包含疟原虫抗原的疫苗的利记博彩app

专利名称：包含疟原虫抗原的疫苗的利记博彩app
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本发明涉及疟疾抗原免疫对抗疟疾疾病的新用途。具体地说，本发明涉及子孢子抗原、具体地说为环子孢子(CS)蛋白或其片段免疫对抗严重疟疾疾病的用途。
疟疾是世界的主要健康问题之一。在20世纪中，经济和社会发展连同抗疟疾运动已导致在世界的大部分区域中根除了疟疾，将世界上受感染区域由50％降至27％。尽管如此，根据预期的人口增长，预计至2010年世界一半人口(接近35亿人)将居住在疟疾传播区域1。现时的估计表明，每年由于疟疾死亡的人数远超过1百万，仅非洲的庞大经济成本就相当于每年1000亿美元2。
这些数字突显了全球性的疟疾危机和向国际卫生机构提出的挑战。此危机的原因是多方面的，范围从可获得的、可承受的和先前高效的药物的广泛抗性的出现，到卫生系统的衰弱和不足、资源缺乏。除非发现了控制该病的方法，否则改善健康和幼儿生存、减少贫困、增加安全性和增强最易受攻击社群的全球性努力将失败。
该疾病的一种最急性形式是由原生动物寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的，该寄生虫是由于疟疾引起的大部分死亡的原因。
恶性疟原虫(P.falciparum)的生活周期复杂，需要人和蚊两个寄主来完成。人的感染是由被感染蚊子唾液中的子孢子接种启动的。子孢子迁移到肝脏并在那里感染肝细胞(肝期)，它们在肝细胞中分化，经红细胞外胞内期(exoerythrocytic intracellular stage)进入裂殖子期，裂殖子感染红细胞(RBC)，以启动无性血液期中的周期性复制。该周期以RBC中的许多裂殖子分化成蚊子摄取的有性期配子体完成，在蚊子中有性期配子体在中央管中经过一系列时期的发育产生子孢子，子孢子迁移到唾液腺。
子孢子期的恶性疟原虫已被鉴定为疟疾疫苗的一个潜在靶。子孢子的主要表面蛋白质称为环子孢子蛋白质(CS蛋白质)。已对各种品系该蛋白质进行了克隆、表达和测序，例如NF54品系克隆3D7(Caspers等，Mol.Biochem.Parasitol.35，185-190，1989)。品系3D7的该蛋白质的特征是具有中央免疫显性重复区，该区含有重复40次的四肽Asn-Ala-Asn-Pro，但其中散布了四个次要重复序列Asn-Val-Asp-Pro。在其它品系中，主要和次要重复序列的数目以及它们相对的位置有变化。这一中央部分与N和C末端部分侧接，N和C末端部分由非重复的氨基酸序列组成，命名为CS蛋白质的无重复部分。
GlaxoSmithKline Biologicals的基于CS蛋白的RTS，S疟疾疫苗自1987年以来就处于研发中，目前是最先进的在研侯选疟疾疫苗4。该疫苗特异性靶向红细胞前期的恶性疟原虫，在未感染疟疾的成年志愿者中赋予对实验室培育的被感染蚊子传递的恶性疟原虫子孢子感染的保护，以及赋予半免疫成人抗天然暴露的保护5，6。
RTS，S/AS02A(RTS，S加佐剂)用于在冈比亚进行的连续I期研究，包含6-11岁和1-5岁的儿童，该研究证实所述疫苗是安全的、良好耐受的和免疫原性的7。随后，选择儿科疫苗剂量并在包含1-4岁莫桑比克儿童的I期研究中进行研究，在该研究中发现所述疫苗是安全的、良好耐受的和免疫原性的8。
但是，长期以来人们一直坚持这样的观点为在天然暴露的条件下获得免于患恶性疟原虫引起的临床疾病的保护作用，应需要一种以上的抗原，并应需要代表所述寄生虫生命周期的多个时期的多种抗原(第3页，Webster，Daniel and Hill，Adrian V.S.Progress with newmalaria vaccines.Bull World Health Organ，Dec.2003，81卷，第12章，902-909页，ISSN 0042-9686；Hoffman S.Save the children.Nature.2004年8月19日；430(7002)940-1)。人们一般还持有这样的观点对提供抗严重疾病的保护作用来说，例如来自红细胞前期寄生虫的CS的抗原应不是优选抗原，因为严重疾病由无性期寄生虫引起，而红细胞前期抗原如CS不在无性期寄生虫上表达。
现在已在幼年非洲儿童的实验中用红细胞前期疟疾抗原获得了令人惊讶的结果。业已发现，基于CS蛋白的RTS，S疫苗不仅可赋予抗在天然暴露下感染的保护作用，而且赋予抗恶性疟原虫引起的广谱临床疾病的保护作用。接受RTS，S疫苗的儿童经历的严重不良事件、住院治疗和严重的疟疾并发症(包括死亡)比对照组少。
具体地说，此基于CS的疫苗可降低严重疟疾疾病发病率的研究结果是出乎意料和令人惊讶的。严重疟疾疾病描述于WHO临床实验规范指南(第3页World Health Organization.Management of severemalaria，实用手册，第2版，2000.http://mosquito.who.int/docs/hbsm.pdf)。遵照基于WHO的严重疟疾定义的儿童分类法鉴别患病非常严重的儿童和高危垂死的儿童。高危可用于指约30％或以上的死亡风险。
而且，抗新感染或临床发作这二者的RTS，S疫苗效力似乎不衰减，也不缓慢衰减。在实验中的6个月随访结束时，所述疫苗仍有效，尽管在感染发病率方面有显著差异。这与先前在未感染疟疾的志愿者或冈比亚成人中进行的实验形成强烈反差，所述实验提示疫苗效力是短期的6，23。
因此，本发明提供疟原虫(Plasmodium)抗原在药物生产中的用途，所述疟原虫抗原在红细胞前期表达，优选为子孢子抗原，所述药物用于抗严重疟疾疾病的接种，所述疟原虫抗原与药物可接受的佐剂或载体组合。
本发明尤其涉及降低严重恶性疟原虫疾病的发病率。
此疫苗的优选目标群是儿童，具体地说是5岁以下的儿童，尤其是1-4岁的儿童。
优选地，所述疟原虫抗原为恶性疟原虫抗原。
所述抗原可选自在子孢子或其它红细胞前期(例如肝期)寄生虫上表达的任意抗原。优选地，所述抗原选自环子孢子(CS)蛋白、肝期抗原-1(LSA-1)、肝期抗原-3(LSA-3)、血小板反应蛋白相关性未名蛋白(TRAP)以及最近已表明在肝期(以及红细胞期)存在的顶端裂殖子抗原-1(AMA-1)。所有这些抗原在本领域都是周知的。所述抗原可为完整蛋白或其免疫原性片段。疟疾抗原的免疫原性片段是众所周知的，例如AMA-1的胞外结构域。
优选地，所述疟原虫抗原融合至乙肝表面抗原(HBsAg)。
用于本发明的优选抗原衍生自环子孢子(CS)蛋白，优选为与HbsAg的杂合蛋白形式。所述抗原可为完整的CS蛋白或其部分，包括CS蛋白的一个或多个片段，所述多个片段可融合在一起。
优选地，基于CS蛋白的抗原为杂合蛋白形式，其含有基本上全部的疟原虫CS蛋白的C端部分、4个或更多个串联重复的CS蛋白免疫显性区以及乙肝表面抗原(HBsAg)。优选地，所述杂合蛋白包含含有与CS蛋白C端部分基本同源的至少160个氨基酸的序列。具体地说，“基本全部的”CS蛋白的C末端部分包括没有疏水锚区序列的C末端。CS蛋白可没有C末端的最后12个氨基酸。
最优选地，用于本发明的杂合蛋白是含恶性疟原虫CS蛋白部分的蛋白，该CS蛋白基本对应于品系NF54来源的恶性疟原虫3D7克隆(Caspers等，出处同上)的氨基酸207-395，由线性接头按照读框融合至HbsAg的N末端。所述接头可包含HbsAg的preS2的一部分。
用于本发明的优选CS构建物概述于WO 93/10152。最优选的是称为RTS的杂合蛋白，其描述于WO 93/10152(其中将其称为RTS*)和WO 98/05355，这两个专利的公开内容通过引用结合到本文中。
特别优选的杂合蛋白是称为RTS的杂合蛋白，其由以下组成●甲硫氨酸残基，由核苷酸1059-1061编码，来源于酿酒酵母TDH3基因序列。(Musti A.m.等，Gene 198325133-143)。
●3个氨基酸Met Ala Pro，来源于通过用于构建杂合基因的克隆方法建立的核苷酸序列(1062-1070)。
●一段189个氨基酸的序列，由代表恶性疟原虫品系3D7(Caspers等，出处同上)的环子孢子蛋白(CSP)的氨基酸207-395的核苷酸1071-1637编码。
●由核苷酸1638-1640编码的氨基酸(Gly)，通过用于构建杂合基因的克隆方法建立。
●4个氨基酸Pro Val Thr Asn，由核苷酸1641-1652编码，代表乙肝病毒(adw血清型)preS2蛋白(Nature 280815-819，1979)的4个羧基末端残基。
●一段226个氨基酸的序列，由核苷酸1653-2330编码，表示乙肝病毒(adw血清型)的S蛋白。
优选地，所述RTS为混合颗粒RTS，S形式。
优选的RTS，S构建物包含两种多肽RTS和S，其同时被合成，并在纯化过程中自发形成复合颗粒结构(RTS，S)。
RTS蛋白优选在酵母中表达，最优选在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达。在该宿主中，RTS将作为脂蛋白颗粒表达。优选的受者酵母菌株优选地已在其基因组中携带若干乙肝病毒S表达盒的整合拷贝。获得的菌株由此合成两种多肽S和RTS，其自发地共组装成混合的(RTS，S)脂蛋白颗粒。这些颗粒有利地在其表面存在所述杂合体的CSP序列。有利地，这些混合颗粒中的RTS∶S比率为1∶4。
本发明允许在疫苗中使用单一疟疾抗原，与先前认为产生保护作用(特别是抗严重疾病的保护作用)应需要的相反。因此，按照本发明，RTS或其它抗原优选为疫苗中的唯一疟疾抗原。
另一方面，本发明提供来自单一疟疾蛋白的抗原在制备用于接种对抗严重疟疾的药物中的用途。所述疟疾蛋白可为本文描述的任何蛋白，包括CS蛋白、AMA-1、TRAP、LSA-1和LSA-3。最优选地其为本文所述杂合形式的CS蛋白。
本发明还提供预防或减少严重疟疾的方法，该方法包括给予对象含在红细胞前期表达的疟疾抗原和佐剂的组合物。所述抗原和佐剂如本文所述。优选的对象是儿童，优选在本文所述年龄范围内。
适用于本发明的接种流程包括以1个月的间隔给予3剂疫苗。
严重疟疾可按照WHO临床实验规范指南(出处同上)定义。在本文所述研究中，用于定义严重疟疾的标准源自WHO临床实验规范指南，并在下表中给出。
作为主要终点，在所述研究中定义的疟疾临床发作要求存在在Giemsa染色的厚血涂片上＞15000/μl的恶性疟原虫无性寄生虫血症，并出现≥37.5℃的发热(腋下体温≥37.5℃)。
严重疟疾的定义是另外存在以下一种或多种严重疟疾贫血(PCV＜15％)、脑型疟(Blantyre昏迷记分＜2)或其它人体系统的严重疾病，所述疾病可包括多次癫痫发作(在之前的24小时中有两次或多次全身性抽搐)、虚脱(定义为不能独立地坐)、低血糖(＜2.2mmol/dL或＜40mg/dL)、临床可疑的酸中毒或循环衰竭。这些在下表1中给出。
严重疟疾病例定义
按照本发明，纯化杂合蛋白的水溶液可直接使用，或与合适的佐剂或载体组合使用。或者，所述蛋白可冻干，然后与合适的佐剂或载体混合。
本发明的优选疫苗剂量是1-100μg RTS，S/剂，更优选5-75μgRTS，S/剂，最优选25μg RTS，S蛋白/剂，优选在250μl(最终液体制剂)中。这是在儿童中使用的优选剂量，具体地说是5岁以下的儿童，更具体地说是1-4岁的儿童，代表优选成人剂量的一半。优选的成人剂量是1-100μg RTS，S/剂，更优选5-75μg RTS，S/剂，最优选50μgRTS，S/剂，在500μl(最终液体制剂)中。
按照本发明，所述抗原与佐剂或载体组合。优选存在佐剂，具体地说是为Th1型应答的优选刺激剂的佐剂。
合适的佐剂包括但不限于任何来源的脱毒脂质A和脂质A的无毒衍生物、皂苷和为Th1细胞应答(本文也称为Th1型应答)的优选刺激剂的其它免疫刺激剂。
广义上可将免疫应答分为两个极端类别，即体液或细胞介导的免疫应答(传统上分别以保护作用的抗体机制和细胞效应子机制为特征)。这些类别的应答已被命名为Th1型应答(细胞介导的应答)和Th2型免疫应答(体液应答)。
极端的Th1型免疫应答可以以抗原特异性的、单倍体限制的细胞毒性T淋巴细胞和天然杀伤细胞应答的产生为特征。在小鼠中，Th1型应答常常以IgG2a亚型抗体的产生为特征，而在人中，这些抗体对应于IgG1型抗体。Th2型免疫应答的特征在于产生一系列的免疫球蛋白同种型，在小鼠中包括IgG1。
可以认为位于这两种类型的免疫应答发展背后的驱动力是细胞因子。高水平的Th1型细胞因子倾向于支持诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子倾向于支持诱导针对抗原的体液免疫应答。
Th1和Th2型免疫应答的区别不是绝对的，可采取这两个极端类别之间的连续体形式。实际上，个体将支持被描述为主要是Th1或主要是Th2的免疫应答。然而，常常方便地按照Mosmann和Coffman(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1 and TH2 cellsdifferentpatterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.Annual Review of Immunology，7，145-173页)在鼠CD4+ve T细胞克隆中所描述的来考虑细胞因子家族。传统上，Th1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ有关。其它通常与Th1型免疫应答的诱导直接相关的细胞因子不由T细胞产生，如IL-12。相反，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)的分泌有关。
已知某些疫苗佐剂尤其适于刺激Th1或Th2型细胞因子应答。传统上，接种或感染后免疫应答的Th1∶Th2平衡的指示包括直接测量用抗原再刺激后由T淋巴细胞在体外产生的Th1或Th2细胞因子，和/或检测(至少在小鼠中)抗原特异性抗体应答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，Th1型佐剂是这样一种佐剂，其在用抗原体外再刺激时刺激分离的T细胞群产生高水平的Th1型细胞因子，并诱导与Th1型同种型相关的抗原特异性免疫球蛋白应答。
能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂描述于WO 94/00153和WO95/17209。
可被配制以生产适用于本发明的佐剂的优选Th1-型免疫刺激剂包括但不限于以下佐剂。
长久以来就已知肠细菌脂多糖(LPS)是一种有效的免疫系统刺激剂，但由于其毒性作用而被剥夺了其佐剂用途。Ribi等(1986，Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins，PlenumPubl.Corp.，NY，407-419页)已描述了LPS的一种无毒衍生物—单磷酰脂质A(MPL)，其通过去除中心的糖基团和由还原末端葡糖胺中去除磷酸酯而产生，具有以下结构
其它脱毒形式的MPL由去除二糖骨架3-位的酰基链产生，称为3-O-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。其可按照GB 2122204B中教导的方法纯化和制备，所述参考文献还公开了二磷酰脂质A及其3-O-脱酰化变体的制备。
优选形式的3D-MPL为具有直径小于0.2μm的小粒度的乳剂，其生产方法公开于WO 94/21292。含单磷酰脂质A和表面活性剂的水性制剂已描述于WO 9843670。
用于本发明的细菌脂多糖衍生的佐剂可由细菌来源纯化和加工，或替代性地其可为合成的。例如，纯化的单磷酰脂质A描述于Ribi等1986(出处同上)，来自沙门氏菌(Salmonella sp.)的3-O-脱酰单磷酰脂质A或二磷酰脂质A描述于GB 2220211和US 4912094。其它纯化的和合成的脂多糖也有描述(Hilgers等，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)141-6；和EP 0 549 074 B1)。特别优选的细菌脂多糖佐剂是3D-MPL。
因此，可用于本发明的LPS衍生物是在结构上类似于LPS或MPL或3D-MPL的免疫刺激剂。在另一个备选中，所述LPS衍生物可为酰化单糖，其是以上结构的MPL的一部分。
皂苷也是符合本发明的优选Th1免疫刺激剂。皂苷是众所周知的佐剂，教导于Lacaille-Dubois，M和Wagner H.(1996.A review of thebiological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine第2卷，363-386页)。例如，Quil A(来自南美Quillaja Saponaria Molina树的树皮)及其分离级分描述于US 5,057,540和“Saponins as vaccineadjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)1-55以及EP 0 362 279 B1。溶血皂苷QS21和QS17(HPLC纯化的Quil A分离级分)已被描述为有效的系统性佐剂，其生产方法公开于美国专利第5,057,540号和EP 0 362 279 B1。在这些参考文献中还描述了用作系统性疫苗的有效佐剂的QS7(Quil A的非溶血性级分)的用途。QS21的用途进一步描述于Kensil等(1991.J.Immunology 146卷，431-437)。QS21与聚山梨醇酯或环糊精的组合也为人所知(WO99/10008)。包含Quil A的分离级分如QS21和QS7的颗粒佐剂系统描述于WO 96/33739和WO 96/11711。
另一种优选的免疫刺激剂是含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸基序的缩写。本领域已知CpG是通过全身和粘膜途径给予的佐剂(WO 96/02555、EP 468520，Davis等，J.Immunol，1998，160(2)870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)4463-6)。历史上观察到BCG的DNA部分能够发挥抗肿瘤作用。在进一步的研究中，来自BCG基因序列的合成寡核苷酸表现出能够诱导免疫刺激作用(体内和体外都如此)。这些研究的作者得出结论包含中心CG基序的某些回文序列具备此活性。之后在Krieg的出版物Nature 374，546页1995中阐释了CG基序在免疫刺激中的核心作用。详细的分析已表明CG基序必须处于一定的序列背景中，并且这些序列在细菌DNA中常见，但很少处于脊椎动物DNA中。免疫刺激性序列常常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序未被甲基化，但已知其它未甲基化的CpG序列是免疫刺激性的，并且可用于本发明。
在某些6核苷酸组合中存在回文序列。若干这些基序可在同一寡核苷酸中以一种基序的重复或不同基序的组合存在。一种或多种这些含免疫刺激性序列的寡核苷酸的存在可以激活各种免疫亚群，包括天然杀伤细胞(其产生干扰素γ并具有溶细胞活性)和巨噬细胞(Wooldrige等，89卷(第8章)，1977)。其它含未甲基化CpG但不具有这一共有序列的序列现在也已被证实具有免疫调节性。
当配制成疫苗时，CpG通常在游离溶液中与游离抗原一起给予(WO 96/02555；McCluskie和Davis，出处同上)，或共价缀合至抗原(WO 98/16247)，或与例如氢氧化铝的载体一起配制((肝炎表面抗原)Davis等，出处同上；Brazolot-Millan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。
上述这种免疫刺激剂可以与载体一起配制，所述载体例如为脂质体、水包油乳剂和/或金属盐，包括铝盐(如氢氧化铝)。例如，3D-MPL可与氢氧化铝(EP 0 689 454)或水包油乳剂(WO 95/17210)一起配制；QS21可有利地与含有胆固醇的脂质体(WO 96/33739)、水包油乳剂(WO 95/17210)或铝佐剂(WO 98/15287)一起配制；CpG可以与铝佐剂(Davis等，出处同上；Brazolot-Millan出处同上)或其它阳离子载体一起配制。
还优选免疫刺激剂的组合，具体地说是单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合(WO 94/00153、WO 95/17210、WO 96/33739、WO98/56414、WO 99/12565、WO 99/11241)，更具体地说是如WO 94/00153所公开的QS21和3D-MPL的组合。或者，CpG加皂苷(如QS21)的组合也构成了用于本发明的有效佐剂。
因此，适宜的佐剂系统包括如单磷酰脂质A(优选3D-MPL)连同铝盐的组合。增强系统包括单磷酰脂质A与皂苷衍生物的组合，具体地说是如WO 94/00153公开的QS21和3D-MPL的组合，或如WO96/33739公开的较低反应原性组合物，其中QS21在含有胆固醇的脂质体(DQ)中被猝灭。
特别有效的佐剂制剂包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚，其描述于WO 95/17210，是用于本发明的另一种优选制剂。
另一种优选制剂包含单独的CpG寡核苷酸或与QS21、3D-MPL一起的CpG寡核苷酸或与铝盐一起的CpG寡核苷酸。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供脱毒脂质A或无毒脂质A衍生物(更优选单磷酰脂质A或其衍生物，如3D-MPL)与本文描述的疟疾抗原的组合用于生产预防严重疟疾疾病的疫苗的用途。
优选地，额外地使用皂苷，优选QS21。
优选地，本发明还使用水包油乳剂或脂质体。
用于本发明的优选佐剂组合是1.3D-MPL、QS21和水包油乳剂。
2.在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21。
3.在脂质体制剂中的3D-MPL、QS21和CpG。
选择每剂疫苗中存在的本发明蛋白的量，其为在典型疫苗中诱导免疫保护应答而无显著不良副作用的量。这种量将根据使用的具体免疫原和疫苗是否佐剂化而变化。一般来说，预期每剂将含1-1000μg蛋白，优选1-200μg，最优选10-100μg。具体疫苗的最佳量可通过包括观测对象中抗体滴度和其它反应的标准研究来确定。在初次接种后约4周对象优选接受加强，此后只要存在感染风险，每6个月重复加强。RTS，S蛋白的优选量也同上文给出的一样。
本发明的疫苗可通过多种途径中的任一种提供，所述途径例如为口服、局部、皮下、粘膜(通常为阴道内)、静脉内、肌内、鼻内、舌下、皮内和通过栓剂。
免疫可为预防性的或治疗性的。本文描述的本发明主要地但非排它性地涉及抗疟疾的预防性接种，更具体地说是预防或降低严重疟疾疾病可能性的预防性接种。用于本发明的合适的药物可接受载体或赋形剂在本领域众所周知，包括例如水或缓冲液。疫苗制备一般描述于PharmaceuticalBiotechnology，61卷Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach，Powell和Newman编辑，Plenum Press New York，1995New Trends andDevelopments in Vaccines，Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。脂质体中的包囊化描述于例如Fullerton的美国专利4,235,877。蛋白质与大分子的缀合公开于例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757。
实施例材料和方法研究区域该实验于2003年4月至2004年5月间在莫桑比克南部 地区(Maputo省)的Centro de em Saude da [CISM] 健康研究中心)进行。该区域的特征已在它处9详述。气候是具有两个明显不同季节的亚热带气候由11月至4月的温暖多雨季节，以及在一年其余时间中一般来说冷且干燥的季节。2003年当中的年降雨量是1286mm。具有显著季节性的终年疟疾传播主要归因于为主要载体的恶性疟原虫不吉按蚊(P.falciparum.Anophelesfunestus)，2002年的估测昆虫接种率(EIR)为38。基于阿莫地喹和磺胺多辛-乙胺嘧啶(SP)的联合治疗是用于无并发疟疾的一线疗法，可容易地在卫生机构使用。 健康中心邻近CISM，是一个110个床位的转诊级卫生机构。地区卫生网络由另外8个周边的卫生所和乡村医院组成。
研究设计研究是双盲的、随机的和受控的IIb期实验，以评价GSKBiologicals的RTS，S/AS02A疟疾疫苗的安全性、免疫原性和效力。首要目标是评价由第3剂后14天开始的6个月监视期内初次接种的1-4岁儿童中抗恶性疟原虫疟疾临床发作的效力。
该实验设计用于检验疫苗在生命周期和疟疾发病中的两个时间点感染和临床疾病中的效力。这两个终点在基于两个不同地点的两个同龄组中被同时检测到(

图1)。同龄组1由 周围10Km半径的区域征募，有助于评价抗临床疾病的保护作用的主要终点，该终点通过在 健康中心和Maragra卫生所的被动病例检验测定。同龄组2在 北部55km的农业和沼泽低地区域Ilha Josina征募，之后进行跟踪，以通过主动和被动监视的组合检测新感染。
对于同龄组1，假定在监视期内在对照组中的临床恶性疟原虫发病率为11％以及疫苗效力为50％，则为了具有80％能力以检测15％疫苗效力的置信下限，需要每组704个可评价对象。对于同龄组2，假定在监视期内新感染率为50％，则为了提供86％能力来以20％置信下限检测预防新感染的50％疫苗效力，需要每组116个可评价儿童。
方案得到莫桑比克国家伦理审查委员会、巴塞罗那医院门诊伦理审查委员会和适宜卫生科技组织(PATH)人体保护委员会批准。该实验按照ICH临床实验规范指南进行，由GSK Biologicals监控。局部安全性监测委员会以及资料和安全性监测委员会密切检查该实验的进行和结果。
筛选与知情同意CISM在研究区域运行人口统计学监视系统10。由该人口普查产生潜在合格的常驻儿童名单。他们在家接受访问，给父母或监护人念信息表，并核对征募标准。这些标准包括被证实在研究区域居住，用EPI疫苗完整地免疫。感兴趣的父母/监护人被邀请至 健康中心或Ilha Josina卫生所。在首次访问时，再读信息表，并由专门受过培训的职员向父母/监护人群体解释。只有在他们通过设计用于检查对该信息的理解的个人口头理解测试之后才征求个人同意。然后邀请他们签署(或者不识字的话按拇指印)知情同意文件。委员会成员担任公证员，会签同意表。筛选包括简单的病史和检查、扎指采血进行血液学和生化检查。
如果儿童具有变态反应病史、血细胞容量小于25％、营养不良(身高别体重≤3Z记分)、具有临床显著的慢性或急性病或异常血液学或生化参数，则将他们排除在参与者以外。合格的受试者招收入研究中，在接种的第一天开始，给予独有的研究编号和单独的照片身份证。
随机化和免疫征募了1-4岁的2022个儿童并随机化，以在 健康中心或Ilha Josina卫生所接受3剂RTS，S/AS02A侯选疟疾疫苗或对照接种方案。在GSK Biologicals使用方块图(1∶1比率，块大小＝6)进行随机化。
RTS，S由在酵母中重组表达的杂合分子组成，其中CS蛋白10，11中心串联重复区和羧基末端区以N末端融合至颗粒中的乙肝病毒S抗原(HBsAg)，所述颗粒还包含未融合的S抗原。全剂量的RTS，S/AS02A(GlaxoSmithKline Biologicals，Rixensart，Belgium)含50μg冻干RTS，S抗原，其在500μL AS02A佐剂(含各50μg的免疫刺激剂3D-MPL[Corixa Inc.，WA，USA]和QS21的水包油乳剂)中重构。在该实验中使用一半成人剂量；即250μL剂量体积，在250μLAS02佐剂(含各25μg的3D-MPL和QS21)中含25μg RTS，S抗原。
因为常规乙肝疫苗接种已于2001年7月引入了莫桑比克的EPI程序，所以12-24个月龄的儿童已经接受了乙肝疫苗免疫。因此，不足24个月的儿童在第1次和第3次接种时接受两剂7价肺炎球菌缀合物疫苗(PrevnarWyeth Lederle Vaccines，New Jersey，USA)，以及在第2次接种时接受1剂嗜血流感杆菌(Haemophilus influanzae)b型疫苗(HiberixTMGlaxoSmithKline Biologicals，Rixensart，Belgium)作为对照疫苗。对于24个月以上的儿童，对照疫苗是预防性乙肝疫苗(Engerix-BGlaxoSmithKline Biologicals，Rixensart，Belgium)。对照组给予全剂量(0.5ml剂量体积)。
RTS，S/AS02A和对照疫苗按照0、1、2月接种程序交替地在臂的三角肌部位肌内给予。因为所使用疫苗的外观和体积截然不同，所以采取特别的防范措施以确保实验的双盲特性。接种小组准备了疫苗并在接种前用不透明带遮住了注射器的内容物。该小组不参与任何其它研究程序，包括终点监视。
安全性和反应原性的随访在每次接种后，观察研究参与者至少1小时。受过培训的外勤人员在随后的3天每天到家里看望儿童，以记录任何不良事件。记录此阶段内诉求的局部和全身不良事件12。通过医院发病率监视系统记录每剂后30天的未经诉求的不良事件。以相似方式检测严重不良事件(SAE)，并在整个研究中进行记录。由第3剂后的60天开始，研究儿童每月在家接受一次访问。在访问期间，检查居住状况，记录未报告的SAE。监测所有参与者的血液学和生化参数；在第3剂后1个月进行全血计数，并在第3剂后的1个月和6个半月监测肌酐、丙氨酸氨基转移酶[ALT]和胆红素。
免疫原性评价在第1剂前测定所有参与者中的乙肝表面抗原(HBsAg)状态。在第1剂前以及第3剂后的30天和6个半月时检测同龄组1中的抗CS抗体，在这些相同的时间点检测同龄组2中的抗HBs抗体。在筛选时测定两个同龄组的间接荧光抗体测试(IFAT)。
效力评价基于卫生机构的发病率监视系统从1997年运行至今13，目前已在 健康中心以及Maragra和Ilha Josina的卫生所建立。在全部3个机构中，项目医务人员一天24小时在岗，以通过个人ID卡识别研究参与者并确保标准化记录和合适的药物管理。
所有在前24小时内报告发热或具有记录到的发热(腋下体温≥37.5℃)的儿童都进行采血，以双份薄或厚血涂片测定疟疾寄生虫，以及以微毛细管测定红细胞压积(PCV)。患有准许入院的临床病症的儿童进入 健康中心。入院时进行更详细的临床史和药物检查，并由医生记录在标准表格上。出院时记录实验室试验结果和最终诊断结果。临床管理按照标准国家指引进行。
在同龄组2中进行主动感染检查(Actived Detection ofInfection)(ADI)。在开始监视疟疾感染前4周，用阿莫地喹(10mg/kg口服3天)和SP(单剂口服25mg/kg磺胺多辛和1.25mg/kg乙胺嘧啶)的组合推测地清除无症状寄生虫血症。两周后检查无寄生虫血症的情况，阳性者用二线疗法(Co-Artem)治疗，并由进一步的ADI评价排除。监视在第3剂后14天开始，在之后的两个半月中每两周进行1次，然后在再往后的两个月中每月进行1次(图1)。在每次访问时，外勤人员到家里看望儿童，完成一个简单的病况调查表，并记录腋下体温。如果儿童是无热的，则通过扎指将血液收集到载玻片和滤纸上。如果发现儿童有发热或有发热史，则陪伴该儿童到卫生所，在那里对他/她进行检查并收集血片。所有具有ADI阳性血片的儿童不管有无症状都进行治疗。
在两个同龄组中于第3剂后6个半月进行横断面调查。在该访问期间测定腋下体温和脾大小(Hackett度量法)，并制备血片。
实验室方法为测定寄生虫的存在情况和恶性疟原虫无性期的密度，按照标准质控方法读取Giemsa染色血片14。在巴塞罗那医院门诊部进行外部验证。使用干式生化光度计VITROS DT II(Orto Clinical Diagnostics，Johnson & Johnson Company，USA)检测生化参数。血液学测试使用Sysmex KX-21N细胞计数仪(Sysmex Corporation Kobe，Japan)进行。红细胞压积(PCV)在肝素化微毛细管中用微型血细胞容量离心机离心后使用Hawksley血细胞容量读数器检测。
用标准血清作为参比，使用含序列[NVDP(NANP)15]2LR的重组抗原R32LR吸附的平板，通过标准ELISA检测环子孢子蛋白串联重复表位的特异性抗体。用市售试剂盒(ETI-MAK-4 DIASORIN)通过ELISA测定HBsAg的存在情况。用市售试剂盒(Abbott的AUSAB EIA)通过ELISA检测抗HBsAg抗体水平。对于IFAT测定，将25μl的测试血清(两倍连续稀释一直到1/81920)与固定在载玻片上的血液期恶性疟原虫寄生虫温育。用FITC标记的二抗伊文氏蓝(Evans Blue)显示阳性反应。记录在UV光学显微镜下发出阳性荧光的最高稀释度。
定义和统计学方法在同龄组1中评价的主要终点是有症状的恶性疟原虫疟疾首次临床发作的时间。临床发作被定义为由于液下体温≥37.5℃而被送至卫生机构且存在高于2500/μl的恶性疟原虫无性寄生虫血症的儿童。已推测出该病例定义为91％特异性和95％灵敏度15。第二个和第三个终点包括对不同定义的临床疟疾的疫苗效力估计和检查多次发作。
所有的入院病例都由两组医师独立地检查，以便确立最终诊断，差异在未盲前的协商会上解决。在其中疟疾被判断为患病的唯一原因或显著致病因素的恶性疟原虫无性寄生虫血症儿童中，确定需要入院的疟疾。严重疟疾的病例定义来源于WHO的临床实验规范指南16。严重疟疾的所有病例都需要具有无性恶性疟原虫寄生虫血症并没有其它更可能的病因。所述定义是严重疟疾贫血(PCV＜15％)、脑型疟(Blantyre昏迷记分＜2)和其它人体系统的严重疾病的复合，所述严重疾病为多次癫痫发作(在之前的24小时中至少有两次或多次全身性抽搐)、虚脱(定义为不能独立地坐)、低血糖(＜2.2mmol/dL)、临床怀疑的酸中毒或循环衰竭。
效力的按照方案(ATP)分析包括满足所有合格标准、完成接种程序并有助于效力监视的受试者。除了评价全因入院以外，还根据研究区域的缺乏情况和抗疟疾药物的使用调整时间风险。为分析临床疟疾的多次发作，在先前发作后28天内受试者被认为是不易感的。
关于首次临床疟疾发作或疟疾感染的时间，疫苗效力使用Cox回归模型评价，被定义为1减去危害比。疫苗效力根据预先确定的年龄共变、蚊帐应用情况、地理区域和距健康中心的距离而调整。使用基于Schoenfeld残差17的测试和时间依赖性Cox模型18用图表研究比例危害假设。对于多次发作的临床疟疾和入院，使用具有正交随机截矩的Poisson回归模型评价群体效应，包括作为偏置变量的时间风险。疫苗效力定义为1减去率比。全文报告调整过的疫苗效力。
其它探察分析包括对严重疟疾和入院疟疾的分析，为此使用Fishers确切检验对比具有至少一次发作的儿童比例差。在确切的95％置信区间下以1减去风险比计算VE19。使用Fishers确切检验评价8个半月时的贫血发病率(PCV＜25％)差异和阳性寄生虫密度比例。使用非参数Wilcoxon检验评价治疗对血细胞容量值和阳性密度几何平均值的作用。
相似的方法学用于治疗意图(ITT)分析。由第1剂开始的时间风险未针对研究缺乏或药物使用情况而调整，效力评价未针对共变而调整。
抗CS和抗HBsAg抗体数据通过具有95％CI的几何平均滴度(GMT)总结。计算抗CS滴度的血清反应阳性率(定义为＞0.5EU/mL)。计算抗HBs滴度的血清保护率(定义为≥10mIU/mL)。使用SAS20和STATA21进行分析。
结果同龄组1和2的实验概图示于图2a和2b。在每个同龄组中，随机化产生相仿的儿童组(表1)。所有的指标都表明，同龄组2的研究区域中的疟疾传播强度高于同龄组1。
疫苗安全性RTS，S/AS02A和对照疫苗是安全的和良好耐受的；两个组中92％以上的受试者接受全部3剂。局部和全身性的诉求不良事件是短时期的，在强度上大部分是温和的或适中的。3级局部或全身不良事件是不常见的和短时期的。在RTS，S/AS02A和对照组中，分别有7例(0.2％)和1例(0.03％)在给药后出现臂部活动受限的局部注射部位疼痛，分别有224例(7.7％)和14例(0.5％)在给药后出现＞20mm的注射部位肿胀。在RTS，S/AS02A和对照组中分别有55例(1.9％)和23例(0.8％)在给药后出现阻碍正常活动的全身性诉求不良事件(发热、过敏、瞌睡、厌食)。在RTS，S/AS02A和对照组中分别有653名(64.5％)受试者和597名(59.1％)受试者报告了至少一个未诉求不良事件。在实验过程中，安全性实验室值基本由基线保持不变。
有429例报告的SAERTS，S/AS02A组有180例[17.8％]，相比之下对照组有249例[24.7％]。在研究中有15例死亡RTS，S/AS02A组5例
，对照组10例[1.2％]。4例死亡以疟疾为显著致病因素，全部4例都在对照组。没有严重不良事件或死亡被判定为与接种相关。
免疫原性研究儿童中的接种前抗CS抗体滴度低。疫苗是免疫原性的，在第3剂后诱导高抗体水平，在6个月内衰减至初始水平的约，但仍大大高于基线值。对照组中的抗体水平在整个随访期都保持很低。所述疫苗还诱导高水平的抗HbsAg抗体(超过97％血清保护率)(表2)。对于CS和HbsAg这二者，所述疫苗的免疫原性在24个月龄以下的儿童中较高。
疫苗效力在于同龄组1中进行的ATP分析中，有282名具有首次或唯一一次临床发作的儿童满足原发性病例定义(在RTS，S/AS02A组中为123名，在对照组中为159名)，获得的原制疫苗效力评价为26.9％(95％CI7.4％-42.2％；p＝0.009)，调整后的评价为29.9％(95％CI11％-44.8％；p＝0.004)(图3a和表3)。临床疟疾首次发作的儿童中的无性期寄生虫密度不受接种影响，因为病发时RTS，S/AS02A组和对照组的几何平均密度分别为43522/μL和41867/μL(p＝0.915)。
当使用不同方法分析时(使用Schoenfeld残差检验危害比[p＝0.139])，按照在主要终点中的定义，在6个月的观察期内没有效力衰减的证据。与这些数据相一致，在第3剂后6个半月的横断面调查中，RTS，S/AS02A接受者中的寄生虫血症发病率不到37％(在RTS，S/AS02A中为11.9％，相比之下在对照组中为18.9％，p＜0.001)。这些儿童中的寄生虫密度在RTS，S接受者和对照之间是相似的(几何平均密度2271对2513；p＝0.699)。
几乎没有儿童经历一次以上的发作，该终点的疫苗效力是VE＝27.4％[95％CI6.2％-43.8％；p＝0.014])。对于基于寄生虫密度截止值的不同病例定义，VE推定值未显著改变(表3)。由第1剂开始的临床疾病时间的ITT分析获得30.2％的VE(95％CI14.4％-43.0％；p＜0.001)。在ATP分析中，伴随发作的贫血(PCV＜25％)在RTS，S/AS02A组有26例，在对照组有36例(VE＝28.2％[95％CI-19.6％-56.9％；p＝0.203])。在8个半月时的贫血发病率对照组为0.29％，相比之下疫苗组为0.44％，p＝0.686。
在RTS，S/AS02A组中，有11名儿童具有至少一次严重疟疾发作，而在对照组中有26名儿童(VE＝57.7％[95％CI16.2％-80.6％；p＝0.019])。在RTS，S/AS02A组中，有42名患疟疾儿童需要入院，相比之下对照组为62名(VE＝32.3％[95％CI1.3％-53.9％；p＝0.053])。在两组之间有相似数量的全因入院(79对90；VE＝14.4％[95％CI-19.7％-38.8％；p＝0.362])。
在同龄组2中测定减少首次感染时间的疫苗效力评价值。有323名首次或唯一一次无性恶性疟原虫寄生虫血症发作的儿童(RTS，S/AS02A组157名，对照组166名)，获得VE评价为45％(95％CI31.4％-55.9％；p＜0.001)(图3b和表3)。对照组和RTS，S/AS02A组首次感染时的无性期寄生虫平均密度是相似的(3950/μL对3016/μL，p＝0.354)。使用和用于评价同龄组1的效力持久性的方法相同的方法，具有最佳拟合的模型提示疫苗效力随时间衰减，稳定在约40％。RTS，S/AS02A组中的无性恶性疟原虫寄生虫血症的发病率在随访结束时显著低于对照组(分别是52.3％对65.8％；p＝0.019)。在8个半月时的贫血发病率对照组为2.7％，RTS，S/AS02A组为0.0％(p＝0.056)。
没有证据表明年龄和疫苗效力之间有相互影响，提示效力未随着年龄增加而显著改变。但是，我们未进行进一步的探索性亚组分析来评价承受疟疾疾病攻击的较年幼组中的疫苗效力。在不足24个月龄的儿童中，在第1剂时在RTS，S/AS02A接受者(N＝173)中有3例严重疟疾，而在对照组接受者(N＝173)中有13例(VE＝76.9％[95％CI27.0％-96.9％；p＝0.018])。对首次或唯一一次临床疟疾发作的发病率进行相似的分析。在RTS，S/AS02A组和对照组中，在较年幼儿童中分别有31例和47例疟疾发作，产生的发病率为0.41和0.70发作PYAR(VE＝46.7％[95％CI14.8％-66.7％；p＝0.009])。抗新感染的VE在较年长和较年幼组中是相似的(44.0％对46.5％)。
在同龄组1中评价CS滴度和疟疾保护作用之间的关系。CS滴度每增加10倍的危害比是0.94(95％CI0.66-1.33；p＝0.708)；CS反应较高的1/4受试者对CS反应较低的1/4受试者的危害比为1.38(95％CICI 0.89-2.12；p＝0.150)。
讨论RTS，S/AS02A是首个在年幼非洲儿童中同时赋予抗恶性疟原虫引起的感染和临床疾病谱的保护作用的亚单位疫苗。结果表明，基于诱导部分抗感染保护的单一红细胞前期抗原的疫苗可降低发病率，即便没有血液期组分。
在年幼非洲儿童中，RTS，S/AS02A被良好耐受，其反应原性谱类似于在先前的该疫苗的儿科实验中所观察到的。局部和全身性症状比在对照疫苗组中更常见，但没有导致受试者退出。所述疫苗是安全的；接受RTS，S/AS02A的儿童体验到的全因严重不良事件、入院和严重疟疾并发症比对照组少。正如已由其它干涉实验所观察到的，我们的研究参与者中的发病率低于该群体中的历史背景发病率9。
尽管高水平地暴露于恶性疟原虫子孢子，但在该群体中天然存在的抗CS抗体水平很低。所述疫苗是高度免疫免疫原性的，尤其是在不足24个月的儿童中。抗体水平在6个月内衰减达约75％，但在随访期结束时其仍远远高于免疫前水平。在RTS，S/AS02A参与者中，我们未检测到抗CS抗体水平和疟疾风险之间的联系。但是，几乎所有疫苗接受者都达到的高滴度和可能存在免疫性的相对低阈值保护水平的可能性潜在地限制了该分析。另外，已知疫苗诱导一般被认为参与保护作用的细胞介导应答，该应答在本研究中未检测到22。
所述疫苗抗感染的效力与该红细胞前期疫苗中和子孢子并限制感染的肝细胞数或进入血流的肝期裂殖子数的已知能力相一致5。所述结果还表明，抗感染的保护作用与抗温和性无并发疾病、疟疾入院和严重疟疾的保护作用之间有显著一致性。尽管似乎有趋势提示较年幼儿童中的效力和对更严重终点的效力较高，但不同终点的置信区间重叠，观察到的差异可能源于偶然性。观察到的抗不同终点的保护作用提示，更容易检测的感染终点可用作抗临床疾病的疫苗效力的替代。
我们意外地没有观察到贫血病例中的显著差异。尽管所述趋势针对在RTS，S/AS02A疫苗接受者中出现的少量病例，但研究当中的疟疾贫血率远低于预期，这限制了检测针对该终点的统计学显著疫苗效力的能力。强烈提醒母亲或监护人在病程早期带其子女到卫生机构可能确保了对疟疾病例的迅速治疗，降低了贫血发病率。另外，莫桑比克最近转换成一种更有效的疟疾一线疗法，接受了这些药物的实验中的儿童更快速地清除了寄生虫，复发较少，因此感染时程较短。这些干涉的每一个都对所观察到的贫血发病率有影响。
使用统计学方法检测衰减效力，提示在整个观察期内都有持续的抗新感染和临床疾病这二者的疫苗效力，在最后的横断面调查中，感染发病率有显著差异。这与在未感染过疟疾的志愿者或冈比亚成人中进行的实验形成强烈反差，所述实验提示疫苗效力是短期的6，23。对这些明显矛盾的结果有几个可能的解释。首先，所述疫苗在本研究群体中的免疫原性远比其在成人中的免疫原性强，持续的免疫应答可能产生持久的保护效力。其次，在本实验中存在的较高水平的子孢子暴露可能产生天然加强的保护性免疫应答，其不能通过抗体检测来揭示。对研究群体保持监视，以监测长期安全性和疫苗效力时程。
本实验一个最值得注意的发现是记录到58％的抗严重疟疾的效力，以及其在较年幼儿童中可能更高的提示。尽管严重疟疾的定义是一个持续争论的问题，但按照基于WHO的定义鉴别患病非常严重的儿童和高危垂死儿童的儿童分类法几乎没有疑问。
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权利要求
1.疟原虫(Plasmodium)抗原在生产药物中的用途，所述疟原虫抗原在红细胞前期表达，所述药物用于抗严重疟疾疾病的接种，所述疟原虫抗原与药物可接受的佐剂或载体组合。
2.权利要求1的用途，其中所述目标群体为5岁以下的儿童。
3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述目标群体为1-4岁的儿童。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述抗原选自CS、LSA-1、LSA-3、AMA-1、Exp-1或其免疫原性片段。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述抗原为融合至乙肝表面抗原(HBsAg)的子孢子抗原。
6.权利要求4或权利要求5的用途，其中所述子孢子抗原为环子孢子蛋白(CS)或其免疫原性片段。
7.权利要求6的用途，其中所述CS蛋白或片段为杂合蛋白形式，所述杂合蛋白含基本上全部的疟原虫(Plasmodium)CS蛋白的C端部分、4个或更多个串联重复的CS蛋白免疫显性区以及乙肝表面抗原(HBsAg)。
8.权利要求7的用途，其中所述杂合蛋白包含基本上对应于恶性疟原虫(P.falciparum)NF54品系3D7克隆CS蛋白的氨基酸207-395的恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白序列，所述CS蛋白序列经线性接头按照读框融合至HBsAg的N末端。
9.权利要求8的用途，其中所述杂合蛋白为RTS。
10.权利要求9的用途，其中所述RTS为混合颗粒RTS，S形式。
11.权利要求10的用途，其中RTS，S的量为每剂25μg。
12.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述抗原与佐剂组合使用，所述佐剂为Th1细胞应答的优选刺激剂。
13.权利要求12的用途，其中所述佐剂包括3D-MPL、QS21或3D-MPL和QS21的组合。
14.权利要求13的用途，其中所述佐剂还包括水包油乳剂。
15.权利要求13的用途，其中所述佐剂还包括脂质体。
全文摘要
本发明涉及疟疾抗原免疫对抗疟疾疾病的新用途。具体地说，本发明涉及子孢子抗原、具体地说为环子孢子(CS)蛋白或其片段免疫对抗严重疟疾疾病的用途。
文档编号A61P33/06GK101056653SQ200580038022
公开日2007年10月17日 申请日期2005年9月14日 优先权日2004年9月16日
发明者J·D·科亨, N·G·托尔尼波特 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司