专利名称：黑乳海参多糖提取方法及其在医药领域中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种从黑乳海参中提取黑乳海参多糖的方法及其黑乳海参多糖在预防和治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
背景技术：
黑乳海参(Holothuria nobilis Jaeger)为棘皮动物门(Echinodermata)海参科(Holothuriadae)生物。海参具有较高的食用和药用价值。明代以后，海参收入本草，列为补益药。资料记载，海参具有补肾益精、养血润燥的功用，主治精血亏损、虚弱劳怯、阳痿、梦遗、小便频数、肠燥便艰等症。现代化学和药理实验研究证实海参体壁真皮结缔组织、体腔、内腺管及内脏含有多种生物活性物质，其主要有效成分为酸性粘多糖(SJAMP)，由氨基半乳糖、己糖醛酸、岩藻糖和硫酸基组成。是一种类肝素抗凝剂，具有抗凝血、抑制血小板聚集、防治急性放射性损伤作用，可明显促进造血功能的恢复和增强。SJAMP能抑制肿瘤生长、抗肿瘤转移，是一种作用较强的免疫促进剂。
国内外关于黑乳海参的研究主要集中于其体内皂苷类成分，对于黑乳海参多糖的提取方法则尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是运用各种现代化学和药理手段，从黑乳海参中提取具有治疗肿瘤疾病的多糖类化合物。
黑乳海参多糖提取工艺流程是将黑乳海参粉碎后，与3～7％的氢氧化钾溶液按质量比1∶2～1∶6混合，并用打浆机打浆，在30～60℃的温度下搅拌提取，提提取时间1～3小时，收集提取液。在提取液中加入总重量1％的纤维素酶和果胶酶，酶解1～2小时，纤维素酶和果胶酶的比例为1∶0.5～2.0。酶解液用3000转/分钟离心机离心后，收集全部滤液，在50～80℃浓缩8～12小时。将浓缩后的浸提液置于冷冻机中冷冻1～3小时，温度为-1～10℃，然后减压至20帕～200帕，干燥温度为30～60℃，经8～12小时，得到白色多糖干性物质，即为黑乳海参多糖。本发明具有黑乳海参多糖损失少，工艺成本低，多糖得率高的特点。
实验研究证明，黑乳海参多糖对人体肿瘤细胞K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等细胞株均有抑制作用；对S180荷瘤小鼠的肿瘤组织也有较强的抑制作用，是有效的治疗肿瘤药物。
本发明对黑乳海参多糖进行了抗肿瘤的评价实验。
(一)黑乳海参多糖对人体外肿瘤细胞的抑制作用。
1.实验目的评价黑乳海参多糖对K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等细胞株生长的影响。
2.实验方法细胞毒活性实验MTT法筛选。黑乳海参多糖的浓度为100μg/ml，10μg/ml，1.0μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml。
数据处理以抑制率(％)表示。计算公式如下抑制率＝[细胞死亡均数-(细胞存活数1+细胞存活数2)/2]/细胞死亡均数对照组指数×100％。
3.结果黑乳海参多糖在100μg/ml时，对K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等细胞株生长有较强的抑制作用(结果见表1)。
表1.黑乳海参多糖对人体肿瘤细胞的抑制作用
4.结论黑乳海参多糖具有较强的抗肿瘤活性。
(二)黑乳海参多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用1.实验目的评价黑乳海参多糖对S180荷瘤小鼠肉瘤组织生长的影响。
2.方法昆明种小鼠，体重20±5g，雌雄各半。随机编成试验组、阴性对照组、内环磷酰胺阳性对照组，每组10只。在无菌条件下，取生长旺盛的瘤源，制备成1-2×107个/ml的细胞悬液，分别接种于相应宿主小鼠腋皮下，接种0.2ml/只，次日开始，按照如下实验方案给药灌胃给药100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，每天一次，连续给药10d；阴性对照组给予与试验组等体积的生理盐水，阳性对照组给予环磷酰胺30mg/kg，腹腔给药，每天一次，连续7d。停药后24h处死各组动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下列公式求出肿瘤抑制率并进行t检验。
3.结果黑乳海参多糖(100mg/kg)具有明显抑制S180荷瘤小鼠肉瘤组织的生长形成。
注与阴性对照组比较*P＜0.014.结论黑乳海参多糖具有较强的抗肿瘤活性。
具体实施例方式
实施例一取新鲜黑乳海参10公斤，洗净，切碎，加入3～7％的氢氧化钾溶液30公斤，打浆机打浆，在45℃搅拌提取2小时，收集提取液。在提取液中加入总重量1％的纤维素酶和果胶酶，酶解1小时，纤维素酶和果胶酶的比例为1∶1。酶解液用3000转/分钟离心机离心后，收集全部滤液，在50℃浓缩12小时。将浓缩后的浸提液置于冷冻机中冷冻2小时，温度为-1℃，然后减压，使干燥压降至100帕，干燥温度为55℃，经10小时，得到白色多糖干性物质，即为黑乳海参多糖。
实施例二取自然干燥的黑乳海参2公斤，粉碎，加入加入3～7％的氢氧化钾溶液12公斤，浸泡，打浆机打浆，60℃搅拌提取3小时，收集提取液。在提取液中加入总重量1％的纤维素酶和果胶酶，酶解2小时，纤维素酶和果胶酶的比例为1∶0.9。酶解液用3000转/分钟离心机离心后，收集全部滤液，在60℃浓缩12小时。将浓缩后的浸提液置于冷冻机中冷冻2小时，温度为5℃，然后减压，使干燥压降至100帕，干燥温度为55℃，经10小时，得到白色多糖干性物质，即为黑乳海参多糖。
实施例三取新鲜黑乳海参5公斤，洗净，切碎，加入3～7％的氢氧化钾溶液30公斤，打浆机打浆，60℃搅拌提取2小时，收集提取液。在提取液中加入总重量1％的纤维素酶和果胶酶，酶解2小时，纤维素酶和果胶酶的比例为1∶1。酶解液用3000转/分钟离心机离心后，收集全部滤液，在80℃浓缩10小时。将浓缩后的浸提液置于冷冻机中冷冻2小时，温度为2℃，然后减压，使干燥压降至40帕，干燥温度为40℃，经12小时，得到白色多糖干性物质，即为黑乳海参多糖。
实施例四取黑乳海参多糖100mg，用适量注射用水溶解，加甘露醇200mg，按照常规冻干工艺冻干，即得注射用冻干粉。用于治疗肿瘤。
实施例五将黑乳海参多糖用适量注射用水分散，喷雾干燥或真空干燥，得黑乳海参多糖干粉。取聚乙二醇400，加入黑乳海参干粉，边加边搅拌至匀，采用压制法，制成软胶囊。用于治疗肿瘤。
实施例六取黑乳海参多糖100g，用适量注射用水分散，加入辅料适量，混匀，制粒，干燥，压成1000片，包衣，即得黑乳海参多糖片。用于治疗肿瘤。
权利要求
1.一种从海洋动物黑乳海参中提取黑乳海参多糖的方法，其特征在于将黑乳海参与溶剂按比例混合，并用打浆机打浆，在一定的温度下进行搅拌提取，提取液用双酶水解，离心，收集并浓缩滤液。将浓缩液冷冻干燥，得到白色的多糖干性物质，即为黑乳海参多糖。
2.按权利要求1所述的黑乳海参，其特征在于，可以是新鲜采集的黑乳海参，也可以是经过干燥后的黑乳海参。
3.按权利要求1所述的黑乳海参与溶剂按比例混合，在一定的温度下搅拌提取，其特征在于，打浆的溶剂为3～7％的氢氧化钾溶液，溶剂与黑乳海参混合的质量比为2∶1～6∶1。搅拌提取温度为30～60℃，时间为1～3小时。
4.按权利要求1所述的双酶水解，其特征在于在浸提液中加入总重量1％的纤维素酶和果胶酶，酶解1～2小时，纤维素酶和果胶酶的比例为1∶0.5～2.0。
5.按权利要求1所述的离心和浓缩，其特征在于用3000转/分钟离心机离心后，收集全部滤液，在50～80℃浓缩8～12小时。
6.按权利要求1所述的冷冻干燥，其特征在于将浓缩后的浸提液置于冷冻机中冷冻1～3小时，温度为-1～10℃，然后减压至20帕～200帕，干燥温度为30～60℃，经8～12小时，得到白色多糖干性物质，即为黑乳海参多糖。
7.一种按权利要求1所述的黑乳海参多糖在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种从海洋动物黑乳海参中提取纯化多糖的工艺。其工艺流程是将黑乳海参粉碎后，与溶剂按比例混合，并用打浆机打浆，在一定的温度下进行搅拌提取，提取液用双酶水解，离心，收集并浓缩滤液。将浓缩液冷冻干燥，得到白色的多糖干性物质，即为黑乳海参多糖。实验研究证明，黑乳海参多糖对人体肿瘤细胞K－562，SHG－44，HCT－8，PC－3M，A－549等细胞株的生长均有抑制作用；对S180荷瘤小鼠的肿瘤组织的生长也有较强的抑制作用。本发明中的黑乳海参多糖是一种作用较强的免疫促进剂，可制备成新的抗肿瘤药物。
文档编号A61K31/715GK1986826SQ20061015546
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者巫军 申请人:巫军