专利名称：一种新的线纹芋螺毒素序列、制备方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种新的中国南海线纹芋螺毒素基因及其编码的多肽序列S6.8和该多肽的制备技术，以及该毒素在神经生物学研究和离子通道药物开发中的应用。
背景技术：
芋螺属于腹足纲芋螺科(Conidae)，栖息在热带海洋的浅海水域，因外形呈圆锥形或芋头状而得名。芋螺具有强大的自然进化能力，单一种属中就包括有数百种物种，这种能力使芋螺成为了海洋无脊椎动物中进化最成功的生物。芋螺的猎食装置形态与其毒液化学成分也在自然进化过程中不断进化发展，以适应不同的栖息环境与捕食对象，构成了极富多样化的形态。芋螺食物种类很广，根据其捕食习性分为食鱼芋螺、食螺芋螺、食虫芋螺。芋螺毒液的毒性很强，人被刺伤时亦常导致严重伤害，甚至死亡，国内外报道过多例由织锦芋螺(C.textile)、地纹芋螺(C.geographus)等刺伤致死的事例。
芋螺毒液是捕食与防御作用的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物，即芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常为由10～30个氨基酸残基组成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架，使之形成高度限定的立体构象。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素比较，芋螺毒素的肽链短得多，二硫键丰富，分子结构更为紧密，但是生物活性却很高。大多数芋螺毒素均由单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽前体，约为70-120个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到成熟肽。
二十世纪八十年代初，美国犹它大学Olivera BM学者实验室最早展开了芋螺毒素全面系统研究工作。现在，芋螺毒素以其分子小，结构稳定，对受体作用范围广并且活性强的特点，已经跃居于动物神经毒素研究的首位。由于它们作用靶点广泛，能高度特异地结合细胞膜上神经递质和激肽的受体和各种离子通道，一方面，可以被直接开发成药物或作为新药的先导化合物应用于临床；另一方面，可以成为神经生物学中发现鉴定新受体，研究受体构效关系及其调控细胞分子机理的重要探针，并推动了离子通道的进化研究。
至今，已经得到分离的芋螺毒素有近千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的ω-CTX M VIIA(SNXIII，商品名Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了III期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于ω-CTX C VID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。芋螺毒素药用研究的其他方向还有具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素，可用于治疗抑郁症。以及抑制α1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗良性前列腺过度增生引起的尿失禁。与此同时，围绕着增强药物分子的稳定性，降低过敏反应以及增加溶解性以利于口服目的的分子改造研究工作也正在进行。利用高通量筛选手段，以ω-conotoxin芋螺毒素分子为参考的一系列有机小分子得到了设计合成，显示了良好的应用前景。
另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。
芋螺在我国南海等海域亦有广泛分布，已查明的芋螺约有80余种。近年来，国内也开展了芋螺毒素的生物化学、分子生物学以及药理作用等方面的研究工作。中国科学院北京药物化学研究所的陈冀胜研究员等人已自桶形芋螺(C.betulinus)、独特芋螺(C.caracteristileus)、菖蒲芋螺(C.vexillum)、地纹芋螺(C.geographus)等类芋螺中分离鉴定了十余种新序列的芋螺毒素。军事医学科学院生物工程研究所的卢柏松、黄培堂以及戴秋云等着重对我国的线纹芋螺、织锦芋螺的毒素基因或毒液成份进行了研究，从中也发现了一些新的毒素成分和基因序列。虽然我国有着丰富的芋螺资源，但由于起步较晚，目前对于芋螺毒素的研究尚处于初期阶段。
线纹芋螺(Conus striatus)是我国海南可采到的少数食鱼芋螺种类之一，其毒液对人类有伤害作用。由于其分布较多，形体较大，毒管组织分离提取较为容易，毒素成分对于高等动物作用较为明显，因而成为众多学者们在多肽化学、分子生物学、毒理学、生态学等多领域的研究热点。目前，从线纹芋螺毒素中已得到分离鉴定研究的毒素包括2种ω-家族芋螺毒素(SVIA和SVIB)、3种α-家族芋螺毒素(SI，SIA，SII)、2种κA-家族芋螺毒素(κA-SIVA和κA-SIVB)、1种δ家族-芋螺毒素(SVIE)、一种μ-家族芋螺毒素(SIIIA)。尽管线纹芋螺毒素已有近五十年的研究历史，近来仍然有新的毒素成分被陆续发现报道。
由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白质结构及功能方面差异较大，具有种类繁多，结构复杂和高度遗传多样性特征。构建芋螺毒素cDNA文库，从中筛选新毒素基因仍然是研究新芋螺毒素及其分子特征的重要途径之一。迄今为止，国外已构建了多种芋螺的cDNA文库，而国内尚未有相关报道。
另外，目前有关芋螺毒素的生化结构及其神经药理活性的研究都是基于天然提取毒素的分子结构，用人工合成的毒素来研究的。虽然已克隆到很多芋螺毒素基因，但目前鲜有芋螺毒素基因体外表达的报道。重组芋螺毒素将以其质优、价廉的优势，代替产率低、成本昂贵的人工合成毒素。开展芋螺毒素体外表达技术的研究，将具有非常重要的理论研究价值和应用价值。
因此，开展我国南海线纹芋螺毒素的生物化学、药理学等，尤其是其分子生物学和基因工程技术领域的探索研究将有助于对新毒素分子相应受体及其作用机制的深入研究，而且可为我国芋螺海洋资源的药用开发利用提供重要理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的中国南海线纹芋螺毒素基因及其编码的多肽片段S6.8及其类似物和衍生物。
本发明的另一目的在于提供该多肽的生产方法。
本发明的第三个目的在于提供该多肽在制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病药物中的应用。
通过cDNA文库的构建和测序的方法，从中国南海线纹芋螺毒管中分离得到新的O-超家族芋螺毒素S6.8基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本发明基因所编码的多肽S6.8，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；其成熟肽的分子量为2,746道尔顿，其理论等电点为4.35。
该蛋白通过原核细胞融合表达载体pTRX在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。
所述表达载体pTRX(申请人自行构建并申请中国专利，专利名称为一种高效原核表达载体，专利号00124832.4，授权公告号1189565C)是以硫氧还蛋白为融合伴体，中间插入His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体。
该重组线纹芋螺毒素S6.8可明显延迟脊椎动物大脑神经元细胞膜钠离子通道的失活，从而延长钠离子通道的开放时间。
本发明所选择的线纹芋螺采自海南省三亚市。
线纹芋螺毒管cDNA文库的构建取活螺体，使用喉闸破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，提取总RNA。反转录为一链cDNA后合成双链cDNA，双链cDNA与pcDNA3.0载体连接后转化E.coli，并保存每个重组克隆。
本发明通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码芋螺毒素的克隆，命名为S6.8(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码78个氨基酸残基，包括有25个氨基酸的信号肽、26个氨基酸的前导肽和27个氨基酸的成熟肽。其信号肽序列和成熟肽的半胱氨酸排布与O-超家族芋螺毒素其它成员具有较高的保守性。前导肽和成熟肽的氨基酸与δ-家族芋螺毒素成员相似性更高。成熟肽段分子量为2,746道尔顿，其理论等电点为4.35。
本发明通过设计了一对引物，将编码新毒素S6.8的成熟肽基因克隆到原核融合表达载体pTRX上(本实验构建)，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pTRX-S6.8)以T7为启动子，TRX为分子融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，利于外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，TRX-S6.8融合蛋白的表达量较高，绝大部分处于可溶状态。
本发明还摸索和优化了重组S6.8蛋白的酶切和纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到融合蛋白，融合蛋白经3C蛋白酶切割、超滤和反相高效液相层析，可得到纯度在95％以上的重组S6.8多肽的成熟肽。
电生理实验结果证实，重组线纹芋螺毒素S6.8可以特异性作用于脊椎动物大脑神经元细胞膜钠通道，明显延迟钠通道的失活，延长钠离子通道的开放时间。因此本发明的重组芋螺毒素S6.8可以用于制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病的药物。
本发明的表达质粒复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecularcloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基培养转化菌株，碱法提取质粒。
图1为线纹芋螺毒素S6.8成熟肽与不同种的O-超家族芋螺毒素成熟肽序列同源性分析结果。其中加黑和阴影表示相同氨基酸。
图2为线纹芋螺毒素S6.8基因PCR产物的2.5％琼脂糖凝胶电泳分析结果。1DL2000DNA分子量标准；2S6.8基因PCR产物；3PCR反应阴性对照。
图3为pTRX-S6.8融合表达质粒的构建流程示意图。
图4为pTRX-S6.8重组表达载体PCR鉴定2.5％琼脂糖凝胶电泳分析结果。1DL2000DNA分子量标准；2重组表达质粒pTRX-S6.8的PCR产物；3PCR反应阳性对照4PCR反应阴性对照。
图5为pTRX-S6.8重组表达载体酶切鉴定2.5％琼脂糖凝胶电泳分析结果。11Kb DNA分子量标准；2重组表达质粒pTRX-S6.8；3重组表达质粒pTRX-S6.8经KpnI和NotI双酶切产物。
图6为重组线纹芋螺毒素TRX-S6.8诱导表达和亲和层析纯化Tricine SDS-PAGE电泳分析结果。1蛋白分子量标准；2诱导后的菌体超声上清；350mMTris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑亲和层析洗脱峰；450mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，50mM咪唑亲和层析洗脱峰；550mM Tris-HCl(pH8.0).0.5MNaCl，150mM咪唑亲和层析洗脱峰；650mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，200mM咪唑亲和层析洗脱峰；750mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，250mM咪唑亲和层析洗脱峰。
图7为重组线纹芋螺毒素TRX-S6.8酶切后超滤及反相高效液相色谱纯化TricineSDS-PAGE电泳分析结果。1超低蛋白分子量标准；2TRX-S6.8蛋白酶切后产物；310kDa超滤膜内组分；4浓缩后10kDa超滤膜外组分；51kDa超滤膜外组分；6保留时间为14.250min的高效液相洗脱峰；7保留时间为18.569min的高效液相洗脱峰。
图8为重组线纹芋螺毒素S6.8的反相高效液相色谱分离图谱。
图9为重组线纹芋螺毒素S6.8对SD大鼠乳鼠海马神经元细胞钠电流峰值电流-电压关系的影响结果。
图10为重组线纹芋螺毒素S6.8作用前后钠离子通道最大开放曲线单指数拟合曲线。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1线纹芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定总RNA的提取和cDNA合成分离线纹芋螺毒管，参照Gibco BRL公司的TRIZOL试剂说明书进行毒管总RNA提取。取1μg线纹芋螺毒管总RNA以SMARTIII olignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDS III/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′)进行逆转录合成第一链，得到10μl cDNA第一链产物。2μl第一链产物以5’PCR primer(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)，CDS III/3’PCR primer(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N-3’)进行第二链扩增。将第二链蛋白酶K消化并纯化后进行Sfi I切割，连接入同样Sfi I酶切处理过的pcDNA3.0文库载体(购自Invitrogen公司)上。反应体系5μl，转化其中1μl，取1/200、1/100和2/100体积转化液分别涂板，其余用于摇总库菌落。从平板中挑取单克隆保种并随机挑取一定数目的单克隆进行测序和生物信息学分析。
实施例2线纹芋螺毒素S6.8基因的序列分析线纹芋螺毒素S6.8基因的质粒和序列来自实施例1文库中strivd4(QID)的基因簇。对其进行生物信息学分析，结果显示其cDNA全长序列长度为601bp，其读码框编码78个氨基酸残基，包括有25个氨基酸的信号肽、26个氨基酸的前导肽和27个氨基酸的成熟肽。其信号肽序列和成熟肽的半胱氨酸排布(C-C-CC-C-C)与O-超家族芋螺毒素其它成员具有较高的保守性。前导肽和成熟肽的氨基酸分析显示其与δ-家族芋螺毒素成员相似性更高(见图1)。进一步分析显示，线纹芋螺毒素S6.8基因编码的成熟肽段含有较少的带电氨基酸，疏水性程度与δ-家族芋螺毒素成员最为接近。该家族毒素可以通过折叠在表面形成疏水性区域与通道蛋白的疏水部分结合，从而特异作用于脊椎动物的Na+通道，延迟通道的失活。物理化学性质预测线纹芋螺毒素S6.8成熟肽分子量为2,746道尔顿，理论等电点为4.35。预测显示该小肽体外存在的稳定性较差，不宜分泌表达。三级结构预测，S6.8成熟肽分子呈球状，构成三对二硫键，主要由短的反向β-折叠和一些转角所构成，不含有α-螺旋。三级结构骨架与其它已知的O-超家族芋螺毒素的结构相类似。
实施例3重组线纹芋螺毒素S6.8表达质粒的构建根据S6.8基因编码成熟肽的氨基酸序列和大肠杆菌的密码子偏好性，设计并合成PCR反应的模板，并结合pTRX质粒(申请人自行构建并申请中国专利，专利名称为一种高效原核表达载体，专利号00124832.4，授权公告号1189565C)的多克隆位点，设计S6.8基因片段的扩增引物，如下所示。在上游引物中引入Kpn I酶切位点以及ProScission Protease切割位点，下游引物中引入Not I酶切位点及双终止密码了。PCR产物经卸Kpn I和Not I酶切与pTRX载体相连后，TRX基因、6个组氨酸序列、蛋白酶PreScission Protease识别位点序列、S6.8基因编码成熟肽的核苷酸序列和终止子TTA TAA融合在一起，并构成一个完整的读码框。
PCR反应S6.8基因的成熟肽模板5’GAT GGT TGC TCG AAC GCT GGT GGC TTT TGC GGC ATT CAT CCAGGT CTG TGT TGT AGC GAG ATT TGC TTG GTG TGG TGT ACG 3’上游引物5’CGGGGT ACC GATKpn I 3C Precision Protease siteGGTTGCTCGAACGCT 3’S6.8下游引物5’ATTTGCGGCCGC CGTACACCACACCAAGC 3’Not I stop codon S6.8以合成的S6.8成熟肽基因为DNA模板，经PCR扩增出的S6.8基因片段(含限制性内切酶酶切位点和蛋白酶PreScission Protease识别序列)约为120bp，与预期PCR产物大小一致(见图2)。扩增产物用Kpn I和Not I酶切后，克隆进线性载体pTRX，构建融合表达质粒pTRX-S6.8，其构建过程见(见图3)。表达载体经PCR鉴定(见图4)和酶切鉴定(见图5)，片段大小正确。对重组质粒进行双向测序，其序列与合成的模板序列结果完全一致，说明合成的引物与PCR扩增的S6.8基因无误，插入表达载体的S6.8基因的读码框正确。
实施例4重组线纹芋螺毒素S6.8的表达将pTRX-S6.8转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与软件预测的理论值17kD相符(见图6)。
在其他条件不变的情况下，经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索，确定在大量表达重组线纹芋螺毒素TRX-S6.8时采了20℃的低温诱导，0.05mM IPTG诱导10hr左右的优化方案。
实施例5重组线纹芋螺毒素S6.8的纯化将诱导表达后的培养菌液在4℃，6,000rpm/min离心5分钟，菌体先用TE缓冲液(pH8.0)重悬，离心，再用预冷的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl溶液洗涤菌体，超声处理后，裂解上清液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析一步纯化。收集穿流峰，分别用不同浓度咪唑(20mmol/L、50mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L)的50mM Tris(pH8.0)，500mmol/L Na Cl缓冲液洗脱至平台期，分别收集洗脱峰进行Tricine SDS-PAGE检测。结果表明，重组TRX-S6.8蛋白主要集中于150-250mmol/L的咪唑洗脱峰中，在250mmol/L咪唑洗脱峰中融合蛋白的含量达70％以上(见图6)。
实施例6重组线纹芋螺毒素S6.8的酶切通过Ni2+Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析所得到的纯化的融合蛋白，通过Sephadex G-25以除去咪唑并更换缓冲液为酶切缓冲液，进行酶切。从酶量、酶切温度、酶切时间、酶切缓冲液等方面进行了酶切条件的优化，确定最佳条件为50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.2mmol/L DTT(pH8.0)酶切缓冲液中20℃酶切作用16hr。
实施例7重组线纹芋螺毒素S6.8酶切后纯化分别使用了切割分子量(MWCO)为10kDa和1kDa的超滤膜来进行样品的分离和浓缩处理。电泳结果显示，10kDa的超滤膜可以有效地拦截住分子量大于10kDa的大蛋白，从而将绝大部分的杂蛋白拦截在膜内(见图7)。将浓缩后的样品，采用C18反向柱进行梯度洗脱分离。流动相AH2O(含0.1％TFA)B乙腈(0.1％TFA)，流速0.8ml/min。检测215nm处的紫外吸收值，三个洗脱峰的保留时间分别为10.296min、14.250min和18.569min(见图8)，分别收集洗脱峰，并进行了鉴定。飞行时间质谱和生物学活性鉴定结果显示，保留时间为14.250min的洗脱峰中组分的为正确折叠的重组多肽。
实施例8重组线纹芋螺毒素S6.8生物学活性检测腹腔注射不同浓度20μl的重组线纹芋螺毒素S6.8溶液之后，金鱼在15-20min之内出现不同程度的异常行为，记录见表1。
表1为腹腔注射重组线纹芋螺毒素S6.8溶液后金鱼的行为记录
注高剂量为50nmol/g；中剂量为5nmol/g；低剂量为500pmol/g；阴性组注射20μl的生理盐水。
实施例9重组线纹芋螺毒素S6.8对钠离子通道的作用以SD大鼠乳鼠海马神经元细胞为实验标本，应用全细胞膜片钳模式进行全细胞电流的记录。对照组和实验组分别记录的是使用0.1μM毒素前后在梯度去极化条件下的全细胞钠电流。钳制电压为-70mV，刺激电压从-70mV至+40mV，脉冲间隔为10mV，刺激电压的脉冲宽度为15ms。实验记录结果见图9，与对照组相比，毒素能够明显增大细胞内向钠电流。使用单指数拟合的方法对毒素作用前后钠通道在最大激活电压-20mV下的最大开放曲线进行拟合，得到各项参数如表2，绘制拟合曲线如图10。计算结果显示，毒素作用前后钠通道开放时间由0.40±0.02ms延长至0.52±0.01ms。由此可见，重组线纹芋螺毒素S6.8可以明显延迟通道的失活，从而延长钠通道的开放时间。
表2重组线纹芋螺毒素S6.8作用前后钠离子通道最大开放曲线单指数方法拟合得到的各项参数
序列表<110>中山大学<120>一种新的线纹芋螺毒素序列、制备方法及其应用<160>2<210>1<211>234<212>DNA<213>中国南海线纹芋螺(Conus striatus)<220>
<221>precursor peptide<222>(109)…(345)<400>11 gaggcaacag tgacacgtgt atcacatcgt ctgtctgatc ttgcacggt gaacttggtt tcatatttct7071 ccactgtctt ctttggcatc acccaaaaca tcaccaag109ATGAAA CTG ACG TGC ATG ATG ATC GTT GCT GTG CTG TTC TTG ACC GCC TGG ACA TTC GTC 1681 M K L T C M M I V A V L F L T A W T F V 20169 ACG GCT GAT GAC TCC AGA AAT GGA CTG AAG AAT CTT TTT CCG AAG GCA CGT CAT GAA ATG 22821 T A D D S R N G L K N L F P K A R H E M 40229 AAG AAC CCC GAC GCC TCT AAA TTG AAC AAG AGA GAT GGG TGC TCT AAT GCT GGT GGA TTT 28841 K N P D A S K L N K R D G C S N A G G F 60289 TGT GGC ATC CAT CCA GGA CTC TGC TGC AGC GAG ATT TGC CTG GTT TGG TGC ACA TGA 34561 C G I H P G L C C S E I C L V W C T * 79346 gtgctattct actggtacat tttgtggctt caacggagga ctctgctgca gcaacctttg cttatttttc 415416 gtgtgcttaa cattttcgtg atgtcttcta ctcccctctg tgctacctgg cttgatcttt gattggcgcg 485486 tgcccttgac tgattatgaa cccccctgat ccgactgtct ggaggcctca ggggtccaac atccaaataa 555556 agcgacatca taatgacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa
<210>2<211>78<212>PRT<213>中国南海线纹芋螺(Conus striatus)<220>
<221>precursor peptide<222>(1)…(78)<400>21 M K L T C M M I V A V L F L T A W T F V 2021 T A D D S R N G L K N L F P K A R H E M4041 K N P D A S K L N K RD G C SN A G G F6061C G I H P G L C C S E I C L V W C T*79
权利要求
1.从中国南海线纹芋螺毒管中分离得到基因，其核苷酸序列如序列表中<400>1序列所示。
2.一种多肽，其含有权利要求1所述基因编码的氨基酸序列、或其保守性变异多肽序列或其活性衍生物。
3.按权利要求1所述的多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列如序列表400<2>所示。
4.权利要求3所述的多肽的成熟肽片段DGCSNAGGFCGIHPGLCCSE ICLVWCT。
5.编码权利要求4所述的多肽片段的核苷酸序列。
6.权利要求4所述的成熟肽片段的C末端酰胺化、或脯氨酸羟化修饰物。
7.权利要求4所述的多肽的生产方法，按照以下步骤进行(1)将编码权利要求4所述的成熟肽基因克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)；(2)培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)；(3)对大肠杆菌BL21(DE3)进行超声裂解，将表达产物的裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到融合蛋白；(4)融合蛋白经3C蛋白酶切割、超滤和反相高效液相层析，得到重组S6.8多肽的成熟肽。
8.权利要求2、3、4或6所述多肽用于制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的中国南海线纹芋螺毒素基因及其编码的多肽序列S6.8，该多肽的制备技术，以及该毒素在神经生物学研究和离子通道药物开发中的应用。本发明通过构建cDNA文库的方法，从中国南海线纹芋螺毒管中克隆得到的新的O－超家族芋螺毒素，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的多肽(芋螺毒素S6.8)，其前体肽和推测的成熟肽氨基酸序列如序列表<400>2序列所示。本发明制备的重组线纹芋螺毒素S6.8可明显延迟脊椎动物大脑神经元细胞膜钠离子通道的失活，从而延长钠离子通道的开放时间，可作为探针用于离子通道类型及亚型的分类鉴定或者作为先导化合物用于新药的研制开发。
文档编号A61K38/17GK1982457SQ200610035328
公开日2007年6月20日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者徐安龙, 刘芸, 王磊, 董美玲 申请人:中山大学