专利名称：：一种洋地黄提取物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种洋地黄提取物及其制备方法，具体涉及洋地黄中洋地黄总苷及其制备方法。
背景技术：
：洋地黄叶为玄参科植物紫花洋地黄(DigitalispurpureaL.)或毛花洋地黄(DigitalislanataEhrh.)的干燥叶，其主要成分为强心苷类。现代药理研究表明洋地黄对心肌有直接作用，能增强心肌的收縮力，对衰竭的心肌更为明显，同时，洋地黄有改善血液循环或直接抑制心内传导系统，从而使心率减慢的作用。因此，洋地黄可用于治疗充血性心力衰竭及心房颤动，而且对心脏性水肿有显著的利尿消肿作用。目前市场上出现了一种包含洋地黄的七叶洋地黄双苷滴眼液(商品名施图伦滴眼液(Stulln②Mono),德国视都灵药厂)，它可临床用于治疗黄斑变性、所有类型的眼疲劳及视网膜黄斑区相关疾病。目前对老年黄斑变性(AMD)尚无理想的防治手段。当病变局限于蒌缩型阶段时，试用抗氧化剂(如维生素E、B6、锌、镁、叶酸等)效果并不显著。而对渗出型病变用激光光凝或手术剥除CNV虽然取得了一定的效果，但光凝可损伤黄斑区特别是中心凹的结构，而且近l/2的病例在术后2年内复发，造成视力显著下降。此外，由于"剥膜"手术同时丧失了RIE细胞，因此，这些治疗也带来了—些并发症。而洋地黄和七叶苷滴眼液治疗黄斑变性，有比较显著的疗效，而且几乎没有副作用。1998年GuntherKahtle应用S加llaMonon进行临床治疗，于28天后检査患者的远近视力，发现均有明显的改善(P<0.01)。因此，可得知该药所含的"洋地黄"和"七叶苷"这两种血管活性成份能改善视网膜的微循环，使受损而未死亡的神经细胞的功能得到恢复。有报道称，对8例16眼AMD患者用施图伦滴眼剂治疗一个疗程(28天)后进行了CDI检测，结果oA用药前后PSV、EDV无明显变化(P>0.05);而SPCA、CIzA的PSV、EDV明显升高(P<0.01)，CIzA、TPCA、NPCA的RI下降(P<0.01)，部分病例视力有提高(提高l-2行)。国外的临床实验数据证明使用施图伦滴眼剂每闩3次，每次1滴，4周到1年后视力明显改善，平均远视力均从0.17提高到0.27,平均近视力从0.19提髙到0.4和0.42。在国内完成的临床验证表明滴用施图伦滴眼剂可明显改養眼血流，治疗后的黄斑区视网膜的血流量、血流速、红细胞移动速率较治疗前有明显提髙滴用施图伦滴眼剂2032天，每闩3次，每次1滴，视力提高0.10.6，眼底出血、渗出、水肿均有明显改善。洋地黄苷的药理作用洋地黄苷有激活色素上皮酶(例如钠一-钾激活腺三磷酶Na-K,ff助e)的作用，这样就能增强色素上皮细胞功能，从而增强其消化吞噬感光细胞外节物质的作用，增进其输送营养物质，保证感光细胞的能量供应，及时清除代谢产物，减少或不发生色素上皮脑浆中的消化不全的残余体，不再发生(或少发生)消化残屑，不至于发生玻璃膜基底的沉积、增厚而形成的玻璃膜沈，保护感光细胞及脉络膜毛细血管，使视网膜不受损害，不致蒌縮，避免或减轻黄斑变性，从而使部分从AMD患者视力得到提高。但是，本领域中并没有提到如何从洋地黄叶提取洋地黄苷的方法。因此，目前本领域中急需一种从洋地黄叶提取洋地黄苷的方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种从洋地黄叶提取洋地黄提取物的方法。本发明提供了一种洋地黄提取物的制备方法，所述方法包括(1)将粉碎的洋地黄叶置于回流装置中，在所述回流装置中加入水或50"959bC2-C4烷基醇(优选乙酵)水溶液，于4O-15Ot:回流提取30"20O分钟，得提取液；(2)将歩骤1所得提取液减压浓縮至C2-C4烷基醇(优选乙醉)含量为15-25%,置0-15'C冷藏过夜后取上清液，将所得上清液减压回收除去C2-C4烷基醇(优选乙醇)，然后用石油醚或氣仿萃取，取水层；(3)将歩骤2所得水层加C2-C4烷基醇(优选乙醇)至C2-C4烷基醇(优选乙醇)含量为15-25%,然后用氯仿或乙酸乙酯或正丁醇萃取，回收有机层，然后用碱溶液萃取有机层多次萃取，直至碱溶液层无色，干燥有机层得洋地黄提取物。本发明另一方面提供了--种洋地黄提取物的制备方法，所述方法包括(1)将粉碎的洋地黄叶覽于回流装置中，在所述回流装置中加入水或50-95%C2-C4烷基醇(优选乙醇)水溶液，于40-150t:回流提取30-200分钟，得提取液；(2)将步骤1所得提取液减压浓縮至C2-C4烷基醇(优选乙醉)含量为15-25%,置0-15"冷藏过夜后取上清液，然后用氯仿或乙酸乙酯或正丁醇萃取，回收有机层，然后用碱溶液萃取有机层多次萃取，直至碱溶液层无色，千燥有机层得洋地黄提取物。在本发明的一个优选实例中，在所述步骤l中，以药材/液体按重量kg^体积L计，加入的水或50-95%C2-C4烷基醇水溶液的量为5-20倍量，较好为6-15倍量，更好为8-12倍量，最好为10倍量。在本发明的一个优选实例中，在上述歩骤l中，所述C2-C4烷基醇水溶液的醇浓度通常为50-95体积％,较好为60-95体积％，更好为80-95体积％,最好为90-95体积%。在本发明的一个优选实例中，在上述步骤1中，所述温度通常为40-150'C,较好为5o-i2ox:，更好为6o-i(xrc，最好为8o-i(xn:。在本发明的一个优选实例中，在上述步骤l中，所述回流时间通常为30-200分钟，较好为40-150分钟，更好为60-120分钟，最好为90-120分钟。在本发明的一个优选实例中，所述碱溶液是10%的氢氧化钠水溶液。本发明还提供了一种洋地黄提取物，其中以洋地黄毒苷计，洋地黄苷含量为20-60重量％。在本发明的一个优选实例中，以洋地黄毒苷计，洋地黄苷含量为20-50重量％，更好为20-45重量％,最好为20-40重量％。本发明还提供了一种滴眼液，它包含上述洋地黄提取物和药学上可接受的载体。本发明所述方法操作简单，成本低，且所得提取物中的洋地黄苷含量离而稳定。具体实施方式本发明一方面提供了一种从洋地黄叶提取洋地黄提取物的方法，所述方法包括(1)将粉碎的洋地黄叶置于回流装置中，在所述回流装置中加入水或50-95%C2-C4烷基醇水溶液，于40-150"C回流提取30-200分钟，得提取液(2)将步骤1所得提取液减压浓縮至C2-C4烷基醇含量为15-25%，置0-15"冷藏过夜后取上清液，将所得上清液减压回收除去C2-C4垸基醇，然后用石油醚或氯仿萃取,取水层(3)将步骤2所得水层加C2-C4烷基醇至C2-C4烷基醇含量为15-25%,然后用氯仿或乙酸乙酯或正丁醇萃取，回收有机层，然后用碱溶液萃取有机层多次萃取，直至碱溶液层无色，干燥有机层得洋地黄提取物。在本发明中，所述洋地黄叶为中药洋地黄叶(玄参科植物紫花洋地黄DigitalispurpureaL.或毛花洋地黄DigitalislanataEhrh,的千燥叶)。在本发明的一个优选实例中，所述洋地黄叶为紫花洋地黄叶，产地上海。为了提高产率，所述步骤1可重复进行一次或多次，例如l-3次、1-5次、1-7次、1-10次或者1-20次等等。各次所得提取液进行合并进行下一步骤。通常，每次加入的水或50-95MC2-C4垸基醉水溶液的量为5-20倍量(药材/液体按重量kg/体积L计，下同)，较好为6-15倍量，更好为8-12倍量，最好为10倍量。在上述步骤l中，所述C2-C4垸基醇水溶液的醇浓度通常为50-95体积％,较好为60-95体积％，更好为80-95体积％,最好为90^95体积％。一般情况下，随着C2-C4垸基醉水溶液的醇浓度上升，所得提取物的产率以及洋地黄毒苷的含量同时提高。在上述步骤1中，所述C2-C4垸基醇通常为C2-C4烷基一元或多元醇，例如二元醇、三元醇等。在本发明的一个优选实例中，所述C2-C4烷基醇选自乙醇、丙醇、丁醇、乙二醉、丙三醇、丙二醇、丁二醇或其混合物。在本发明的一个优选实例中，所述C2-C4烷基醇选自乙醇、正丙醇和正丁醇或其混合物。在本发明的其它部分中，所述C2-C4烷基醇的定义与上面的定义相同。在上述步骤l中，所述温度通常为40-15(TC,较好为50-120'C，更好为60-10(rC，最好为8o-iocrc。在上述步骤1中，所述回流时间通常为30-200分钟，较好为40-150分钟，更好为60-120分钟，最好为90-120分钟。通常情况下，随着时间的延长，所得提取物的产率以及洋地黄毒苷的含量同时提高。在上述步骤2中，所述减压操作是常规的，通常可以通过抽真空的方式进行。本领域的普通技术人员根据本发明的描述可以直接得到怎样进行减压操作来达到本发明的目的。或者，所述减压操作也可以这样进行将所得提取液减压浓缩至干，然后用C2-C4垸基醇含量为15-25%的水溶液溶解。上述C2-C4垸基醇水溶液的醇含量较好为17-23%,更好为18-22%,最好为20%。在上述步骤2中,减压浓縮后C2-C4烷基醉含量通常为15-25%，较好为较好为17-23%，更好为18-22%,最好为20%。在上述步骤2中，所述冷藏温度通常为(M5"，较好为0-10"C，更好为4-8r'最好为4C。通常，所述冷藏操作是在电冰箱中进行的。为了提高产率，所述步骤2中的萃取步骤可一次或多次进行，例如l-3次、1-5次、1-7次、1-10次或1-20次等。各次萃取后将所得水层合并进行下一步骤。通常，石油醚和氯仿的每次用量为0.1-5倍量(以待萃取溶液体积计，下同)，较好为0.3-1倍量，更好为1/3倍量。为了提高产率，所述步骤3中的萃取步骤可一次或多次进行，例如l-3次、1-5次、1-7次、1-10次或1-20次等。各次萃取后将所得有机层合并进行下一步骤。通常，氯仿或乙酸乙酯或正丁醇的每次用量为0.1-5倍量(以待萃取的醇溶液体积为基准，下同)，较好为0.3-1倍量，更好为l/3倍量。通常，碱溶液的每次用量为5-1/10倍量(以有机层体积为基准，下同)，较好为3-1/10倍量，更好为1-1/10倍量，最好为1/10倍量。在上述步骤3中，所述碱溶液是常规的，只要它能达到除色的目的即可。在本发明的一个优选实例中，所述碱溶液选自氡氣化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化铵溶液或其混合物。在本发明的另一个优选实例中，所述碱溶液为10%的氢氧化钠水溶液。本发明另一方面提供了另一种从洋地黄叶提取洋地黄提取物的方法，所述方法包括(1)将粉碎的洋地黄叶置于回流装置中，在所述回流装置中加入水或50-95%C2-C4烷基醇水溶液，于40-150r回流提取30-200分钟，得提取液(2)将歩骤1所得提取液减压浓縮至C2-C4烷基醇含量为15-25%,置0-15X:冷藏过夜后取上清液，然后用氣仿或乙酸乙酯或正丁醇萃取，回收有机层，然后用碱溶液萃取有机层多次萃取，直至碱溶液层无色，干燥有机层得洋地黄提取物。为了提高产率，所述步骤1可重复进行一次或多次，例如l-3次、1-5次、1-7次、1-10次或者1-20次等等。各次所得提取液进行合并进行下一歩骤。通常，每次加入的水或5(^95S^C2-C4烷基醇水溶液的量为5-20倍量(药材/液体按重量kg/体积L计，下同)，较好为6-15倍量，更好为8-12倍量，最好为10倍量。在上述步骤1中，所述C2-C4垸基醉水溶液的醇浓度通常为50-95体积％，较好为60-95%，更好为80-95%,暈好为90-95%。一般情况下，随着C2-C4烷基醇水溶液的醇浓度上升.所得提取物的产率以及洋地黄毒苷的含量同时提髙。在上述歩骤1中，所述C2-C4垸基醇通常为C2-C4烷基一元或多元醇，例如二元醇、三元醇等。在本发明的一个优选实例中，所述C2-C4烷基醇选自乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、丙三醇、丙二醇、丁二醇或其混合物。在本发明的一个优选实例中，所述C2-C4垸基醉选自乙醇、正丙醇和正丁醇或其混合物。在本发明的其它部分中，所述C2-C4烷基醉的定义与上面的定义相同。在上述步骤l中，所述温度通常为40-12(TC，较好为50-120"C,更好为60-100'C,最好为80-l(XTC。在上述步骤l中，所述回流时间通常为30-200分钟，较好为40-150分钟，更好为60-120分钟，最好为90-120分钟。通常情况下，随着时间的延长，所得提取物的产率以及洋地黄毒苷的含量同时提高。在上述步骤2中，所述减压操作是常规的，通常可以通过抽真空的方式进行。本领域的普通技术人员根据本发明的描述可以直接得到怎样进行减压操作来达到本发明的目的。或者，所述减压操作也可以这样进行将所得提取液减压浓縮至干，然后用C2-C4烷基醉含量为15-25%的水溶液溶解。上述C2-C4烷基醇水溶液的醇含量较好为17-23%,更好为18-22%,最好为20%。为了提高产率，所述步驟2中的萃取步骤可一次或多次进行，例如l-3次、1-5次、1-7次、1-10次或1-20次等。各次萃取后将所得有机层合并进行下一步骤。通常，氯仿或乙酸乙酯或正丁醇的每次用量为0.1-5倍量(以待萃取的醇溶液层体积为基准，下同)，较好为0.3-1倍量，更好为l/3倍量。通常，碱溶液的每次用量为5-1/10倍量(以有机层体积为基准，下同)，较好为3-1/10倍量，更好为1-1/10倍量，最好为/10倍量。在上述步骤2中，所述碱溶液是常规的，只要它能达到除色的目的即可。在本发明的一个优选实例中，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化铵溶液或其混合物。在本发明的另一个优选实例中，所述碱溶液为10%的氢氧化钠水溶液。在上述步骤2中，所述冷蔵温度通常为0-15'C，较好为0-10'C，更好为4-8"C,最好为4'C。通常，所述冷藏操作是在电冰箱中进行的。在上述方法中，为了得到更纯的提取物，用碱溶液萃取后的有机层通常可以用水洗涤除去有机层的碱性物质。所述洗錄可多次进行，知道有机层呈中性即可。本发明还提供了一种洋地黄提取物，其中以洋地黄毒苷计，洋地黄苷含量为20-60重豕％，较好为20-50重量％,更好为20-45重量％，最好为2040重量％。或者，以洋地黄毒苷计，所述洋地黄苷含量为25-60重量％、30-50重量％、30-40重量％等。洋地黄提取物通常包含洋地黄苷，其中所述洋地黄苷是紫花苷A、紫花苷B、羟基洋地黄毒苷和洋地黄毒苷等的总称。在本领域中，通常以洋地黄毒苷的含量来表征洋地黄苷的含量。本发明还提供了一种洋地黄苷滴眼液，所述滴眼液包括本发明所述的洋地黄苷提取物和药学上可接受的载体。在本发明中，所述药学上可接受的载体是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述可直接得到那些载体可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述载体选自pH调节剂、防腐剂中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述pH调节剂选自氢氧化钠和/或盐酸、硫酸、枸橼酸、枸撺酸钠、硼酸、硼酸钠、三乙醇胺、磷酸盐类或其混合物。在本发明的另一个优选实例中，所述防腐剂选自苯扎氯铵、苯扎溴铵、羟苯甲、乙、丙酯或它们的混合物。制备本发明所述洋地黄苷滴眼液的方法是常规的，现有技术已经公开了多种制备滴眼液的方法。本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接得到制备洋地黄苷滴眼液的方法。本发明所述洋地黄苷滴眼液的使用方法也是常规，例如直接将滴眼液滴于眼中，一天分3次到10次不等。实施例洋地黄毒苷含量的检測方法色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B,按下表进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min:检测波长为220nm。时间(min)流动相A(%)流动相B(%)0—585155—3585—4015-6035—4140—8560-41—508515洋地黄毒苷含量測定法:取样品10.0mg置于200ml量瓶中，加水超声使溶解并定容至刻度。精密量取100jJ注入液相色谱仪，记录色谱图。另精密称取洋地黄毒苷对照品适量，用50免乙腈制成每lml含0.005mg的对照品溶液。精密量取lOOjil注入液相色谱仪，记录色谱图。取各色谱峰面积之和(As)及洋地黄毒苷峰的面积(Ar)，按下式计算，即得。每lml溶液含洋地黄苷的mg数(按洋地黄毒苷计)-(AsXCr)/Ar式中Cr为对照品溶液的浓度(mg/ml)。实施例l在洋地黄叶粗粉1公斤中加入70%乙醉水溶液6L，于6(TC回流提取60分钟。残渣再加70免乙醇6L于60TC回流提取60分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20%后置于4'C冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙醇后，用三分之'-量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20免乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酷层浓缩至800ml后，用80mllO免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酯层千燥至千，得洋地黄提取物的得率为0.110%(l.lg)，洋地黄苷含量为23.5%。实施例2在洋地黄叶粗粉1公斤中加入80免乙醉水溶液8L，于60r回流J^取90分钟。残渣再加80免乙酵8L于601C回流提取卯分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20免后置于4'C冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙醮层浓縮至800ml后，用80mllO免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酷层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.090%(0.9g)，洋地黄苷含量为30.4%。实施例3在洋地黄叶粗粉1公斤中加入90免乙醉水溶液10L,于60t:回流提取120分钟。残渣再加90%乙醇10L于60t:回流提取120分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20免后置于4r冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙醉后，用三分之--量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓缩至800ml后，用8Omll0免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll%NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酯层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.140%(1.4g)，洋地黄苷含量为39.3%。实施例4在洋地黄叶粗粉1公斤中加入90免乙醇水溶液6L，于8(TC回流提取90分钟。残渣再加90免乙醇6L于8(TC回流提取90分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20免后置于4'C冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓縮至800ml后，用80mllO免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙醮层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酯层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.090%(0.9g),洋地黄苷含量为20.6%。实施例5在洋地黄叶粗粉1公斤中加入70%乙醇水溶液8L，于80X:回流提取120分钟。残渣再加70%乙醇8L于80"回流提取120分钟，合并提取液。所得提取液减压浓缩至含醇量为20免后置于4"冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醸萃取一次。取水层减压回收至千后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓縮至800ml后，用80mll0免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酷层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.075%(0.75g)，洋地黄苷含量为23.6%。实施例6在洋地黄叶粗粉1公斤中加入80免乙醇水溶液10L,于80"C回流提取60分钟。残渣再加80%乙醇10L于80"回流提取60分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20免后置于4"C冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓缩除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓縮至800ml后，用80mllO免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll%NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酯层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.090。％(0.9g),洋地黄苷含量为23.5%。实施例7在洋地黄叶粗粉1公斤中加入80免乙醇水溶液6L,于IOO'C回流提取120分钟。残渣再加80%乙醇6L于IOOX:回流提取120分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20免后置于4"C冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓缩除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓縮至800ml后，用80mll09b的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酯层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.090%(0.9g)，洋地黄苷含量为24.3%。实施例8在洋地黄叶粗粉1公斤中加入90%乙醇水溶液8L，于100r回流提取60分钟。残渣再加90%乙醇8L于IOO"C回流提取60分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20%后置于4C冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙醉后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取--次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酷萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓縮至800ml后，用80mll0免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙簾层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.075%(0.75g)，洋地黄苷含量为30.1%。实施例9在洋地黄叶粗粉1公斤中加入70%乙醇水溶液10L,于100"C回流提取90分钟。残渣再加709b乙醇IOL于10CrC回流提取90分钟，合并提取液。所得提取液减压浓缩至含醇量为20免后置于41C冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓縮至800ml后，用80mllO免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80rall免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酯层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.090%(0.9g)，洋地黄苷含量为34.0%。根据实施例l-9作为正交实验，列表如下表1因素水平表因素水平温度(A,"C)乙醇量药材(B，V/W)提取时间(C，分钟)乙醇浓度(D,免)160660702808908031001012090表2Lq(34)正交试验结果试验号ABCD得率(免)含量(％)111110.11023.5212220.09030.431330.14039.342120.09020.622310.07523.6623120.09023.5731320.09024.3832130.07530.193210.09034.0得率Kl0.3400.2900.2750.275K20.2500.2400.2700.270最优A,B3C3D3K30.2500.3200,3050.305R0.0900.0800.0350.035含量Kl93,268.477.18UK267.784.162,278.2最优AiB3C3D3K388.496.885.090.0R25.528.47.911.8试验结果表明，当温度下降，或者乙醇用量上升，或者提取时间延长，或者乙醇浓度上升时，洋地黄提取物的得率以及洋地黄苷的含量都会上升。实施例10在洋地黄叶粗粉1公斤中加入90免乙酵水溶液IOL，于60'C回流提取120分钟。残渣再加90%乙醇10L于601C回流提取120分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为209b后置于4"C冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓缩除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用15%乙醉溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓縮至800ml后，用80mllO免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取--遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙H层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.090%(0.9g)，洋地黄苷含量为28免。实施例11在洋地黄叶粗粉1公斤中加入90免乙醇水溶液IOL，于60"回流提取120分钟。残渣再加90%乙醇10L于60卩回流提取120分钟，合并提取液。所得提取液减压浓缩至含醇量为20免后置于4X:冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙酵后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用25免乙醇溶解，再每次用三分之一量的乙酸乙酷萃取3次，合并乙酸乙酯层。将所得乙酸乙酯层浓縮至800ml后，用80mllO免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll%NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性。然后将乙酸乙酯层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.076%(0.76g),洋地黄苷含量为32%。由实施例3、10和11可知，上述水层回收至干后用20%乙醇溶解能得到较好的洋地黄提取物得率和洋地黄苷含量。实施例12在洋地黄叶粗粉1公斤中加入90%乙醇水溶液10L,于60C回流提取120分钟。残渣再加90%乙醇10L于60"C回流提取120分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20免后置于41C冰箱过夜，次日过滤,将上清液浓縮除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的氯仿萃取3次，合并氯仿层，将所得氣仿层浓縮至800ml后，用80m!10免的NaOH溶液萃取氣仿层，萃取8次后，再用80ml19feNaOH溶液萃取—遍。将氣仿层再用水洗涤至水层呈中性。然后将氯仿层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.090%(0.9g)，洋地黄苷含量为26免。实施例13在洋地黄叶粗粉l公斤中加入909b乙醇水溶液10L，于6(TC回流提取120分钟。残渣再加90%乙醇IOL于60"回流提取120分钟，合并提取液。所得提取液减压浓縮至含醇量为20免后置于4*0冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓縮除去乙醇后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次。取水层减压回收至干后用20%乙醇溶解，再每次用三分之一量的正丁醉萃取3次,合并正丁醉层。将所得正丁醉层浓缩至800ml后，用80mllO免的NaOH溶液萃取正丁醇层，萃取8次后，再用80mll%NaOH溶液萃取一遍。将正丁醇层再用水洗涤至水层呈中性。然后将正丁醇层干燥至干，得洋地黄提取物的得率为0.209%(2.09g),洋地黄苷含量为15%。由实施例3、12和13可知，使用氣仿萃取所得提取物得率和洋地黄苷含量均不如用乙酸乙酯萃取所得提取物，但是用正丁醇所得提取物得率较高，但是洋地黄苷含量较低。实施例14洋地黄叶粗粉1公斤，加80%乙醇10L，90"C回流提取2h，残渣再加80%乙醇8L回流提取2h,合并提取液，减压浓縮至含醉量20免，于4"冰箱过夜，次日过滤，将上清液浓缩至无醇味后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次，水层减压回收至千后，用20%乙醉溶解，再用三分之一量的乙酸乙酷萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓縮至800ml后，用80mll0兔的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酷层再用水洗涤至水层呈中性，将乙酸乙酯层至干，得洋地黄提取物1.2g洋地黄苷含量为28%。实施例15洋地黄叶粗粉1公斤，加90%乙醇20L,60X:回流提取2h,残渣再加90%乙醇10L回流提取2h，共提取三遍，合并提取液，减压浓缩至干后，用2升20%乙醇溶解，于4'C冰箱过夜，次闩吸取上清液，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的乙酸乙酯萃取3次，合并至800ml后，用80mllO兔的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用80mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性，将乙酸乙酯层至干，得洋地黄提取物1.2g，洋地黄苷含量为40%。实施例16洋地黄叶粗粉2公斤，加90免乙醉20L,6(TC回流提取2h，残渣再加909b乙醇20L回流提取2h,共提取三遍，合并提取液，减压浓縮至干后，用4升20免乙醇溶解，于4TC冰箱过夜，次日吸取上清液，将上清液浓缩至无醉味后，用三分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的石油醚萃取一次，水层加乙醇至含醇量为20%,用三分之-量的乙酸乙酯萃取3次，合并至1600ml后，用160mllO免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取8次后，再用160mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性，将乙酸乙酯层至干，得洋地黄提取物2.0g洋地黄苷含量为35%。实施例17洋地黄叶粗粉2公斤，加水20L，1(XrC回流提取2h，残渣再加水10L回流提取2h，合并提取液，减压浓縮至干，用25免乙醉IOL溶解后，于4r冰箱过夜，次H吸取上清液,用二分之一量(以待萃取溶液的体积计，下同)的乙酸乙酯萃取3次，合并至1600ml后，用160mll0免的NaOH溶液萃取乙酸乙酯层，萃取10次后，再用160mll免NaOH溶液萃取一遍。将乙酸乙酯层再用水洗涤至水层呈中性，将乙酸乙酯层至干，得洋地黄提取物1.5g洋地黄苷含量为209b。实施例18洋地黄滴眼液洋地黄叶干提物0.05g硼酸18.0g苯扎氣铵O.lg注射用水加至1000ml制备方法1.将硼酸、苯扎氣铵溶解于500ml的注射用水中，搅拌均匀。2.将实施例3所得洋地黄叶干提物加入到步骤1所得溶液中溶解，并搅拌均匀。3.加注射用水至全量，拢拌均匀并过滤灌装。实施例19洋地黄和七叶亭苷滴眼液洋地黄叶千提物O.OSg七叶亭苷O.lg硼酸18.0g苯扎氯钹O.lg注射用水加至1000ml制备方法1.将硼酸、苯扎氧铵溶解于500ml的注射用水中，搅拌均匀。2.将洋地黄叶干提物和七叶亭苷加入到步骤1所得溶液中溶解，并搅拌均匀。3.加注射用水至全量，搅拌均匀并过滤灌装。实施例20兔眼刺激性研究。试验方法将权利要求18所得滴眼液滴入新西兰家兔一侧眼结膜囊内，另一側作为赋形剂对照。给药后使眼睛被动闭合510秒。每円给药3次，连续28R。受试物给予完毕后第l、2、4、24、48、72小时对眼进行荧光素染色裂隙灯检査。结果如表3。表3家兔的眼刺激试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>结论家兔接触本品后，未见明显剌激性反应。表4眼刺激评价标准<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>权利要求1.一种洋地黄提取物的制备方法，所述方法包括(1)将粉碎的洋地黄叶置于回流装置中，在所述回流装置中加入水或50-95％C2-C4烷基醇(优选乙醇)水溶液，于40-150℃回流提取30-200分钟，得提取液；(2)将步骤1所得提取液减压浓缩至C2-C4烷基醇(优选乙醇)含量为15-25％，置0-15℃冷藏过夜后取上清液，将所得上清液减压回收除去C2-C4烷基醇(优选乙醇)，然后用石油醚或氯仿萃取，取水层；(3)将步骤2所得水层加C2-C4烷基醇(优选乙醇)至C2-C4烷基醇(优选乙醇)含量为15-25％，然后用氯仿或乙酸乙酯或正丁醇萃取，回收有机层，然后用碱溶液萃取有机层多次萃取，直至碱溶液层无色，干燥有机层得洋地黄提取物。2.—种洋地黄提取物的制备方法，所述方法包括(1)将粉碎的洋地黄叶置于回流装置中，在所述回流装置中加入水或50-95%C2-C4烷基醇(优选乙醇)水溶液，于40-150"回流提取30-200分钟，得提取液(2)将步骤1所得提取液减压浓縮至C2-C4垸基醉(优选乙醇)含量为15-25%，置0-15C冷藏过夜后取上清液，然后用氣仿或乙酸乙酷或正丁醇萃取，回收有机层，然后用碱溶液萃取有机层多次萃取，直至碱溶液层无色，干燥有机层得洋地黄提取物。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤l中，以药材/液体按重量kg/体积L计，加入的水或50-95%C2-C4烷基醇水溶液的量为5-20倍量，较好为6-15倍量，更好为8-12倍量，最好为10倍量。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在上述步骤1中，所述C2-C4烷基醉水溶液的醇浓度通常为50-95体积％,较好为60-95体积％，更好为8&95体积。^，最好为90-95体积％。5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在上述步骤l中，所述温度通常为4(M5(TC，较好为5(M201C，更好为60-100"，最好为80-100'C。6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在上述歩骤l中，所述回流时间通常为30-200分钟，较好为4(M50分钟，更好为60-120分钟，最好为9O120分钟。7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述碱溶液是10%的氢氧化钠水溶液。8.—种洋地黄提取物，其中以洋地黄毒苷计，洋地黄苷含量为20-60重量0%。9.如权利要求8所述的洋地黄提取物，其特征在于，以洋地黄毒苷计，洋地黄苷含量为20-50重量％,更好为20-45重量％,最好为20-40重量％。10.—种滴眼液，它包含权利要求8所述的洋地黄提取物和药学上可接受的载体。全文摘要本发明提供了一种洋地黄提取物以及制备洋地黄提取物的方法。本发明还提供了一种包含所述洋地黄提取物的滴眼液。文档编号A61K36/80GK101209312SQ20061014797公开日2008年7月2日申请日期2006年12月26日优先权日2006年12月26日发明者何威之,夏凌云,杨保华,郭雅琦,陈彬华,雷仕庆,原高申请人:信谊药厂