专利名称：重组腺病毒的冻干制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制品技术领域，特别涉及利用重组腺病毒作为表达载体的冷冻干燥剂型产品的制备。
背景技术：
在基因治疗和疫苗研究学领域，腺病毒作为基因转移的载体，被广泛地使用。重组腺病毒是指将外源基因插入活的腺病毒载体，通过病毒使外源基因在宿主细胞中表达，由此刺激机体产生更广的特异的免疫应答。
重组腺病毒载体较易生产，成本较低，对人致病性小且不诱导癌变，繁殖滴度高，装载容量大，成为近年来病毒载体研究热点。但是，腺病毒对反复冻融敏感，容易失活。由于热稳定性较差，从生产场地到使用现场均要求疫苗严格的冷链，并要避免反复冻融。通常将腺病毒保存于含10％甘油的缓冲液中，并于-80℃储存。运输以及临床使用时须在干冰上进行，使用前需要大量稀释以减轻甘油的毒性和肌肉注射时的疼痛感。因此，即便是含有稳定剂的液体重组腺病毒制剂对温度也较为敏感，给运输、保存带来较大困难，这在很大程度上限制了其在临床上的应用。因而迫切需要发展在冷藏条件下能使腺病毒稳定的新的复合物。
生物技术药物的基本剂型是冻干剂型。冻干由于能较好地克服液体产品稳定性较差的问题，应用前景会更为广阔，它已被广泛地用于提高多种病毒性疫苗和蛋白质药品的稳定性。然而还没有关于腺病毒冻干制剂在基因治疗领域应用于人体的报道。迄今为止，尚未有能在4℃-8℃长期保存的冻干腺病毒制剂上市。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种安全、高效、稳定性好、有效期长的冻干剂型重组腺病毒的制备方法。
本发明包括a)配方重组腺病毒1011～2×1013TCID50，人血白蛋白0.2～1克，海藻糖2～4克，甘露醇1～3克，右旋糖苷1～2克，蔗糖1～3克。
磷酸盐生理氯化钠溶液，PH值为7.0～8.0，定容100毫升。
右旋糖苷可以是高，中，低分子的右旋糖苷，如右旋糖苷70，40，20；优选低分子的右旋糖苷20。
海藻糖、甘露醇、右旋糖苷均优选医用规格制品。
冷冻干燥剂型重组腺病毒，其中所用的平衡盐溶液使用磷酸盐生理氯化钠溶液(PBS)，PH值为7.0～8.0。
b)冷冻干燥剂型重组腺病毒的制备方法是按照保护剂配方，称取各组份，加入到磷酸盐生理氯化钠溶液(PBS)中，充分溶解后，用孔径0.22μm滤膜过滤除菌，再将重组腺病毒浓缩液加入到上述含有保护剂的溶液中进行灌装，每支西林瓶分装0.5毫升后，开始进行真空冷冻干燥；将病毒液于-35～-40℃预冷冻3～4h，然后在搁板温度-30℃～-32℃，真空度10Pa下，干燥8～9h。待制品完全成型后，使搁板温度由-10℃，0℃逐渐升至32℃，真空度10Pa下再干燥2～3h。干燥结束后密封瓶口即制成冷冻干燥剂型重组腺病毒制剂。
得到的冷冻干燥剂型重组腺病毒产品，外观良好，呈白色疏松体，残余水分小于或等于2％(g/g)，复水迅速。
本发明的重组腺病毒在冻干状态下得到更好的保护，制剂安全性和稳定性能好，费用低，容易进行生产和使用。4～8℃有效期为18个月以上，在4～8℃保存两年后，仍能保持冻干后的外观；克服了液体疫苗低温冻结保存及运输过程中严格冷链，有效期短的缺点，为采用重组腺病毒作为载体的基因治疗的临床实验提供良好的应用前景。具有一定的社会经济效益和实施价值。
图1、37℃条件下冻干制剂和液体制剂的稳定性对比曲线。
图2、4℃～8℃条件下冻干制剂和液体制剂的稳定性对比曲线。
具体实施例方式
下面结合实例进一步说明本发明。
实施例1冷冻干燥剂型重组腺病毒的制备方法是在100毫升PH值为7.0～8.0的磷酸盐生理氯化钠溶液(PBS)中，加入人血白蛋白0.5克，海藻糖3克，甘露醇2克，右旋糖苷2克，蔗糖2克。充分溶解后，用孔径0.22μm滤膜过滤除菌，再将重组腺病毒1011TCID50浓缩液加入到上述含有冷冻干燥剂的溶液中进行灌装，每支西林瓶分装0.5毫升后，开始进行真空冷冻干燥。将病毒液于-35～-40℃预冷冻3～4h，然后在搁板温度-30℃～-32℃，真空度10Pa下，干燥8～9h。待制品完全成型后，使搁板温度由-10℃，0℃逐渐升至32℃，真空度10Pa下再干燥2～3h。干燥结束后密封瓶口即制成冷冻干燥剂型重组腺病毒制剂。每瓶含每人份接种病毒量5×108TCID50。
右旋糖苷优选低分子的右旋糖苷20。
实施例2冷冻干燥剂型重组腺病毒的制备方法是在100毫升PH值为7.0～8.0的磷酸盐生理氯化钠溶液(PBS)中，加入人血白蛋白0.2克，海藻糖2克，甘露醇1克，右旋糖苷1克，蔗糖1克。充分溶解后，用孔径0.22μm滤膜过滤除菌，再将重组腺病毒2×1012TCID50浓缩液加入到上述含有冷冻干燥剂的溶液中进行灌装，每支西林瓶分装0.5毫升后，开始进行真空冷冻干燥。将病毒液于-35～-40℃预冷冻3～4h，然后在搁板温度-30℃～-32℃，真空度10Pa下，干燥8～9h。待制品完全成型后，使搁板温度由-10℃，0℃逐渐升至32℃，真空度10Pa下再干燥2～3h。干燥结束后密封瓶口即制成冷冻干燥剂型重组腺病毒制剂。每瓶含每人份接种病毒量1010TCID50。
右旋糖苷选中分子的右旋糖苷40。
实施例3冷冻干燥剂型重组腺病毒的制备方法是在100毫升PH值为7.0～8.0的磷酸盐生理氯化钠溶液(PBS)中，加入人血白蛋白0.2克，海藻糖4克，甘露醇3克，右旋糖苷2克，蔗糖3克。充分溶解后，用孔径0.22μm滤膜过滤除菌，再将重组腺病毒2×1013TCID50浓缩液加入到上述含有冷冻干燥剂的溶液中进行灌装，每支西林瓶分装0.5毫升后，开始进行真空冷冻干燥。将病毒液于-35～-40℃预冷冻3～4h，然后在搁板温度-30℃～-32℃，真空度10Pa下，干燥8～9h。待制品完全成型后，使搁板温度由-10℃，0℃逐渐升至32℃，真空度10Pa下再干燥2～3h。干燥结束后密封瓶口即制成冷冻干燥剂型重组腺病毒制剂。每瓶含每人份接种病毒量1011TCID50。
右旋糖苷选高分子的右旋糖苷70。
实验例1制剂冻干前后的滴度比较将含有冻干保护剂的重组腺病毒，按每人份分装量0.5ml，内含病毒量5×108TCID50，一部分于4℃保存，用来检测制剂冻干前的感染性滴度；另一部分制剂用来进行冷冻干燥。三个不同批号的含有疫苗冻干保护剂的重组腺病毒制剂经冷冻干燥后，再检测病毒的感染性滴度，与冻干前的感染性滴度相比较。感染性滴度检测表明冻干前后感染性滴度的下降值仅在0.15个Log10TCID50/ml左右。
表1制剂冻干前后的滴度比较
实验例2重组腺病毒4℃～8℃保存感染性滴度测定同一批号的，冻干的重组腺病毒和未经冻干的液体对照腺病毒，存放在同一4℃～8℃冰箱内，定期随机取样检测疫苗的感染性滴度。结果说明，冷冻干燥剂型重组腺病毒具有良好的稳定性，在4℃～8℃条件下存放13个月，感染性滴度下降约0.5个Log10TCID50/ml。而未经冷冻干燥的液体对照重组腺病毒存放1个月后感染性滴度就明显下降，下降值约达到1个Log10TCID50/ml。
表2重组腺病毒4℃～8℃保存感染性滴度测定
实验例3重组腺病毒37℃加速稳定性试验无保护剂的对照液体腺病毒制剂，37℃放置7天后滴度下降接近2.5个Log10TCID50/ml；而37℃放置28天后，加有保护剂的冻干腺病毒制剂的滴度总下降值平均不超过一个Log10TCID50/ml。
表3重组腺病毒37℃加速稳定性试验
实验例4保护剂对冻干腺病毒制剂感染性滴度的影响将含有人血白蛋白，海藻糖，甘露醇，右旋糖苷，蔗糖的冻干保护剂和磷酸盐生理氯化钠溶液(PBS)的重组腺病毒制剂和不加保护剂只用PBS缓冲液稀释的重组腺病毒，在同一真空冷冻干燥条件下进行冷冻干燥，然后随机取样测定病毒感染性滴度。结果证明未加保护剂的腺病毒经冷冻干燥后，病毒活力丧失很大。
表4保护剂对冻干腺病毒制剂感染性滴度的影响
实验例5冻干腺病毒制剂的安全性实验选用5只18-20克健康小白鼠，每只腹腔注射冻干腺病毒制剂109TCID50/只，，注射后密切观察，30分钟内无异常反应，连续观察3天，所有小鼠均未出现与注射冻干腺病毒制剂有关的副反应，如食欲下降，连续干咳、明显耸毛、痉挛及死亡现象。
权利要求
1.一种重组腺病毒的冻干制剂，其特征在于，包括重组腺病毒2×1012TCID50，人血白蛋白0.2～1克，海藻糖2～4克，甘露醇1～3克，右旋糖苷1～2克，蔗糖1～3克，磷酸盐生理氯化钠溶液，PH值为7.0～8.0，定容100毫升。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒的冻干制剂，其特征在于，右旋糖苷是右旋糖苷70或右旋糖苷40或右旋糖苷20；
3.根据权利要求2所述的重组腺病毒的冻干制剂，其特征在于，右旋糖苷是右旋糖苷20。
4.一种重组腺病毒的冻干制剂的制备方法，包括a)配方重组腺病毒2×1012TCID50，人血白蛋白0.2～1克，海藻糖2～4克，甘露醇1～3克，右旋糖苷1～2克，蔗糖1～3克，磷酸盐生理氯化钠溶液，PH值为7.0～8.0，100毫升；b)制备方法包括下列骤按照保护剂配方，称取各组份，加入到磷酸盐生理氯化钠溶液中，充分溶解后，用孔径0.22μm滤膜过滤除菌，再将重组腺病毒浓缩液加入到上述含有保护剂的溶液中进行灌装，每支西林瓶分装0.5毫升后，开始进行真空冷冻干燥；将病毒液于-35～-40℃预冷冻3～4h，然后在搁板温度-30℃～-32℃，真空度10Pa下，干燥8～9h；待制品完全成型后，使搁板温度由-10℃，0℃逐渐升至32℃，真空度10Pa下再干燥2～3h，干燥结束后密封瓶口。
全文摘要
本发明涉及一种重组腺病毒的冻干制剂及其制备方法，属于生物制品技术领域。包括重组腺病毒2×10
文档编号A61K47/42GK1883707SQ200610016860
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月19日 优先权日2006年5月19日
发明者孔维, 张一折, 姜春来, 滕宏刚, 吕帅然 申请人:吉林大学