专利名称：抗狂犬病病毒重组免疫毒素及制备工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种抗狂犬病病毒免疫毒素，特别是提供了抗狂犬病病毒重组免疫毒素及制备工艺，用于狂犬病的紧急预防与暴露后治疗，属于重大人兽共患传染病防治药物制备技术领域。
背景技术：
狂犬病早在公元前四世纪即有记载，是由狂犬病毒引起的直接接触性、病毒性传染病，所有温血动物均易感，是目前危害人类健康的一种重要疫病。据世界卫生组织统计，全世界每年有40,000-70,000人死于狂犬病，1950-2005年我国狂犬病死亡总人数约102,280例，从2006年1月开始，我国每月因狂犬病死亡人数呈持续上升状态，从5月开始超越了长期领先的肺结核，成为国人生命的第一杀手，当前我国狂犬病总的发病和死亡人数仅次于印度，居世界第2位。狂犬病患者一旦出现症状几乎100％死亡，目前主要措施是在被动物致伤前或致伤后注射狂犬病疫苗或狂犬病抗血清。作为暴露后免疫的疫苗应快速产生抗体以阻止病毒侵袭神经系统，而当前国内外的疫苗需要较长的时间(10-14天)才能诱导机体产生有效保护滴度的中和性抗体，尤其对潜伏期短或病变部位离中枢神经系统较近的患者，常常因免疫失败而造成死亡。狂犬病抗血清或狂犬病免疫球蛋白具有直接中和病毒作用，但问题是抗体只能中和游离于体内的病毒，而不能破坏病毒复制所依赖的感染细胞，病毒一旦进入细胞，抗体便失去了其中和能力，因此无法完全清除病毒。
近十几年来，国内外学者纷纷将单克隆抗体、基因工程抗体、细胞因子等作为载体，与化学药物、毒素、同位素及酶类等相连接，将其带至病灶部位，特异性的杀伤肿瘤细胞，这种治疗称为导向治疗，有关的药物称为“生物导弹”或“免疫导向药物”。2002年Zevalin被FDA批准用于淋巴瘤的治疗，成为第一个用于肿瘤免疫治疗的放射性毒素偶链的抗体药物，此外DAB389IL-2和CD33-刺孢霉素也被FDA批准用于皮肤T-淋巴细胞瘤(CTCL)和急性髓性白血病(AML)的治疗。
发明内容
本发明提供一种抗狂犬病病毒重组免疫毒素，集杀伤病毒感染细胞和中和游离病毒为一体的药物。
本发明还提供了上述免疫毒素的制备工艺，目的旨在为人狂犬病的预防与控制提供新的途径，并适合于工业化生产。
本发明公开的重组免疫毒素，其靶向载体为抗狂犬病病毒中和性单链抗体，药物弹头为绿脓杆菌外毒素PE40。
本发明的解决方案是根据免疫学基本原理，筛选能产生抗狂犬病病毒高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞基因组，利用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因，并构建抗狂犬病病毒中和性单链抗体，将构建的单链抗体基因酶切插入到含有绿脓杆菌外毒素(PE40)的表达载体中，转化大肠杆菌进行原核表达，将表达的融合蛋白进行纯化。
本发明抗狂犬病病毒重组免疫毒素的制备方法主要包括以下步骤1、分泌抗狂犬病病毒中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选以纯化的狂犬病病毒国际标准株(CVS株)免疫Balb/c小鼠→无菌分离小鼠脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合→HAT法筛选阳性融合细胞→ELISA法筛选分泌高亲和力中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；2、狂犬病病毒中和性单链抗体(ScFv)基因的构建提取分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株RNA→互补合成轻、重链cDNA→PCR方法扩增鼠源单克隆抗体重链可变区与轻链可变区基因→采用SOE-PCR(重叠延伸拼接法)将轻、重链可变区基因装配为ScFv基因；3、单链抗体(ScFv)基因克隆ScFv基因与PMD18-T载体连接→转化Ecoli.JM109感受态→克隆ScFv基因；4、抗狂犬病病毒重组免疫毒素的制备酶切装有ScFv基因的PMD18-T载体和装有绿脓杆菌外毒素(PE40)的原核表达载体(PET28)→T4连接酶于16℃连接过夜→重组质粒转化→菌体发酵→蛋白纯化→复性。
下面实验证明了狂犬病重组免疫毒素在防治狂犬病上效果方法将狂犬病病毒倍比稀释后，将10-5稀释液接种已长成单层的敏感细胞，分为六组，分别在接种病毒后12h、24h、36h、48h、60h、72h向各孔中加入抗狂犬病病毒重组免疫毒素，另设一组作为病毒对照，每组重复6孔，然后每天观察细胞形态、病毒蚀斑出现情况及蚀斑大小，连续观测12天(试验组在给药后开始观察)。
结果病毒对照组最早出现细胞病变，在接种病毒5天后开始出现蚀斑，8天时蚀斑开始消退，10天后蚀斑连成一片，接种病毒后12h、24h、36h给重组免疫毒素组始终未出现病毒蚀斑，48h给药组在接种病毒后10天开始出现病毒蚀斑，试验结束时出现8个大小为1-2mm病毒蚀斑，期间病毒蚀斑数目及大小均未增加，60h给药组在接种病毒后9天开始出现蚀斑，试验结束时出现12个大小为1.5-2mm蚀斑，期间蚀斑数目及大小均未增加，72h给药组在接种病毒后7天开始出现蚀斑，试验结束时出现18个大小为3-4mm的蚀斑，期间蚀斑数目及大小均未增加。
具体结果如下表抗狂犬病病毒重组免疫毒素体外试验结果
注表中蚀斑出现时间指自接种病毒后开始出现蚀斑的时间，“------”指未出现蚀斑。
结果表明该重组免疫毒素既可中和游离病毒又可杀伤病毒感染细胞，可阻止病毒的进一步感染，早期用药结果优于晚期用药，因此此重组免疫毒素可用于狂犬病的早期预防和暴露后紧急预防。
本发明用于狂犬病的防治较现有的其它产品具有如下优点1、本发明所用载体为抗狂犬病病毒高亲和性单链抗体，故该发明既具有中和游离病毒的能力，又可通过PE的细胞毒性作用杀伤病毒感染细胞。
2、本发明为重组抗体类药物，可快速清除体内的病毒与杀伤病毒感染细胞，可用于狂犬病的紧急预防与暴露后治疗。
3、本发明克服了化学方法制备免疫毒素所存在的产率低、分子大、免疫原性大、组成不均一的缺点。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明权利要求范围之内。
实施例1抗狂犬病病毒重组免疫毒素的制备1、分泌抗狂犬病病毒中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选以纯化的狂犬病病毒国际标准株(CVS株)免疫Balb/c小鼠，共免疫三次，每次间隔15d，三免后血清抗体效价检测(ELISA检测效价＞27，琼脂扩散试验效价＞23)，无菌分离小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，HAT法筛选阳性融合细胞，ELISA法筛选分泌高亲和力中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2、狂犬病病毒中和性单链抗体(ScFv)基因的构建利用trizol提取分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株RNA，互补合成轻、重链cDNA，PCR方法扩增鼠源单克隆抗体重链可变区与轻链可变区基因，采用SOE-PCR(重叠延伸拼接法)将轻、重链可变区基因装配为ScFv。
3、单链抗体(ScFv)基因克隆将装配好的ScFv基因与PMD18-T载体16℃连接过夜，转化Ecoli.JM109感受态，涂布于氨苄(Ampcilin)抗性平板过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，对所克隆的ScFv基因进行测序。
4、抗狂犬病病毒重组免疫毒素生产工艺流程分别用XhoI和EcoRI酶切克隆的ScFv基因及装有绿脓杆菌外毒素(PE40)的表达载体，T4连接酶于16℃连接过夜，构建重组质粒。将构建的重组质粒转化E.coliJM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化E.coliBL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％比例加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得抗狂犬病病毒重组免疫毒素。
权利要求
1.一种抗狂犬病病毒重组免疫毒素，其特征在于靶向载体为抗狂犬病病毒中和性单链抗体，药物弹头为绿脓杆菌外毒素PE40。
2.根据权利要求1所述的抗狂犬病病毒重组免疫毒素制备工艺，其特征在于包括以下步骤1)分泌抗狂犬病病毒中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选以纯化的狂犬病病毒国际标准株CVS株免疫Balb/c小鼠→无菌分离小鼠脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合→HAT法筛选阳性融合细胞→ELISA法筛选分泌高亲和力中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；2)狂犬病病毒中和性单链抗体基因的构建提取分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株RNA→互补合成轻、重链cDNA→PCR方法扩增鼠源单克隆抗体重链可变区与轻链可变区基因→采用重叠延伸拼接法将轻、重链可变区基因装配为ScFv基因；3)单链抗体基因克隆ScFv基因与PMD18-T载体连接→转化Ecoli.JM109感受态→克隆ScFv基因；4)抗狂犬病病毒重组免疫毒素的制备酶切装有ScFv基因的PMD18-T载体和装有绿脓杆菌外毒素PE40的原核表达载体PET28→T4连接酶于16℃连接过夜→重组质粒转化→菌体发酵→蛋白纯化→复性。
全文摘要
本发明公开了一种抗狂犬病病毒重组免疫毒素的制备工艺，筛选能产生抗狂犬病病毒高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞基因组，利用聚合酶链式反应方法扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因，并构建抗狂犬病病毒中和性单链抗体，将构建的单链抗体基因酶切插入到含有绿脓杆菌外毒素的表达载体中，转化大肠杆菌进行原核表达，将表达的融合蛋白进行纯化。本发明可中和游离病毒，并通过PE的细胞毒性作用杀伤病毒感染细胞，能快速清除体内的病毒与杀伤病毒感染细胞，可用于狂犬病的紧急预防与暴露后治疗。本发明克服了化学方法制备免疫毒素所存在的产率低、分子大、免疫原性大、组成不均一的缺点。
文档编号A61P31/12GK1927887SQ200610017178
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月15日 优先权日2006年9月15日
发明者夏咸柱, 杨松涛, 朱平, 王化磊, 王承宇, 高玉伟, 黄耕, 王铁成 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所