专利名称：聚乙二醇修饰的神经毒素,其制备方法及用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体地说，涉及一种聚乙二醇修饰的神经毒素、其制备方法及用途。
背景技术：
神经毒素(neurotoxin，NT)是一类单链多肽，可以从金环蛇(Bungarusfasciatus(Schneider))，银环蛇(Bungarus multicinctus multicinctus(Blyth))，眼镜蛇(Naja naja(Linnaeus))及眼镜王蛇(Ophiophagushannah(Cantor))的毒液中分离提纯得到。按照作用靶部位的不同，神经毒素可以分为突触前神经毒素和突触后神经毒素。由于突触前神经毒素的致死活性比突触后神经毒素高得多，所以临床上应用较多的是突触后神经毒素。
目前实测的突触后神经毒素全序列有100多个。它们的分子量大约为6800，多为碱性蛋白，等电点在9～10之间，不具有酶活性，功能单一，只作用于乙酰胆碱受体。其中的短链神经毒素含60-62个氨基酸残基及4个二硫键，长链神经毒素含65-74个氨基酸残基及5个二硫键。序列比较表明，短链神经毒素之间的同源性高达70～95％以上，它们都有明显的氨基酸残基重复的现象，例如QQ，TT，GG等。来源于眼镜蛇毒的短链神经毒素N端序列大都为LECHNNQQ。短链神经毒素是乙酰胆碱的强拮抗剂，它竞争性地结合位于神经-肌肉接头后膜的乙酰胆碱受体(AChRs)，阻止肌肉细胞的去极化，使动物产生松弛性肌肉麻痹，最后因呼吸衰竭而死亡。
中国专利CN104096A和CN1209998A公开了一种来源于眼镜蛇蛇毒神经毒素的制备方法及临床戒毒和止痛的医学用途。长期的临床使用表明，神经毒素对停用或禁戒海洛因、吗啡等后出现的各种生理和精神依赖症状均有一定疗效，且具有无成瘾性、无耐受性的特点。
但是对于人体而言，神经毒素属于异源蛋白，所以在使用过程中同样具有蛋白质药物所共有的特点，如存在免疫原性，半衰期短，稳定性差等。其中由眼镜蛇神经毒素引起的过敏反应已有报道。(刘文，陈慧，郑惠.科洛曲片致过敏性休克.药物不良反应杂志[J].2001，(3)196.)为此，有必要采用蛋白质修饰技术以获得低免疫原性的眼镜蛇神经毒素，从而改善该蛋白质的药物动力学特性，以提高其耐受性和减少给药次数。
目前普遍采用的改造蛋白质分子的方法是大分子化学修饰法。所谓蛋白质的大分子化学修饰，是相对于采用较小分子量的修饰剂去修饰蛋白质而言的。大分子修饰剂，通常指一些人工或天然的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，右旋糖苷(葡聚糖)，人血清白蛋白，肝素，聚赖氨酸，聚丙氨酸，聚乙烯酸和聚乙烯砒咯烷酮等(Lundblad，R.L.Bradshaw，R.A.Applications of Site-Specific Chemical Modification in the Manufacture ofBiopharmaceuticalsI.An Overview.Biotechnol.Appl.Biochem.1997，26143-151.)。其中应用最多、成功率最高的是PEG修饰技术。
用于修饰蛋白质药物的PEG有很多种，包括修饰氨基的烷基化PEG和酰基化PEG，修饰巯基的PEG马来酰亚胺和PEG-邻-吡啶二硫醚等，以及修饰羧基的PEG-酰肼等。典型的修饰反应列举如下 APEG-醛；BPEG-羟基琥珀酰亚胺酯；CPEG-马来酰亚胺；DPEG-酰肼修饰研究中大多数是将多肽分子中的氨基作为修饰位点。
为克服蛇毒神经毒素作为药物使用所存在的不足，采用聚乙二醇修饰技术对神经毒素的氨基进行修饰，以获得聚乙二醇修饰的神经毒素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的神经毒素存在免疫原性，半衰期短，稳定性差等缺陷，采用蛋白质修饰技术以获得低免疫原性的眼镜蛇神经毒素，从而改善该蛋白质的药物动力学特性，以提高其耐受性和减少给药次数，更好地满足神经毒素在临床应用方面的需求。
本发明的一个目的是提供一种聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，神经毒素的氨基上连接有活化的聚乙二醇或其衍生物链。
优选地，所述聚乙二醇修饰的神经毒素具有如下通式结构 其中m为单甲氧基(monomethoxy)的缩写，n＝2～5；R代表去除一个氨基(NH2)的神经毒素分子。
所说的神经毒素包括从蛇毒中提取或用基因工程手段制备的各种神经毒素；优选从眼镜蛇蛇毒中提取。
所说的活化的聚乙二醇或其衍生物是本领域一般技术人员所公知的，并且描述于例如Robert MJ等，先进的药物传递评论(Advanced DrugDelivery Reviews)(2002；54459-476)。优选地，使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯，可采用美国Nektar Therapeutics公司生产的产品。
所说的聚乙二醇链的分子量为2000～100000。
本发明的另一个目的是提供聚乙二醇修饰的神经毒素的制备方法，包括如下步骤在神经毒素溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5-9.5。然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，优选与神经毒素的摩尔比为0.1～100。反应温度优选为4-40℃，反应时间优选为5～120分钟。反应完毕后，将反应混合液优选采用离子交换柱进行色谱分离，用磷酸盐缓冲液将其平衡，用含NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱，即可得聚乙二醇修饰的神经毒素。
举例来说，本发明聚乙二醇修饰的神经毒素可以由下式制得
其中R-NH2为神经毒素。mPEG为CH3O-(CH2CH2O)t-CH2CH2OH其中m＝单甲氧基(monomethoxy)的缩写，t＝44～2200；n＝2～5R代表代表去除一个氨基(NH2)的神经毒素分子。
本发明制备的聚乙二醇修饰的神经毒素为单聚乙二醇修饰的神经毒素，也就是只对1分子神经毒素的1个氨基进行修饰，当然该氨基可以是N末端的氨基，也可以是赖氨酸上的ε-氨基。
本发明的另一个目的是提供聚乙二醇修饰的神经毒素在制备高效低毒的戒毒药物中的应用。
本发明的聚乙二醇修饰的神经毒素可以与任何药学上可接受载体结合，制备成任何药学上可接受剂型的戒毒药物。
本发明的聚乙二醇修饰的神经毒素能够基本保持神经毒素的生物活性，同时它比未修饰的神经毒素有较低的免疫原性、毒性和更好的稳定性，因此作为戒毒药物，它比未修饰的神经毒素有更大的优越性。本发明的聚乙二醇修饰的神经毒素的制备方法，简单易行。
图1是聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素分离纯化图谱。
图2是聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素HPLC分析图谱。
图3是眼镜蛇神经毒素HPLC分析图谱。
图4是聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素的MALDI-TOF-MS图具体实施方式
在具体实施方式
中仅用来源于眼镜蛇蛇毒的一种神经毒素进行说明，但本发明并不限于这种神经毒素。
实施例1
丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)对眼镜蛇神经毒素修饰条件的选择反应温度的选择取1.5mg/ml的眼镜蛇神经毒素溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为8.0，再加入mPEG-SPA-5000固体1.6mg，溶解，混匀，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4℃、10℃、25℃和37℃反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素，其中25℃的修饰率最高。
反应时间的选择取1.5mg/ml的眼镜蛇神经毒素溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为8.0，再加入mPEG-SPA-5000固体1.6mg，溶解，混匀，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后于25℃分别反应5、10、15、30、60、120min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素，其中30min后的修饰率没有明显提高。
mPEG-SPA-5000同眼镜蛇神经毒素的摩尔比的选择取1.5mg/ml的眼镜蛇神经毒素溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为8.0，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别加入mPEG-SPA-5000固体0.016、0.16、1.6、16mg(相当于mPEG-SPA-5000同眼镜蛇神经毒素的摩尔比在0.1~100)，溶解，混匀，反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素，当mPEG-SPA-5000同眼镜蛇神经毒素的摩尔比在10时修饰率已达到最高，进一步增加mPEG-SPA-5000的量修饰率也没有明显地增加。
反应pH值的选择各取0.5mg/ml的眼镜蛇神经毒素溶液2ml，置于6支带塞试管中，分别加2ml不同pH值的磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，再加入mPEG-SPA-5000固体7.0mg，溶解，混匀，于25℃反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件都能得到聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素，其中pH值为8.0时修饰率最高。
实施例2
修饰产物的分离纯化与鉴定取1.1mg/ml的眼镜蛇神经毒素溶液2ml，加磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为8.0，再加入mPEG-SPA-5000固体15.7mg，溶解，混匀，于25℃反应30min，加入100mg甘氨酸终止反应。
取上述反应液，用截流分子量为3000的超滤膜浓缩至15ml，上柱分离。色谱条件如下层析填料Source 30S柱规格2.6×8cm流动相0.02M Na2HPO4-NaH2PO4，pH8.0流速3.0ml/min检测波长215nm收集每管5ml结果得到两个洗脱峰，分别为聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素和眼镜蛇神经毒素，具体结果见图1，图中保留体积38.49ml的峰为聚乙二醇化眼镜蛇神经毒素峰，保留体积为68.96ml的峰为眼镜蛇神经毒素峰。
采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对得到的组分峰进行分析，合并相同组分。色谱条件如下色谱柱Symmetry300TMC45μm；3.9×150mm检测波长215nm流动相A)水/三氟乙酸(100/0.1)B)水/三氟乙酸/乙腈(10/0.1/90)梯度洗脱方法B(0～18min，0％～50％；18min~23min，50％~0％)流速1.0ml/min柱温37℃RP-HPLC分析结果表明得到的聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素和眼镜蛇神经毒素的纯度均在95％以上，具体结果见图2和图3，图中保留时间为12.079min的为聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素，保留时间为8.789min的为眼镜蛇神经毒素。
采用MALDI-TOF对聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素进行分子量测定，结果表明聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素的分子量在12000道尔顿(见图4)，而眼镜蛇神经毒素的分子量为7000道尔顿，二者相差5000左右，这表明该聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素为单修饰，也即是结合了一分子的聚乙二醇。
实施例3聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素稳定性的研究反复冻融稳定性取眼镜蛇神经毒素和聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素(无菌液态，无任何保护剂)，置-28℃冷冻后，于室温下融解，用HPLC法检测其裂解情况。如此反复冻融三次。结果表明，眼镜蛇神经毒素及聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素反复冻融三次后，峰面积均基本保持不变。因此，可以认为聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素保持了眼镜蛇神经毒素抗反复冻融的稳定性。
热稳定性取眼镜蛇神经毒素和聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素(无菌液态，无任何保护剂)，分别置于30℃、40℃、60℃条件下。于第5及第10天取样，用HPLC法检测其裂解情况。结果表明，眼镜蛇神经毒素在60℃下5天时峰面积即有明显减少，而聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素在10天时峰面积未有明显改变。在30℃、40℃时，眼镜蛇神经毒素及聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素10天内峰面积均基本保持不变。因此，可以初步认为聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素可以明显增加眼镜蛇神经毒素的热稳定性。
酶稳定性取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.8)2.7ml，分别加入0.3ml眼镜蛇神经毒素和聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素样品，37℃水浴，于0、0.5、1、2、4h取样0.3ml，测定样品的生物活性。结果表明眼镜蛇神经毒素在0.5h内活性迅速降到原来的20％，而聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素在1h内活性仅降到原来的50％。因此，聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素能明显增加眼镜蛇神经毒素抵抗胰蛋白酶水解的能力。
实施例4聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素与眼镜蛇神经毒素的药效学比较研究对吗啡依赖动物戒断作用的研究
(1)试验方法1、小鼠跳跃试验取小鼠80只，随机分为4组即空白对照组、聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素1、2、3组共4组。各组均腹腔注射吗啡，给药程序见表1，最后一次给吗啡后的50分钟，聚乙二醇修饰眼镜蛇毒1、2、3组分别按55.32mg/kg、110.64mg/kg、221.28mg/kg剂量灌胃，此后30分钟各组均腹腔注射纳洛酮15mg/kg，观察15分钟内小鼠跳跃次数及1小时体重变化，结果见表2。
2、大鼠催促试验取大鼠40只，随机分为4组即空白对照组、聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素1、2、3组共4组。各组均腹腔注射吗啡，每天3次，给药剂量为第一天10mg/kg/次、第2-3天20mg/kg/次、第4-10天30mg/kg/次。眼镜蛇神经毒素组和聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素1、2、3组于试验第八天起口服灌胃，每天一次，连续3次，给药程序见表3。在最后一次腹腔注射吗啡后8小时，腹腔注射纳洛酮10mg/kg，观察1小时内的戒断症状及体重改变，并对戒断症状进行评分。(见表3)3、吗啡依赖猴自然戒断试验取猕猴6只，体重3-5kg，随机分为2组，即空白对照组和聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素组，各组动物均每天2次皮下注射吗啡，21天内吗啡剂量由2.5mg/kg递增至25mg/kg，此后按此剂量维持90天，至试验结束。
在试验81天起用掺食法分别在两组食物中加眼镜蛇神经毒素和聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素，给药剂量81-82天为11.79mg/kg/天；第83-84天为23.58mg/kg/天；第85-86天为47.16mg/kg/天；第87-88天为94.32mg/kg/天；第89天为188.64mg/kg/天。第90天停药后观察各组情况变化。
(2)试验结果1、小鼠跳跃试验
表1小鼠跳跃试验吗啡给药程序
表2聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素对吗啡依赖小鼠跳跃试验的影响
**p＜0.01空白组比较从表4可知，聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素组小鼠经纳洛酮催促后，与眼镜蛇神经毒素组比较跳跃次数及体重减轻程度均有显著性差异(p＜0.05)，提示聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素对吗啡依赖小鼠具有减轻其戒断症状作用。
2、大鼠催促试验表3聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素对吗啡依赖大鼠催促试验的影响
**P＜0.01与生理盐水组比较试验中，各组吗啡致大鼠依赖后，用纳洛酮催促结果发现眼镜蛇神经毒素组大鼠表现为高度激惹、腹泻、流涎、咬牙、异常姿势及体重明显减轻，其戒断症状评分(表5)明显高于聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素各组(P＜0.01)，聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素各组在停用吗啡后，见轻微流泪、腹泻、流涎及体重减轻。结果提示聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素对吗啡依赖大鼠有减轻其戒断症状作用。
3、吗啡依赖猴自然戒断试验各组在停用吗啡后，眼镜蛇神经毒素组在停用吗啡3小时后出现明显症状，主要表现为烦躁不安、咬笼、咬链条、阵发性震颤、流涎，3小时后2只猴出现腹泻，症状持续2-3小时，以后每1-3小时反复出现，到72小时出现嗜睡躺卧，体重下降0.7-0.9kg，一只猴死亡。而聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素组则在停用吗啡后出现轻度烦躁不安、嘶叫、流泪，1只猴出现腹泻，以上症状均较眼镜蛇神经毒素组轻，5小时后症状基本消失，72小时后体重下降0.3-0.4kg。
结论1、小鼠跳跃试验当口服本品总量为小鼠镇痛ED50的1-4倍时，可明显减轻依赖吗啡小鼠的跳跃次数和体重减轻程度，明显低于眼镜蛇神经毒素组(P＜0.05)。
2、大鼠催促试验当口服本品总量为大鼠镇痛ED50的4.5-18倍时，其戒断症状评分及体重减轻程度明显低于眼镜蛇神经毒素组(P＜0.01)。
3、吗啡依赖猴自然戒断试验当口服本品总量为猴镇痛ED50的26倍时，其出现的戒断症状及体重减轻程度明显低于眼镜蛇神经毒素组。
总之，通过小鼠跳跃试验、大鼠催促试验和吗啡依赖猴自然戒断试验均证实聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素相比眼镜蛇神经毒素，其缓解吗啡依赖动物戒断症状的功效更显著。
实施例5聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素与眼镜蛇神经毒素的急性毒性试验比较研究将四种不同浓度的聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素和眼镜蛇神经毒素注射至体重20-25g的小鼠的腹腔内。每种浓度注射8只小鼠。计算聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素和眼镜蛇神经毒素引起50％死亡的剂量(LD50)。(LD50计算方法参见Reed LJ and Muench H.Am.J.Hygiene，1938；27493.)结果测定出眼镜蛇神经毒素LD50为0.20mg/kg，聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素的LD50为10.0mg/kg。因此，眼镜蛇神经毒素经聚乙二醇修饰后，其毒性显著降低。
实施例6聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素对实验动物免疫原性的研究以家兔作为制备抗血清的实验动物，采用福氏佐剂免疫法，并分别以眼镜蛇神经毒素和聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素作为抗原，剂量均为20μg/kg/次，每周1次，共5次。
分别以眼镜蛇神经毒素和聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素作为抗原，用双向免疫扩散法测定它们各自抗血清的效价，测定结果为眼镜蛇神经毒素组抗血清的效价为1∶16；聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素组抗血清的效价测不出。
分别以眼镜蛇神经毒素和聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素作为抗原，然后用眼镜蛇神经毒素组的抗血清作为第一抗体，再以辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为第二抗体，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定它们各自的免疫原性，测定结果为眼镜蛇神经毒素组为阳性，聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素组为阴性。
以上结果表明同眼镜蛇神经毒素比较，聚乙二醇修饰的眼镜蛇神经毒素的免疫原性显著降低。
实施例7用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SPA-20000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SPA-30000)代替实施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了实施例中1-6相似的结果。
实施例8用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SBA-20000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SBA-30000)代替实施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了实施例中1-6相似的结果。
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，神经毒素的氨基上连接有活化的聚乙二醇或其衍生物链。
2.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，其结构如下 其中m为单甲氧基，n＝2～5；R代表去除一个氨基(NH2)的神经毒素分子。
3.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，所述的神经毒素包括从蛇毒中提取或用基因工程手段制备的各种神经毒素。
4.如权利要求3所述的聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，所述的神经毒素为从眼镜蛇蛇毒中提取的神经毒素。
5.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，所述的活化的聚乙二醇或其衍生物为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。
6.如权利要求1～5任一项所述的聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，所述的聚乙二醇链的分子量为2000～100000。
7.制备权利要求1～5任一项所述的聚乙二醇修饰的神经毒素，其特征在于，包括如下步骤在神经毒素溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5～9.5，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反应完毕后，将反应混合液进行色谱分离，即可得聚乙二醇修饰的神经毒素。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，反应温度为4～40℃。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，反应时间为5～120分钟。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，活化的聚乙二醇或其衍生物与神经毒素的摩尔比为0.1～100。
11.权利要求1～6所述的聚乙二醇修饰的神经毒素在制备戒毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种聚乙二醇修饰的神经毒素及其制备方法。其特征在于，神经毒素的氨基上连接有活化的聚乙二醇或其衍生物链。本发明的聚乙二醇修饰的神经毒素能够基本保持神经毒素的生物活性，同时它比未修饰的神经毒素有较低的免疫原性、毒性和更好的稳定性，从而改善了神经毒素的药物动力学特性，提高了耐受性和减少了给药次数。本发明还公开了聚乙二醇修饰的神经毒素在制备高效低毒的戒毒药物中的应用。
文档编号A61K47/48GK101077888SQ20061002683
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月24日 优先权日2006年5月24日
发明者冯军, 赵文杰, 翟宁, 薛春佳, 公伟 申请人:上海医药工业研究院