊促使皿活为vna因子)或vna因子，提高微X因子转化为Xa因子的催化效率。TF鹏卜结构織全蛋白1-219或3-219氨基酸,部分)在;W杆菌中的皿，产生保留结合VHa因子并变构撒活该因子能力的约26kDa多肽。该f^TF淋为可溶性TF或sTF)不结合细M，因ifcbffl常在皿vn因子自激活或vna因子介导的x因子撒活中，效率比天然TF低得多。sTF编码cDNA的工程化使M哺乳动物细胞表面以糖磷月旨Wl醇锚定蛋白形式,，这导致与天然TF有相同特异性促凝活性的蛋白，这表明该蛋白膜结合相当重要。很久已经意i赠lj，先天Vffl因预乏，tt液凝结由^^度TF引发的情况下，以WL酶产生方面的异常为特征。最近认识到，血小板功能紊乱也与WL酶产量M^相关。维他命K-fM1tt液凝结蛋白，其是WL酶产4^需，其舰结合阴离子磷脂、特别是PS，聚集于激活血小板、内皮细胞禾n/或對亥细胞表面。WL酶，强大的血小板激动剂，其可放大血小板激活，戶腿激活由接触内皮下的胶原暴翻而引发。因此，鹏的凝血酶产生，可能是出血倾向的基础或可放大出血倾向，其中戶，出血倾向伴随着血浆凝结因T^舌L或血小板紊乱。其它文献报道，给动##脉目做酶原激斷膜结合的TF)产生Mlfil的普遍激活，该结果与同时湖sTF和Vna因子相同，在实麵物出血中可产生有益效果，这表明sTF可作为设计的减少出血治疗的基础。期望在有需要的个体中有效增弓IihlfiL和凝血的治疗蛋白。附图简述图1.重组蛋白的蛋白纯化和western印记。上图，SDS-PAGE和考马斯離她。中图，小鼠单抗与人TF的western印记。下图，小鼠单抗与His6的western印记。M，^f量^H己；第1-5道，在A，B，C电泳图中相同第l道，sTF-膜联蛋白V(sTF-annV);第2道，sTFAA-膜麟白V(sTFAA-annV);第3道,膜联蛋白V;第4道，sIP;第5邋重组TF。第6邋电泳图A:牛血清白蛋白；电泳图B:重组TF(Innovin⑧,DadeBehrin&New昧DE)。图2.重组蛋白对血浆凝结的影响。A機maAlfe桨随不同浓度天然TF—)，sTF(T)或sTF-annV("的凝结时间。加至每样品的PC/PS总量为10mM(PC:PS摩尔比,4:l)。显示的是平均值±SEM。B，用^#偏促舰酶原激酶时间方敦adilutepartialthromboplastintimaprotocol)ii量的sTF(T),膜联蛋白V(▲)，sTT+膜联蛋白V(),或sTF-annV("血浆凝结时间，戶腿实验方餘实驗骤中描述。C，在所加磷脂缺乏情况下，不同浓度sTF(T)，膜联蛋白V(A)，sTP-annV—)，或sTFAA-annV(o)的血浆凝结时间。显示的是平均值土SEM。图3.sTF-araiV和sTFAA-annV的磷脂结合。M^测每蛋白从磷脂悬浮液取代FITC-膜联蛋白V的能力(该实验方法在实验步骤中描述)，将sTF-annV(*)和sTFAA-annV(o)结合PC/PS颗粒能力与膜联蛋白V(A)的能力进行比较。曲线用非线性回归和单位点配体结合方程式(aonesiteligamlbindlrvg叫uaton)计i^几模拟。EDTA-皿荧光百分数表祸平均值±SEM)。图4.天然TF,sTF-annV或sTF存在情况下的VHa因子自动、^r活。在PC/PS(810mHPC:PS摩尔比=4:1)和CaCl2存在情况下，将VII因T(80nM)加入至等摩尔浓度的天然TF(一,sTF(V)，或sTF-annV—)中。在指定时间，移出^j，，M31,于含EDTA的溶液中而终止反应。在所力口sTF和CaCl2存在情况下，M:测量Chromozymt-PA水解率，确定每样品的VHa因T^。显示的是平均值±SEM。图5.在重组蛋白存在情况下，VHa因子介导的Xa因子产生。A在5pM天然TF(■)，sTF(，),sTF顿V()，或sTFAA彌V(。)#&情况下，将不同浓度的X因子，加入至1nMVHa因子，5mMPC/PS(摩尔比,4:1)，5mMCaCl2和ChromozymX底物。按实验步骤"/BB载方法，测物水^^加^1率，该水解速率拟合Mchaelis-Menten方程。B，在含28nMX因子，5mMCaCl2，1nMVila因子，0.347mMPC/PS和不同浓度的sTF("或sTF-annV("的溶液中，测量Xa因子的产生的初^^率。图6.sTF-annV或VHa因子对肝素-处理的血浆aPTT的$娘。A,含肝素钠(l单你mL)血浆的aPTT分析，在不同浓度Vila因刊"或sTF-annV(■)存在瞎况下进行。B，含依诺肝素钠(enoxaparins。diumXl单^/mL)的血浆aPTT，在不同浓度Vila因T("或sTF-annV一)存在情况下测量。虚线显示在缺乏肝素或依诺肝素瞎况下，aFTT分析的平均凝结时间。显示的是平均值±SEM沃多数體敏小而不可见)。图7.sTF-annV对尾出血时间的效应。图A:将小鼠(n=13>好皮下aft依诺肝素嵌20m&1<g)，2小时后将其麻醉，按实验步骤中戶形己载的方法测SM出血时间。出血一停止，立即给动tl^脉ait位于TBS中的sTF-annV(90mcg^g)。五，后，再次测量出血时间。差异有显著性，p=0.01(自双尾t-test)。图B:按，方法，测量尾出血时间。给予SQ依诺肝素(^fe7jC)2小时后，将动物静咏MtsTF-annV(90mcg/kg)或，摩尔量的sTF，膜联蛋白V或sTF+膜联蛋白V。10min后测量尾出血时间。sTF-amV縮短了未会好依诺肝素小鼠(p>0.2)和纟舒依诺肝素小鼠(p<0.0001，Welch's校正、TO非自t-test)的出血时间。在未给予依诺肝素组的每组中，研究两只动物，在依诺肝素处理组的每组中，研究四只动物。发明详述本发明构思,嵌合蛋白至血管损伤部位，其中所述嵌合蛋白包含可激注组织因T(sTF)或具有足以增强VEa因子胺M活性至少10倍的活性的其有效部分，在所述血管损伤部位其用作止血剂，使诱导分散的血管内凝结(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)的机会降至最低。虽然可以使用激活的血小板、内皮细胞或单核细胞的特异性抗体进行耙向，但是优选能结合所有三种细胞类型的靶向部分，至此，因为它对任意给定个体中可能存在的,胞数量改变更不敏感。因为每种感兴趣细胞类型在激活时IKE表面,磷脂酰丝氨酸(PS)，所以本发明构思用sTF嵌合蛋白(例如，sTF-annV)^sTF靶向至含PS膜上，其中将sTF与PS结合结构域例如膜联蛋白V(AnnV)偶联，膜联蛋白V为人PS结合蛋白，其显示可结合激活的血小板、内皮细麟口戦细胞。对膜联蛋白V以该方刻顿的争论在于它魏凝蛋白，因为它能与维他命K-繊性蛋白竞争结MPS的膜。在本发明雌的实施方案中，sTF包含与AnnVMS^^接的人TF的217个MS酸(SEQIDNO:2)(它也可以连接在羧基，，也可以通M^接子序列连接在M^ra，基彩掃)。如前皿，TF常规结^T细M,因为它含有膜内锚定区，然而，sTF缺乏锚定区且10年前已克隆皿，其比天然蛋白(TF)活性低约1000倍。sTF例如由包含SEQIDNO:l的cDNA编码。本文构思的可溶性组织因刊sTF)包括SEQIDNO:2，或其207位有半胱氨舰保留了足以增强Vila因子胺,活性(抓)至少10倍的任意子序列(subsequence)。因此，本文所用的构思的sTF包括，包^MS酸1-207，5-207，10-207，15-207，20-207，25-207，3曙7，35-207,格207，45-207，50-207,55-207，60^207，65-207，70~207，75-207，80^207,85-207,90~207，95-207，100"207，或105-207的sTFi^豆部分，以及包含在1-207至105-207之间的所有序列，例如包括2-207和104"207。本发明进一步包,码SEQIDNO:2或如上其功肯旨活性截短部分的任意备选cDNA，例如,SEQIDNO:2的备选cDNA，可包括与SEQIDNO:l相似但其具有保守取代密码子的cDNA(即，具有不同核苷,列，但编码相同M^酸的密码)。本发明进一步包括如上戶皿的任意sTF序列，,列，其中所述序列在SEQBDNO:2N-糊，进一步包括嫩卜的ser-gly序列或仅gly難，由7此分别产生了219，或218个m^酸的序列，而且其中在SEQIDNO:2的207位的半胱氨酸残基由此分别^M209位或208位。sTF-ArmV嵌合蛋白的第二结构域，包含全长人蛋白膜联蛋白V(SEQIDNO:4)^^有效PS结合片段。AnnV是35kDa蛋白，例如由SEQIDNO:3编码，其可产生于多种细胞，其可结合某彌脂，特另提如上戶脱的磷脂ifeM氨酸。PS常见于细M内侧(所有细胸。存在能转移PS至细M^卜侧的相关酶机制，其中在铐存在清况下，PS能被AnnV结合。连接子区(例如，但不限于SEQIDNO:6，其由具有SEQIDNO:5的cDNA编码)任舰在嵌合蛋白sTF域与AnnV^间出现。在另一实施方式中，本发明嵌合蛋白也可在羧基和/或魏糊或者内部，含有一呦能fei己(tag)序列，其主要包括例如6^组氨酸SEQIDNO:8，其由具有SEQIDNO:7的cDNA编码)，其用于辅助嵌合蛋白纯化，而且其,在嵌合蛋白治疗给药应用之前，从嵌合蛋白切除。在备选的实施方式中，将突式sTF用于嵌合蛋白。在一实施方式中，sTF突变体在163和164位具有丙氨^^，而不是天然sTF该位置所见的赖氨酸歹纖例如或者在219M^酸sTF的165位和166位)。该备选实施方案本文称为"sTFAA-AnnV"(SEQIDNO:10，例如其由SEQE)NO:9cDNA编码)。在另两个实施方案中，sTTF突变條163和164位有谷氨^^或谷氨酰胺^代，本文称为"sTFEE"(SEQIDNO:12，例如其由SEQEDNO:llcDNA编码)和"sTFQQ"(SEQIDNO:14，例如其由SEQIDNO:13cDNAl^马)。这些突变体^i^始sTF中的\可以包括(但不限于M壬意^^f有下列取代在13，131，163，164或183位丙氮酸取代，在42或138位天冬M取代在48位色氨酸取代,在52位丝氨酸取代，在128位天冬氨酸取代，在163或164位谷氨酸取代，或在129，163或164位谷氨,取代。事实上，本发明构思在这些位点中的任意位点上，非极性氨基酸可被极性氨基酸或其它非极性氨基鹏取代，极性氨基酸可被繊性錢酸或其它极性氨基^ff取代，正电荷氨基酸可被负电荷、极性或一敞性氨基酸或者其它正电荷,^M取代，以及负电#酸可被正电荷、极性或非极性,酸或者其它负电^^取代。因此，本发明的嵌合蛋白sTF-annVtt^包括，例如含SEQIDNO:2的蛋白鹏有效部分，其与含SEQE)NO:4的蛋白鹏有效部^^接。sTF-annV蛋白可进一步包M^接子，包括但不限于，位于sTF和annV序列间的具有SEQIDNO:6的连接子。含或不含连接子序歹啲sTF-annV蛋白，可以包含内部嫩卜部^H3序列，例如SEQIDNO:8，用于辅助sTF-annV蛋白纯化。flBf可其它有效的连接子序列和/或纯化^iB^列，自用于替代SEQBDNO:6和/或SEQIDNO:8。在本发明某些实施方案中，可能期望嵌合蛋白具有縮短的血清半衰期使血清滞留时间最短，以限制嵌合蛋白引起所不期望的血栓形成潜能，或者使得嵌合蛋白在特定量的凝血酶形成之后被清除。在本发明这些实施方式中，将裂解位点例如血纤蛋白溶酶(plasmin)裂解位点或者凝血酶(thrombin)裂解位点，置于本文戶腿任一嵌合蛋白的sT7与araiV序列之间。例如，具有SEQIDNO:16(例如其由SEQIDNO:15cDNA编码)的血纤蛋白溶H^f位点，或例如SEQIDNO:18(例如其由SEQIDNO:17cDNA编码)WLill^位点，可被插入至sTF与annV序歹,的OT(含或不含^^子序列和/或纯化^i游列)。为延长血清半衰期以增加其活性，本发明也构思含多个与膜联蛋白V織繊基^^接的sTF域的嵌合蛋白(例如具有SEQIDNO:19的蛋白，其例如由SEQIDNO:20cDNAi^马)。本发明也构思包含sTF或多个sTF織或本文记载的其衍生物)和蛋白的其它非AnnVPS结合域的嵌合蛋白，所述蛋白例如为突触结合蛋白I(synpatotagminl),赫本领嫩术人员已知的其它蛋白，其用于锚定sTF赔含PS的膜。用于取代AnnV的其它PS结合蛋白的实例，包括《旦不限于，膜联蛋白家族成员，学L麟素(lactadherin)，已知结合PS的蛋白中发现的结构域，戶舰蛋白例如V/Va因子，X/Xa因子，MIa因子,VH/VIIa因子，K/IXa因子，Vffl/Vma因子，血影蛋白，B类I型清道夫受体，蛋白激酶C,以及含蛋白激酶C的C2结构域的蛋白(其包括鄉结合蛋白))，Rab亲和蛋白(Rabphilin)家驗员，PS受体,内皮麟素样OxLDL受体l(LOX-l)，PS抗体，磷脂,氨鹏羧酶，MARCKS(肉豆蔻酰化、富丙氨酸蛋白激酶C底物)，PS-p68，IW蛋白，红细胞蛋白4.1，血红蛋白，钙调蛋白家员，S100入S100B，钙周期素结合蛋白家族成员，孚LM糖蛋白，MFG-E8(糊旨漆EGF因子8),以及本领域普通技术人员已知的其它PS亍。在本发明的一个实施方式中，在舒sTF-annV(赫文构思的ftf可其它嵌合蛋白)之前，将劇中瘤个体首先会好化疗鄉，戶脱化疗引趔中瘤劍中瘤血管变化，导致sTF-annV结合增加，例如M御中瘤或血管细IW面增强PS,而导致sTF-annV结合增加。然后纟^sTF-annV，所述sTF-araiV将会以增加量结合肿瘤和肿瘤血管。化疗定义为致癌细胞死亡的倒可治疗(即药物，化学试剂，激素，维他命，等等，其是本领域普通技术人员公知的。另一方法^^合予区域放疗(對虫或结合药物治m，以增强sTF-annV安te禾P/或其结合。癌细胞接受来自环境的信号，其允许它们生长、迁移和侵入正常组织。癌细胞不同于正常细脏处在于它们许多在其表面，有增加数量的某些"受体"分子，可帮助细胞存活。在一个实施方式中，本发明构思将新蛋白设计为阻断肿瘤细胞表面受体，包撤且织因子和尿激酶受体，由此改刻幗细胞行为。在一个实施方式中，本发明构思将嵌合蛋白设计为抑制通过细胞受体的信号传執signaling)，其中戶舰受体对癌细胞，也可會树正常的炎症细胞比较重要。特别地，本发明构敏l)新蛋白，其与尿激酶受体结合，从而Kih正常经该受体产生信号的两蛋白(尿激酶和血纤蛋白溶酶原激活剂抑制剂-l，也称PAI-1)的结合，和(2)新蛋白，其与细胞表面结合，且包含细面蛋白ia织因子的鹏卜结构域，戶;Mla织因子用作血浆蛋白^尔为VIIa因子的受体。因为包含(天然)组织因子和Vila因子的复糊，育^生以组织因子ifeM尾^^式影响癌细胞行为的信号，所以本文构思的含sTF嵌合蛋白，可作为VHa因子接收池(sink)，从癌细胞表面的组织因子转移VHa因子。本发明也构思同时结合尿激酶受体和Vila因子的新蛋白，以阻止癌细胞从其自身细!W面组织因子和尿激酶受体^f受益。本发明也构思组织因子结构:^B/^M激酶受体结构域的突变体，以增强每种这些结构,其配体的亲和力。尿激酶受体和组织因子也见于，称为慢性炎症细胞的巨噬细胞。本文记载的嵌合蛋白也可用于治疗人类或动物疾病，在该疾病中，持续的巨噬细胞介导的炎症在该持久疾病或不适中起作用。在另一实施方案中，本发明包括与ATF连接的sTF(sTF-ATF)，该嵌合蛋白可同时阻断细胞的TF和尿激,体。ATF■激酶的MrSS白片段(尿激酶A链1-135,酸，因此称为ATF)。ATF(SEQIDNO:22，例如其由具10有SEQDDNO:21的cDNA编码)结合尿^ll受体，但与^:尿激酶不同，其不被内化。可结合肿瘤脉管并可包括本发明蛋白的其它肽，包括但不限于HWGF(SEQIDNO:23)^基序肽(基质金属蛋白膝2和基质金属蛋白膝9，也称为明胶酶A和明胶酶B，的选择性抑制齐IJ)，例如合劍太CTTHWGFTLC(SEQIDNO:24)靶向血管生成性血管，抑制人内皮细胞和肿瘤细Bte移，也在动物模型中PMJ中瘤生长和侵入，提高负荷人對中瘤的小鼠的存活。如上戶脱，本文构思的任一肿瘤治疗方法，可包括以膜麟白V(非sTF-膜,白V)进，査的初始步骤，以确^t治疗预期有正常^i^，答的个体。优选的个体为显示膜联蛋白V肿瘤吸收而非肿瘤区^1量吸收的个体。这>1##是更有效的治疗，因为某些潜在个皿无先行药物治疗和/^m治疗的情况下，可能有增强的吸收(由此其不一定受益于这些伴随着副作用的辅助治m，而其它个体可能没有。后者将更可會纵首次化疗皿疗中^，从而允许在sTP-AnnV和治疗之间产生协同作用。在膜联蛋白V筛査中(在sTF-AnnV给药之前进行)，膜联蛋白V结合于血液凝±夫中捕获的激活血小板。因此，膜联蛋白V筛查可确定有sTF-AnnV结合的提高风险的个俠subjects)，所述个,非肿瘤血管床中可能发生病理WL銜即，中风，心脏病发作，深静脉血栓，等等。Mit行膜联蛋白V先期筛査，避顿该并发歸更高风险的个体，^f顿者安全瞎况可得到提高。膜联蛋白V筛查可用多种成像技术进行(特别是磁共振成像禾啦医疗学成像)，该技术允许开，的成像化合物。备皿，在乡好sTF-AnnV之前(有或没有化疗种或放m，给个体静脉^#膜联蛋白V，以预防所不期望发tt栓的血管与sTF-膜联蛋白结合。^i^骤网材料如所述制备重乡fl^-锚定TF，重组sTF(TF2-加)，以及VH和TF的单克隆抗体。与重组蛋白的Hi*标记反应的单克隆抗体，来自CellSignalingTechnology(Beverly,MA)。Chromozymt-PA(N-甲基磺鹏-D"苯丙酰甘氨酰-L-精氨酸4硝基苯胺^&)和ChromozymX(N-甲縫鶴-D^正亮氨酰-甘氨酰-L-精氨酸"4"苯基重氮酸醋^ik)来自RocheDiagnosticsCoip(Indianapolis,IN)。纯化的人X,Xa^VII，和Vila因子来自EnzymeResearchLaboratories(SouthBen4IN)。除非另有说明，否则，所有其它试剂均来自SigmaChemicalCo.。磷脂以氯仿lt存液形式，获自AvantiPolarLipid(Alabaster,AL)，其用于制备单层磷腊泡囊。将等^f以摩尔比磷脂翻旦fii(PCyPS4:1混合，氩气下蒸发去除氯仿。自脂重悬于0.1MNaCl，0.05MTris-HCl,pH7.5,超声，悬液AM明，产生PC/PS泡囊。磷月^^M磷酸分析确定。[(X)40]TF至磷脂泡囊的再脂化，用辛基-(3~1>葡糖吡喃法进行，通常TF/磷脂摩尔比1:8700。有效TF浓度M在含Chromozymt-PA的溶液中，用逐步增加浓度的Vila因子滴定，并将所得胺,活性，与已知浓度sTF与Vila因子温育所得胺l^^性(amiddyticactivity)进行比较，而测量。TF制备物磷脂浓度用磷酸分析测量，以使TF与sTF-annV直接比较时，PS存在量相当。荧光素^I氰酸,ITC》膜联蛋白V，M将FITC与膜联蛋白V以2:1摩尔比，在0.5M碳麟缓冲瓶pH9.5室温暗室下温育1小时而带恪。未结合FITC通过150mMNaCl,0.01MTris-HCl,pH8.2^ii滤，接着用相同缓冲液透析另外的48小时而去除。魏载鹏建膜联蛋白VcDNA(于pET-22b(+)载体中)由AntonyRosen博士惠赠。sTF-annV构建体，M将TF2-219^S酸编码cDNA与膜联蛋白VcDNA5',接而产生。sTFcDNA用正向引物5'-CATGCCATGGCAGGCGCTTCAGGCACTACAAATA03'(SEQIDNO:25),和反向引物5'-CCCMGTCTTGGGTTCTCTGMTTCCCCTTTCTC"3'(SEQIDNO邻进行PCR克隆。用下列引物5_GGGGMTTCAGAGAAGGTGGCGGTTCAGGCGGTGGAGGTTCAGGAGGTGGCGGATCAATGGCACAGGTTCTC"3'(SEQIDNO:27).4柳QuikChangeMuttiSite"DirectedMutagenesisKit(Stratagene，LaJoIIa^CA)，将编码(GGGGS)3的连接子序列插入至sTF和膜联蛋白VcDNA之间。将sTF-araiV基因克隆至pET-22b(+)载体iVcoI和报ndn位点。该载体编码在,^有Hi"标己的蛋白。由突，式的sTF与膜联蛋白V连接组成的嵌合俠sTFAA-amV)，iM:定点突变产生。用QuikChangeMuitiate^DirectedMutagen^isWt(Stratagene,LaJ0n4CA)和下列引物5'-CTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAGCCGCAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTG陽3'(SEQ、DND:28).将sTF的164和165位BS(即219M^^:度的sTF的165和166^S)进行赖氨酸至丙氨酸的突变。将sTFAA-annV基因克隆至pET-22b(+)载体的M，ol和77^/01位点。DNA测序证实了所有三种构建体的组成。sTF-annV，sTFAA-annV和膜联蛋白V的,和纯化将含sTHF-amV,sTFAA-annV或annV基因的pET-22b(+)载体，插入至鄉杆難株BL-21脂,ovag叫Madison^Wl)。该载^^了指导重组蛋白i4A周质空间的信号肽。当细菌悬液A6oo达到0.8时，在25r添加0,3mM异丙基-P"Ml!代半乳B比喃;^(IPTG)15小时诱导鋭。收获细胞，进斤渗透冲击(5mMMgS04)，蝶周质组分。用0.3MNaCl,0.05MNaH2P04,pH8.0平衡His-Select柱(Sigma^St.Louis，MO)ffl31固定金属亲和层析，将重组蛋白纯化。在10和20mM咪唑存在瞎况下用相同溶液将柱洗涤，然后用250mM咪唑洗脱。^B兑、細0.1MNaCl,50mMTris-HClpH7.4透析。重组蛋白的纯度和身份，用SDS-PAGE和Western印i己检测。[薩〗磷脂结合分析嵌合体对含PS磷脂泡囊的亲和性，通过使用商购aPTT凝结剂(DadeActinFSLDadeBehring,NewarkDE)作PS源的6fca公JR^方ii4行测量。按照制造商4顿说明重构试剂，并以1:10繊于补加2.5mMCa卩的140mMNaCl，0.01MHEPES，pH7.5(HBS)溶液中(HBS"Ca，。将^#磷月騰液(10mL)在包被微离心管(Slickseal，NationalScientific,Claremon^CA)的HBS-Ca吣溶液中，与50nMFTTC-膜联蛋白V(使微中PS饱和的浓度，可实验测定)M育。37tl温育15min后，将混合物16,000xg离心20min。将团块在HBS^Ca^溶液13中洗涤，然后重悬T^不同量各未标记的竞争性蛋白(膜联蛋白V，sTF-annV或sTFAA-annV)的HBS《aW溶液中。再次37'C温育12hr后，将混合物离心，将团块在HBS-Ca^溶液中洗涤。然后将团±爐悬于补加10mMEDTA的HBS中，室温温育16hr，以洗脱结合的FITC-膜联蛋白V。将管离心，移出上清液。通过荧光微板读数仪(Victor2,Wallac，PeikinElmer，Boston^MA)测定荧光(激发波长485nm;^!t波长535nm)，确定上清液中FITC-膜联蛋白量。VII因子自激活分析嵌合蛋白鹏W因子自激活的能九fflil在含5mMCaCl2的0.1MNaCl,50mMTris-HCl,0.1%牛血清白蛋白，pH7.4(TBS)(TOS/Ca2,溶液中，将各嵌合蛋白(终浓度，80nM)添加至VII因子(终浓度，80nM)进行测量。在<顿sTF-annV或sTF的实验中，将PC/PS泡囊以与天然TF制备物相同乡鹏n浓度，添加至温育混^tK总磷脂浓度，810mHPC:PS摩尔比=4:1)。錢定时间间隔，从各温育混^t/移取10mL等5^样，转移至含40mLTBS+5mMEDTA的聚苯乙烯管中，终止反应。所产生VTIa因子的量，M添加150mLTBS/Ca2+,过量sTF，和Chromozymt-PA(终浓度分别为5mH124nM和5mM)，并检测Aws的变化而测量。VIIa因子结合分析sTWTF诱导的Vila因子胺,活性增加用于对这些蛋白与Vila因子的结^i4行定量。将逐步增加浓度的sTF-annV，sTFAA-annV或sTF，在96孔分析板中的TBS/Ca^溶液中与VHa因子(5nM)温育。室温10min后，将Chromozymt-PA加入(终浓度1mM)，用微板读数仪(MolecularDevices,MenloParl^CA)在405nm处，测量底物水解的初速率。从测量值减去不存在sTF，sTF-annV或sTFAA-annV时的Vila因子背景活性。动力学参数用Prism4(GraphPadSoftware5SanDiego，CA)计算oX因子撒活sTF,sTT-annV,sTFAA崔V或天然再脂化(relipidated)TF雜情况下Vila因子介导的X因子激活，M^—期分抓onestageassay)进行。将sTF,sTF-araiV，sTFAA-annV或天然TF加入TBS/Ca2+溶液中的1nMVila因子，X因子，PC/PS(摩尔比，4:1)和0.5mMChromozymX中。20min后检测生舰物水解(A405变化)，参照纯化人Xa因子制备的标准曲线，将離化为Xa因子浓度。取所《寻抛物线导数扭riv81^ofresultingparabolicprogresscurve(SoflmaxPro,MolecularDevices,MenloPari^CA)，确定Xa因子产^3I率，用Prism4(GraphPadSoftware,SanDiego，CA)计算动力学参数。血浆凝结分析凝结时间不同浓度重组蛋白和PC/PS(摩尔t匕4:l)存在情况下及添加CaCl2后的正常人柠檬酸盐化血浆的凝结时间，'用机械凝结测量仪(ST4，DiagnosticaStago,Parsipanny,NJ)测量，^i!j量上限为999s。,撒活的^(paitialK^ijflL酶原激酶时间将商业获得aPTT试齐lJ(Dade0Actin⑧，DadeBehring)以1:50,于TBS，在各祌浓度sTF，膜联蛋白V或sTF-annV存在情况下，用TiS行111t酸盐化AJL浆凝结时间测量。将血桨与糖aPTT试剂和重组蛋白37。C温育3min，然后添加25mMCaCl2。形成凝辦万需时间用|凝结测量仪测量。激活的偏促凝血酶原激酶时间(Ac^atec/partfe/ffvom6pptes胁(frne，aPTI^根据制造商使用说明，将含1单位/mL肝素钠(AmericanPharmaceuticalPartners,Inc.LosAngeles,CA)或依诺肝素lft(Lovenox⑧,AventisPharmaceuticals,Bridgewater,NJ)与不同、浓度的sTF-annV或Vila因子的血浆的aPTT，用商业获得aPTT试剂(Actin⑧FSL;DadeBehring，New昧DE)进行测量。小鼠尾出血时间将小鼠按俄克拉荷马大学|科学中心机构动物保护和使用委员会(theUniversityofOklahomaHealthSciencesCenterInstitutionalAnimalCareandUseCommittee)认可的方案，进行圈养和研究。将小鼠皮下皿依诺肝素钠，两小时后用戊巴比势60mg/kg，i.p.给予)，。将尾在37。C常MS水中预暖，用解剖刀在直径2mm处横切，然后将尾置于37"恒温常MibJC管中。记录出血停止所需时间。在初步剂量探寻实验中，逐步增加给予依诺肝素钠的剂量。一旦誠剂量确定(20mg/kg)，首次实验5min后进行第二次出血时间测量。卜的出血时间，舰在邻近首次横切的5mm处，横切尾而进行。与第一次相比，第二次出血时间不具有显著性差异(p=03，双尾成对t-teAPrism4,GraphpadSoftware)。未处理小鼠然后用类似方式处理，但是在首次出血时间确定后，立即静脉SMsTF-annV(90mcg/kg)。注射5min后进行第二次出血时间测量。双尾自t-test，用于比较两次出血时间。然后研究其它组动物。SQ皿盐7M依诺肝素(20mg/kg)两小时后，给小鼠IV,sTF-annV(90mcg/kg),盐水sTF，膜联蛋白V,或者sTF+膜联蛋白V的组合。所有蛋白以sTF-annV的等摩尔量注射。10，后测量出血时间。结果膜,白V和膜联蛋白V嵌合体的,和纯化将编码三种蛋白的cDNA构建体(膜联蛋白V，sTF-annV和sTFAA-annV)，在^W杆菌(E.coli)周质空间表达，将蛋白用固定金属亲和层析纯化(参见图1，纯化蛋白用SDS-PAGE和western印记分析)。在初始研究中，比较了在相同浓度添加的磷脂和CaCl2存在的情况下，sTF，天然TF,和sTF-annV加皿浆凝结的能力。如图2A所示，sTF-annV和天然TF相比sTF，在更;^體上縮短了血浆凝结时间。接着，用IWaPTT实验，确定sTF-annV效果是否育^lil^加sTFMM联蛋白V复制。在,aPTT试齐O(用作磷腺勒和sTF，膜联蛋白V，sTF+膜联蛋白V组合，或sTF-annV存在情况下，将血浆复f5(recalcified)。如图2B所示，同时加入sTF和膜联蛋白V，不能重现sTF-annV的促凝效果。在该条件下，sTF-annV显示出血浆凝结的两相效应，在更高浓度下延长凝结时间。该结驟示，在更低浓度下因sTF结构域而雜促M^IS，在更高浓度下膜联蛋白V抗凝效应则占主导。为了舰该假说，构建！WsTF结构域在165位和166位(218aasTF的164和165位)l^氨自变为丙氨酸的构建体，该突变已知会损伤X因子激活。所得嵌合俠sTFAA-annV)也,出血浆凝结双相效应(图2C)，但其比sTF-annV有更低的促凝活性，并且在M,度下还展示出抗凝活性。在存在TF-annV和sTFAA-annV能改^ifiL浆凝结证据的情况下，对其组分结构域再进行详细功能鉴定。磷脂结合活性sTF-annV和sTFAA-annV结合PS的能力，用公开的PS-结合实验之6^Sit行分析，其中膜联蛋白V,sTF-annV或sTFAA-annV与FITC-膜联蛋白V竞争结合磷贈泡囊。如图3所示，两种嵌合体都展示出与膜联蛋白V相当的PS-结合活性。膜联蛋白V的Kd为12nM;sTF-annV，为13nH以及sTFAA-annV，为llnM。Vn因子自激活活性先前已显示，TF而不是sTF，在PS和Ca2+存在情况下，■VII因子自激活。sTT不能增加VII因子自激活的原因在于，sTF:VHa复^tl对含PS膜的低亲和力。由于嵌合体的膜联蛋白V结构鹏示出对含PS月旨质体的高亲和力，我们鄉IJsTF-annV可皿与TF相当的VII因子自'^:活，而不与sTF相当。如图4戶标，sTF-araiV以与天然TF相当的速率，舰了VH因子自激活而不是sTF(其无活性)。该结果也际，sTF-annV能结合VII因子，与天然TF相当。VHa因子结合活性为了测量嵌^^体的VHa因子结合，我们对Vila因子结合TF/sTF时其胺,活性的增加，进行了定量。由于sTF结合膜的情况不佳，所以我们在缺乏PS情况下进行分析。sTF-annV和sTFAA-annV都可以与sTF相同的程度，增加Vila因子的胺,活性，这表明，膜联蛋白V结构域并不干扰sTF结构域结合VHa因子的能力(数据未示出)。s!F的Vila因子结合IQ为8.17nM;sTF-annV为7.05nM;以及sTFAA-annV为3.47nM，所有f^lte稀在磷脂泡囊瞎况下得出。X因子撒活检测了sTF-annV和sTFAA-annV，对Vila因子介导X因子激、，率的效果。如图5A所示，在sTF-annV或sTFAA-annV存在情况下，X因子撒活速率高于sTF存在情况下的激活速率。如sTFAA在先研究所预期的那样，sTF-annV将比sTFAA-annV更有能力支持X因子的激活。如表1所示，在sTF-annV存在情况下戰因子催化效^(KA)约为天然TF存在情况下的67%，但其约为sTFAA-annV催化效率的5倍。由于高浓度sTF-annV与延^JfiL浆凝结时间有关，所以劍门研究了逐步增加、浓度的sTF-annV对VHa因子介导X因子激M率的，。如图5B所示，sTF-annV展示出X因子、激活的双相效应，这与血浆凝结，相类似。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>sTF，sTF-膜联蛋白V和sTFAA-annV对Vila因子介导的X因子撒皿率的舰。sTF-膜联蛋白ffi素存在情况下对凝结的效应肝素为常用抗凝剂，其ffl^增强serpin(—种抗WL酶蛋白X主要卿制Xa因子和WL酶的能力而起作用。在各种sTF-annV浓度下，我们将未分级肝素钠或依诺肝素，低分子量肝素，加入至柠檬酸盐化血浆中，然后测量血浆aPTT。sTF-annV縮短了含1单你mL未分级肝素(图6A)或1单你mL依诺肝素(图6B)血浆的aPTT。Vila因子，雜多种与WL酶产量M^相关的临床状况中用作治疗剂治疗出血，该因子也缩短了肝素处理血浆的aPTT，尽管不如sTF-annV那么纟iyc(图6A和6B)。sTF-annV对小鼠尾出血时间的效应虽然人模型出血时间实验被认为是主要反映了血小板功能，但是小鼠凝血酶生产的缺陷却是由延长的出血时间所反映。因此，我们给予正常小鼠依诺肝素，以确定s!P-annV是否会影响体内方式的MlfiL酶产生。将小鼠皮下注射依诺肝素辨20mg/kg)，一种已知会抑带JWL酶产生的药物，然后2小时后测量出血时间。该出血时间伤口其出血停止后，将动物静脉注射sTF-annV(90mcg/kg)，5min后再次测量出血时间。(初步实验显示，依诺肝素处理的动物的第二次出血时间与第一次出血时间不存在显著差异，p=0.3，自,t-test)。如图7A所示，sTF-annV显著縮短了依诺肝素处理小鼠的出血时间(p:O.Ol，成对鹏t-test)。依诺肝素处理导致的平均出血时间10.7溯(中值，6.1^H+)。sTF-annV处理后的平均出血时间为1.4，(平均值，U併中)。未处理动物的平均出血时间为1.2併中。在其它组小鼠中测量尾出血时间。sTF-annV縮短了未用依诺肝素处理动物的出血时间(1.5±0.7minVS3.6±0.2mii^pX).02，Welch's舰未舰t-test;图7B)。然后将幼稚动物用依诺肝素(20mg/kg,SQ)处理，2小时后，DSf注射sTF-annV(90mcg/kg)或等摩尔量的sTF，膜联蛋白V，或者81￥+膜联蛋白V组合。如图7B所示，縮短的出血时间仅在sTF-annV处理动物中观察至lj(p<0.0001,Welch's校正鹏未舰t-test)，錄明嵌合体本身而不是其M成分，縮短了出血时间。先前研條明，分离的TF鹏卜结构織sTF褓留了足以允许结合Vila因子并增强其小肝三肽合鹏物的构象。然而，sTF在舰Vila因子介导的X因子激活方面，效率更低。这似乎是因为sTF与sTF-VHa复，对膜表面有相对较低亲和力。通过取代TF跨膜结构域的糖磷脂酰肌醇锚定部分，Paboreky改al能产生有完全促凝活性的膜结合sTF变体，这表明如果适当限制于细胞表面，sTF的功能将与天然TF相当。其它人也偶联了sTF与肽部分，并显示了其体内和体夕隙结系统的活化。各种研究都禾,了特定细胞类型^l剖区特异的耙向结构域，所有这些研究及开^[癌剂，而不，的ihlfiL化合物。在本工作中，含sTF结构域的嵌合体蛋白在雌的实施方式中创建，有下列几种新特征(l)它对在止血中扮演作用的细胞类型具有"多特异性"；(2)它具有具抗凝结特性的膜耙向结构域。因此，虽然膜联蛋白V作为PS结合蛋白的能力，使其作为耙向部分具有吸引力，但是其抗凝活性却阻碍了它应用于设计为促aibfe剂的构建体中。因此，sTF-annV初始研究涉及确定其是否确实为促凝剂，如果是，其促凝活性与sTF和天然TF比较如何。因为我们认识到膜联蛋白V与磷脂的比例是重要的，所以我们在分析中利用磷脂悬液，而不是激活细胞，以保持一致性。在我们发现sTF-annV具有促凝活髓(图2A)，劍门确定促凝活性是嵌合鹏异的，其不育^13±添加等摩尔量的3拉的sTF和膜联蛋白V混^tl来重现(图2B)。謝门也制备了嵌合辨本文称为sTFAA-annV)，其中sTTF165和166位魏酸具彌氨輕丙氨酸的突变，该改变已知会显著斷氐TF促凝活性，我们发现，该嵌合糊失了促凝活性(图2C)。最后，劍门研究了改变反应混^tl中嵌合做S比例的后果。我们发现，对sTF-annV和sTFAA-annV而言，蛋白/PS比例增加舰某点时，将产生抗凝^0^(图2C)。因此，当雜能结合其它凝结因子的功能性过量PS结合位点时，MM联蛋白V结构,sTF靶向至膜表面，将是促凝的。当膜联蛋白v存在難加时，这離点将变得敦隹以舰凝结因子vn/vn^x,vm，D^v和n，且凝结减慢。接着我们对包含sTF-araiV的功能结构,行了分析，以确定将该它们连接在一起是否将导致两者之一的功能增加或损失。齢体结始PS泡囊能力的实對图3)、皿vn因子自激活实觀图4)、增强vna因子胺(W及x因子,活性实验(图5)，表明sTF和膜联蛋白V结构域都具有功能，尽管天然TF，Vila因子至X因子的催化效率是sTF-araiV的两傲参见表1)。闕这對开究表明，sTF彌V可用作促凝剂，但其促凝活性很;^上繊于磷脂浓度。因为体内伤口位置的PS局部浓度并彌切了解，所以体外实验只能有限预测PS结合蛋白(例如sTF-amV)的体内行为。为了在可由身体,伤的应激确定PS浓度的情况下体内检测sTF-amV，我们进行了小鼠尾出血时间实验。在之前给予依诺肝素，低^fSfF素，用于损伤tt酶产生盼瞎况下，该方法已知对缺陷的Wl酶制造敏感。在预备该实验中，我们在依诺肝素及未分级肝素存在情况下，研究了sTF-annV对血浆凝结的^^，并且将其与Vila因子效应相比较，所述Vila因子是目前用于治疗具有多种出血症患者的蛋白。Vila因子和sTTF-annV都縮短了肝素和依诺肝素处理血浆的凝结时间，尽管sTF-annV比Vila因子强大几个|^(图6)。我们用逐步升高剂量的依诺肝素处理小鼠，确立了再现性增加两次Jl,出血时间的剂量。然后劍门在第一次和第二次尾出血时间之间，尾静脉注射sTF-annV。在所有测试的动物中，第二次出血时间显謝氏于第一次出血时间。用其它动物实验,我们发现sTF-annV的玄娘，不能由^^湖slP，膜联蛋白V，或两者的混^tim现。因为人VHa因子在小鼠血桨中不具有完全活性，所以Vila因子不肖調于直接比较。选用该sTF-annV剂量是因为该剂量(基于^S)与常规推荐重组vna因子的剂量相当。这些研究显示，似乎拮抗性蛋白结构域可在嵌合分子中组合形成蛋白，所形成蛋白其離并不简单地由主结构域净M所确定。蛋白sTF-annV展示出可反映其任一相对结构域的，，这取决于相关瞎况。sTF-annV展示出促凝和抗凝活性的能力使^ihlfiL好中独树一峡。因为AnnV结合PS，而PSML液凝结所需，所以单独4OTAnnV可,凝结机制蛋白结合PS，因此AmV实际上抑制血液凝结，因雌常不会将其认为^lhlflL剂。尽管sTF在高浓度下肖劭BM液凝结，但本发明记载的sTF与annV的复，，将不会是提高血液凝结显而易见的方法，而且因为AnnV结构鹏在，很可能被本领域知识人员预期，其要么不具有她效应，要么具有抗凝效应。血^fe源的lhJfiL剂已经显示出在某些患者中诱导血栓(不期望的血液凝结)，血栓也已经棚重组VHa因子治疗的某些夕M先患者中观察到。本发明提供了定位sTF至撒活血小板区域的方^(本文记载的AnnV结构,其它结构域)，与在脉管系统中循环的效力相当的ibfiL化^tl相比，其可能更娃。我们的工作显示，在更高浓度下，sTF-annV蛋白丧失了促凝^iS(止血)，变成了抗繊U，这一点可iiillfiL液凝结时间的延长来证明。这可能是因为以下事实在高浓度下，由于占领了X因子潜在结合位点，AnnV结构域玄M变得比其定位sTF结构^SM表面的舰更重要。没有手随其它她剂在高浓度下具有抗凝活性。该特征可能使sTF-AnnV比其它当前可获得的ihlfiL剂更安全。[薩]实用性本发明嵌合蛋白可用于各种与ihJfe和血栓形成相关的治疗应用。用作lhlfiL剂本发明构思^嵌合蛋白sTF-armV(^文记载与其它PS结合元件连接的sTF嵌合体)于出血患者，以在出血区域增加MlfiL酶产生而使出血停止。通常，按压或缝合能使出血停止。然而，有些时候这些方法不能容易地^^，在此情况下，化^tl例如sTF-annV将是有用的。这样的情况包括(l旌抗凝药物存在瞎况下的出血，(2)缺乏(先诚非先天)一种或多种WL因子的出血，例如这可以在夕唯和大量输血、维4也命K缺乏、血友病、血液》疑结因子抗体皿中观察到，(3)肝脏疾病，(4)在压迫出血区无效顿法应用情况下的出血，例如损伤弥散区出血，食道脉管曲张、胃炎、膀胱炎、子宫内膜炎、血管损伤或头创伤出血，(5)在血小板不以适当量存在情况下的出血，(6)Ml小板不能正确辦功21能瞎况下的出血，^#(7班出血症患者治疗中，用作重组Vila因邻DA-批准药物)的辅助药。也可预期本文记载的sTF-annV^^[以嵌合蛋白，用于在不与癌状态相关的血管中诱导血栓形成，但^t宿主可能是有害的。这样的血管收1包括但不限于，毛细管扩张、动脉畸形、静脉畸形、^ffl血管畸形、淋巴管畸形、动静脉畸形、血管瘤、或动脉瘤。此外，本发明预期用该记载蛋白治疗以结构正常的血管生长为特征的区域，其方式或位点可能^1S:宿主健康，有时统称其为"新血管生成"区。可以预期，将sTF-annV或其变体^宿主(M:本文记载的多种途径中的任一种)，从而以治疗方式诱导局部血栓形成。在之前或同时利用另一治疗药征以提高sTF-annV效力可能^i、要的。这种辅助治疗可能包括药物，化学物，顿躐，或者娜治疗。膜联蛋白V可在肿瘤内结合肿瘤禾n^jfiL管细胞。膜联蛋白V(^文记载的其它PS结合结构)介导的sTF肿瘤定位，将导致弓l刻中瘤内血液凝结，从而切,输到中瘤的营养流，导致肿瘤死亡。本发明利用AnnV结构域或PS结合结构将嵌合蛋白定,肿瘤。本发明也构思將sTF-amV用于縦治疗物质，例如娜性物质或化疗化合物，到中瘤離常血管床。在一个实施方式中，例如将治疗性增强的(例如放射性的)sTF-annV^it至患癌宿主。将治疗活性的sTF-annV定位于肿瘤血管中，可能離截好化疗、放疗或其徵作以增强sTF-annV对目标区域的耙向，这将增强分子的治疗效果。使用这种^^的、与放射性或化疗部分连接的sTF-annV好可用于治疗各种癌症、血管瘤、或血管畸形中的任一种。化疗或放射性物质与蛋白如何连接的实例，在U.S.6,074,643;6,696,478;6，403，771;5,620,675;5,346,686;5，219，556;6，852，318,5,863,538;7,001,991;5,108,987;5,000,935;4,895,714;和4，886，780中有记载，将^&tk明确iM^弓讲入。本发明化合物的"治g效量"或"生物有效量"，是指可有效^S制、抑制、减少劍J^llML顿栓形成，或者控制、抑制或M^、肿瘤生长的量。术语"控制"意指减慢、打断、阻止或停lK病或状7皿展，且不一定显示出完全消除,所有症状的一切过程。[OIOS]术语"治疗有效量"或"生物有效量"进一步意在定义产生疾病状况特征性的ffi可参数或临床症状,的量。实际剂量针对不同特定^f会有不同，其根据患者^M^况、症^重禾i^相反J际而变化。本文使用的术语"个体(subject)"或"患者"是指患有特定疾病、需要本文附己载治疗的温血动物，例如哺乳动物。应该理解，豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、牛、绵羊、动物园动物(200animals)、家畜、以及人类，都是本术语意义范围内的动物实例。用于本文记载的治疗的化合物的治旅效量或生物有效量，可M使用常规技將卩观^^似斜牛下获得的结果，由参与诊断医师(本领域的技术人员)容易地确定。在确定治疗有效剂量时，参与诊断医师要考虑多种因素，包括但不限于B甫乳动物的种类；动物尺寸、年龄和总体状况；所涉及特定g或状况；疾病^^况的相关禾號#重程度；个体的反应；给药的特定化合物;给药方式；给药制齐鹏征性的的生物利用度；戶腿的剂量方案；伴随药物的使用；以及其它相关情况。本发明化合物的治旅效量或生物有效量，也指治疗本文记病状况或另一状况有效的化合物量。本发明组合物的治疗有效量或生物有效量，通常包含足量活性成分(即嵌合蛋白)以iim约0.1ng/kg至约100mg/kg(活性成分驢患者体重)。优选地，组^,至少10ng/kg至50mg/kg，最，至少100ng/kg至10mg/kg。本发明方法的执行，包括以任意誠系统鹏部制剂、以有效3IU^h文所歹柳量的量，给予个体治旅效量或生物有效量的活性成分。药剂给药可以一次性给药，爽例如)每天1-5次、或每周1次或2次，^lil静脉滴注连续给药，这取决于所期望的治疗效果。显然，im的给药剂量和给药方式，可由本领域技术人员确定。制剂制备领域的技术人员，可以容易髓当的给药形式和给药方式，这取决于戶膽化合髓定特性，所治疗疾病的状态或状况，疾病或微J^f处的阶段，以及4顿本领域已知审U剂技术的其它相关瞎况，这些瞎况例如记载在Remington'sPharmaceuticalSciences,latestedition^MackPublishingCo.中。药物组^t/可用本领域的己知技术进^f格。典型地，将治旅效量tt^^J与药学可接受的载^^t行混合。本发明的化，或组合物可以多种途格合药，例如口S蜮胃肠外给药(即皮下给药、静脉内给药、肌肉内给药、im内给药、或气管内给夠，眼内给药，或喷内给药。对于口鹏合药而言，化，可制备成固体或液体制剂，例如胶囊、丸齐IJ、片抓锭剂、熔融物、粉末、悬浮剂、或乳剂。固脾位剂型可为常规明胶形式的胶囊，包含例如表面活性剂、润滑剂以及惰性填充抓诸如乳糖、蔗糖和就淀粉，或者它们可为缓糊柳。药剂可以肠衣包被。在另一实施方式中，本发明化，可用传统片剂基质例如乳糖、繊和玉米淀粉，结合粘合齐綱如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶，崩解剂例如马铃薯淀粉或藻酸，以及润滑剂例如硬脂酸或硬脂,，制成片剂。液体制剂可将活性成分、溶解于水性或非水性药学上可接受的1」而制备，所述药学上可接受'凝l」还可包含悬浮剂、甜味剂、调味剂、以及防腐剂，这些都是本领域已知的。对胃肠外给麵言，可糊七^tl溶解于生理可接受的药繊体，以溶液或悬浮液纟好。说明性的魏药物载体是，水、盐水、^H溶液、果糖溶液、乙醇、或者动植物或合成来源的油。药物载体也可包含本领域己知的防腐剂和缓冲剂。本发明化合物在某些剝牛下，也可局部给予。这可通过简单配制待给药化合物的溶鹏行，在存在或不存在其它赋形剂情况下，雌i顿已矢舰M皮吸收的激W，例如乙醇或二甲基亚P(DMSO)进行。优选的局部给药，使用贮库和多子,药贴或固体基质类药贴进行。如上所述，组合物也可包括飾载体。对于局部应用而言，任何常规赋形剂tN"添加，将活性成分制成乳液、软膏、粉末、乳膏、喷雾剂、或气溶胶。对于外科^A而言，活性成分可与任一公知生物可降解和生物可t^载体组合，例如聚乳酸和胶原制剂。这些材料可以是固^^A物、缝合物、海绵物、伤口敷料，等等形式。在fti可情况下，对于这些材料的局部应用而言，活性成分通常以龍比约1:1^至1:20,000在载体^!W剂中出现，但不限于该范围内的比例。局部用组合物的制备，在Remington'sPharmaceuticalSciences,latestedition,(MackPublishing)中有详细记载。其它的药物方法可用于调节药效持续肌半衰期增加的制齐诉暖释制剂，可ffl3^顿聚合物结合、复合或吸收本文记载的蛋白而获得。控制鹏和/鹏加半衰期，可m^择魏大賴例如多糖、聚酯、聚m^酸、聚乙烯吡咯烷酮均聚物、乙烯醋酸乙烯酯、甲基纤维素、或羧甲基纤维素，以及丙烯鹏，例如N《2条丙萄甲基丙烯鹏、大肝的^^浓度、以及齡的方法而获得，以控制释放。另一控制缓释制剂药效持续期或半衰期的可能方法是，将嵌合蛋白或其功能衍生物整合至多聚物材料颗粒中，例如聚酯、聚酰胺、聚氨基酸、水》鹏、爽乳酸)、乙烯醋酸乙烯共聚物、诸如PEG的共聚物麟、以及聚(l-天本文记载蛋白的半衰期，可用本领域已知方法将其与其它分子例如聚合物结合形成药物-聚合物缀而增加。例如，蛋白可结合至本领域已知的惰性聚，^，例如在称为"PEG化"的方法中的聚乙二SKPEG)分子。PEG化由此可增加体内半衰期，从而增加蛋白好治疗效果。PEG化也可斷氐蛋白肝潜在抗原性。PEG化也能增强蛋白溶解度，从而提高其治疗效果。所用PEGs可为线性^5:链。PEG好可被官能团f,，例如Harris改al，(9)戶标，其顿内被此明确M31援引引入，而且蛋白的氨基^或半胱氨^S(如果存在)或其中的其它连接氨基酸,用于连接PEG，其中PEG^T可载有一种或多种类型蛋白中的一个或多个，棘蛋白可载有一个以上PEG肝。"PEG化蛋白"是指本发明的蛋白，其具有的聚乙二,EG)部分共^Hi接在蛋白的M^^B^^^,团上。"聚乙二醇"或"PEG"是指聚亚^S二醇化，或其衍生物，有或没有偶職蜮偶軟活化部分衍生化(例如硫醇、triflate、lresylate、氮丙啶、环氧乙烷，或者雌马来舰麟分)。化儒，诸如马来舰胺单甲縫PEG，是本发明示例性或活化PEG化^tl。其它的聚亚皿二醇化合物，例如聚丙二醇，可用于本发明中。其它的魏聚^t/^^/包括但不P艮于例如，非多肽聚^tl，下列类型的带电或中性聚合物葡聚糖、多聚唾液酸或其它糖类聚合物，生物素衍生物，以及树状聚，。术语PEG也包括其它聚亚^^化物类的聚^。例如，PEG可连接于蛋白的任意N端錢酸，禾P/^i接于N端錢酸的下游氨基酸,，例如赖氨酸、组氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸，棘本领職术人员已知的其它此类S^酸。例如，半胱氨酸-PEG化蛋白可M;将聚乙二醇与蛋白的半胱氨^S的含硫基团进fi^i接而制成。化對,齢蛋白包含至少一个PEG部分，itiiM少两个PEG部分超不消除活性、结舒蛋白的最多数量PEG部分，例如，PEG部分可结針M^酸BS，,在蛋白的N端部分或其P(逝。结合于蛋白的PEG部分，肝量分布可从约200至20,000MW。优i^J:也，PEG部分从约1,000至8,000MW，更t^A^勺3-50至5,000MW，最优选约5,000MW。PEG分子共价结合于^本发明化学傲布蛋白上的实际数量，可根据所期望的蛋白稳定銜即血清半衰鄉而大幅变化。本文构思的蛋白可用，例如(但不限于)美国专利Nos.，4,179,337;5，382，657;5,972,885;6,177,087;6,165,509;5,766,897;和6^17,869公开的fe^连接于PEG分子；该各文献说明书和附图&tk明确M31M引引入。JtW卜，嵌合蛋白的血清半衰期可M用额外氨基酸或多肽延长嵌合蛋白而增加，例如舰添加数个,sTF结构域，或#附着与治疗个体相容的^1蛋白，例如人类个体的Arfl清白蛋白。此外，也可将嵌合蛋白包埋于制备的微胶囊中，例如，通过团聚技术或界面聚合技术制备(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚"(甲基丙烯酸甲酯)微胶彰，或包埋于胶状药物m系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒、以及纳米胶囊)或巨乳液(macroemulsions)中。这些技术在:W版本的Remington'sPharmaceuticalSciences中有公开。美国专利4,789,734记载了脂质体中包埋生化物质的方法，^ifc明确通过援弓l引入。总体而言，将物质溶于水溶液，加入适当的磷脂和脂质，如果需要，加A^面活性剂，然后将物质进行必要的透析鋼声。GGregoriadis(10)对已知方法进行了综述。聚，或蛋白形成的微球，是本领,术人员公知的，其能定制以通过胃Mil直接^A血流。或者，可整^剂，而且微球或微球复合物^A，以缓释一定时期，范围从数超数月。参见例如美国专利4,906,474;4，925，673;和3,625^14，它们在此引入作为参考。对于本发明冻干产品的重构而言，可使用无菌,液，所述稀释液可含有,生理剩牛的通常接受的物质称或官方规定所要求的物质。在S^面，无菌,液可包含缓冲剂以获得生理可接受的pH，例如氯化钠、盐水、冲盐水、禾p/^它生理学可接受并^gy^可安全JOT的物质。一般而言，人体静脉注射物质应与食品药品监督管理局所确立的规则一致，其可由本领m员获得。药物组^t/也可以是含上述多种相同物质的水溶液形式，用于重构冻干产品。化合物也可以药学可接受的酸或働卩成盐给予，戶腿盐M与无机酸反应，例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、和磷酸，以及与有机酸反应，例如甲酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙,、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、和反丁烯二酸，^K1与无机贩应，例如M^化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，以M31与有机ms应，例如单-,二-，三烷凝n芳基胺、以及取代的乙醇胺，而形成。如上所述，本发明化合物可并入用于治疗目的的药物制剂。然而，术语"药物制剂"在本文中广义意指包皿有本发明嵌合蛋白组合物的制剂，其不仅用于治疗目的，而且用于本领域己知的试剂或诊断目的，或者用于组织培养目的。用于治疗应用的药物制剂，应包含"药学上可接受的"或"治疗有效量的"嵌合蛋白，即该用量是预防性或治疗性繊措M0f必需的。如果药物制剂用作试剂或诊断目的，那么它应包含试剂量或诊断量的齢蛋白。本发明的范围并不受限于本文戶;H己载的具体实施方式，因为这些实施方式意在说明本发明的某一方面，而^M功能Wr实施方式都在本发明范围内。的瓶本发明化合物和方法的各种z鄉以及本文记载和显示的那些，对本领域技术人员来说，根据前文记载,而易见的。5.RufW,RehemtullaAMorrisseyJH,EdgingtonTS.PhosphcNi(ritHnd^)enderitand~dependentinteraclionsrequdredfbrtissuefactorreceptormidco^ctorfunction.JChem1^1;286(4):2158-86.01486.vanhtoerdeWL,deGrootPG,ReuteHngspergerCP.ThecomplexityofthephosphollfAlbfndb^proteinAnne:dnV.ThrambHa抓ost1995;73(2):172-9.01487.TaltJF.GibsonD.Phos(MpidblndftigofannexinV:effectsofcericiumandrrombrarwfrfwsphaWylserine咖tentArchBfochemBiophys1992;298(1):187-91.01幼8.ReuMr^spergerCP.Annex!ns:keyregulatorsofhaemostasis,thrombosis,andapoptosls.ThrombHaemost2001;86(":4139.0151]9.Harrisetal..Peflvlafl肌ANovelProoessfor,tfyjngPhararmacoklnetlcs.qinPharmacokinet2001:40(7);539"5015210.Gregn^sG.Chapter14.Uposomes,DrugCarriereinBiologyandMedldne,pp.287-341(AcademicPress,1979).015311DrakeMorrisseyJH,EdgingtonTS.Selectivecellularexpressionoftissuefactorinhumantissues.Implicationsfbrdisordersofhemostasisandthrombosis.AmJPathol.1989;134:1087-1097.0154RufW,RehwntirtlaA,MorrteseyJH,Ec^ngtonTS.Phosphol一cHndepenctentand-dependentInteractionsrequiredfortissuefactorreceptorandcoladorfiNfic^m.JBiolChem.1891',266:215821明.卵夠NeuwschwarK)~PF,MorrisseyJH.Deletionofthemembraneandio陶regionoftissueVictoraboHshesautoacSvationof紐ctorVIIbutnotcofaciorfunction.AnalysisofamutantwithaselectivedeficiencyInactivity.JBiolChem.1992;267:14477-14482.01敦PabwskyLR,CarasIW,FisherKL,GormanCM.UpWassociation,butnotthetransmembranedwnain,isrequiredfwtissuefactoractivity.Subs麵wiofthetransmembranedomainwithaphosphstW^inositolanchor,JBiolChem.1991;266:21911-21916.280157]MacfeuiaRG,BiggsR.A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