专利名称：：一种粪便样品病毒分离前的简便除菌方法
技术领域：
：本发明涉及病毒样品分离前的除菌技术，特别提供了一种操作简便，低成本的病毒分离前粪便样品的除菌方法。
背景技术：
：病毒分离鉴定是病毒性疾病检疫、诊断和流行病学调查的重要方法之一。众所周知患病动物的粪便是含病原微生物(细菌、病毒等)最多的传染源，粪便也是感染机体排毒的主要形式，诸如SARS、禽流感、甲肝等传染病，主要的传播途径是通过粪便传染。同时从粪便中分离到病毒也可是诊断传染病的重要依据。近年来，在禽流感爆发流行的检测、监测过程中，都是通过对动物(禽类，哺乳动物类)粪便的检测，行病毒培养分离，从而采取积极的防控措施的。从粪便中分离病毒，首先要对粪便样品进行除菌(细菌)处理，通常采集34克的粪便溶于Hank's盐溶液中制成20%的悬液，充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素1000-2000U/ml，链霉素1000-2000ug/ml，再用微孔滤器(孔径450nm)过滤；然后接种组织细胞，鸡胚或实验动物，进行病毒培养分离。
发明内容本发明的目的在于提供一种粪便样品病毒分离前的简便除菌方法，该方法操作简便，成本低廉，并且可以提高病毒的分离率。本发明具体提供了一种粪便样品病毒分离前的简便除菌方法，其特征在于采集34克的粪便样品于Hank's盐溶液中制成20%的悬液，充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素10,000-20,000U/ml，链霉素20,000-20,000ug/ml，混匀后在4"C静置4小时。本发明粪便样品病毒分离前的简便除菌方法加大了抗菌素用量10-15倍(10,000-30,000U/ml，链霉素10，000-30，000ug/ml)，去除了粪便样品中的细菌污染。本发明粪便样品病毒分离前的简便除菌方法省去了样品过滤除菌的操作程序。本发明粪便样品病毒分离前的简便除菌方法减少了样品携毒量的丢失，保证了样品的携毒量，不影响病毒的分离率。因为样品中颗粒性物质对病毒有缠裹，吸附的作用，如形皿径大于450mn的颗粒后，不能被滤膜滤过，从而影响了病毒的分离率。本发明粪便样品病毒分离前的简便除菌方法降低了样本处理的成本，微孔滤器(直径2cm,孔径450nm)，一份样品/个/次，价格12.00-15.00刃个(进口)，3.00-3.50^;/个(国产)。本发明粪便样品病毒分离前的简便除菌方法操作简便。具体实施例方式实施例1采用本发明除菌方法2005年湖北某县疑似禽流感野鸟粪便样品113份。具体操作方法釆集粪便34克/份，分别溶于Hank's盐溶液中制成20%的悬液，充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素10,000U/ml，链霉素10,000ug/ml。混匀后在4"C静置4小时，然后按常规方法接种9-11日龄的鸡胚尿囊腔，进行禽流感病毒分离。接种后继续37i:孵化，检出24小时内死亡鸡胚，吸取尿囊液做细菌培养试验(注l);继续孵化至96小时后吸取尿囊^a行HA效价测定，结果判断HA效价^1:32判为分离获得流感病毒。结果见表l。表12005年湖北某县疑似禽流感野鸟粪便113份样品病毒接种前的除菌实验结果样品接种胚48h死胚污染率HA效价5:1:32病毒分离率青霉素10，000U/ml(n)(n，)(n0)(%)(no)(%)链霉素10,000ug^ml-^——-^——-----11311310.881210.61注l:细菌培养，操作无菌操作下，打开鸡胚尿囊腔，取尿囊液100微升，加入LB液体培养基5毫升内，置37t培养48小时，结果判断培养基呈混浊状态，判为细菌培养阳性，表示接种样品的尿囊液含有污染的细菌；培养基颜色清亮，则判为阴性，表示接种的尿囊液无细菌污染。注2:n为待检粪便样品份数。n'为接种的鸡胚数。^为接种后孵育48内的死胚数，48内的死胚判为污染。no判为分离获得流感病毒的数量，当HA效价21:32判为分离获得流感病毒。比较例12005年湖北某县疑似禽流感野鸟粪便样品113份。具体操作方法采集粪便34克/份，分别溶于Hank，s盐溶液中制成20Q/。的悬液充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素1000U/ml，链霉素1000ug/ml，再用113个滤器(孔径450nm)分别过滤113份样品，然后按常规方法接种9-11日龄的鸡胚尿囊腔，进行禽流感病毒分离。接种后继续37'C孵化，检出24小时内死亡鸡胚，吸取尿囊液做细菌培养试验(注1)，继续孵化至96小时后吸取尿囊液迸行HA效价测定，结果判断HA效价3:32判为分离获得流感病毒。结果见表2。表22005年湖北某县疑似禽流感野鸟粪便113份样品病毒接种前的除菌实验结果样品接种胚48h死胚污染率HA效价^1:32病毒分离率青霉素l,OOOU/ml(n)(n，)(n0)(%)(no)(%)链霉素l，OOOug/ml~~-------11311365.3097.96实施例2采用本发明的除菌方法2006年浙江某1似禽流感鸡粪便样品46份。具体操作方法采集粪便34克/份，分别溶于Hank's盐溶液中制成20%的悬液，充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素20,000U/ml，链霉素20,000ug/ml。混匀后在4'C静置4小时，然后按常规方法接种9-11日龄的鸡胚尿囊腔，进行禽流感病毒分离。接种后继续37。C孵化，检出24小时内死亡鸡胚，吸取尿囊液做细菌培养试验(注l);继续孵化至96小时后吸取尿囊液进行HA效价测定，结果判断HA效价^1:32判为分离获得流感病毒。结果见表3。表32006年浙江某县疑似禽流感鸡粪便46份样品病毒接种前的除菌实验结果样品接种胚48h死胚污染率HA效价^1:32病毒分离率青霉素20，0O0U/ml(n)(n，)(n0)(%)(no)(%)链霉素20,000ug/ml---~--464600510.8比较例22006年浙江某县疑似禽流感鸡粪便样品46份。具,作方法采集粪便34克/份，分别溶于Hank's盐溶液中制成20%的悬液充分混匀后6謹r/min离心20min，取上清液加青霉素2000U/ml，链霉素2000ug/ml，再用孔径450nm的微孔滤膜过滤，按常规方法接种9-11日龄的鸡胚尿囊腔，进行禽流感病毒分离。接种后继续37。C孵化，检出24小时内死亡鸡胚，吸取尿囊液做细菌培养试验(注l);继续孵化至96小时后吸取尿囊液进行HA效价测定，结果判断HA效价^1:32判为分离获得流感病毒。结果见表4。表42006年浙江某县疑似禽流感鸡粪便46份样品病毒接种前的除菌实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3采用本发明的除菌方法2006年湖南省某县疑似禽流感鸟粪便样品123份。具体操作方法采集粪便34克/份，分别溶于Hank's盐溶液中制成20%的悬液，充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素30,000U/ml，链霉素30,000ug/ml。混匀后在4。C静置4小时，然后按常规方法接种9-11日龄的鸡胚尿囊腔，进行禽流感病毒分离。接种后继续37。C孵化，检出24小时内死亡鸡胚，吸取尿囊液做细菌培养试验(注l);继续孵化至96小时后吸取尿囊液进行HA效价测定，结果判断HA效价^1:32判为分离获得流感病毒。结果见表5。表52006年湖南省某县疑似禽流感鸡粪便123份样品病毒接种前的除菌实验结果样品接种胚48h死胚污染率HA效价5:1:32病毒分离率青霉素30,000U/ml,、(n)(n')(n0)(%)(no)(%)链霉素30，000ug/ml~--"~~~----12312300129.75比较例32006年湖南省某县疑似禽流感鸟粪便样品123份。具体操作方法采集粪便34克/份，分别溶于Hank's盐溶液中制成20M的悬液充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素2000U/ml，链霉素2000u^ml，再用孔径450nm的微孔滤膜过滤，按常规方法接种9-11日龄的鸡胚尿囊腔，进行禽流感病毒分离。接种后继续37'C孵化，检出24小时内死亡鸡胚，吸取尿囊液做细菌培养试验(注l);继续孵化至96小时后吸取>^囊行HA效价测定，结果判断HA效价^1:32判为分离获得流感病毒。结果见表6。表62006年湖南省某1#似禽流感鸡粪便123份样品病毒接种前的除菌实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表7:实施例与比较例的实验结果比较青霉素(P.G)滋霉素(S.m)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种粪便样品病毒分离前的简便除菌方法，其特征在于采集3-4克的粪便样品于Hank’s盐溶液中制成20％的悬液，充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素10,000-20,000U/ml，链霉素20,000-20,000ug/ml，混匀后在4℃静置4小时。全文摘要一种粪便样品病毒分离前的简便除菌方法，其特征在于采集3-4克的粪便样品于Hank’s盐溶液中制成20％的悬液，充分混匀后6000r/min离心20min，取上清液加青霉素10,000-20,000U/ml，链霉素10,000-20,000ug/ml，混匀后在4℃静置4小时。本发明方法操作简便，成本低廉，并且提高了病毒的分离率。文档编号A61L11/00GK101190343SQ20061013441公开日2008年6月4日申请日期2006年11月29日优先权日2006年11月29日发明者霜唐,铮寇,忠张,李天宪,李永东,范兆军,陈绳亮申请人:中国科学院武汉病毒研究所