专利名称::新颖的营养药物性组合物的利记博彩app新颖的营养药物性组合物本发明涉及新颖的营养药物性组合物。本发明涉及包含三肽甲硫氨酸-丙氨酸-脯氨酸(Met-Ala-Pro,在下文中MAP)和/或异亮氨酸-苏氨酸-脯氨酸(Ile-Thr-Pro,在下文中ITP)。本发明更特别地涉及包含MAP和/或ITP的组合物,其用于促进健康或用于预防和/或治疗疾病。所述组合物特别适用于治疗或预防高血压和心力衰竭,或相关病症如心绞痛、心肌梗死、中风、外周动脉梗阻疾病、动脉粥样硬化和肾病。本发明另一方面涉及MAP和/或ITP在制造下述营养药物性组合物中的用途,所述营养药物性组合物用于治疗或预防高血压和心力衰竭中伴随的消耗。本发明另一方面涉及治疗或预防高血压和心力衰竭或相关病症如心绞痛、心肌梗死、中风、外周动脉梗阻疾病、动脉粥样硬化和肾病,其中向需要这类治疗的个体施用有效数量的包含MAP禾口/或ITP的组合物。己知高血压为世界性过早死亡的最重要的可预防诱因之一。另外,甚至位于正常范围最上端的血压被认为提高过早死亡的风险。高血压是冠心病的主要危险因子和中风的最重要的危险因子。其有助于所有心血管疾病的大约一半,这些疾病在2002年占据了16.7百万的全球死亡。舒张压每提高10点或收縮压每提高20点,心血管疾病的风险加倍。在大部分国家中,成年人多达三分之一遭受高血压。高血压的患病率随年龄而提高,且该趋势在发展中国家特别明显。另外,据估计40%的高血压患者不能被诊断。目前,没有对高血压患者的治愈性疗法,且治疗的主要目标为将血压降至较安全的水平。饮食和生活方式的改变(如更多的锻炼、降低盐摄入和有效的压力管理)也可代表预防高血压的工具。这随后可降低药疗法的需要量,所述药疗法通常伴随着从干咳到日常生活活动能量丧失范围内的副作用。因此,存在通过食品添加物用于预防和治疗高血压的巨大需要,所述食品添加物是安全的,并且不伴随目前用于治疗高血压的药物的副作用。目前,ACE抑制剂、血管紧张素n受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、利尿剂和e-阻滞剂广泛用于治疗高血压。ACE抑制剂降低血管紧张素II(一种已知提高血压的肽激素)的水平。血管紧张素n受体拮抗剂阻断血管紧张素II与其受体的结合,从而显示血压降低的效应。钙通道阻滞剂减少钙进入血管壁细胞,从而减少血管缢縮,这依次降低血压。利尿剂引起提高的钠和水的尿排泄,这引起血压降低。e阻滞剂阻断去甲肾上腺素和肾上腺素对e肾上腺素能受体的作用,从而减少血管缢縮并降低血压。本发明涉及作为营养药(优选药物)的MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐。本发明还涉及MAP禾n/或ITP或MAP盐和/或ITP盐作为营养药(优选药物)的用途,涉及MAP禾n/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于制造营养药(优选药物)的用途,涉及MAP禾n/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于促进健康或预防和/或治疗疾病的用途,涉及MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于制造治疗心血管疾病(例如高血压和心力衰竭)的营养药(优选药物)的用途,涉及MAP禾n/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于治疗糖尿病前期或糖尿病的用途,涉及MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于治疗或预防肥胖症的用途,涉及MAP禾n/或ITP或MAP盐和/或ITP盐提高血浆胰岛素或提高对血浆胰岛素敏感性的用途,涉及MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐提高血浆胰岛素或提高2型糖尿病或糖尿病前期对血浆胰岛素敏感性的用途,涉及MAP禾n/或ITP或MAP盐和/或ITP盐降低2型糖尿病或糖尿病前期血中餐后葡萄糖浓度的用途,涉及MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐提高2型糖尿病或糖尿病前期血中餐后胰岛素分泌的用途,涉及MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐的用途(其中MAP和/或ITP为食品添加物的形式),涉及MAP禾卩/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于制造用于治疗性治疗压力效应的功能性食品的用途,涉及MAP禾n/或ITP或MAP盐和/或ITP盐局部应用(优选个人护理应用)的用途,和涉及MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐在饲料和宠物食品中的用途。MAP为优选的三肽并优选用于本发明用途中。另外,本发明涉及治疗1型和2型糖尿病、在患有糖尿病前期或葡萄糖耐量受损(IGT)的个体中预防2型糖尿病的方法(包括向需要这类治疗的患者施用MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐)和治疗或预防遭受高血压或心力衰竭的患者的方法(包括向需要这类治疗的患者施用MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐)。根据本发明的另一方面,公开了化学合成MAP和/或ITP或MAP盐禾口/或ITP盐的方法。另外本发明涉及包含MAP禾口/或ITP或MAP盐和/或ITP盐作为活性成分的药物,包含MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐作为活性成分的食品添加物,包含MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐作为活性成分的食品,包含MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐作为药物或用于健康益处的组合物,优选为食品或饲料的组合物(其中健康益处为治疗压力效应),包含MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于局部剂的组合物(优选用于个人护理)并涉及为乳液、凝胶或乳剂的组合物。根据本发明惊奇地发现,MAP和ITP均抑制血管紧张素I转化酶(ACE)并从而抑制血压降低效应。ACE的抑制引起经降低的血管收縮、经增强的血管舒张、经促进的钠和水排泄,这随后引起经降低的外周血管阻力和血压和改进的局部血流量。因此,本组合物对预防和治疗可由ACE抑制影响的疾病特别有效,所述疾病包括但不仅限于高血压、心力衰竭、心绞痛、心肌梗死、中风、外周动脉梗阻疾病、动脉粥样硬化、肾病、肾机能不全、勃起机能障碍、内皮技能障碍、左心室肥大、糖尿病性血管病变、液体潴留和醛甾酮过多症。所述组合物还可用于预防和治疗胃肠道病症(腹泻、过敏性肠综合征)、验证、糖尿病、肥胖症、痴呆、癫痫、老年性意识错乱和Meniere's疾病。另外,所述组合物可增强认知功能和记忆(包括Alzheimer's疾病)、饱满感,限制局部缺血损伤和预防旁路手术或血管成形术之后的动脉再阻塞。糖尿病是一种普遍的慢性病,迄今无法治愈。糖尿病的发生和流行呈指数级增加,并且是发达国家和发展中国家最为常见的代谢疾病之一。糖尿病是多种原因引起的复杂疾病,其特征为受损的碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢以及胰岛素分泌和/或胰岛素耐受抵抗。这引起提高的空腹血糖浓度和餐后血糖浓度,如果不处理则引起并发症。该疾病有两种主要的种类胰岛素依赖型糖尿病(IDDM,T1DM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM,T2DM)。T1DM4型糖尿病。T2DM-2型糖尿病。T1DM和T2DM糖尿病与高血糖症、血内胆固醇过高症和高脂血症相关。T1DM和T2DM中各自的绝对胰岛素缺乏和对胰岛素不敏感引起肝、肌肉和脂肪组织葡萄糖利用降低以及血糖水平提高。未控制的高血糖症与提高的和过早的死亡相关,因为增加了微血管疾病和大血管疾病的风险,所述疾病包括肾病、神经病、视网膜病、高血压、中风和心脏病。近期证据表明严格的血糖控制是预防T1DM和T2DM中这些并发症的主要因素。因此,通过药物或疗法的最佳血糖控制是治疗糖尿病的重要途径。T2DM治疗最初涉及饮食和生活方式的改变,当这些手段不能维持适当的血糖控制时,用口服降血糖药和/或外源胰岛素治疗患者。目前治疗T2DM的口服药剂包括控制胰岛素分泌的药剂(磺脲剂)、促进肝内胰岛素活动的药剂(缩二胍剂)、胰岛素增感剂(噻唑烷二酮)和抑制葡萄糖吸收的药剂(a-葡糖苷酶抑制剂)。然而,目前可得的试剂通常不能长期维持合适的血糖控制,因为胰腺细胞功能的逐渐丧失引起高血糖症的逐渐恶化。随着时间进展,能够维持目的血糖水平的患者比例显著降低,施用附加的/其他的药剂成为必须。另外,药物可能具有有害的副作用,并涉及高初始失效率和次级失效率。最后,降血糖药的使用可有效控制血糖水平,但不能预防糖尿病所有的并发症。因此,用于治疗所有类型糖尿病的现有方法不能达到血糖量正常和预防糖尿病并发症的理想。因此,尽管治疗T1DM和T2DM的疗法选择基本上依赖于施用胰岛素和口服降血糖药物,仍需要具有最小副作用的安全有效的营养添加剂用于治疗和预防糖尿病。许多患者对能够最小化伴随高剂量药物的副作用并产生额外临床益处的其他替代疗法感兴趣。患有糖尿病的患者对具有温和抗糖尿病效应并且没有主要副作用的被认为是"天然"的治疗方法非常感兴趣,所述治疗可以用做辅佐治疗。T2DM是渐进的慢性病,直到负责产生胰岛素的胰腺细胞(胰岛/3-细胞)发生显著损伤时才会被识别。因此,对发展饮食添加剂存在增长的兴趣,所述饮食添加剂可用于预防0细胞损伤并从而预防显性T2DM在风险人群(特别是有患T2DM高风险的老年人)中发展。由于葡萄糖和脂质对e细胞有损伤,所以可通过降低血糖和/或血脂水平来保护胰腺P细胞。可通过不同的机制降低血糖水平,例如通过增强胰岛素敏感性和/或通过降低肝糖产生。也可通过不同的机制降低血脂水平,例如通过增强脂质氧化和/或脂质储存。保护胰腺P细胞的另一可能策略为降低氧化应激(oxidativestress)。氧化应激也可引起P细胞损伤及引起胰岛素分泌损失和发展为显性T2DM。因此,T2DM是由多种器官位点共存缺陷引起的复杂疾病肌肉和脂肪组织对胰岛素的抵抗、有缺陷的胰腺胰岛素分泌、无限制的肝糖产生。这些缺陷通常伴随脂质异常和内皮官能障碍。考虑到T2DM的多重病理生理学损伤,组合疗法是处理该疾病的吸引人的疗法。本发明涉及包含蛋白质水解产物和亮氨酸的新颖的营养药物性组合物。该包含亮氨酸的营养药物性组合物还可包含水解产物、未水解的蛋白质和碳水化合物作为治疗或预防糖尿病或其他葡萄糖耐量受损相关病症(如X综合症)的活性成分。另一方面,本发明涉及这类化合物作为用于所述治疗或预防的营养添加剂的用途,例如作为多维生素制剂的添加剂,所述制剂包含维持正常代谢功能所必需但不在体内合成的维生素和矿物质。另一方面,本发明涉及治疗1型和2型糖尿病以及用于在患有前糖尿病(pre-diabetes)或葡萄糖耐量受损(IGT)或肥胖症的个体中预防T2DM的方法,其包括对需要这类治疗的受试者施用MAP和/或ITP和蛋白质水解产物或未水解的蛋白质和/或碳水化合物。本发明的组合物尤其旨在治疗T1DM和T2DM,并在患有前糖尿病或葡萄糖耐量受损(IGT)的个体中预防T2DM。本发明涉及包含MAP和/或ITP和任选的蛋白质水解产物的组合物。另外,该组合物包含氨基酸,优选所述氨基酸为亮氨酸。所述MAP和/或ITP和任选的蛋白质水解产物有利地用于提高血液中血浆胰岛素,优选对于2型糖尿病或糖尿病前期。令人惊奇的是发现该MAP和/或ITP可用于2型糖尿病或糖尿病前期,优选在血中降低餐后葡萄糖浓度或提高餐后胰岛素分泌。所述包含MAP和/或ITP和蛋白质水解产物或未水解蛋白质和/或碳水化合物的组合物协同地次级胰岛素分泌并提高葡萄糖向胰岛素敏感的耙标组织(例如脂肪组织、骨骼肌和肝等)的配置,从而在糖尿病治疗中提供协同效应。通常认为压力相关疾病和压力对身体的副作用对许多人具有显著的影响。最近几年,压力的效果及其对多种疾病和病症的多种发展的贡献在医学和科学界得到了更广泛的接受。消费者现在越来越明白这些潜在的问题,并对降低或预防压力对他们健康的可能副作用越来越感兴趣。本发明的一个目的为提供食品或可整合在其中的成分,所述成分适用于帮助身体处理压力的作用。本发明的另一目的为提供具有高浓度下述成分的食品,所述成分提供健康益处,例如帮助身体处理压力的副作用。根据一方面,本发明提供三肽MAP和/或三肽ITP和/或其盐用于制造下述功能性食品的用途,所述食品用于治疗性治疗压力的作用。已知某些肽显示抗压作用。因此相信三肽MAP和/或三肽ITP和/或其盐非常适用于提供这类健康益处。本领域技术人员非常明白如何确定材料的这类性质。本文中使用的术语"营养药物性(nutmceuUcal)"表示了同时在营养领域及医药领域应用中的有效性。因此,新颖的营养药物性组合物可作为食物和饮料的添加剂,也可作为药物制剂用于肠道或非肠道应用,所述药物制剂可以是固体制剂,例如胶囊或药片,或是液体制剂,例如溶液或悬浮液。从前文明显可知,术语"营养药物性组合物"也包括含有MAP和/或ITP和任选的蛋白质水解产物或未水解蛋白质和/或碳水化合物以及含有上述活性成份的添加组合无碍,如食品添加物。本文中使用的术语"食品添加物"指出旨在补充食谱的含有"食品成分"的由嘴摄取的产品。这些产品中的"食品成分"包括维生素、矿物质、草或其它植物、氨基酸和例如酶、器官组织、腺体和代谢物的物质。食品添加物也可以是提取物或浓縮物,并可以是许多形式,例如片剂、胶囊、软凝胶、凝胶胶囊、液体或粉末。它们也可以是其它形式如棒,但是如果它们是其它形式,则食品添加物的标签信息通常不会表示产品为常规食品或膳食或食谱的唯一成分。MAP和/或ITP可通过水解或发酵含有MAP和/或ITP的任何合适物质制造。有利地,蛋白质物质含有MAP和/或ITP二者的片段。优选蛋白质物质为酪蛋白或乳。三肽MAP(Met-Ala-Pro)和ITP(Ile-Thr-Pro)也可以使用常规技术通过化学合成制造。根据本发明惊奇地发现包含MAP和/或ITP的组合物刺激胰腺胰岛素分泌并增强葡萄糖到胰岛素敏感靶组织的配置。因此,包含MAP和/或ITP的组合物可用于预防或治疗T1DM和T2DM二者,并用于在患有糖尿病前期、葡萄糖耐量受损(IGT)的个体中预防T2DM。MAP和/或ITP和蛋白质水解产物或未水解蛋白质和/或碳水化合物(其个体显示不同的作用机制)的组合使用在糖尿病患者中到达和维持耙血糖水平是有效的。由于上文鉴定的活性成分的的不同作用,已经考虑它们的组合会利用协同和多器官效应。由于个体活性成分的不同作用机制,所述组合不仅促进glycemic控制,而且引起一些调整中更低的药物剂量并最小化不良作用。由于它们不同的作用机制和位点,上述食品添加物的特定组合还利用协同效应以达到大于单一剂可达到的葡萄糖降低程度。因此,尽管在治疗性治疗T1DM和T2DM中所选择的疗法实质上基于胰岛素和口服降血糖药的施用,但是适当的营养治疗对于成功治疗糖尿病也具有较大的重要性。可向本发明营养药物性组合物添加多维生素和矿物质添加物以获得一些食谱中缺乏的适当数量必须营养。多维生素和矿物质添加物也可适用于疾病预防和保护,所述预防和保护针对营养丧失和不足,所述营养丧失和不足由糖尿病中有时观察到的生活方式和不当膳食构成引起。另外,氧化剂应激已涉及胰岛素抗性的发展。活性氧簇可通过破坏胰岛素受体信号级联放大损伤胰岛素刺激的葡萄糖摄入。用抗氧化剂如a-生育酚(维生素E)、抗坏血酸(维生素C)控制氧化剂应激可在治疗糖尿病中具有价值。因此,多维生素添加物的摄取可添加至上述活性物质中以维持均衡的营养。另外,MAP和/或ITP与矿物质如镁(Mg^)、钙(Ca^)和/或钾(K+)的组合可用于促进健康并预防和/或治疗疾病,包括但不仅限于心血管疾病和糖尿病。在本发明优选的一个方面,本发明的营养药物性组合物含有MAP和/或ITP和蛋白质水解产物。MAP和/或ITP以给服用者提供从每kg体重约0.001g到每kg体重约1g的每日剂量的量适当存在于本发明的组合物中。食物或饮料适当的含有每份约0.05g到每份约50g的MAP和/或ITP。如果营养药物性组合物是药物制剂,该药物制剂可含有MAP和/或ITP的量为每剂量单元(如每胶囊或药片)约0.001g到约1g,或对液体制剂而言每日剂量约0.035g到每日剂量约70g。蛋白质水解产物以给服用者提供每kg体重约0.01g到每kg体重约3g的每日剂量的量适当存在于本发明的组合物中。食物或饮料适当的含有每份约O.lg到每份约100g的蛋白质水解产物。如果营养药物性组合物是药物制剂,该药物制剂可含有蛋白质水解产物的量为每剂量单元(如每胶囊或药片)约0.01g到约5g,或对液体制剂而言每日剂量约0.7g到每日剂量约210g。在本发明优选的另一方面,该组合物含有上述MAP和/或ITP和未水解的蛋白质。未水解的蛋白质以给服用者提供每kg体重约0.01g到每kg体重约3g的每日剂量的量适当存在于本发明的组合物中。食物或饮料适当的含有每份约O.lg到每份约100g的未水解蛋白质。如果营养药物性组合物是药物制剂,该药物制剂可含有未水解蛋白质的量为每剂量单元(如每胶囊或药片)约O.Olg到约5g,或对液体制剂而言每日剂量约0.7g到每日剂量约210g。在本发明优选的另一方面,组合物含有如上所述MAP和/或ITP和蛋白质水解产物或未水解蛋白质和碳水化合物。碳水化合物以给服用者提供每kg体重约0.01g到每kg体重约7g的每日剂量的量适当存在于本发明的组合物中。食物或饮料适当的含有每份约0.5g到每份约200g的碳水化合物。如果营养药物性组合物是药物制剂,该药物制剂可含有碳水化合物的量为每剂量单元(如每胶囊或药片)约0.05g到约10g,或对液体制剂而言每日剂量约0.7g到每日剂量约490g。优选的本发明营养药物性组合物包含MAP和/或ITP和蛋白质水解产物或未水解蛋白质和/或碳水化合物,特别是下列组合MAP和/或ITP和蛋白质水解产物;MAP和/或ITP和蛋白质水解产物和碳水化合物;MAP和/或ITP和未水解蛋白质;MAP和/或ITP和未水解蛋白质和碳水化合物;最优选MAP和/或ITP和蛋白质水解产物的组合。剂量范围(对70kg重的人而言)MAP禾口/或ITP:每天0.005g-70g蛋白质水解产物每天0.07g-210g未水解蛋白质每天0.07g-210g碳水化合物每天0.1g-490g三肽MAP(Met-Ala-Pro)和ITP(Ile-Thr-Pro)可以以多种方法制造,所述方法包括化学合成、酶水解和含蛋白质溶液发酵。复合混合物中生物活性肽例如得自发酵的蛋白质水解产物或液体的鉴定是具有挑战性的任务。不考虑基本问题是否使用正确的蛋白质底物、是否使用正确的酶、是否使用正确的微生物培养物,可期望若干生物活性肽存在于含有数千种肽的复合样品中。使用重复的高效液相色谱(HPLC)分级和生物化学评估的传统鉴定途径通常是费时的,并易于丧失存在的生物活性肽,使得相关生物活性的检测非常困难。在本操作中,使用非常复杂的仪器并筛选许多不同的蛋白质水解产物和发酵培养基,最终导致具有ACE抑制特性的两种新颖肽MAP和ITP的鉴定。在本方法中将恒流生物化学测定法与与HPLC分级体系联机偶联。HPLC柱流出液在恒流ACE生物测定和化学分析技术(质谱)之间分流。通过HPLC分离粗水解产物和发酵培养基,之后通过联机生物化学测定的手段检测生物学活性化合物的存在。持续记录质谱图使得当生物化学测定中肽显示阳性信号时可立刻获得结构信息。通过上述途径鉴定的三肽MAP和ITP可通过多种方法制造,所述方法包括经济学上可行的制造途径。使用例如描述于"Peptides:ChemistryandBiology"byN.SewaldandH,D.Jakubke,Eds.Wiley-VCHVerlagGmbH,2002,Chapter4的常规技术通过化学合成的制造是可能的。适用于大规模制造的特别cost-effective的化学肽合成方法基于烷基氯甲酸盐或pivaloylchloride的使用(用于激活羧酸基团)组合甲基酯(用于C-端保护)和节氧羰基(Z)或叔丁氧羟基基团(用于N-保护)的使用。例如在MAP情况下,L-脯氨酸甲基酯可与异丁基氯甲酸盐激活的Z-Ala偶联;得到的二肽可以通过使用氢和Pd的水解在C端Z-脱保护,并用异丁基氯甲酸盐激活的Z-Met再次偶联;在得到的三肽中用NaOH水解甲基酯,并在通过氢解Z-脱保护后获得三肽Met-Aia-Pro。类似地可合成Ile-Thr-Pro,但是在偶联反应中Thr的羟基功能需要苯甲基-保护;在最终步骤中该基团在Z-脱保护时被同时去除。MAP和/或FTP也可使用含有氨基酸序列MAP和/或ITP的任何蛋白质底物通过酶水解或通过发酵途径制造。蛋白质底物有利地含有MAP和ITP两种片段。用于这类酶或发酵途径的优选蛋白质底物为牛乳或牛乳酪蛋白级分。通过最佳化发酵或水解条件可最大化生物活性分子MAP和/或ITP的产生。企图将产量最大化的技术人员知道如何调节过程参数,如水解/发酵时间、水解/发酵温度、酶/微生物类型和浓度等。MAP和/或ITP或包含MAP和/或ITP的组合物有利地为水解产物,并优选根据涉及以下步骤的过程制造(a)酶水解其氨基酸序列中包含MAP或ITP的合适蛋白质底物,得到包含三肽MAP和/或ITP的经水解的蛋白质产物;(b)从经水解的蛋白质产物中分离富含三肽MAP和/或三肽ITP的级分;和任选地(c)浓縮和/或干燥来自步骤b)的级分以获得富含三肽MAP和/或三肽ITP的经浓縮的液体或固体。酶水解步骤(a)可以是引起蛋白质水解的合适蛋白质底物的任何酶处理,所述蛋白质水解引起MAP和/或ITP三肽的释放。尽管可使用若干酶组合将目的三肽从蛋白质底物释放,本过程中使用的优选的酶为脯氨酸特异内切蛋白酶或脯氨酸特异寡肽酶。合适的蛋白质底物可以是包含MAP和/或ITP氨基酸序列的任何底物。已知包含MAP的蛋白质底物为例如酪蛋白、小麦谷蛋白、向日葵蛋白质分离物、稻蛋白、卵蛋白。合适的蛋白质底物优选包含如在牛P-酪蛋白、小麦谷蛋白a-麦醇溶蛋白级分和向曰葵蛋白质分离物中的2S级分中所存在的氨基酸序列AMAP或PMAP。酪蛋白底物可以是含有大量P-酪蛋白和a-s2酪蛋白的任何材料。合适底物的实例为如以及酪蛋白、酪蛋白粉、酪蛋白粉浓縮物、酪蛋白粉分离物或P-酪蛋白或a-s2-酪蛋白。优选具有高酪蛋白含量的底物,如酪蛋白蛋白质分离物(CPI)。酶可以是能够水解蛋白质(如P-酪蛋白和/或a-s2-酪蛋白)使得一个或多个MAP和/或ITP三肽释放的任何酶或酶组合。分离步骤(b)可以以技术人员已知的任何方式执行,例如通过沉淀、过滤、离心、抽提或层析或其组合。优选分离步骤(b)使用微滤或超滤技术执行。过滤步骤中使用的膜的孔径以及膜的电荷可用于调控三肽MAP和/或三肽ITP的分离。使用UF/NF膜分级酪蛋白水解产物描述于Y.Poilotetal,JournalofMembraneScience158(1999)105-114。浓縮步骤(c)可涉及纳米过滤或蒸发由步骤(b)产生的级分,得到高度浓縮的液体。适当配制时(如具有低水活性(Aw)、低pH和优选如苯甲酸盐或山梨酸盐的防腐剂)这类经浓縮的液体组合物形成本发明三肽的良好储存方法。任选地,蒸发步骤之后跟随干燥步骤(例如通过喷雾干燥或冷冻干燥)以得到含高浓度MAP禾n/或ITP的固体。酶方法优选地包含单一酶孵育步骤。根据本发明的酶方法还涉及脯氨酸特异蛋白酶的使用,所述脯氨酸特异蛋白酶优选不含有污染性的酶活性。脯氨酸特异蛋白酶定义为在脯氨酸羧基端一侧水解肽键的蛋白酶。优选的脯氨酸特异蛋白酶为在脯氨酸和丙氨酸残基的羧基端一侧水解肽键的蛋白酶。脯氨酸特异蛋白酶优选能够水解大蛋白质分子如多肽或蛋白质自身。根据本发明的方法通常具有小于24小时的孵育时间,优选孵育时间为小于10小时,更优选小于4小时。孵育温度通常高于30°C,优选高于40°C,更优选高于50。C。本发明的另一方面为从经水解的蛋白质中纯化和/或分离三肽MAP和ITP。大部分根据本发明的经水解的蛋白质优选能够在所选择的pH条件下沉淀。该纯化方法包含将pH改变为大部分经水解的和未水解的蛋白质沉淀的pH,并将沉淀的蛋白质与残留在溶液中的(生物活性)三肽中分离。为了获得羧基端具有脯氨酸残基的所述三肽,能够在羧基端一侧切割脯氨酸残基的蛋白酶的使用提供优选的选择。所谓的脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26)具有优先在脯氨酸残基羧基侧切割肽的独特可能性。脯氨酰寡肽酶还具有在丙氨酸残基的羧基侧切割肽的可能性,但是后一反应不如涉及脯氨酸残基的肽键切割有效。在所有分离自哺乳动物以及微生物来源的充分表征的脯氨酸特异蛋白酶中,已鉴定了一个独特的肽酶结构域,其从酶的活性位点中排除大的肽。事实上这些酶不能够降解含有多于约30个氨基酸残基的肽,从而这些酶目前被称为"脯氨酰寡肽酶"(Fulopetal:Cell,Vol.94,161-170,July24,1998)。因此,这些脯氨酰寡肽酶在能够发挥其水解作用之前需要与其它内切蛋白酶预水解。然而如WO02/45523所述,甚至脯氨酰寡肽酶与这类另一内切蛋白酶的组合也得到下述水解产物,所述水解产物特征为具有羧基端脯氨酸残基的肽比例显著提高。因此,这类水解产物形成用体外ACE抑制效应用于分离三肽的极佳起点,以及对胃肠蛋白水解降解的提高的抗性。"肽"或"寡肽"在本文中定义为通过肽键连接的至少两个氨基酸的链。属于"肽"和"寡肽"认为同义(如通常所识别的)且各术语可根据上下文要求交换使用。"多肽"在本文定义为含有多于30个氨基酸残基的链。本文所有的(寡)肽和多肽式或序列根据普遍实践以从氨基端到羧基端的方向从左至右书写。本文所使用的氨基酸单字母密码为本领域普遍已知,并可见于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)。内切蛋白酶在本文定义为以内切方式水解多肽中的肽键并属于EC3.4的酶。内切酶根据催化机制分为两个亚-亚类。有丝氨酸内切蛋白酶(EC3.4.21)、半胱氨酸内切蛋白酶(EC3.4.22)、天冬氨酸内切蛋白酶(EC3.4.23)、金属内切蛋白酶(EC3.4.24)和苏氨酸内切蛋白酶(EC3.4.25)亚-亚类。外切蛋白酶在本文定义为水解邻近末端a-氨基基团的肽键的酶("氨基肽酶")或水解末端羧基基团和次末端氨基酸之间肽键的酶("羧肽酶")。WO02/45524描述可得自Aspergillusniger的脯氨酸特异蛋白酶。所述来自A.niger的酶优先切割脯氨酸的羧基端,但是也可切割羟基脯氨酸的羧基端,并以较低效率切割丙氨酸的羧基端。WO02/45524还教导该来自A.niger的酶与来自其它微生物或哺乳动物来源的已知脯氨酰寡肽酶之间不存在清晰的同源性。与已知的脯氨酸寡肽酶相反,A.niger酶具有酸性pH最适度。尽管已知的脯氨酰寡肽酶以及来自A.niger的酶是所谓的丝氨酸蛋白酶,但是A.niger酶属于完全不同的亚家族。经分泌的A.niger酶显示是丝氨酸蛋白酶S28家族成员,而不是大部分胞质脯氨酰寡肽酶被归类在其中的SO家族(Rawling.N.D.andBarrett,A丄;Biochim.Biophys.Acta1298(1996)l-3)成员。如本发明方法中使用的来自A.niger的酶制剂优选基本上纯净,即除纯净的脯氨酸特异内切蛋白酶固有的内蛋白水解活性之外不存在显著的内蛋白水解活性。我们还证明来自A.niger的酶制剂(优选根据本发明所使用的)不含有任何外蛋白水解活性,更特别是氨基肽水解副活性。优选本发明方法中使用的来自A.niger的酶制剂中不存在外蛋白水解活性。非重组Aspergillus菌株中基本不存在脯氨酸特异的外蛋白水解活性的观点的实验性证据可见于WO02/45524。因为通过将酪蛋白底物仅与脯氨酸特异内切蛋白酶孵育,本发明的方法是可能的,因此最佳孵育条件如温度、pH等可容易地选择,并且不需要调整为使用两种或更多酶的情况时应有的次最佳条件。另外,不期望的副产物(如例如引起培养基异味的额外的、非生物活性的肽或游离氨基酸)的形成被预防。选择反应条件的更多自由度使得用于其它标准的更容易的选择成为可能。例如,现在选择下述条件更为容易,所述条件相对于随后的蛋白质沉淀步骤而言对微生物感染和对最佳pH条件较不敏感。Aspergillus酶不是寡肽酶,而是能够水解完整蛋白质、大肽以及较小的肽分子而不需要附加的内切蛋白酶的真正的内切肽酶。由于不需要附加的内切蛋白酶,这个新的并令人惊奇的发现打开了使用A.niger酶制备有空前高含量的带有羧端脯氨酸残基的肽的水解产物的可能性。这类新的水解产物可从来自植物或动物来源的不同蛋白质起始材料制备。这类起始材料的实例为酪蛋白、明胶、鱼或卵蛋白、小麦谷蛋白、大豆和豌豆蛋白以及稻蛋白和向日葵蛋白。因为钠在高血压中起重要作用,用于制造ACE抑制性肽的优选底物为这些蛋白质的钙盐和钾盐而非钠盐。来自A.niger的脯氨酰内切蛋白酶的pH最适度为4.3左右。由于该低pH最适度,牛乳酪蛋白酸盐与来自A.niger的脯氨酰内切蛋白酶的孵育并非不言而喻的。如果pH落于6.0以下,则牛乳酪蛋白酸盐会沉淀,但是在pH6.0时A.niger仅有有限的活性。即使在该相当不顺利的条件下,与来自A.niger的脯氨酰内切蛋白酶的孵育也能够产生若干已知的ACE抑制性肽,如IPP和LPP。非常令人惊奇的是在这些条件下不产生VPP。牛乳酪蛋白结合大量不同的蛋白质,包括3-酪蛋白和/c-酪蛋白。根据已知的氨基酸序列,P-酪蛋白包含ACE抑制性三肽IPP、VPP和LPP。k-酪蛋白仅包含IPP。来自A.niger的酶不包含任何可测量的氨基肽酶活性的事实有力地提示所形成的IPP从k-酪蛋白中存在的-A107-I108-P109-P110-序列中释放。据推测IPP的羧基端肽键被来自A.niger的脯氨酰内切蛋白酶的主要活性切割,但是之前的Ala-Ile键的切割由其Ala-特异的副活性完成。类似地,VPP的缺失可根据氨基肽酶副活性的缺失解释。vpp包含在e酪蛋白中序列-P8,-V82-VS3-V84-P85-PS6-里。因此脯氨酸特异内切蛋白酶切割VVVPP序列但是不能释放VPP。这些结果通过将酪蛋白酸盐与来自A.niger的内切蛋白酶在简单的单步骤酶方法中孵育获得。含有蛋白质的水性溶液对微生物感染高度易感染,特别是在高于5.0的pH值和5(TC或更低的温度下保持数小时后。特别地,微生物毒素可在这类延长的孵育步骤中产生,并可能在随后的加热步骤中存活并对食品分级过程形成潜在对威胁。本发明优选使用高于50°C的孵育温度。结合单步骤酶方法(其中酶孵育进行少于24小时,优选少于8小时,更优选少于4小时的周期),根据本发明的方法提供经改进的微生物稳定性的优点。使用本发明酶-底物比例与高温度条件的组合,IPP和LPP的切除在3小时的孵育周期内完成。因为ACE抑制性肽IPP和LPP可以使用单一的、本质上纯净的内切蛋白酶从酪蛋白上切除,因此本发明得到比起现有技术方法更少数量的水溶性肽。在这些水溶性肽中,IPP和LPP以主要数量存在。这在需要高浓度ACE抑制性三肽而不需要许多其它的、通常活性较小化合物的情况下尤其重要。根据本方法优选蛋白质中存在的一I-P-P-或一L-P-P-序列的至少20%,更优选至少30%,最优选至少40X分别被转化为IPP或LPP。在实施例中,我们通过新颖的和令人惊奇的纯化步骤说明生物活性肽的5倍纯化效应。该纯化方法的基础由来自A.niger的脯氨酸特异内切蛋白酶的独特性质形成。与该酶的孵育以水溶性三肽的形式释放底物分子的最具生物活性的部分。底物分子的无生物活性部分或生物活性较小的部分在很大程度上保持未被切割并从而保持底物分子的大得多的肽或多肽部分。由于这些更大的肽或多肽部分在所选择的pH条件下水溶性有限,因此这些无生物活性或生物活性较小的底物分子部分从可溶性大得多的生物活性三肽中被容易地分离。在该方法中,最初的水解产物在55°C、pH6.0的简短酶孵育周期内形成,然后被任选地加热至高于S(TC的温度以杀死所有污染的微生物并灭活来自A.niger的脯氨酰内切蛋白酶。随后酸化水解产物以确认pH降至4.5或至少低于5.0。该pH值(由于其代表了酶的最佳条件,因此不能用于灭活来自A.niger的脯氨酰内切蛋白酶的)下,来自酪蛋白酸盐的所有大肽沉淀,从而仅较小的肽残留在溶液中。由于被沉淀的酪蛋白酸盐可通过倾析或过滤步骤或低速(即低于5000rpm)离心容易地去除,因此水相含有相对于存在的蛋白质高比例的生物活性肽。根据KjeldaW数据,80%到70%的酪蛋白酸盐通过低速离心步骤被去除,这意味着ACE抑制性肽的四倍到五倍纯化。我们发现可有利地应用纯化原理获得生物学活性肽,所述生物学活性肽最好得自除酪蛋白以外的蛋白质材料。另外,根据本发明方法不但能够分离和纯化酶制造的水解产物,而且能够分离和纯化通过合适微生物发酵的蛋白质。将酶和底物在接近底物会沉淀且酶仍具活性的pH值处孵育会允许该纯化步骤发生。由于来自A.niger的脯氨酰内切蛋白酶的低pH最适度,可认为底物在pH1.5到6.5之间的范围内沉淀。考虑到它们特异的沉淀行为(谷蛋白在高于pH3.5时沉淀,向日葵蛋白在高于pH4.0并低于pH6.0时沉淀,卵白在高于pH3.5并低于pH5.0时沉淀)形成经水解的蛋白质沉淀条件的实例,并且经沉淀的蛋白质可从经水解的蛋白质或肽中分离。倾析、过滤或低速离心后,含有生物活性肽的上清液可以被回收为经纯化的状态。随后的蒸发和喷雾干燥的步骤会产生用于获得具有高生物活性的食品等级糊剂或粉末的经济途径。通过根据所述方法消化酪蛋白酸盐,获得白色无味的高浓度ACE抑制性肽的粉末。备选地,可使用蒸发或纳米过滤进一步浓缩生物活性肽。通过提高水活性(Aw)加上调节pH和添加食品级别的防腐剂(如苯甲酸盐或山梨酸盐)适当配制这类浓度,这会产生微生物稳定的、食品级别的、降血压肽的液体浓縮物。适当地稀释至正确的三肽浓度时,获得适用于对所有种类的食品和饮料赋予ACE抑制特征的通用起始材料。需要时,可进一步加工经倾析、过滤或低速离心获得的上清液,以改善最终产物的口味。例如,可将上清液与粉末状的、经激活的活性炭接触,然后进行过滤步骤去除活性炭。为了最小化最终产物的苦味,可以将倾析、过滤或低速离心后获得的上清液与另一蛋白酶进行孵育,例如枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或谷氨酸-特异的内切蛋白酶。需要时可通过随后的纯化步骤进一步提高生物活性成分MAP和/或ITP的浓度,所述纯化步骤利用三肽MAP和ITP的特异亲水/疏水特性。优选的纯化方法包括纳米过滤(按尺寸分离),用例如己烷或丁醇萃取然后蒸发/沉淀或与经酸化的水解产物(用色谱树脂从AmberliteXADrange(Roehm)获得)接触。也使用由Pharmacia提供的丁酰琼脂糖树脂。在另一个实施例中,我们描述酪蛋白水解产物中新的ACE抑制肽MAP和ITP的鉴定和新肽的纯化方法,所述酪蛋白水解产物使用来自A.niger的脯氨酸特异内切蛋白酶制备。只有使用该单个的(基本纯净的)内切蛋白酶结合大比例非生物活性肽的去除以及高度复杂的分离和鉴定设备才允许我们跟踪和鉴定这些新的ACE抑制性三肽。在根据实施例(沉淀后)制备的来自酪蛋白的生物活性肽(CDBAP)中,三肽MAP和ITP被鉴定为对应于2.9mgMAP/克CDBAP(CDBAP中4.8mgMAP/克蛋白质)禾n0.9mgITP/克CDBAP(CDBAP中1.4mgITP/克蛋白质)的量。CDBAP的另一特性在于格外高的以摩尔计24%的脯氨酸含量。实施例7中描述的测定阐述了ModifiedMatsui测试中对两个新三肽的非常低的IC50值,即对MAP为0.5微摩尔/1和对ITP为10微摩尔/1。如果我们意识到已知最为有效的天然ACE抑制肽之一——IPP在该ModifiedMatsui测试中具有2微摩尔/1的IC50值,则该发现更加令人惊奇。根据本方法,优选地至少20%,更优选地至少30%,最优选地至少40X的存在于蛋白质中的-M-A-P-或-I-T-P-序列分别被转化为MAP或ITP。实施例中进一步阐述了新近鉴定的ACE抑制肽MAP和ITP的有用性。在后面的实施例中,我们显示两个肽均在下述孵育条件下幸存,所述孵育条件模拟通常存在于胃肠道的消化条件。根据这些数据,我们得出下述结论新颖的三肽很可能在哺乳动物(例如人)胃肠道中幸存,意味着如果用于治疗高血压时可观的经济学潜力。在实施例中,我们证明高级的ACE抑制肽MAP不仅能够在酶水解实验中被产生,而且在经适当的食品级别微生物发酵的乳制品中是可检测的。但是,我们不能证明这类发酵产物中肽ITP的存在。额外的(例如色谱)纯化步骤之前或之后获得的肽MAP和域ITP可用于整合进以常规基础被消耗的食品产物中。这类产物的实例是人造黄油、spreads、多种乳制品如黄油或酸乳或含乳或乳清的饮料。尽管这类组合物通常被施用给人类,但是它们也可被施用给动物,优选地施用给哺乳动物,以缓解高血压。另外,所获得的产物中高含量的ACE抑制剂使得这些产物非常适用于以丸剂、药片或高度浓縮的溶液或糊或粉末的形式被整合进食品添加物中。确保连续释放ACE抑制肽的缓释饮食添加物尤其值得注意。根据本发明的MAP和/或ITP肽可作为干粉被配制在例如药丸、药片、颗粒、药囊或胶囊中。或者根据本发明的酶可作为液体被配制在例如糖浆或胶囊中。用在多种配方中并含有本发明酶的组合物也可掺入至少一种下述化合物生理学可接受载体、佐剂、赋形剂、稳定剂、缓冲液和稀释液,这些术语以其常规含义使用以表示有助于包装、递送、吸收、稳定或(在佐剂的情况下)增强酶生理学效应的物质。可以粉末状形式与根据本发明的酶组合使用的多种化合物的相关背景可见于"PharmaceuticalDosageForms",secondedition,Volumes1,2and3,ISBN0-8247-8044-2MarcelDekker,Inc.。尽管作为干粉被配制的本发明的ACE抑制肽可被储存相当长的时间,但是应通过选择合适的包装(例如铝泡aluminiumblister)来避免与潮湿或湿润空气接触。相对新颖的口服应用形式是使用多种类型的明胶胶囊或以明胶为基础的药片。考虑到天然ACE抑制肽抵抗高血压的相关性,该新的和成本有效的途径为温和降压的饮食产品或甚至是兽医产品提供了吸引人的起点。因为该途径还包括惊人的简单纯化步骤,所以也扩大了降血压的、浓縮的饮食添加物的可能性。根据本发明的或根据本发明使用的脯氨酸特异内切蛋白酶是指WO02/45524的权利要求1-5、11和13中提到的多肽。因此,该脯氨酸特异内切蛋白酶是具有脯氨酸特异内切蛋白水解活性的多肽,其选自(a)具有下述氨基酸序列的多肽或其片段,所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸1到526具有至少40%的氨基酸序列同一性;(b)由下述多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸在低严格度条件下与(i)SEQIDNO:l的核酸序列,或大于60个、优选地大于100个核苷酸至少80%或90%与之同一,更优选大于200个核苷酸至少90%与之同一的片段,或(ii)与SEQIDNO:l的核酸序列互补的核酸序列杂交。SEQIDNO:l和SEQIDNO:2显示于WO02/45524中。优选地,多肽是经分离的形式。根据本发明使用的优选的多肽具有与SEQIDNO:2的氨基酸1到526至少50%,优选地至少60%,优选地至少65%,优选地至少70%,更优选地至少80%,进一步更优选地至少90%,最优选地至少95%和进一步最优选地至少约97%同一的氨基酸序列,或包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。优选地,多肽由下述多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格度条件下,更优选地在中严格度条件下,最优选地在高严格度条件下与(i)SEQIDNO:l的核酸序列或其片段,或(ii)与SEQIDNO:l核酸序列互补的核酸序列杂交。术语"能够杂交"是指本发明的靶多核苷酸能够与用作探针的核酸(例如SEQ.IDNO:1中公开的核苷酸序列或其片段,或SEQ,IDNO:1的补体)以显著高于背景的水平杂交。本发明还包括编码本发明脯氨酸特异内切蛋白酶的多核苷酸,以及与之互补的核苷酸序列。核苷酸序列可以是RNA或DNA,包括基因组DNA、合成DNA或cDNA。优选地,核苷酸序列是DNA,最优选地是基因组DNA序列。典型地,本发明的多核苷酸包含核苷酸的连续序列,所述连续序列能够在选择性条件下与SEQIDNO:1的编码序列或SEQIDNO:1编码序列的补体杂交。这类核苷酸可以根据本领域公知的方法来合成。本发明的多核苷酸能与SEQIDNO:1的编码序列或SEQIDNO:1编码序列的补体以显著高于背景的水平杂交。背景杂交可由于cDNA文库中存在的其它cDNA而发生。典型地,通过本发明多核苷酸与SEQIDNO:1编码序列或SEQIDNO:1编码序列的补体之间相互作用而产生的信号水平是其它多核苷酸与SEQIDNO:1编码序列之间相互作用的至少10倍、优选地至少20倍、更优选地至少50倍、进一步更优选至少100倍强。相互作用的强度可通过例如放射性(例如用32P)标记探针来测量。典型地,可使用低严格度条件(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约4(TC)或高严格度条件(例如0.3M氛化钠和0.03M柠檬酸钠在约60°C)进行选择性杂交。UWGCGPackage提供BESTFIT程序,该程序可用于计算同一性(例如按其默认设定使用)。PILEUP和BLASTN算法也可以用于计算序列同一性或比对序列(例如鉴定等价物或响应序列,例如按照它们的默认设定)。用于进行BLAST分析的软件可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。该算法首先涉及通过鉴定査询序列中长度为W的短词来鉴定高分值序列对(HSP),所述短词与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足一些阈值为正的得分T。T是指相邻词的得分阈值。这些初始的相邻词击中作为种子起始了寻找包含它们的HSP的搜索。所述词击中沿着每个序列在两个方向上延伸,直到累积的比对得分能够提高为止。当累积的比对得分与其达到的最大值相比下降X量时;由于一个或多个负分残基比对的累积,累积得分达到零或零下时;或达到任一序列末端时,停止每个方向上的词击中延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的敏感性和速度。BLAST算法使用如下的默认值词长(W)ll、BLOSUM62评分矩阵比对(B)为50、期望(E)为10、M=5、N二4和两链均比较。BLAST算法进行了两个序列间的相似性统计分析。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总概率(smallestsumprobability(P(N))),其提供对两个核苷酸或氨基酸序列间随机发生的匹配可能性的提示。例如,当第一个序列与第二个序列比较时最小总概率是小于约1、优选地小于约0.1、更优选地小于约0.01,最优选地小于约0.001时,认为一个序列与另一序列相似。Aspergillus属的菌株具有食品级别的状态,来自这些微生物的酶己知形成不受怀疑的食品级别来源。根据另一优选的实施方案,酶由其生产细胞分泌而不是非分泌的,因此称为胞质酶。这样,酶可以从细胞培养基中不经昂贵的纯化步骤以基本纯净的级别被回收。优选地,所述酶在主要的pH和温度条件下对其底物具有高亲和力。根据本发明的营养药物性产物可以是任何食物类型的。除食品外它们可包含适当数量的普通食物成分,例如香料、糖、水果、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂等等。优选地,营养药物性产物包含50-200mmol/kgK+和/或15-60mmol/kgCa"和/或6-25mmol/kgMg2+,更优选地包含100-150mmol/kgK+和/或SO-SOmmol/kgCa"和/或10-25mmol/kgMg2+,最优选地包含110-135mmol/kgK+和/或35-45mmol/kgCa2+和/或13-20mmol/kgMg2+。这些离子掺入本发明的营养药物性产物中时具有进一步降低血压的有益效应。有利地,营养药物性产物包含一种或多种B族维生素。已知B族维生素叶酸参与一种人饮食中的氨基酸^"高半胱氨酸的代谢。许多年来,高水平的高半胱氨酸被与心血管疾病高发病率相关联。认为降低高半胱氨酸可降低心血管疾病的风险。已知维生素B6和B12千扰嘌呤和硫胺的生物合成,参与用于生产甲硫氨酸的高半胱氨酸甲基化过程和若干生长过程中的甲基合成。维生素B6(盐酸吡眵醇)是已知的维生素补体。维生素B12(cyanobalamin)有助于神经系统的健康,并涉及红血细胞的生产。其还已知为食品补充剂中的维生素。由于它们对心血管疾病风险降低的组合的正效应,优选根据本发明的产物包含维生素B6和维生素B12和叶酸。营养药物性产物中B族维生素的量可由技术人员根据本文给出的这些B族维生素的每日量来计算叶酸200-800^g/天,优选地200-400/xg/天;维生素B6:0.2-2mg/天,优选地0.5-1mg/天,维生素B12:0.5-4//g/天,优选地l-2/zg/天。优选地,营养药物性产物包含3wt^到25wt。/。甾醇,更优选7wty。到15wt。/。甾醇。掺入甾醇的优点在于其会引起人血中LDL-胆固醇水平降低,这会导致心血管风险降低。当提及甾醇时,其包括饱和的氢化甾醇和甾醇/氢化甾醇的经酯化的衍生物,或其任何混合物。在提及甾醇酯(sterolester)的该应用中,其还包括它们的饱和衍生物、氢化甾醇酯和甾醇酯与氢化甾醇酯的组合。甾醇或植物固醇(也称作植物甾醇或蔬菜甾醇)可以分为三类4-去甲基甾醇、4-一甲基甾醇和4,4'-二甲基甾醇。在油中,它们主要作为游离甾醇和甾醇的脂肪酸酯存在,尽管也存在甾醇葡萄糖苷和经酰化的甾醇葡萄糖苷。存在三种主要的植物固醇,即P-谷甾醇、豆固醇和芸苔甾醇。所指成分的流程图在"InfluenceofProcessingonSterolsofEdibleVegetableOils",S.P.Kochhar;Prog.LipidRes.22:pp.161-188中给出。在该说明书中,各5a饱和的衍生物如二氢谷甾醇、芸苔甾醇和麦角烷醇及其衍生物被称为氢化甾醇(氢化甾醇)。优选地(任选地被酯化的)甾醇或氢化甾醇选自|3-谷甾醇、芸苔甾醇、氢化菜油甾醇(campestanol)、豆甾醇、菜子甾醇(brassicasterol)、菜子氢化甾醇(brassicastanol)的脂肪酸酯或其混合物。任选地,甾醇或氢化甾醇被脂肪酸至少部分地酯化。优选地,甾醇或氢化甾醇被一种或多种C2-22脂肪酸酯化。就本发明的目的而言,术语C2-22脂肪酸是指包含C2-22主链和至少一个酸基的任何分子。尽管在本语境中并非优选,但是C2-22主链可被部分地取代或可存在侧链。然而优选地,C2-22脂肪酸是包含一个或两个酸基作为末端基团的线性分子。最优选的是存在于天然油中的线性C8-22脂肪酸。任何这类脂肪酸的合适实例是醋酸、丙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸。其它合适的酸为例如柠檬酸、乳酸、草酸和马来酸。最优选的是豆蔻酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山酸、油酸、鲸蜡烯酸、芥酸、反油酸、亚油酸和亚麻酸。需要时,脂肪酸混合物可用于酯化甾醇或氢化甾醇。例如,可能使用天然存在的脂或油作为脂肪酸的来源,通过相互酯化(interesterification)反应进行酯化。上述有助于提高心血管健康的营养药物性成分K+、Ca"和Mg"、B族维生素(叶酸、B6、B12)和甾醇在本文中集体称为心脏健康成分。以下实施例进一步阐述本发明。A.可使用下述成分通过常规配制步骤制备药物组合物实施例l软明胶胶囊使用下列组分按照传统工序来制备软明胶胶囊活性成份MAP和/或ITP0.1g,蛋白质水解产物0.3g其它组分甘油、水、明胶、植物油实施例2硬明胶胶囊使用下列组分按照传统工序来制备硬明胶胶囊活性成份MAP和/或ITP0.3g,蛋白质水解产物0.7g其它组分-填料适量的乳糖或纤维素或纤维素衍生物润滑剂如果需要的话,硬脂酸镁(0.5%)实施例3药片使用下列组分按照传统工序来制备药片活性成份MAP和/或ITP0.4g,未水解蛋白质0.4g其它组分微晶纤维素、二氧化硅(Si02)、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠。B.可以使用下列组分按照传统工序来制备食物产品实施例4含30%果汁的软饮典型份量240ml活性成份该食物产品中加入了MAP和/或ITP、蛋白质水解产物和作为碳水化合物来源的麦芽糊精。MAP禾口/或ITP:每份0.5g-5g蛋白质水解产物每份1.5g-15g麦芽糊精每份3g-30gI.用下述组分制备软饮复合物果汁浓縮物和水溶性香料l.l橙汁浓縮物60.3。白利糖度(Brix),5.15%酸度657.99拧檬浓縮物43.5。白利糖度,32.7%酸度95.96水溶性橙味香料13.43水溶性杏味香料6.71水26.461.2颜料[g]]8-胡萝卜素10%CWS0.89水67.651.3酸和抗氧化剂抗坏血酸4.11无水柠檬酸0.69水43.181.4稳定剂果胶0.20苯甲酸钠2.74水65.601.5油溶性香料油溶性橙味香料0.34蒸馏得到的甜橙油0.341.6活性成份以上文提到的浓度存在的活性成份(这指上文提到的活性成份MAP和/或ITP、蛋白质水解产物和麦芽糊精)。果汁浓縮物和水溶性香料在没有空气掺入的条件下混合起来。颜料被溶于去离子水中。抗坏血酸和柠檬酸溶于水中。苯甲酸钠溶于水中。搅拌下加入果胶,煮沸令其溶解。冷却所述溶液。甜橙油和油溶性香料预先混合起来。1.6中提到的活性成份被干燥地混合起来,然后优选搅拌添加到果汁浓縮物混合物(1.1)中。为制备所述的软饮复合物,3丄1至3丄6的所有部分都被混合到一起,然后用Turrax以及高压均质机(Pl=200bar,p2=50bar)对其进行均质。II.用下述组分来制备瓶装糖浆软饮复合物74.50水50.00糖桨,60。白利糖度150.00所述瓶装糖桨的组分被混合到一起。用水将所述瓶装糖浆稀释到1L,成为现成可饮用的饮料。变化可以对所述饮料进行巴氏消毒来代替使用苯甲酸钠。所述饮料还可经过碳酸化。实施例5酪蛋白酸钾与来自A.的脯氨酸特异内切蛋白酶孵育快速地产生IPP禾口LPP而非VPP。在该实验中,将来自A.niger的过量产生的、基本纯净的脯氨酸特异内切蛋白酶与酪蛋白酸钾孵育,以检测ACE抑制肽IPP、VPP以及LPP的释放。使用的内切蛋白酶基本纯净是指不存在除纯净的脯氨酸特异内切蛋白酶固有的内切蛋白水解活性(即羧基端切除脯氨酸和丙氨酸残基)以外的显著内切蛋白水解活性。为了尽可能地限制作为摄食ACE抑制肽的结果的钠摄入,使用酪蛋白酸钾作为该孵育的底物。以10X(w/w)的蛋白质浓度将酪蛋白酸盐悬浮于65。C的水中,然后使用磷酸将pH调节为6.0。然后将悬液冷却至55°C并以4单位/克(关于单位的定义,参阅材料&方法部分)的蛋白质浓度添加来自A.niger的脯氨酸特异内切蛋白酶。将该混合物在连续搅拌下孵育24小时。该阶段不再进行pH调节。在孵育的l、2、3、4、8和24小时取样。通过将样品立刻加热至90°C5分钟终止每个样品的酶活性。冷却后使用磷酸将每个样品的pH迅速降低至4.5,之后在Hereaus床面离心机中将悬液在3000rpm离心5分钟。完全澄清的上清液用于LC/MS/MS分析,以定量上清液中的VPP、IPP、LPP、VWPP和VWPPF肽(参阅材料&方法部分)。牛乳酪蛋白掺合大量不同的蛋白质,包括3-酪蛋白和k-酪蛋白。根据已知的氨基酸序列,e-酪蛋白包括ACE抑制性三肽IPP、VPP和LPP。在P-酪蛋白中,IPP包含在序列-P7广Q72-N73-l74-P75-P76-中,VPP包含在序列-P『Vs2-V83-Vs4-P85-P86-中,LPP包含在序列-150丄151-152-153-中。k-酪蛋白(其以约50%的3-酪蛋白浓度存在于经酸沉淀的酪蛋白制剂)进包含IPP。在k-酪蛋白中,IPP包含在序列-Ah)7-I霧P,-Pho-中。酪蛋白的其它蛋白质成分不含IPP、VPP或LPP。表2和表3显示存在于经酸化和离心的上清液中的肽浓度,其被计算为添加进孵育混合物中的每克酪蛋白酸钾。如表2所示,孵育1小时后IPP到达其最大浓度。之后IPP浓度没有再提高。五肽VVVPP的形成显示与IPP产生相同的动力学。如理论所期望的,VVVPP的摩尔产率与LPP肽的摩尔产率相似。LPP和VVVPP的产率均达到理论可行产率的约60%。LPP的最大浓度仅在孵育3小时后达到的事实提示e-酪蛋白分子具体部分的切割可能更难一些。与VVVPP相反,完全不形成六肽VVVPPF。该现象提示脯氨酸特异内切蛋白酶有效地切割-P-F-键,从而产生VVVPP。三肽IPP立刻被形成,但是其摩尔产率不大于VVVPP或LPP最大摩尔产率的约三分之一。因为IPP既包含在e-酪蛋白中也包含在k-酪蛋白中,因此其产出是无法预期的。对该现象的可能解释是脯氨酸特异蛋白酶可以产生IPP,但是仅从酪蛋白酸盐的k-酪蛋白部分产生。考虑到相关的k-酪蛋白氨基酸序列,这提示-A。7-I雨-肽键被酶的丙氨酸特异活性切割。如果是真的,则所释放的IPP数量达到k-酪蛋白中存在量的约40%,但是不大于P加k酪蛋白中理论存在的IPP的约10%。释放IPP的该切割机制也解释了VPP为何不能从其前体分子VVVPP形成的原因所需的内切蛋白水解活性不仅存在于所使用的来自A.niger的酶制剂中。表2按每克添加的蛋白质己酸的经酸化上清液的摩尔肽含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>酸性酪蛋白沉淀步骤的掺入导致5倍浓度的ACE抑制肽如实施例5所述,在pH6.0将10。^(w/w)蛋白质浓度的酪蛋白酸钾与来自A.niger的脯氮酸特异内切蛋白酶孵育。多种孵育时间段后加热样品以停止进一步的酶活性,之后将pH降至4.5以最小化酪蛋白可溶性。通过低速离心去除不溶性酪蛋白分子。在表2和表3中,我们提供了基于10%蛋白质的起始浓度计算的ACE抑制肽浓度。然而,作为酸化和随后的离心步骤的结果,大部分添加的蛋白质已被去除。而为了将该经酸化的上清液的经减少的蛋白质含量计算在内,进行氮(Kjeldahl)分析。根据后一数据,发现多种上清液含有表4显示的蛋白质水平。表4酸化的上清液中蛋白质的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>考虑到这些数据,我们再计算了每种上清液中存在的ACE抑制肽的浓度,但是这次使用它们的实际蛋白质含量。再计算的数据显示在表5中。按存在的每克蛋白质计算的经酸化上清液中肽浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表3和表5中存在的数据的比较清晰地显示之后进行工业可行的倾析、过滤或低速离心步骤的简单的酸化步骤导致特异ACE抑制肽浓度5倍的提高。实施例7在浓縮的酪蛋白水解产物中鉴定新颖的和可能的ACE抑制三肽MAP和ITP为了便于更彻底地分析存在的生物活性肽,以制备规模制备酪蛋白水解产物,所述酪蛋白水解产物通过用纯净的来自A.niger的脯氨酸特异内切蛋白酶消化并通过酸沉淀来获得。为此,将3000克酪蛋白酸钾重悬于25升75"C的水中。彻底的均质化后用经稀释的磷酸将pH缓慢调节至6.0。冷却至55'C后,以4个酶单位/克酪蛋白酸盐(单位的定义参阅材料&方法部分)的浓度添加来自A.niger的脯氨酸特异内切蛋白酶。在55°C孵育(搅拌)3小时后,通过缓慢地添加浓縮的磷酸将pH降低至4.5。在该更大规模的制备中,省略所述方法该部分中用于灭活脯氨酸特异内切蛋白酶的加热处理步骤。然后将悬浮液快速冷却至4。C并在该温度保持过夜(不搅拌)。第二天早上,将澄清的上层倾析并蒸发,以达到40%干物质的水平。将后一浓縮的液体在14(TC下进行UHT处理4秒钟,然后在50"C下超滤。微生物过滤后喷雾干燥液体。该材料在下文中称为来自酪蛋白的生物活性肽(CDBAP)。使用材料&方法部分中加下划线的LC/MS操作测定粉末状产物的IPP、LPP和VPP含量。根据其氮含量,粉末状的产物具有约60%的蛋白质含量(使用6.38的转换因子)。粉末的IPP、LPP和VPP含量提供在表6中。CDBAP产物的氨基酸组成提供在表7中。非常值得注意的是酸沉淀后获得的喷雾干燥材料中摩尔脯氨酸含量的提高从最初的12%提高至约24%。表6:CDBAP的IPP、LPP禾卩VPP含:<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表7:酪蛋白酸盐起始材料和CDBAP的氨基酸组成(酸水解后的氨t,并显示为摩尔氨基酸含量百分比)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>与来自相同供应商的Q-TOF质谱仪配对。在测试中,20MlMilIi-Q水中10%(w/v)CDBAP的溶液被注射在5/mi颗粒大小的150x2.1lnertsil5ODS3柱上(Varian,Middelburg,theNetherlands)。流动相A由MiIIi-Q水中0.1。/。的三氟乙酸(TFA)溶液组成。最初的洗脱液组成为100%A。洗脱液被保持为100%A5分钟。然后开始IO分钟到达5%B的线性梯度,之后是10分钟到达30%B的线性梯度。通过将B的浓度在5分钟内提高至70%并在70。%B再保持5分钟来冲洗柱。之后在1分钟内将洗脱液改变为100%A,平衡9分钟。总运行时间为50分钟。洗脱液流为0.2ml每分钟,柱温度设定为60°C。记录215nm处的UV色谱图。使用1分钟的间隔时间(导致200Ad的级分体积)将洗脱级分收集在96孔板中。通过添加80Atl0.05%的水性氨水(25%)溶液来中和孔中的流出物。在氮气中5(TC下蒸发溶剂直至干燥。之后将残余物重溶于40^的MiIIi-Q水中并混合1分钟。为了进行at-lineACE抑制测定,添加27;xl磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4中的33.4mUml"ACE(酶得自Sigma)溶液(有260mM的氯化物浓度),允许混合物在96孔板中700rpm下孵育5分钟。孵育周期后添加13/xlPBS缓冲液中的0.35mM马尿酸-组氨酸-亮氨酸(HHL)溶液,在700ROM混合1分钟。允许混合物在GC-烘箱中反应60分钟。反应后将平板在熔化的冰上冷却。然后在flash-HPLC柱上分析96孔板。将30每孔的反应混合物注射进装配了来自相同供应商的10x4.6mmRP18e保护柱的ChromlithFlashRP18e25x4.6mmHPLC柱(Merck,Darmstadt,Germany)上。等度流动相由水/乙腈79/21中0.1%的TFA溶液组成。洗脱流为2ml每分钟,柱温度为25°C。注射以1分钟的间隔时间进行。在280nm处监测马尿酸(H)和HHL。测量H和HHL的峰高并根据以下等式计算每种级分的ACE抑制<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>DCW*100分析物的ACEIa抑制百分比DCW水中ACE将HHL切割为H和HL的程度DC3分析物将HHL切割为H和HL的程度通过将H峰高表达为H和HHL峰高和的部分来计算切割的程度在18分钟和26分钟之间洗脱的级分中测量到最高的ACE抑制。收集该区并再注射于颗粒大小为3/mi的150x2.1mmBiosuite柱(Waters,Etten-Leur,theNetherlands)上。流动相A由MiIIi-Q水中0.1%的甲酸(FA)溶液组成。流动相B由甲醇中0.1%FA溶液组成。最初的洗脱成分为100%A。洗脱液被保持为100%A5分钟。然后开始15分钟到达5%B的线性梯度,之后是30分钟到达60%B的线性梯度。将洗脱液维持为60%B5分钟。之后在1分钟内将洗脱液降低为100%流动相A,平衡10分钟。总运行时间为65分钟。洗脱液流为0.2ml每分钟,柱温度设定为6CTC。记录215nm处的UV色谱图。使用10秒的间隔时间从Biosuite柱收集级分。再次将级分分为两份,一份用于使用前文所述at-lineACE抑制方法测量活性,而另一份用于使用MS和MS-MS鉴定活性肽。分子离子326.2080Da的两个色谱峰和分子离子330.2029Da和318.1488Da的另外两个峰对应于再18和26分钟之间区域测量的提高的ACE抑制。使用MS-MS将这些肽分别鉴定为IPP和LPP(-0.6卯m)、ITP(-4.8ppm)和MAP(+2.8ppm)的结构同分异构体。肽的蛋白质来源是K酪蛋白腦-110(IPP)、iS-酪蛋白fl51-153(LPP)、a-s2-酪蛋白fll9-121(ITP)和/3-酪蛋白fl02-104(MAP)。先前IPP和LPP被报导为IC50值分别为5禾口9.6/xM的ACE抑制肽(Y.Nakamura,M.Yamamoto.,K.Sakai.,A.Okubo"S.Yamazaki,T.Takano,J.DairySci.78(1995)777-783;Y.Aryoshi,TrendsinFoodScienceandTechnol.4(1993)139-144)。然而,就我们所已知,三肽ITP和MAP从未被报导为可能的ACE抑制肽。MAP、ITP和IPP被化学合成,并使用下文所述的经改进的Matsui测定法测量每种肽的活性。在MicromassQuattroIIMS设备(再正电喷射、多重反应监控模式下运行)上进行多种样品中MAP和ITP的定量。使用的HPLC方法与上述的方法相似。MS设定(ESI+)如下锥部电压37V、毛细管电压4kV、3001/h的干燥氮气。来源和雾化温度分别为IO(TC和250°C。使用合成的肽制备校准线,对MAP使用先驱离子(precursorion)318.1和总和产物离子(summedproductions)227.2和347.2,对ITP使用先驱离子320.2和总和产物离子282.2和501.2。根据这些分析,新颖的ACE抑制三肽MAP和ITP以下述响应量存在于CDBAP产物中2.9mgMAP/克CDBAP或4.8mgMAP/克CDBAP中的蛋白质,0.9mgITP/克CDBAP和1.4mgITP/克CDBAP中的蛋白质。为了测定MAP和ITP的ACE抑制活性,根据Matsui等(Matsui,T.etal.(1992)Biosci.Biotech.Biochem.56:517-518)的方法进行一些小修饰来测定化学合成的三肽。多种孵育显示于表8中。表8:用于MatsuiACE抑制测定法的步骤。成分添加于1.5mL管中,终体积为120Ad。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>四种样品的每一种含有75Ml溶解于250mM硼酸盐溶液的3mM马尿酰组氨酸亮氨酸(Hip-His-Leu,Sigma),所述硼酸盐溶液含有200mMNaCl,pH8.3。ACE得自Sigma。混合物在37。C孵育,30分钟后通过添加1250.5MHCl终止。随后加入225/xlbicine/NaOH溶液(lMNaOH:0.25Mbicine(4:6)),之后加入25/il0.1MTNBS(0.1MNa2HP04中的2,4,6画三硝基苯磺酸,Fluka,Switzerland)。再37。C孵育20分钟后,加入4ml0.2MNa2HP04中的4mMNa2S03,用UV/Vis分光光度计(带有CPS控制器的ShimadzuUV-1601,Netherlands)测量416nm处的吸光度。根据下式,将ACE抑制(ACEI)活性的数量计算为与不存在抑制剂时ACE转化速率相比的抑制百分比ACEI(%)=((对照1-对照2)-(样品1-样品2))/(对照1-对照2))*100其中对照l-不含ACE抑制成分时的吸光度(-最大ACE活性)[AU]。对照2二不含ACE抑制成分且不含ACE时的吸光度(背景)[AU]。样品1=存在ACE禾nACE抑制成分时的吸光度[AU]。样品2=存在ACE抑帝U成分,但是不存在ACE时的吸光度[AU]。获得的化学合成的MAP和ITP三肽的IC5。与在本实验筛选阶段使用的at-line测量中获得的ICs。值一起显示于表9中。化合合成的IPP的测量作为多种测量的内部参考而被包括。表9:通过at-lineACE测定法和经改进的Matsui测定法测定的MAP、ITP和IPP的ACE抑制值(IC50值)。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>实施例8新颖的ACE抑制肽MAP禾HITP很可能在人胃肠道中幸存被消耗后,饮食蛋白质和肽被暴露于胃肠道中多种消化性酶过程。为了评价新鉴定的生物活性肽在人胃肠道中的稳定性,将CDBAP制剂(如实施例7所述制备)进行胃肠处理(GIT),所述胃肠处理典型地模拟在人体中发现的消化条件。在GIT模型系统中不同的孵育时间后获得的样品使用on-lineHPLC-Bioassay-MS或HRS-MS系统定量任何残留的MAP和ITP肽。在带有100ml烧瓶的标准化的混合设备(如由Vankd,US所提供)中迸行GIT操作。水浴温度设定为37.5。C,选择搅棒速度使得样品保持为悬浮液(IOOrpm)。将3.4克CDBAP(蛋白质水平约60%)溶解/悬浮于100mlMiIIi-Q水中。在胃模拟中,使用5MHC1降低pH。胃模拟结束和十二指肠阶段时,使用5MNaOH提高pH。将CDBAP悬浮液预加热至37.5。C并取出5ml悬浮液以溶解0.31g胃蛋白酶(Flukaorderno.77161)。T=0时,将5ml现溶解的胃蛋白酶加回悬浮液中。然后使用分离的pH计根据以下流程手动缓慢调节CDBAP的pH:1=20分钟,pH降低至3.5{=40分钟,pH至3.0t二50分钟,pH至2.3t二60分钟,pH至1.8t二65分钟,pH提高至2.7t二75分钟,pH至3.7t二80分钟,pH至5.3在t二90分钟时,在另一5ml的CDBAP悬浮液中小心混合0.139g的8倍USP胰酶(Sigmaorderno.P7545),立刻加回。根据以下流程继续孵育-t二93分钟,pH调至5.5t二95分钟,pH调至6.3t-100分钟,pH调至7.1在t-125分钟时停止实验并检查pH(仍为pH7)d然后将样品转移至烧杯中并置于微波炉中直至沸腾。随后将样品转移至玻璃管中并在95'C孵育60分钟以灭活所有的蛋白酶活性。冷却后将样品置于Falcon管中,在3000xg离心10分钟。将上清液冷冻干燥。测定获得的粉末的总N浓度并使用酪蛋白的Kjeldahl因子(6.38)将其转换为蛋白质水平。根据这些数据,GIT操作后CDBAP制剂的蛋白质水平是48.4%。在根据GIT的蛋白质水解处理后幸存的MAP和ITP的水平如实施例7所述被测定,获得的数据显示在表10中。根据实验的结果,MAP和ITP均显示针对GIT消化的高度抗性。结合这些三肽的IC50值(也在实施例7中测定),数据提示两个新颖的ACE抑制肽作为降血压肽的巨大潜力。表10:经过模拟的人胃肠道(GIT操作)之前和之后的MAP和ITP<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>实施例9模拟的体外胃肠消化合成的MAP与ITP为了测量肽在胃肠道(GI)中的稳定性,使用微溶出(micro-dissolution)。以下测试被用于检测MAP和ITP的GI稳定性。成分使用以下溶液用于溶出0.1mol/1HC11mol/1NaHC03模拟胃液;1.0g氯化钠和3.5ml0.1mol/1HC1,在500ml水(在超生浴中脱气10分钟)中酶的胃条件(1ml总体积需要的用量)2.9mg胃蛋白酶和0.45mgAmanoLipase-FAP15,在50模拟胃液中酶的肠条件(1ml总体积需要的用量)9mgPancreatine(SigmaP8096)和0.125mg胆汁提取物,在50/^l1.0mol/1NaHC03中步骤胃条件-每个管形瓶装有-0.821^模拟胃液+70AdMiIIiQ+(经10x稀释的)混合物1,-当T=37.5°C(1=0)时取样,添加50Ad胃蛋白酶/酯酶混合物(摇动)。-测量pH,并用0.1mol/1HC1调节至3.5-孵育60分钟,60分钟后取样。肠条件-加入50Ml胰酶制剂混合物,测量pH并用HC1将其调节至6.8。-在添加胰酶制剂(摇动)后5分钟、30分钟和60分钟取样。-将所有样品在95t:保持60分钟,使酶停止其活性。-冷却后将样品储存在-20°C直到分析。-将样品离心并用HPLC-MRM-MS分析。表11和表12给出以ng/ml计的、经测量的肽浓度,其被计算为MAP的相对浓度。表11-模拟体外胃肠消化合成的MAP-1microgram/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>其中-是指注意未进行测量。表12-模拟体外胃肠消化合成的MAP-10microgram/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>其中-是指注意未进行测量。表13-模拟体外胃肠消化合成的ITP-1microgram/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>其中-是指注意未进行测量。表14-模拟体外胃肠消化合成的ITP-10microgram/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>其中-是指注意未进行测量。上述结果证明三肽MAP在胃肠条件下,特别是胃条件下1小时后合理地显示良好的稳定性。尽管在到达肠末端之前MAP经受了进一步降解,但是大部分肽在胃后不久(即在十二指肠和空肠的近心端)被吸收。然而,相信存在酪蛋白水解产物中的其它肽时,MAP被保护免于受该降解。该结果还证明了ITP在胃肠条件下的优良稳定性。该优良稳定性可补偿ITP作为ACE抑制剂的一定程度的较低效力。这些结果证明三肽MAP在胃肠条件下,特别是胃条件下1小时后合理地显示良好的稳定性。但是,在到达肠末端之前其经受了进一步的降解。然而,相信存在酪蛋白水解产物中的其它肽时,MAP被保护免于受该降解;这解释了在实施例8和9中MAP稳定性的明显差异。实施例10制备含MAP的经发酵乳如实施例7所述,在根据实施例7中所述酶操作制备的酪蛋白水解产物中鉴定高度有效的ACE抑制三肽MAP。然而,我们想知道是否也能够使用发酵脱脂乳的更普通的途径获得MAP三肽。为了检测该用途,我们利用表征为API50CHL带(可得自bioMerieuxSA,69280Marcy-I'Etoile,France)的乳酸杆菌菌株。使用的该菌株能够发酵D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡糖胺、麦芽糖、乳糖和海藻糖。根据APILABPlus数据库(5.0版;也可得自bioMerieux),该菌株被表征为丄acto^c!7/w<ie/Z>n^db'/亚禾中,丄fl"Z505-14。该菌株保藏于CentraalBureauvoorSchimmelculturen,Baarn,TheNetherlands(CBS109270)。为了制备真实发酵实验的预培养物,用2%到4%的Z^ctoZ>"7/tt/e仿rwech'菌株培养物接种无菌脱脂乳(Y叩perexCampina,Netherlands),并在37。C培养24小时。在真实的发酵实验中,将4.2%MPC-80的重溶乳(Campina,Netherlands)、0.5%乳糖禾卩0.3%Lacprodan80(Campina,Netherlands)在80°C巴氏灭菌2分钟。冷却后将乳用2wt%的预培养物接种,并在150ml瓶中在静止条件下进行发酵,发酵在40。C不调控pH而进行。24小时后取样并在14.000g离心10分钟。获得的样品pH是5.3,MAP浓度是18.3mg/L。然而,在经发酵的乳中可不检测到ITP。权利要求1.作为营养药物,优选作为药物的MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐。2.MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐作为营养药物的用途,优选地作为药物的用途。3.MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于生产营养药物的用途,优选地用于生产药物的用途。4.MAP禾n/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于改善健康或预防和/或治疗疾病的用途。5.MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于生产营养药物的用途,优选地用于生产药物的用途,所述营养药物和药物用于治疗心血管疾病,例如高血压和心力衰竭。6.MAP禾Q/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于治疗前糖尿病或糖尿病或用于治疗肥胖症的用途。7.治疗1型和2型糖尿病和用于在患有前糖尿病或葡萄糖耐量降低(IGT)的个体中预防2型糖尿病的方法,所述方法包含向需要这类治疗的受试者施用MAP禾口/或ITP或MAP盐和/或ITP盐。8.治疗患有高血压或心力衰竭的人或预防它们的方法,所述方法包含向需要这类治疗的受试者施用MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐。9.MAP禾口/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于提高血浆胰岛素或对血浆胰岛素的敏感性的用途。10.MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于提高2型糖尿病或前糖尿病的血浆胰岛素或对血浆胰岛素的敏感性的用途。11.MAP禾B/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于降低2型糖尿病或前糖尿病血中餐后葡萄糖浓度的用途。12.MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于提高2型糖尿病或前糖尿病血中餐后胰岛素分泌的用途。13.如权利要求2到12中任一项所述的MAP禾口/或ITP或MAP盐禾口/或FTP盐的用途,其中MAP和/或ITP是饮食添加物的形式。14.MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐用于生产功能性食品的用途,所述功能性食品用于治疗性治疗应激效应。15.MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐在局部应用中的用途,优选地在个人护理应用中的用途。16.MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐在饲料和宠物食品中的用途。17.包含作为活性成分的MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐的药物。18.包含作为活性成分的MAP禾卩/或ITP或MAP盐和/或ITP盐的饮食添加物。19.包含作为活性成分的MAP禾口/或ITP或MAP盐和/或ITP盐的食物。20.包含作为药物或用于健康益处的MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐的组合物。21.如权利要求20所述的组合物,其中健康益处是治疗应激效应,优选地所述组合物是食物或饲料。22.包含MAP和/或ITP或MAP盐和/或ITP盐的组合物,所述组合物用于局部剂,优选地用于个人护理。23.如权利要求22所述的组合物,其为乳液、凝胶或乳剂。24.生产ITP或ITP盐的方法,所述方法包括通过将异亮氨酸、苏氨酸和脯氨酸偶联形成ITP的化学合成,以及,任选地将TTP转化为其i卜jm。25.生产MAP或MAP盐的方法,所述方法包括通过将甲硫氨酸、丙氨酸和脯氨酸偶联形成MAP的化学合成,以及,任选地将MAP转化为卦26.生产MAP和/或ITP的方法,所述方法包括通过合适微生物发酵合适蛋白质,所述微生物能够从所述蛋白质生产MAP和/或ITP。27.生产MAP禾口/或ITP的方法,其中所述蛋白质是酪蛋白,优选地,所述微生物产生乳酸<全文摘要本发明描述了MAP和/或ITP或其盐作为营养药物(优选药物)的用途。文档编号A61K38/06GK101171025SQ200680014770公开日2008年4月30日申请日期2006年4月27日优先权日2005年4月28日发明者克里斯帝诺思·雅各布斯·凡普拉德荫克,斯文·沃尔夫拉姆,赛德瑞拉·克利斯纳·格尔哈德,鲁波·伊第恩斯申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司