专利名称：一种绵羊胸腺肽的制备方法
技术领域：
本发明属于药品制备技术领域，特别涉及羊胸腺肽的制备工艺。
背景技术：
有关胸腺肽的研究开始于20世纪60年代，是胸腺组织上皮细胞分泌的多肽激素。1961年Miller和Archer分别在小鼠和家兔中发现胸腺对淋巴细胞的分化、成熟和免疫活性的获得有重要的作用，此后许多学者相继从人胚胸腺、小牛、绵羊、猪等的胸腺或血清中分离得到胸腺肽混合物；不同来源的胸腺肽的组分、理化性质、生物活性等没有显著性差别。1972年，Golden从小牛胸腺中分离出胸腺肽组分5(TF5)；后经等电聚焦电泳获得α1-10(PI＜5.0)、β1-5(5.0＜PI＜7.0)、γ(PI＞7.0)3个区，15条多肽(刘治军等，胸腺肽研究进展及临床应用，首都医药，2003，10910)40)。近几年，国外研究机构对TF5进行了纯化及生物化学性质方面的研究，已证实有生物活性的单肽为α1、α5、α7、β3、β4(Edward Hhannappel et al，TheThymosinsProthymosins α，Parathymosins，andβ-thymosinsStructure andFunction，Vitamins and Hormones，2003，66(1)257)，目前已有单一的胸腺肽以基因工程的方式生产，如α1。虽然利用基因工程生产单一的胸腺肽已经应用于临床，但是从胸腺提取的胸腺肽混合物仍然有其优势，因为不同胸腺肽成分对不同的免疫细胞及其不同的发育阶段的作用是不同的(Bela Bodeyet al，Rewiew of thymic hormones in cancer diagnosis andtreatment，International Journal of Immunopharmacology，2004，4(4)539)。
胸腺肽已经被广泛地应用于临床，主要用来治疗乙肝、丙肝等感染性疾病；非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、肝癌、胃癌等恶性肿瘤；自身免疫性疾病，如重症肌无力、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎；也用于皮肤病、过敏性紫癜、肺结核、上呼吸道感染等疾病的治疗。还可延缓和预防中老年人胸腺生理性退变，有防衰老的作用。
除临床上应用最广的是胸腺肽外。动物胸腺中还有多种多肽类激素，总称为胸腺激素。已由小牛胸腺分离精制的胸腺激素有胸腺素(Thymosin)、胸腺体液因子(Thymus humoral factor)、胸腺生成素(thymopoietin)和胸腺因子(Thymic factor)等。
胸腺肽的药理作用可概括为以下几方面1.诱导和促进胸腺依赖性T淋巴细胞分化和成熟。2.增强巨噬细胞的吞噬功能和抗原提呈能力。3.提高白细胞介素-2的产生水平并增强其受体的表达水平和受体亲和力。4.在肿瘤坏死因子存在或不存在的条件下，胸腺肽α1可促进骨髓来源的树突状细胞成熟分化并增强其功能。6.胸腺肽α1具有调节海马神经元突触传递的作用。胸腺肽对免疫系统的作用途径有两个一是通过形形色色的神经内分泌通路，改变激素水平，其作用主要表现为调节下丘脑-垂体-肾上腺轴，从而间接地作用于宿主的防御机制；二是直接介入免疫系统中发挥作用。此外，它还能调节糖皮质激素的分泌，这说明它可以抗应激作用。还发现胸腺肽具有抗衰老作用。
综上所述，胸腺肽作为一种较强的生物反应调节剂，已经在医学临床和兽医临床的疾病预防与治疗中发挥了越来越重要的作用，尤其是“非典”疫情出现以后，胸腺肽在其治疗中起了很大作用，从而引起了人们越来越多的关注，促进了胸腺肽制剂的广泛开发与应用。
目前，临床上应用的胸腺肽，除基因工程胸腺肽单组分外，都是从猪和牛的胸腺提取的、含有多种组分的胸腺肽。在1987年，谢家麒等人提取绵羊胸腺生成素(Thymopoietin，TP)，而不是胸腺肽(谢家麒等，绵羊胸腺肽类提取物的制备及其临床应用的研究，中国兽医科技，1987，116-19)。到目前为止，还没有用绵羊胸腺生产胸腺肽的。
目前胸腺肽的生产工艺为1、原料处理将动物胸腺组织剔除筋膜，漂洗后用绞肉机和匀质器破碎组织，加2倍体积双蒸水，反复冻融2、3次。每次-20℃贮存48小时以上。
2、将提取液加热到85℃，10分钟。离心去除沉淀蛋白。
3、离心液用截留分子量为1万的超滤柱进行超滤。
4、测定多肽含量，定溶。
5、过滤除菌制成水针剂或加赋形剂冻干。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绵羊胸腺肽的制备方法，用该方法收率高，生产周期短，并且所生产出的绵羊胸腺肽具有较高的活性/重量比。
本发明提供了一种绵羊胸腺肽的制备方法，包括原料处理、热变性除杂蛋白处理、碱除杂蛋白处理，其主要特征在于以绵羊胸腺肽为原料；原料处理过程为将绵羊胸腺组织在1～4倍体积的，pH为2.0～5.0的酸性缓冲液中，捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞，低温抽提1～4小时。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法中，更为具体地，所述热变性除杂蛋白处理过程为将原料处理后的蛋白质粗提液用电磁炉隔水加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液，除去变性蛋白；所述碱除杂蛋白处理过程为用碱调经热变性除杂蛋白处理后的上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白；用酸调上清液至pH6.0～7.5，离心取上清液，经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法中，所得滤液，可以进一步经纳滤浓缩，过滤除菌制成水针剂或加赋形剂冻干。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述原料处理过程中，酸性缓冲液可以选择为乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸等酸的钠盐或钾盐，浓度为20～150mM。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述原料处理过程中，缓冲液体积最好为2倍，pH值最好为3.0。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述原料处理过程中，低温抽提时间最好为2小时。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述碱除杂蛋白处理过程中，碱可以选择为氨水，钠、钾碱，或钠、钾弱酸盐。最好为氨水或氢氧化钠。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述酸除杂蛋白处理过程中，酸可以选择为盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸、或硫酸。最好为盐酸。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法与传统方法相比，用冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞代替了反复冻融，时间有4天以上缩短到一天；并用酸性溶液代替了双蒸水，从而抑制了蛋白酶活性，避免了活性成分的降解，提高了胸腺肽的生物活性。另外，热变性除杂蛋白也是在酸性条件下进行的，这也使一部分杂蛋白由于酸变性产生沉淀，并与热变性除杂蛋白一步完成，也避免了热变性除杂蛋白的升温过程中活性成分的降解；最后，在工艺中增加了一步碱变性除杂蛋白，使提取的绵羊胸腺肽的活性/重量比进一步得到提高。
利用本发明方法提取绵羊胸腺肽。活性测定采用T细胞活性测定法——脱E-玫瑰环试验。结果表明，用新工艺提取的绵羊胸腺肽，不仅收率高，而且活性显著提高。与目前药厂所用的生产工艺相比生产周期明显缩短，由7天以上缩短到4天；收率提高近1倍(2500mg/每kg胸腺提高到大于4200mg/每kg胸腺)；体外玫瑰花结试验(E-RFC％)测定活性提高达200多倍；胸腺素α1含量提高由1％到2％以上。
具体实施例方式
1.原料处理将动物胸腺组织剔除筋膜，漂洗后加1～4倍体积的pH2.0～5.0的缓冲液，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞。低温抽提1～4小时。
2.热变性除杂蛋白上述蛋白质粗提液用电磁炉隔水加热至70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，低温离心取上清液，除去变性蛋白。
3.用碱调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。可以用氨水、或钠、钾碱、或、钾弱酸盐，最好用氨水或氢氧化钠。
4.上清液用酸调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液。可以用乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸、硫酸。
5.液进行纳滤，提高胸腺肽原料中胸腺肽的浓度，用来配制不同规格的胸腺肽制剂。
6.测定多肽含量，定溶。
7.过滤除菌制成水针剂或加赋形剂冻干。
实施例1称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加20mMNaAc pH2.0的缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提2小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的HCL调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2500ml，再进行纳滤得滤液300ml。测定胸腺肽含量为16mg/ml，胸腺素α1的含量为3.1％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加27％。
实施例2称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加100mMNaAc pH5.0的缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提2小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的HAc调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2600ml，再进行纳滤得滤液310ml。测定胸腺肽含量为13.5mg/ml，胸腺素α1的含量为2.9％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加25％。
实施例3称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加50mM pH5.0的磷酸缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提2小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的H3PO4调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2400ml，再进行纳滤得滤液295ml。测定胸腺肽含量为14.5mg/ml，胸腺素α1的含量为2.8％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加29％。
实施例4称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加20mMNaAc pH3.0的缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提3小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的HCL调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2700ml，再进行纳滤得滤液320ml。测定胸腺肽含量为15mg/ml，胸腺素α1的含量为3.0％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加25％。
实施例5
称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加20mMNaAC pH3.0的缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提4小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的HCL调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2700ml，再进行纳滤得滤液320ml。测定胸腺肽含量为14mg/ml，胸腺素α1的含量为2.9％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加23％。
实施例6称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，用绞肉机和匀质器破碎组织，加2000ml双蒸水，反复冻融三次，每次-20℃贮存48小时。将提取液加热到85℃，10分钟。离心去除沉淀蛋白，取上清液。离心液用截留分子量为1万的超滤柱进行超滤，得滤液2600ml。测定胸腺肽含量为1.2mg/ml，胸腺素α1的含量为1.1％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.5mg/ml，(E-RFC％)活性增加20％。
权利要求
1.一种绵羊胸腺肽的制备方法，包括原料处理、热变性除杂蛋白处理、碱除杂蛋白处理，其特征在于以绵羊胸腺肽为原料；原料处理过程为将绵羊胸腺组织在1～4倍体积，pH为2.0～5.0的酸性缓冲液中，捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞，低温抽提1～4小时。
2.按照权利要求1所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于，所述热变性除杂蛋白处理过程为将原料处理后的蛋白质粗提液用电磁炉隔水加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液，除去变性蛋白所述碱除杂蛋白处理过程为用碱调经热变性除杂蛋白处理后的上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白；用酸调上清液至pH6.0～7.5，离心取上清液，经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液。
3.按照权利要求2所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所得滤液，进一步纳滤浓缩，过滤除菌制成水针剂或加赋形剂冻干。
4.按照权利要求1所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述原料处理过程中，酸性缓冲液选择为乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸等酸的钠盐或钾盐，浓度为20～150mM。
5.按照权利要求1所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述原料处理过程中，缓冲液体积为2倍，pH值为3.0。
6.按照权利要求1所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述原料处理过程中，低温抽提时间为2小时。
7.按照权利要求2所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述碱除杂蛋白处理过程中，碱选择为氨水，钠、钾碱，或钠、钾弱酸盐。
8.按照权利要求7所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于碱为氨水或氢氧化钠。
9.按照权利要求2所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述碱除杂蛋白处理过程中，酸选择为盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸、或硫酸。
10.按照权利要求9所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于酸为盐酸。
全文摘要
一种绵羊胸腺肽的制备方法，包括原料处理、热变性除杂蛋白处理、碱除杂蛋白处理，其特征在于以绵羊胸腺肽为原料；原料处理过程为将绵羊胸腺组织在1～4倍体积，pH为2.0～5.0的酸性缓冲液中，捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞，低温抽提1～4小时。本发明方法收率高，生产周期短，并且所生产出的绵羊胸腺肽具有较高的活性/重量比。
文档编号A61K38/00GK101062059SQ20061004638
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月25日 优先权日2006年4月25日
发明者薛百忠, 王宏英, 徐梅, 薛雁, 沈文彧, 兰海英, 刘鹏辉, 苏珊, 李淼, 刘宏大 申请人:沈阳守正生物技术有限公司