专利名称：具有抗新生血管生成活性和抗肿瘤作用的玻璃海鞘多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及由玻璃海鞘(Ciona intestinalis)中分离纯化的一组抗新生血管生成多肽，以及该多肽的提取方法和在预防和/或治疗由新生血管生成引起的疾病等领域的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病，因而也是当前全球研究的热点。目前临床上应用的抗肿瘤药物仍以细胞毒类药物为主，这类药物对肿瘤虽然具有一定的疗效，但存在选择性差、毒副作用大等缺点。近年来随着分子生物学的发展，人们对肿瘤发生发展的分子机制的了解不断深入，为肿瘤的治疗提供了新的模式。
现在已知，新生血管生成是肿瘤生长、发展的必经之路，且与实体瘤的发生、转移有着密切的关系，许多肿瘤仅在新的血管生成之后才出现临床症状，抑制肿瘤新生血管生成具有特异性高、疗效好、不易产生耐药性以及毒副作用低等特点，因此抑制血管形成可望成为治疗癌症的一个突破点。
以新生血管生成为靶点的抗肿瘤药物具有较好的专一性，近年来受到广泛关注，人们发现抑制新生血管生成过程可以有效抑制肿瘤生长，许多新生血管生成抑制剂在多种动物模型中表现出强烈的抗肿瘤活性。与常用的细胞毒性药物相比，由于内皮细胞具有遗传学的稳定性，以其作为生物靶点的抗肿瘤药物不易产生抗药性，其意义特别重大。
近年来国际上已报道约500个新生血管生成抑制剂，目前已有60多个新生血管生成抑制剂临床试验阶段，近10种已进入II-III期临床研究并取得了令人鼓舞的实验结果。其中，蛋白多肽类药物Avastin和Endostatin已于2005年、2006年分别在国外和国内上市。
海鞘(Ascidian)属于脊索动物门(Chordates)，尾索动物亚门(Urochordata)，海鞘纲(Ascidiacea)，全世界大约有1600种。从中发现了许多具有新的结构和生物学功能的环肽、线性肽及desipeptides。Didemnins(膜海鞘素)最早是从加勒比海鞘中分离的，是desipeptides的家族，具有抗肿瘤，抗病毒和免疫抑制作用，其中Didemnins B是抗肿瘤活性最强的环肽(体外对L1210的IC50为2.5ng/ml)，也是第一种进入临床试验的海洋天然产物。由两种海鞘Didemnum cuculiferum和Polysyncranton lithostrotum中发现的一种13个氨基酸的环肽可显著抑制微管聚合，并能延长小鼠p388淋巴细胞白血病的生存期；但由玻璃海鞘(Cionaintestinalis)中分离出抗肿瘤蛋白一直未见报道。本发明从玻璃海鞘中分离到一组新的具有抗新生血管生成活性的多肽。实验证实，该多肽对斑马鱼胚胎血管生成有显著的抑制作用，对人脐静脉内皮细胞的迁移和管状形成有显著的抑制活性。与现有的抗肿瘤药物相比，以血管生成为靶点的抗肿瘤药物具有毒副作用小，不易产生耐药性等优点，有希望发展成为新型的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明涉及一组具有抗新生血管生成活性并对肿瘤细胞系有直接抑制作用的多肽，该组多肽是玻璃海鞘(Ciona intestinalis)来源的。以凝胶过滤法测定其分子量约为1-3kDa。
本发明还涉及获得该多肽的方法。它主要包含下述步骤，新鲜海鞘粉碎匀浆后，水浴处理，高浓度有机溶剂沉淀，上清液去掉有机溶剂冻干浓缩，SephadexG-25凝胶过滤层析，Superdex75快速蛋白质液相色谱层析(FPLC)。
最后本发明还涉及诊断治疗与新生血管生成异常相关疾病的方法。本发明的蛋白多肽或其一部分可以治疗和/或预防新生血管生成方面引起的疾病。
本发明涉及一种用于分离纯化抗新生血管生成蛋白多肽的方法，包括如下步骤[1]取新鲜的玻璃海鞘，粉碎匀浆，水浴处理，有机溶剂沉淀；[2]上清液去掉有机溶剂后冻干，缓冲液重新溶解，SephadexG-25凝胶过滤层析，得到活性峰3；[3]峰3部位再经过Superdex75 FPLC后得到活性峰F-2；命名为BLF-2；[4]通过凝胶过滤法测定其分子量约为1-3KD；[5]BLF-2对斑马鱼胚胎新生血管生成有显著的抑制活性，对人脐静脉内皮细胞的迁移和管状形成有明显的抑制作用；下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权力要求书所界定的本发明
图1为玻璃海鞘有机溶剂沉淀后的上清液sephadex G-25凝胶过滤层析图活性峰为峰3图2为峰3部分Superdex75 FPLC的层析图活性峰为峰F-2即BLF-2。
图3为BLF-2对斑马鱼胚胎血管生成的抑制作用，呈剂量依赖关系。
图4为BLF-2对内皮细胞迁移的抑制作用，呈剂量依赖关系。
图5为BLF-2对内皮细胞管状形成的抑制作用，呈剂量依赖关系。
具体实施例方式
实施例1BLF-2的制备丙酮分级沉淀，凝胶层析等技术制备玻璃海鞘多肽。其操作步骤如下
(1)取新鲜玻璃海鞘，采集于青岛胶南，粉碎匀浆，60-80℃水浴加热10-30min，离心取上清；(2)上清用70％冷丙酮沉淀，弃沉淀得上清；(3)上清液利用旋转蒸发仪在29℃，抽真空去掉丙酮；(4)去掉丙酮的上清液冻干后用少量缓冲液重新溶解，SephadexG-25凝胶过滤层析，得到5个峰，取第3个活性峰，收集活性组分，冻干，如图1所示。
(5)峰3用少量纯水重新溶解再经Superdex75 FPLC，得到3个峰，取第二个峰，收集活性组分，如图2所示。
实施例2BLF-2的体内抗血管生成活性(1)取健康的斑马鱼胚胎，在受精后24小时去膜，在胎水中加入不同浓度的BLF-2；(2)作用到受精后72小时，固定，脱水，染色，脱色；(3)在显微镜下观察斑马鱼胚胎肠下静脉的发育情况，随着BLF-2浓度的升高，肠下静脉的网状面积减小甚至消失，呈剂量依赖关系；不同浓度的BLF-2(20μg/ml-80μg/ml)对斑马鱼胚胎肠下静脉有明显的抑制活性；由图2可见，用20μg/ml的BLF-2处理受精后24小时的斑马鱼胚胎作用到受精后72小时，50％的肠下静脉(SIVs)被抑制；在40μg/ml时，SIVs几乎完全被抑制；并呈剂量依赖关系。
实施例3BLF-2的体外抗血管生成活性(1)低浓度的BLF-2(0.5μg/ml-10μg/ml)对Be17402肝癌细胞及MCF-7乳腺癌细胞的增殖有明显的作用，此数据未给出；(2)不同浓度的BLF-2(5μg/ml-20μg/ml)对人脐带内皮细胞的迁移有明显的抑制活性，并呈剂量依赖关系；由说明书附图，图4可见，12μg/ml的BLF-2与没有加BLF-2的对照相比较从上室迁移到下室的细胞数明显减少；随着BLF-2浓度的升高，迁移的细胞数依次减少；(3)不同浓度的BLF-2(5μg/ml-20μg/ml)对人脐带内皮细胞的管状形成有明显的抑制活性，并呈剂量依赖关系；由图5可见，12μg/ml的BLF-2与没有加BLF-2的相比较会抑制内皮细胞的管状形成；在以上浓度范围内，随着BLF-2浓度的升高，形成的管状的面积减少，甚至不形成管状。
权利要求
1.一组玻璃海鞘多肽，它由玻璃海鞘经多种分离手段得到的组分，分子量为1-3kDa，所述多肽具有体内外抗血管生成活性，体外抗肿瘤活性；
2.一种获得权利要求1所述的玻璃海鞘多肽的方法，它包括以下步骤，所有的操作均在4℃下进行-取新鲜的玻璃海鞘，粉碎匀浆，有机溶剂沉淀；-上清液去掉有机溶剂后冻干，缓冲液重新溶解，SephadexG-25凝胶过滤层析，得到活性峰3；-峰3部位再经过Superdex75 FPLC后得到活性峰F-2，命名为BLF-2，即具有抗新生血管生成活性和抗肿瘤作用的玻璃海鞘多肽。
全文摘要
本发明公布了由玻璃海鞘提取分离，具有抗新生血管生成作用的有效部位及有效成分，玻璃海鞘经高浓度有机溶剂沉淀，上清部分除去有机溶剂后经凝胶过滤，根据保留时间计算出分子量为1－3kDa的玻璃海鞘多肽。本发明还涉及此多肽用于治疗和/或预防癌症的用途。具体地说，就是通过多种的分离纯化手段从玻璃海鞘中分离纯化出一组新的蛋白多肽，并通过体内、体外活性实验确定此多肽在新生血管生成疾病的预防和治疗用途。
文档编号A61K38/02GK1962689SQ20061007055
公开日2007年5月16日 申请日期2006年11月23日 优先权日2006年11月23日
发明者董平原, 林秀坤, 魏宁, 牛荣丽, 王征 申请人:中国科学院海洋研究所