专利名称：氨基酸改性壳聚糖亲核no供体及其合成方法
技术领域：
本发明涉及一种医药工程技术领域的药物及其合成方法，具体是一种氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体及其合成方法。
背景技术：
在最近的十年中，国外对基于含有[N(O)NO]-官能团的NO供体控释材料进行了大量的研究。最初的研究集中于将离子型的亲核NO供体NONOate分散于各种疏水性聚合物中，通过NO的释放增强这些材料的血液相容性。虽然这些研究取得了相当大的成功，但是研究发现，亲水性的NO供体会从聚合物中渗出，在血液中形成致癌性的N-亚硝胺物质。将这类材料应用于临床，还必须考虑以下几点作为聚合物基体材料的生物相容性和生物可降解性。亲核试剂的细胞毒性和生物相容性。有一些[N(O)NO]-基团载体如二乙烯三胺发现对身体有害；聚乙烯亚胺(PEI)会诱导广泛的细胞死亡，生物相容性较差。因此选用无毒的有良好生物相容性的NO载体引起人们的关注。其中的解决办法之一就是采用对身体无害的具有仲胺基团的亲核载体如聚氨基酸、小分子多肽。
氨基酸是生物体内大量存在的同时具有氨基和羧基的双官能团生命小分子配体。氨基酸是合成人体蛋白质、激素、酶及抗体的原料，参与人体内正常的代谢和生理活动。而且，氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系，L-半胱氨酸能增强生物体的抗病能力等。因此目前，聚氨基酸类材料在药物控制释放方面的应用又引起了广泛的关注。氨基酸在人体内通过酶的作用，参与新陈代谢，营养物质被人体吸收，代谢产物为无机小分子，由排泄系统排出体外，所以具有良好的生物相容性。
经对现有技术的文献检索发现，Bohl等在《Biomaterials》(生物材料)(2000，212273-2278)上发表了“Nitric oxide-generating polymers reduceplatelet adhesion and smooth muscle cell proliferation”(NO产生聚合物减少血小板粘附和平滑肌细胞增殖)，该文提出了采用氨基酸对具有光学活性的聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)改性使其具有亲核的NH基团。同NO反应后，得到一系列不同半衰期的NO释放凝胶材料。其不足之处在于所用的基体材料生物相容性欠佳，由于基体材料的水溶性不能制备机械性能良好的薄膜和涂层。
美国专利USP6261594(Chitosan-based nitric oxide donor compositions)以及USP6451337(Chitosan-based nitric oxide donor compositions)提出了将改性壳聚糖作为亲核NO载体，合成出系列壳聚糖-NO加成物。壳聚糖的具体的改性分为两类(1)亲水基团改性N-羧丁基壳聚糖，N-羧乙基壳聚糖，N-羧甲基壳聚糖。(2)疏水性基团改性N-丙基壳聚糖，N-羧乙基壳聚糖甲酯。其不足之处在于改性壳聚糖的生物相容性差，NO的负载程度较低。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体及其合成方法。本发明采用氨基酸对壳聚糖进行改性，从而提供更多的亲核位点，提高NO的负载量，同时通过壳聚糖和氨基酸这两种都具有良好生物相容性的材料的结合，有助于解决此类NO供体药物应用于临床存在的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体，壳聚糖作为基体材料，采用氨基酸改性增加其亲核位点(NH基团)，与NO反应产生[N(O)NO]-官能团，分子结构如下
其中[N(O)NO]-官能团为NH基团同NO反应形成，NH基团来自于氨基酸的氨基NH2或壳聚糖分子结构中的氨基NH2改性反应；R为直链或支链的烷基。
当氨基酸在壳聚糖的C6位上发生反应时，氨基酸分子上的氨基NH2与C6位羧化壳聚糖分子上的COOH反应，形成NH位点，与NO反应形成[N(O)NO]-基团。
当氨基酸在壳聚糖的C2位发生反应时，氨基酸分子上的羧基和壳聚糖分子中的氨基NH2反应形成NH位点，与NO反应形成[N(O)NO]-基团。
本发明所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，可以采用以下两种中的任意一种方法(1)在C6位点引入氨基酸。将C6-O羧化壳聚糖的羧基COOH先用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)或EDC进行活化，再同氨基酸的氨基(NH2)反应，可制得C6位点氨基酸改性壳聚糖。将改性产物同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行高压反应(Na+/NH≥3)，压力为5-10atm，室温反应3-7天，产生[N(O)NO]-基团。
方法(2)在C2位点引入氨基酸。将氨基酸的羧基先用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)或EDC进行活化再同壳聚糖分子上的氨基(NH2)反应，可制得C2位点氨基酸改性壳聚糖。将改性产物同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行高压反应(Na+/NH≥3)，压力为5-10atm，室温反应3-7天，产生[N(O)NO]-基团。
所用壳聚糖的粘均分子量为1-100万，脱乙酰度50-100％。
所用羧化壳聚糖分子的羧化取代度为1.1，以C6-O羧甲基壳聚糖为主。
所用的氨基酸包括甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等常见的酸性、碱性和中性氨基酸。
本发明制备的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体，可以制备成能够释放NO分子的药物膜、微球、纳米球，可广泛的应用于治疗心血管系统疾病，肺部高压，促进伤口愈合，有效的预防成型术后再狭窄，提高医疗装置的抗血栓性能。
具体实施例方式
本发明合成方法的合成路线如下方法(1)在C6位点引入氨基酸(以甘氨酸(中性)GLY和赖氨酸(碱性)LYS为例)羧基活化
方法(2)在C2位点引入氨基酸因氨基酸中也存在羧基，先将氨基酸中的羧基活化，再与壳聚糖中的2号碳位的-NH2反应。
以下结合本发明技术内容提供实施例实施例1在C6位点引入甘氨酸羧甲基壳聚糖的制备将壳聚糖15g和异丙醇200ml加入三颈瓶中，搅拌使壳聚糖均匀分散在异丙醇中，将10mol/L NaOH溶液50ml分为5份，每隔30min加入一份，室温搅拌1小时，得反应物淤浆。将24g固体氯乙酸溶于70ml异丙醇中，分4次加入反应物淤浆中。加完后将反应物用水浴加热到70℃，控温下开启回流冷凝装置，搅拌2小时。停止后用冰醋酸调节pH值到7-8，析出大量浅黄色絮状沉淀，真空抽滤，得黄色固体，并用甲醇洗涤3次，将所得黄色固体真空干燥1天，温度为60℃。
羧甲基壳聚糖的活化将羧甲基壳聚糖(CMCS)加入反应器中，然后加入溶剂(水，乙睛，醇)，搅拌使羧甲基壳聚糖充分溶解。已溶解的N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide NHS)水溶液和二环己基碳二亚胺(Dicuclohexylcarbodiimide DCC)醇溶液分别加入上述溶液，在上述反应体系中，CMCS∶NHS∶DCC的摩尔比为1∶1.5∶1。室温搅拌24h得乳黄色混浊液。过滤后，将白色固体用有机溶剂充分洗涤后真空干燥，然后将滤液中的反应物再次沉淀出来后洗涤、真空干燥备用。
甘氨酸改性羧甲基壳聚糖称取摩尔比为1∶1的甘氨酸和已活化的羧甲基壳聚糖加入0.05mol/L的NaHCO3缓冲溶液中，搅拌反应1天后得淡黄色溶液。将所得溶液浓缩后，透析三天，冷冻干燥后得白色纤维状物质。
甘氨酸改性壳聚糖FTIR1650-1655cm-1(酰胺I)，1560cm-1(酰胺II)，1600cm-1(-COONa)，13C NMR176.0ppm，-COOH；43.0ppm，-CH2-，1H NMR4.22(1H)，2.52(2H)，3.91(3H)，3.0-3.3(4H，5H，6H)，1.42(7H)，4.33(8H)，3.62(9H)实施例2在C6位点引入赖氨酸称取摩尔比为1∶1的赖氨酸和实施例1中已活化的羧甲基壳聚糖加入0.05mol/L的NaHCO3缓冲溶液中，搅拌反应1天后得淡黄色溶液。将所得溶液浓缩后，透析三天，冷冻干燥后得白色纤维状物质。
赖氨酸改性壳聚糖FTIR1730cm-1(-COOH)，1630cm-1和1514cm-1(NH3+)，1415cm-1(-CH2和-CH3)，2928cm-1(-CH2)。1H NMR4.33(8H)，3.41(9H)，1.05(10H)，0.88(11H)，2.35(12H)，3.60(13H).
实施例3在C2位点引入氨基酸因氨基酸中也存在羧基，先将氨基酸中的羧基活化，再与壳聚糖中的2号碳位的-NH2反应。将氨基酸溶于100ml水醇(2∶1)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应1h，加入二环己基碳二亚胺(DCC)的醇溶液，室温反应24h。在上述反应体系中，氨基酸∶NHS∶DCC的摩尔比为1∶1.5∶1。取定量的壳聚糖(氨基酸∶壳聚糖摩尔比1∶1)溶于0.1M醋酸溶液在搅拌下滴加入上述溶液中，室温反应24h，将所得溶液浓缩后，透析三天，冷冻干燥后得白色纤维状物质。
FTIR1650cm-1(酰胺I)，1560cm-1(酰胺II)，1310cm-1(酰胺III)；1H NMR3.53(8H)实施例4氨基酸改性壳聚糖负载NO反应将CH3ONa(1.5g，13.9mmol)溶于50ml甲醇中制备甲醇钠溶液，然后将氨基酸改性后的壳聚糖(1g，4.5mmol)悬浮于该溶液中，需要满足Na+/NH≥3。将其置于高压反应釜中，在5atm的NO压力下反应，每天通NO 60min，反应3天后，过滤用乙醚洗涤产物，常温真空干燥，贮存于密闭干燥器中，温度为-20℃。
对于含有[NONO]-的官能团，最有效的表征方法是紫外特征吸收取少量产物溶于0.1M的NaOH溶液中，测得[NONO]-的官能团特征吸收256nm。
NO释放性能研究氨基酸改性壳聚糖产物因为引入了羧基，因此水溶性较好，试验研究显示，其在酸性和碱性溶液中都具有较好的溶解性。将其放入透析袋中测定其NO的释放过程。对释放曲线进行函数拟合，求出其释放半衰期。对于C6GLYCS/NO释放总量为423nmol/mg，半衰期为0.143h；C6LYSCS/NO，释放总量为327nmol/mg，半衰期为0.223h；C2GLYCS/NO，释放总量为310nmol/mg，半衰期为0.311h。
从上述数据可以看出C6位点改性壳聚糖NO亲核供体的释放量大于C2位点改性壳聚糖NO亲核供体，但半衰期却明显小于C2位点改性壳聚糖NO亲核供体。C6位点甘氨酸改性壳聚糖NO的释放量大于赖氨酸改性壳聚糖NO的释放量，半衰期则是赖氨酸改性壳聚糖大于甘氨酸改性壳聚糖。
权利要求
1.一种氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体，其特征在于壳聚糖作为基体材料，采用氨基酸改性增加其NH亲核位点，与NO反应产生[N(O)NO]-官能团，分子结构如下 其中[N(O)NO]-官能团为NH基团同NO反应形成，NH基团来自于氨基酸的氨基NH2或壳聚糖分子结构中的氨基NH2改性反应；R为直链或支链的烷基。
2.根据权利要求1所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体，其特征是当氨基酸在壳聚糖的C6位上发生反应时，氨基酸分子上的氨基NH2与C6位羧化壳聚糖分子上的COOH反应，形成NH位点，与NO反应形成[N(O)NO]-基团。
3.根据权利要求1所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体，其特征是当氨基酸在壳聚糖的C2位点发生反应时，氨基酸分子上的羧基和壳聚糖分子中的氨基NH2反应形成NH位点，与NO反应形成[N(O)NO]-基团。
4.一种如权利要求1所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，其特征在于C6位点或C2位点氨基酸改性壳聚糖分子上的NH基团同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行反应，其中Na+/NH≥3，压力为5atm，室温反应3天，产生[N(O)NO]-基团，得到含有[N(O)NO]-基团的亲核NO供体。
5.根据权利要求4所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，其特征是，NH基团来自于壳聚糖的氨基和羧化壳聚糖的羧基与氨基酸的羧基或氨基反应后形成。
6.根据权利要求4所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，其特征是，C6位点氨基酸改性壳聚糖的制备是将C6位羧化壳聚糖的COOH先用N-羟基琥珀酰亚胺NHS和二环己基碳二亚胺DCC或EDC进行活化再同氨基酸的氨基NH2反应制得。
7.根据权利要求4所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，其特征是，C2位点氨基酸改性壳聚糖的制备是将氨基酸的羧基COOH先用N-羟基琥珀酰亚胺NHS和二环己基碳二亚胺DCC或EDC进行活化再同壳聚糖的氨基NH2反应，制得。
8.根据权利要求6或者7所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，其特征是，所用的氨基酸包括甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
9.根据权利要求6所述的氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，其特征是，用氯乙酸和壳聚糖进行羧甲基反应，产物以C6-O羧甲基壳聚糖为主。
全文摘要
一种氨基酸改性壳聚糖亲核NO供体及其合成方法，属于医药工程技术领域。本发明选择壳聚糖作为基体材料，采用氨基酸改性增加其亲核位点(NH基团)，与NO反应后生成含有[N(O)NO]官能团的亲核NO供体，供体分子结构如下。这类新型的亲核NO供体具有不同的NO释放速率和半衰期，能够克服目前此类NO供体临床应用中存在的难题亲核试剂(多胺)的细胞毒性和致癌性副产物亚硝胺的生成，因此具有重要的临床应用价值和应用前景。
文档编号A61K47/36GK1868544SQ20061002831
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者万锕俊, 高群 申请人:上海交通大学