专利名称：鲍鱼菇提取物和提取方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及天然菇类抗氧化活性成分的提取，特别是一种鲍鱼菇提取物和提取方法及其应用。该提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化剂，用于防治疾病，并且可作为提高机体免疫力，延年益寿的保健品。
背景技术：
从目前研究结果来看，氧自由基不仅与衰老、个体发育以及细胞分化有关，而且与人类大部分常见的主要疾病均有关，从人类死亡率最高的心脑血管疾病到人类最可怕的杀手—癌症和艾滋病，以及人口老龄化社会所面对的最大挑战—神经退行性疾病，无一不和自由基有着密切的关系。通过保持自由基平衡或者除去过多的自由基可以达到防病治病的目的。但是目前人工合成的抗氧化剂，具有一定的毒性和诱变性，而且使用上受到很大程度的限制，所以国内外研究人员正在从植物、真菌(菇类)、海洋生物中寻找安全、低毒、高效的天然抗氧化剂。比如香菇(Lentinus edodes)和草菇(Volvariellavolvacea)的甲醇和水的粗提物具有自由基清除和抑制大鼠红细胞溶血的作用；云芝多糖(PSK)、灵芝多糖等从六种蘑菇中提取的具有抗癌活性的多糖，具有清除超氧自由基和羟自由基的作用。
鲍鱼菇(Pleurotus abalonus)属侧耳科，侧耳属，又名台湾平菇，台湾黑鲍菇，它是热带和亚热带地区一种大型的木生食用菌，其营养丰富，富含高蛋白、低脂肪和适当的纤维素，肉质肥厚、脆嫩可口、风味独特，颇受人们的喜欢。国内主要是把其作为一种食用菇类，国内外都尚未见到鲍鱼菇提取物作为体内抗氧化剂以及提取工艺方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲍鱼菇提取物和提取方法及其应用，该提取物包括多糖类和蛋白类，具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化剂，用于防治疾病，并且可以提高机体免疫力，作为延年益寿的保健品。该菇类资源丰富，提取容易，安全无毒，可以用于天然保健品开发。
本发明提取物总有效成分为乙醇沉淀DEAE洗脱物(P0.5)，占提取物总重量的8.5％(其他成分主要为单糖及纤维素)，其中，有效成分为两种复合物糖蛋白1(P0.5a)以及糖蛋白2(P0.5b-1)，P0.5a主要含多糖82.64％，蛋白0.63％；P0.5b-1主要含多糖45.48％，蛋白12.63％。分子量分别为P0.5a为120,000，P0.5b-1为13,000。
本发明鲍鱼菇提取物的提取方法是经过下述的步骤1)将100～200g干燥的鲍鱼菇子实体用500ml蒸馏水浸泡，回流条件下提取，提取液冷却至室温，离心分离，取上清液-40℃冷冻干燥，得干粉；所述的回流提取是提取2～4小时。
2)干粉溶解于80％的乙醇溶液中，于4℃过夜，离心，弃上清，-40℃将沉淀冷冻干燥，得干粉；3)将制得的干粉溶解于10mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于阴离子交换纤维素层析柱，然后分别用200ml的10mM Tris-HCl，0.1N NaCl，0.5N NaCl，1N NaCl依次洗脱，洗脱速度为每3分钟收集2ml，于-40℃冷冻干燥，收集产物P0.5；4)产物P0.5上样于葡聚糖凝胶Sephadex G-200层析柱，用400ml蒸馏水洗脱，洗脱速度为每10分钟收集2ml，-40℃冷冻干燥，得到P0.5a；5)将P0.5b上样于葡聚糖凝胶Sephadex G-75层析柱，用400ml蒸馏水洗脱，洗脱速度为每6分钟收集2ml，-40℃冷冻干燥，得到P0.5b-1。
本发明的提取方法是经过下述具体的步骤1)将100～200g干燥的鲍鱼菇子实体切碎，用500ml蒸馏水浸泡，回流条件下提取2～4小时，提取液倾出，冷却至室温后离心，取上清液-40℃冷冻干燥，即得干粉。
2)取2g干粉溶解于50ml双蒸水中，再加入无水乙醇至终浓度为80％的乙醇溶液，于4℃过夜，离心，弃上清，用真空冷冻干燥机于-40℃将沉淀冷冻干燥，得干粉(P)。
3)取制得的干粉50mg溶于5ml Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH8.0)，上样于阴离子交换纤维素层析柱(DEAE)，然后分别用200ml的10mM Tris-HCl，0.1N NaCl，0.5NNaCl，1N NaCl依次洗脱，洗脱速度为每3分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，收集产物(P0.5)。
4)经分离得到的活性物质上样于层析柱(葡聚糖凝胶Sephadex G-200)，用400ml蒸馏水洗脱，洗脱速度为每10分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，得到P0.5a和P0.5b。
5)将分离得到的活性物质(P0.5b)上样于层析柱(葡聚糖凝胶Sephadex G-75)，用约400ml蒸馏水洗脱，洗脱速度为每6分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，得到P0.5b-1。
本发明鲍鱼菇子实体提取物不仅对机体红细胞溶血有显著抑制作用和对组织脂质过氧化有很强的抑制作用外，而且具有高效清除超氧阴离子的活性，是一种高效抗氧化剂，P0.5b-1的抗氧化活性要强于P0.5a。通过防止机体过量的自由基产生和清除产生的自由基，提高机体抗病能力，预防与自由基有关的各种疾病的发生达到延缓衰老的作用。
本发明具有抗氧化活性的特点，可以制成抗氧化剂，用于防治疾病，提高机体免疫力，以及作为延年益寿的保健品。并且可以用于天然保健品开发，该真菌资源丰富，提取容易，安全无毒。
图1是P经DEAE阴离子交换纤维素柱层析的洗脱曲线。
图2是P0.5及Vc抑制SAM鼠体外红细胞溶血曲线。
图3是P0.5及BHA体外抑制SAM鼠脑匀浆脂质过氧化作用曲线。
图4是P0.5及BHA体外抑制SAM鼠肾匀浆脂质过氧化作用曲线。
图5是P0.5b-1纯化产物经HPLC纯度鉴定。
具体实施例方式
实施例11.鲍鱼菇子实体提取物制备与纯化1)干燥的鲍鱼菇子实体切碎150g，水浸泡500ml，回流条件下提取2～4小时，提取液倾出，冷却至室温后离心，取上清液-40℃冷冻干燥，即得干粉。
2)取2g干粉溶解于50ml双蒸水中，再加入无水乙醇至终浓度为80％的乙醇溶液，于4℃过夜，离心，弃上清，用真空冷冻干燥机于-40℃将沉淀冷冻干燥，得干粉(P)。
3)取制得的干粉50mg溶于5ml Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH8.0)，上样于阴离子交换纤维素层析柱(DEAE)，然后分别用200ml的10mM Tris-HCl，0.1N NaCl，0.5NNaCl，1N NaCl依次洗脱，洗脱速度为每3分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，收集产物(P0.5)。
4)经分离得到的活性物质上样于层析柱(葡聚糖凝胶Sephadex G-200)，用400ml的蒸馏水洗脱，洗脱速度为每10分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，得到P0.5a和P0.5b。
5)将分离得到的活性物质(P0.5b)上样于层析柱(葡聚糖凝胶Sephadex G-75)，用约400ml蒸馏水洗脱，洗脱速度为每6分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，得到P0.5b-1。
2.提取物成分确定经过上述DEAE阴离子交换纤维素柱分离出1种活性成份P0.5，经葡聚糖凝胶Sephdex G-200层析柱将P0.5纯化出P0.5a和P0.5b两种大分子活性成份，然后利用葡聚糖凝胶Sephdex G-75对P0.5b进一纯化，得到P0.5b-1和P0.5b-2，其中P0.5b-1具有显著的抗氧化活性。P中活性成份P0.5，P0.5a和P0.5b-1的收率见表1。
表1P活性成份纯化结果
经多糖含量测定(蒽酮比色法Kawagishi，H.，Nomura，A.，Mizuno，T.，Kimura，A.，Chiba，S.Isolation and characterization of a lectin from Grifola frondosa fruiting bodies.Biochemical & Biophysical.Acta，1990，134247～252)发现，P0.5a主要成分为多糖，糖含量高达82.64％，P0.5b-1含有45.48％的多糖。对活性成份进行蛋白质含量测定(改良Lowry法Y.Orii and T.E.King.On the nature of the three intermediate species formed after reactionof reduced cytochrome oxidase with oxygen Journal of Biological Chemistry，1976，2517487～7493)，使用上海分析仪器总厂生产的752紫外光栅分光光度计。测定结果表明P0.5a含有少量蛋白，占0.63％，P0.5b-1含有12.63％的蛋白。结果见表2。
表2P0.5、P0.5a、P0.5b中多糖及蛋白含量测定
经高效液相色谱法(HPLC)鉴定纯度。使用岛津LC-10AT HPLC仪，采用TSK gelWxlb凝胶柱，缓冲液为0.1M PB+0.3M NaCl，测定吸收波长为230nm，测得结果P0.5a以多糖为主，含有极微量的蛋白。P0.5b-1为单一峰，见附图5，而且在P0.5、P0.5a、P0.5b-1三种抗氧化活性成分中，活性最高。
3.分子量的确定方法为标准洗脱曲线的制作将四种凝胶过滤分子量Marker(表1)各10mg溶于1mL去离子水中，小心上样于已用去离子水平衡好的葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)凝胶过滤层析柱(2.5×100cm)，然后用去离子水洗脱，流速为3ml/10min，3ml/管进行自动分步收集。测定每管在280nm处的光吸收值。以分子量的对数值为横坐标，蓝色葡聚糖2000(Dextran Blue2000)的洗脱体积为外水体积(V0)，各物质洗脱体积Ve-V0为纵坐标，绘制标准洗脱曲线。
表1凝胶过滤分子量Marker
2)样品的葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)分子筛凝胶柱层析将经过DEAE-cellulose阴离子纤维素交换柱层析分离得到的抗氧化活性物质进一步上样于葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)分子筛凝胶柱层析，并以与标准品Marker相同的条件进行洗脱，收集。利用标准曲线计算样品相对分子量。经此步，即可对活性成分进行进一步的纯化，又可根据洗脱体积对活性物质分子量进行初步估算。经过计算得到P0.5a分子量为120KD，P0.5b-1分子量为13KD。
4.鲍鱼菇子实体提取物抗氧化活性测定结果见附图2，3，4。
5.为了更好的理解本发明，下面用动物实验来说明鲍鱼菇子实体提取物活性成份在小鼠体内的抗氧化效果及对小鼠延缓衰老的作用，来说明本发明的特点。
机体在正常的生理条件下，自由基的产生与消除处于动态平衡，这是因为存在着清除自由基的酶促反应和非酶促反应的防御系统。如果防御系统功能下降，体内产生自由基的水平会随之增高，很容易与其他物质生成新的自由基，而且往往以连锁方式进行下去，对组织造成严重损伤，破坏细胞内各种生物大分子，导致细胞死亡。本发明将P0.5提取物作用于小鼠体内第一，通过提高内源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)的活性，消除并防止自由基的产生；第二，该提取物本身所含有的抗氧化成份直接清除体内已有自由基代谢产物(过氧化脂质LPO或丙二醛MDA)，减少自由基对各种抗氧化酶的灭活作用，维持机体生理平衡，使机体免受损害，起到防病和延缓衰老的效果。
本发明鲍鱼菇子实体提取物抗氧化活性的测定方法如下1)细胞水平测定采用红细胞溶血测定法。
给药小鼠摘眼球取血，制备10％红细胞悬液，加入等体积自由基引发剂2，2-偶氮-双-(2-脒基丙烷)氯化二氢(AAPH)，引起红细胞膜磷脂发生过氧化反应，导致细胞膜破裂，释放出血红蛋白，于540nm测定上清液的吸光值，按下式计算抑制率抑制率(％)＝(1-A/B)×100％APBS反应管吸光值 B完全溶血吸光值2)组织水平测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法。
将小鼠的肝组织匀浆后加入TBA，100℃加热15分钟，不饱和脂肪酸过氧化产物之一丙二醛产生，丙二醛与TBA反应产生红色物质，在535nm处测定光吸收，抗氧化活性按下式计算抑制率(％)＝(A-A1)/A×100％A对照吸光值，A1试样体系吸光值3)组织中SOD酶活性测定 采用亚硝酸盐法黄嘌呤氧化酶(XO)与其底物次黄嘌呤或黄嘌呤反应产生O2-·，与羟胺反应生成NO2-·，在酸性条件下继而与对氧基苯磺酸和N-萘二氨基乙烯发生显色反应生成红色产物，SOD酶抑制该反应。由抑制的程度确定SOD酶活力。通过波长550nm处比色，计算酶活力。
4)全血CAT酶活性测定采用紫外速率直接法CAT可分解H2O2生成H2O和O2，H2O2在240nm处有吸收峰，测定反应中H2O2在一定时间内吸光度降低来表示CAT活性。取小鼠新鲜血20μl与5ml蒸馏水中，制成1∶250溶血液，即为待测样品。将溶血液与H2O2混合后在240nm处测定吸光值的变化。
计算公式2.3×1000a30b×log(A0/A30)]]>a250×15 b全血Hb浓度(g/L)5)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定，采用DTNB直接法GSH-Px可特异性地催化GSH与过氧化物的氧化还原反应，以单位时间内GSH减少的量来表示GSH-Px的活力。在一定条件下GSH与DTNB(5，5’-二硫代对硝基苯甲酸)反应生成浅黄色5’-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子，在423nm处有最大吸收。
取小鼠全血10μl加入1ml双蒸水中，制成1∶100溶血液，即为待测样品，将样品与GSH混合后加入H2O2，反应3分钟，然后加入NaOH调pH6.5，再加入DTNB显色剂，通过测定各管吸光度来测定酶活性。
计算公式全血＝[GSH]非酶管-[GSH]样品管+[GSH]试剂空白管/3×4μl通过以上方法对三批给药和对照组小鼠进行抗氧化活性测定。测定结果见表3表3 9月龄小鼠给药后抗氧化活性测定结果
通过以上结果表明，鲍鱼菇子实体提取物对机体具有提高各种抗氧化酶的活性，是一种有效的抗氧化剂。
实施例2选择SAM鼠(天津防病中心提供)雄性、8月龄为实验动物进行分组，给药组6只，对照组6只，鲍鱼菇子实体提取物(P0.5)加水配成适当水溶液，通过灌胃的方式给药30天，给药剂量80mg/kg·bw，对照组给以相等剂量的生理盐水，每日一次。给药30天之后的实验小鼠，断颈处死，取肝组织，制成10％肝匀浆液，离心后取上清液1ml，加入无水乙醇10μl，冰浴30分钟，加入10％TritonX-100 110μl，冰浴5分钟。将样品稀释200倍加入反应体系，测定管加入酶液2ml，10mM的PBS 1ml混匀，在240nm处测定30秒吸光值的变化，计算CAT酶活力。
给药组6只鼠的CAT酶活力平均为275.1K/g.Hb，对照组6只鼠的CAT酶活力平均为180.2K/g.Hb，给药组比对照组CAT平均酶活力高94.9K/g.Hb。
实施例3小鼠寿命实验选择SAM鼠10只，均为雄性，有关资料记载SAM鼠平均寿命为333天，将试验鼠分为两组，为给药组5只，对照组5只，给药浓度30mg/kg·bw，每日一次以口服形式。给药时间从小鼠10月龄开始(270天之后)一直到小鼠自然死亡为止，见表4。
表4小鼠寿命时间(天)
以上结果表明，选用SAM鼠作动物实验，在小鼠9个月之后通过口服鲍鱼菇子实体提取物，可使小鼠寿命由对照组平均341天延长到平均寿命为394天，给药组比对照组平均寿命增加57天。
权利要求
1.一种鲍鱼菇提取物，其特征在于该提取物总有效成分为乙醇沉淀阴离子交换纤维素层析柱洗脱物P0.5，占提取物总重量的8.5％，其他成分主要为单糖及纤维素；其中，有效成分为两种复合物糖蛋白P0.5a和糖蛋白P0.5b-1，P0.5a主要含多糖82.64％，蛋白0.63％；P0.5b-1主要含多糖45.48％，蛋白12.63％；分子量分别为P0.5a为120,000，P0.5b-1为13,000。
2.权利要求1所述的鲍鱼菇提取物的提取方法，其特征在于它是经过下述的步骤1)将干燥的鲍鱼菇子水浸泡，回流条件下提取，提取液冷却至室温，离心分离，取上清液-40℃冷冻干燥，得干粉；2)干粉溶解于80％的乙醇溶液中，于4℃过夜，离心，弃上清，-40℃将沉淀冷冻干燥，得干粉；3)将制得的干粉溶解于10mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于阴离子交换纤维素层析柱，然后分别用200ml的10mM Tris-HCl，0.1N NaCl，0.5NNaCl，1N NaCl依次洗脱，洗脱速度为每3分钟收集2ml，于-40℃冷冻干燥，收集产物P0.5；4)产物P0.5上样于葡聚糖凝胶Sephadex G-200层析柱，用400ml水洗脱，洗脱速度为每10分钟收集2ml，-40℃冷冻干燥，得到P0.5a；5)将P0.5b上样于葡聚糖凝胶Sephadex G-75层析柱，用400ml水洗脱，洗脱速度为每6分钟收集2ml，-40℃冷冻干燥，得到P0.5b-1。
3.按照权利要求2所述的鲍鱼菇提取物的提取方法，其特征在于步骤1)所述的鲍鱼菇与水的重量体积比为1～2∶5。
4.按照权利要求2所述的鲍鱼菇提取物的提取方法，其特征在于步骤1)所述的回流提取是提取2～4小时。
5.按照权利要求2所述的鲍鱼菇提取物的提取方法，其特征在于步骤2)所述的干粉溶解是取干粉溶解于水中，再加入乙醇至乙醇的终浓度为80％。
6.一种权利要求1所述的鲍鱼菇提取物的提取方法，其特征在于是经过下述具体的步骤1)干燥的鲍鱼菇子实体切碎，水浸泡，回流条件下提取2～4小时，提取液倾出，冷却至室温后离心，取上清液-40℃冷冻干燥，即得干粉。2)取2g干粉溶解于50ml双蒸水中，再加入无水乙醇至终浓度为80％的乙醇溶液，于4℃过夜，离心，弃上清，用真空冷冻干燥机于-40℃将沉淀冷冻干燥，得干粉(P)。3)取制得的干粉50mg溶于5ml Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH8.0)，上样于阴离子交换纤维素层析柱(DEAE)，然后分别用200ml的10mM Tris-HCl，0.1NNaCl，0.5N NaCl，1N NaCl依次洗脱，洗脱速度为每3分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，收集产物(P0.5)。4)经分离得到的活性物质上样于层析柱(葡聚糖凝胶Sephadex G-200)，用400ml的蒸馏水洗脱，洗脱速度为每10分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，得到P0.5a和P0.5b。5)将分离得到的活性物质P0.5b上样于层析柱(葡聚糖凝胶Sephadex G-75)，用400ml蒸馏水洗脱，洗脱速度为每6分钟收集2ml，用真空冷冻干燥机于-40℃冷冻干燥，得到P0.5b-1。
7.按照权利要求6所述的鲍鱼菇提取物的提取方法，其特征在于步骤1)所述的鲍鱼菇与水的重量体积比为1～2∶5。
8.权利要求1所述的鲍鱼菇提取物的应用，用于体内抗氧化剂的药物。
全文摘要
本发明涉及鲍鱼菇提取物和提取方法及其应用。本发明总有效成分占提取物总量的8.5％，两种有效成分均为糖蛋白复合物其中一种P
文档编号A61P39/00GK1911253SQ20061001370
公开日2007年2月14日 申请日期2006年5月16日 优先权日2006年5月16日
发明者刘方, 李乐, 傅明, 江荺, 王春玲, 宋敏, 袁芳 申请人:南开大学