改良的腺病毒载体及其应用的利记博彩app

专利名称：改良的腺病毒载体及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及医药领域、特别涉及通过使用在疫苗组合物中包含治疗性核酸的重组嵌合腺病毒载体而进行治疗和预防的领域。
背景技术：
重组腺病毒载体广泛用于基因治疗和疫苗。迄今为止，已经鉴别了51种不同的腺病毒血清型。对亚群C腺病毒的应用如基因治疗已经进行了最深入的研究，尤其是血清型2和5(Ad2和Ad5)在本领域广泛应用。重组Ad5用于多种不同目的，包括免疫接种。重要的是，基于Ad5载体的疫苗已经示出在多种动物模型中引起强保护性免疫应答。此外，正在进行对HIV免疫接种的大规模临床试验，其中使用基于Ad5的重组载体(WO 01/02607；WO 02/22080；Shiver et al.2002；Letvin et al.2002；Shiver and Emini.2004)。然而，基于重组Ad5载体的HIV及其它病原体的疫苗的应用很可能明显受到人群中Ad5特异性中和抗体(NAb)的高血清阳性率的限制。在小鼠和恒河猴中的研究已经显示出抗Ad5免疫性的存在显著抑制基于Ad5的疫苗的免疫原性。来自1期临床试验的早期数据显示这种问题也可能发生在人体中(Shiver 2004)。
一种有希望绕开先前感染了最常见的人腺病毒(如Ad5)的个体中预先存在的免疫性的存在的策略包括从未遭遇这种预先存在的免疫性的腺病毒血清型开发重组载体。经鉴别特别有用的人腺病毒载体是基于血清型11、26、34、35、48、49和50，如WO 00/70071、WO 02/40665和WO 2004/037294所述(也见于Vogels et al.2003所述)。其它研究人员已经发现腺病毒24(Ad24)也是特别令人感兴趣的，因为已表明其是罕见的血清型(WO 2004/083418)。
一种相似的策略基于使用猿猴腺病毒，因为这些腺病毒典型地不感染人体。它们在人体样品中呈现低血清阳性率。然而，它们也可用于人体，因为这些病毒可在体外感染人体(WO 03/000283；WO2004/037189)。
已经示出基于腺病毒血清型35(Ad35)载体的疫苗可以引起不被抗Ad5免疫性所明显抑制的强细胞免疫应答(Barouch et al.2004；Vogels et al.2003)。相似地，已经示出黑猩猩腺病毒引起受抗Ad5免疫性影响最低的免疫应答(Farina et al.2001；Pinto et al.2003)。近年来证实中和抗体(NAb)和CD8+T淋巴细胞应答均有助于抗Ad5免疫性，而Ad5特异性NAb看起来发挥主要作用(Sumida et al.2004)。尽管这种进展看起来是非常有用的方案，但在没有预先存在的Ad5免疫性的研究中表明基于Ad35载体的疫苗在小鼠中的免疫原性低于基于Ad5载体的疫苗(Barouch et al.2004)。
显然，本领域需要另外的腺病毒载体，其在宿主中不遭遇预先存在的免疫性，但仍然是免疫原性的并且能诱导针对由插入到载体所携带的核酸中的异源核酸编码的蛋白质的强免疫应答。
附图简述

图1(A)示出来自美国、海地、博茨瓦纳、赞比亚和南非的样品中Ad5、AdI1和Ad35的血清阳性率百分比；(B)示出来自美国和来自非洲的样品中抗Ad5、AdI1和Ad35的中和抗体效价。图1C示出这些样品中抗Ad5、Ad5f35、Ad5f35p35、Ad35f5和Ad35的中和抗体效价。
图2(A)示出编码Ad35k5纤维蛋白(fiber protein)的核酸序列(SEQ ID NO1；下划线示出编码Ad5纤维knob的部分)；(B)示出Ad35k5纤维蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2；下划线处代表Ad5纤维knob的部分)；(C)示出编码Ad35f5纤维蛋白的核酸序列(SEQ IDNO4；下划线处示出编码保留的Ad35纤维片段的部分，而BsiWI克隆位点以小写字母表示)；(D)示出Ad35f5纤维蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO5；下划线处代表保留的Ad35纤维片段部分)；(E)示出编码Ad35k2 6纤维蛋白的核酸序列(SEQ ID NO80；下划线处示出编码Ad2 6纤维knob的部分)；(F)示出Ad35k2 6纤维蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO81；下划线处代表Ad2 6纤维knob部分)；(G)示出编码Ad35k4 9纤维蛋白的核酸序列(SEQ ID NO82；下划线处示出编码Ad4 9纤维knob的部分)；(H)示出Ad35k49纤维蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO83；下划线处示出Ad4 9纤维knob部分)。
图3示出给未进行过实验的小鼠(naive mice)注射携带SIV gag编码基因的Ad5、Ad35fib5.BSU、Ad35.BSU和Ad35载体与注射空白载体(Ad5.empty和Ad35.empty)的小鼠相比所诱导的针对SIV gag的T细胞应答。Y轴表示SFC/106脾细胞。
图4示出表达SIV Gag的Ad5、Ad35k5和Ad35载体在未进行过实验的小鼠中的免疫原性，用109vp(A)和108vp(B)免疫，或者在用108vp的各载体免疫之前注射一次(C)或两次(D)1010vp Ad5-Empty进行预免疫(pre-immunization)。在所有情况中，在免疫后的多个时间点通过Db/AL11四聚体结合分析评价Gag-特异性CD8+T淋巴细胞应答。
图5示出小鼠中由Ad35k5载体引起的抗载体免疫性。(A)从未进行过实验的C57/BL6小鼠在第0周用109vp Ad35k5-Gag初次免疫并在第4周用109vp Ad5-Gag或Ad35-Gag加强。(B)在Ad5和Ad35基于荧光素酶的病毒中和分析中评价的用109vp Ad5-Gag、Ad35k5-Gag或Ad35-Gag注射的小鼠血清样品。
图6示出在小鼠中表达HIV-I Env的Ad5、Ad35k5和Ad35载体的免疫原性。将从未进行过实验的Balb/c小鼠用108vp Ad5-Env、Ad35k5-Env或Ad35-Env免疫。(A)通过混合肽(pooled peptide)和MIlO表位肽特异性IFN-γ ELISPOT分析评定的Env特异性细胞免疫应答。(B)通过ELISA评定的Env特异性体液免疫应答。
图7示出在第0周用1011vp Ad5-Gag(A、B)、Ad35-Gag(C、D)和Ad35k5-Gag(E、F)初次免疫的恒河猴中Ad5、Ad35k5和Ad35载体的免疫原性。在第12周，所有猴子均接受同源加强免疫。Env-和Gag-特异性细胞免疫应答在免疫后的多个时间点通过混合肽IFN-γELISPOT分析评定(A、C、E)。载体特异性NAb效价通过Ad5和Ad35病毒中和分析评定(B、D、F)。
图8示出在图7描述的研究中猴子中CD4+和CD8+T淋巴细胞应答。使用在免疫后第16周从猴子中获取的CD8耗竭的及CD4耗竭的PBMC进行混合肽IFN-γELISPOT分析。猴子在第0周和第12周接受1011vp(A)Ad5-Gag、(B)Ad35-Gag或(C)Ad35k5-Gag。
图9示出在接受(A)109vp、(B)108vp或者(C)107vp的未进行过实验的小鼠中Ad5-Gag、Ad5HVR48(1)-Gag和Ad5HVR48(1-7)载体的免疫原性。Gag-特异性CD8+T淋巴细胞应答在免疫后的多个时间点通过Db/ALll四聚体结合分析评定。
图10示出在免疫之前8周和4周注射两次1010vp Ad5-Empty预免疫的、接受(A)109vp、(B)108vp或者(C)107vp的小鼠中Ad5-Gag、Ad5HVR48(1)-Gag和Ad5HVR48(1-7)载体的免疫原性。
图11示出基于Ad5的六邻体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO12)，其中在7个HVR处掺入了来自Ad48的7个相应HVR(下划线处)(Ad5HVR48(1-7))。
图12示出基于Ad5的六邻体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO13)，其中在7个HVR处掺入了来自Ad35的7个相应HVR(下划线处)(Ad5HVR35(1-7))。
图13示出基于Ad5的六邻体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO14)，其中在7个HVR处掺入了来自AdI1的7个相应HVR(下划线处)(Ad5HVR11(1-7))。
图14示出基于Ad5的六邻体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO15)，其中在7个HVR处掺入l来自Ad2 6的7个相应HVR(下划线处)(Ad5HVR2 6(1-7))。
图15示出基于Ad5的六邻体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO16)，其中在7个HVR处掺入了来自Pan9腺病毒的7个相应HVR(下划线处)(Ad5HVRPan9(1-7))。
图16示出在背景情况下(无感染，graph 1°& 2°Ab)及在用Ad35k5(两批#4、#5)、Ad35k26(两批#3两次、#28)和Ad35k49(三批#4、#5、#9)感染后的细胞内gag染色。
图17示出Ad5HVR4 8(1-7)*中六邻体蛋白的氨基酸序列(SEQID NO84)，其中缺失如表IV所示的HVR1序列，表IV所示的HVR2序列由QG接头取代，表IV定义的HVR3至HVR7在Ad5与Ad4 8之间已经被置换。
图18如图17，本图是针对Ad5HVR35(1-7)*(SEQ ID NO85)。
图19如图17，本图是针对Ad5HVR2 6(1-7)*(SEQ ID NO86)。
图20；如图17，本图是针对Ad5HVR4 9(1-7)*(SEQ ID NO87)。
图21是在用Ad5-Empty二次预免疫(double pre-immunization)、随后在第0天用Ad35-Gag初次免疫、在第28天用所示的三种不同载体加强后，小鼠中CD8+T淋巴细胞应答的示意图。
发明概述本发明揭示了新开发的重组腺病毒载体，用以改良基因输送、接种和基因治疗。在一个优选的实施方案中，所述载体是基于腺病毒血清型35(Ad35)的重组腺病毒，其中至少Ad35纤维knob被替换为结合柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)的血清型的纤维knob。更优选地，这种血清型是Ad5纤维knob(产生称作Ad35k5的载体，其中只有knob被替换，或者产生称作Ad35f5的载体，其中knob、轴(shaft)及尾部的一部分被替换)。纤维的轴和尾部可以携带主链血清型，即Ad35，而本发明还涉及其中轴结构域与纤维knob血清型是相同血清型的载体。在Ad35f5中，来自主链血清型的尾部区域部分保证与衣壳剩余部分的正确相互作用以产生稳定的载体。本发明的载体包含感兴趣的治疗性核酸，优选可用于接种目的的核酸。
本发明涉及重组腺病毒载体，它们在大多数人群中遭遇较低的预先存在的免疫性并仍然能诱导针对由所述载体所包含的核酸编码的抗原的强免疫应答。这通过产生携带嵌合衣壳的基于腺病毒血清型如AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49、Ad50或者猿猴腺病毒的重组载体而实现。所述嵌合衣壳包含纤维蛋白，所述纤维蛋白部分基于来自与主链载体不同的人腺病毒血清型的纤维蛋白，且在最优选的实施方案中，所述纤维蛋白结合(通过其knob结构域)CAR受体。优先结合CAR的许多不同的腺病毒可用于提供纤维knob，如A、C、D、E和F亚群的人腺病毒，和也结合CAR的绵羊腺病毒。用于提供纤维knob结构域的优选腺病毒血清型是亚群C的人腺病毒，更优选Ad2和Ad5。
在另一个实施方案中，本发明产生的病毒是基于亚群C腺病毒优选地Ad5的重组腺病毒，其通过功能性缺失E1区域而制成复制缺陷型，且其中病毒衣壳中的六邻体蛋白是嵌合蛋白，由此一或多个高变区(HVR)由衍生自罕见的腺病毒血清型的HVR置换。这种罕见的血清型不遭遇人群中大多数个体中的NAb。用于提供HVR的优选血清型是Ad35和Ad48。优选地，所述重组病毒包含待被输送至宿主以进行预防或治疗目的的感兴趣的异源核酸。
详细描述如上所述，基于Ad5的重组载体的应用由于先前感染野生型病毒而在大多数人个体中存在的中和抗体(NAb)的存在而受到限制。尽管病毒外壳中存在的不同衣壳蛋白在宿主中诱导抗体，但是已经证实Ad5特异性NAb的主要靶位是Ad5六邻体蛋白(Sumida et al.2005)。由此产生这样的观点，即通过改变所述六邻体蛋白由此其不再被现有的NAb所发现，可以产生改良的腺病毒载体，这对于已经具有抗Ad5的NAb的、或者先前用基于Ad5的先前疫苗接种的、或者在初次/加强方案中用基于Ad5的载体初次免疫的人有益处。然而，改变六邻体蛋白不是轻而易举的。完全的六邻体改变通常只是在相同Ad亚群的腺病毒之间才是可能的，并且产生存活性很差的病毒(Youil et al.2002；Gall et al.1998；Roy et al.1998)。如果这是限制因素，则基于Ad5的载体必须含有来自另一亚群C腺病毒的六邻体蛋白。然而，即使不是全部也是大多数的这些载体是无用的，因为那些血清型不被认为是罕见的。人群中大多数个体都曾经遭遇过亚群C的血清型。优选使用来自应未遭遇已经存在的NAb的血清型的六邻体。那些罕见的血清型主要在亚群B(AdI1、Ad34、Ad35、Ad50)和D(Ad24、Ad26、Ad48和Ad4 9)中发现。
本发明人现在首次揭示通过(重新)限定六邻体的特异部分及通过使用保守方法和可利用的结构和序列数据，可以鉴别并且交换某些区域，产生可生产的重组病毒，所述病毒是存活的并且可以生产至足够高的效价。用于提供六邻体蛋白或其相关部分的优选血清型是AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50，因为已知这些血清型遭遇较低的预先存在的免疫性(见WO 00/70071)。更优选的是AdI1、Ad26、Ad35和Ad48，而Ad48是最优选的血清型。在这方面非人腺病毒也是令人感兴趣的。一个优选的例子是黑猩猩腺病毒Pan9。
被鉴别的区域是7个表面环，也称作六邻体高变区(HVR)。腺病毒血清型中的六邻体可变性集中在这7个环中(Crawford-Miksza andSchnurr.1996)。应理解本发明不限于如实施例所述使用Ad48的HVR。这通过相对广义(见表II)及相对更限定的、更加最小化(minimalistic)的定义(见表IV)的Ad5、AdI1、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50中HVR的鉴别而进一步证实。Ad48是所有其它血清型的例子，这些其它血清型也遭遇较低的预先存在的免疫性且得益于由Ad5所代表的亚群C腺病毒的已知优势(强免疫原性，易于生产等)和罕见血清型的益处也可用于生产嵌合的腺病毒。显然，如果期望使用初次/加强接种方案，其中优选使用另一血清型主链，如Ad35，则有利的是用未遭遇针对引发载体而产生的NAb的载体加强。因此，如AdI1、Ad24、Ad2 6、Ad35、Ad4 8、Ad4 9、Ad50等与另一罕见血清型(如上述任何罕见血清型)的HVR的组合也是本发明的一部分。这种载体的非限制性例子是Ad5HVR4 8、Ad5HVR35、Ad35HVR11、Ad35HVR4 8、Ad11HVR35和Ad11HVR4 8，具有至少1个、更优选6个、最优选7个血清型之间置换的HVR。因此，优选采用来自一个罕见血清型的至少一个HVR，插入主链血清型的六邻体中。本发明人已经示出将Ad5的所有7个HVR置换为Ad4 8的相应HVR，产生存活的并可生产的载体，所述载体在用空白Ad5病毒免疫的小鼠中几乎不遭遇任何预先存在的免疫性。然而，如果仅置换第一个HVR(在病毒基因组中从左侧ITR至右侧ITR可见)则无作用。这不意味着一个置换可能不是足够的。本发明人认为一个区域比其它区域更具有免疫原性，尚待研究的是这7个鉴别的区域中哪个区域贡献最大，哪个HVR在一定背景或特定应用中不需要被置换。某些个体与其它个体相比，针对不同的HVR可以产生不同的免疫应答。此外，含有嵌合六邻体的载体在宿主中仅存在中等NAb活性的背景中可以提供益处。根据提供的例子，由于2次连续给予1010vp的空白Ad5载体而产生的预先存在的免疫性非常高。然而，最优选所述六邻体蛋白中所有HVR均被置换，这样提供产生载体的最佳机会，所述载体不被宿主中预先存在的NAb检测到。
为了产生改良的腺病毒载体，首先对Ad5特异性中和抗体(NAb)表位作图。作图表明Ad5血清阳性率和效价在人群中非常高(在美国为大约50％，在部分发展中国家为90％)。此外，如本文所揭示，发现功能显著的Ad5特异性NAb几乎只是针对六邻体蛋白(也见Sumida et al.2005所述)。相反，针对纤维蛋白的Ad5特异性抗体在相应自然环境中不显著抑制Ad5疫苗免疫原性，所述环境即与在人体中发现抗Ad5 NAb效价的相关环境。与Ad5相反，发现Ad35和AdI1血清阳性率和效价在世界上许多不同区域的人群中非常低。
本发明涉及新的腺病毒载体，其携带罕见的(或者至少罕见中和的)Ad血清型如AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad4 8、Ad4 9和Ad50的六邻体，及优选来自与CAR受体相互作用的血清型的至少纤维knob结构域，如来自亚群A、C、D、E和F的大多数人腺病毒血清型及绵羊腺病毒。用作主链载体并因此携带其自身六邻体蛋白及与其相对在人群中很少发现NAb的优选血清型是AdI1和Ad35。用作主链载体及针对其纤维的优选血清型是Ad5。本领域充分认识到在免疫应答中起主要作用的细胞是树突细胞，因为这些细胞在其表面上能有效呈递免疫原性肽，从而引起针对这种肽的强免疫应答。在本领域由于其非常有效地感染树突细胞的能力而优选的载体是来自腺病毒亚群B的那些载体，或者携带以有效方式识别并感染树突细胞的腺病毒的纤维蛋白的载体，见例如WO 02/24730和WO 00/70071所述。这些载体大概使用CD46作为受体。令人惊奇地，如本发明所示，本发明人发现，对于携带已知通过CAR相互作用的腺病毒载体(即Ad5)的至少纤维knob的载体，当该纤维knob被克隆在遭遇较低水平预先存在的免疫的载体的顶部时，其使得免疫应答被增强。考虑到希望的免疫应答通过树突细胞，这是非常不可思议的。
应理解的是所述knob结构域是主要参与识别腺病毒载体结合的特异性细胞受体的结构域，本领域技术人员可易于将其与纤维蛋白的其余部分区分开来(通过序列对比及关于受体相互作用的一般知识)。先前示出Ad5纤维knob与细胞表面上的CAR相互作用，并在病毒进入之前介导有效的病毒附着，这通过五邻体基部(penton base)和细胞整联蛋白而进一步促进(Bergelson et al.1997；Bewley et al.1999；Roelvink et al.1998和1999；Wickham et al.1993)，而B型病毒如AdI1和Ad35通过CD46相互作用(Gagger et al.2003)。本发明涉及腺病毒载体，其中至少受体结合结构域(由knob结构域限定)被交换。后者的载体因此仍包含纤维结构域，如来自主链载体的轴和/或尾部的部分。实际上希望使用主链载体的至少部分尾部区域以保证与其它衣壳蛋白的适当稳定的相互作用，产生稳定的重组载体。
本发明的嵌合腺病毒载体与仅基于Ad5或Ad35而无嵌合纤维的载体相比在疫苗和基因治疗方面更有效。本领域已知携带嵌合的Ad5-Ad35纤维的嵌合腺病毒。揭示了携带嵌合纤维的Ad5载体，其中至少knob结构域衍生自Ad35(WO 00/31285，WO 00/52186；WO02/24730；Shayakhmetov et al.2003；Rea et al.2001)。Smith et al.(2003)揭示了一种嵌合纤维，其中尾部和轴来自Ad35，而knob结构域来自Ad5。这些引用的参考文献中的所有载体均基于Ad5，提示所述载体由于病毒载体衣壳中Ad5六邻体的存在而仍遭遇预先存在的免疫性。Ophorst et al.(2004)提供的数据证实了这种现象。重组复制缺陷型Ad35载体和产生其的方法也为本领域所已知(WO 00/70071；WO02/40665)，而Ganesh et al.(2003)揭示了包含纤维的基于Ad35的载体的应用，其中Ad35的纤维knob已经由Ad5的置换。然而，所述载体携带一标记基因(绿色荧光蛋白，GFP)及显然呈现较低的转导效力。因此，Ganesh等未揭示或提议基于其中Ad35的至少knob由Ad5的knob置换的载体的疫苗，更不用说与其应用相关的优势了。Ganesh等还揭示了一种基于具有完整的Ad5纤维的Ad35的载体。必须注意这种载体包含完整的Ad5纤维而不是嵌合纤维，因此与本发明揭示的载体不同。Ganesh等提醒部分纤维交换发现较低的转导效力。本发明的载体具有良好的转导效力，而嵌合纤维保证稳定锚定在剩余衣壳中。本领域技术人员没有动机想到进行这样的接种，其目的是将已知非常有效感染树突细胞的血清型(如亚群B的那些血清型，例如AdI1、Ad34和Ad35)的纤维knob置换为主要通过CAR感染细胞的血清型的纤维knob。
由于宿主对于腺病毒载体的中和活性主要是归因于针对六邻体蛋白的NAb，因此腺病毒载体也可以基于高度中和的血清型，例如Ad5，其中六邻体由罕见中和的血清型如AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad4 8、Ad4 9和Ad50的六邻体交换。这种载体的一个例子称作是Ad5h35(基于Ad5的载体，其包含来自Ad35的六邻体蛋白代替Ad5的六邻体)。本领域技术人员基于本发明揭示的信息及基于本领域可利用的知识能想像并产生不同的可能组合。显然难以交换全部的六邻体(Gall et al.1998；Youil et al.2002)。本发明实施例中揭示了一种新的及实用的方式构建嵌合六邻体蛋白。WO 00/03029的实施例8揭示了使用其它血清型的六邻体蛋白克隆包含嵌合衣壳的载体的另一种方法。
本发明的重组腺病毒载体，即基于通常在人群中遭遇较低预先存在的活性的血清型的那些载体(AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50，以及某些猿猴腺病毒)，其携带通常引起高免疫应答的腺病毒的knob结构域，代表了在通常引起高免疫应答的腺病毒以及由于携带在世界上高比例人群中不被预先存在的免疫性检测到的六邻体蛋白而逃避预先存在的中和活性的腺病毒基础上的改良。换句话说及在本发明所例证，Ad35fib5和Ad35k5均代表了在Ad5和Ad35载体基础上的改良。
假定Ad5载体在人群中具有高水平的抗Ad5免疫性，其很可能被抗载体免疫性充分抑制，至少基于在小鼠和猴中进行的实验结果是如此。假定人群中抗Ad35免疫性的水平低，则在这方面Ad35和Ad35相关载体比Ad5载体具有实质优势。换句话说，Ad35、Ad35fib5和Ad35k5载体基本上不被抗载体免疫性抑制。然而，基于Ad35载体的疫苗与基于Ad5载体的疫苗相比在针对抗原性插入物的抗体方面免疫原性较低。
重要的是，本发明人首次揭示了携带不同但高度免疫原性载体的至少(异源)knob结构域的低中和化载体在诱导免疫应答方面比具有其天然纤维的主链载体更有效。因此，这种载体代表超越目前可利用的腺病毒载体的技术和实践进展。本领域技术人员将能利用本文提供的知识，基于相同的原理克隆其它腺病毒载体。例如，本发明还涉及重组猿猴腺病毒，其携带免疫原性人腺病毒的纤维的knob结构域。除了重组猿猴腺病毒之外，其它非人腺病毒，如重组牛和犬腺病毒也涵盖在本发明中。本发明还涉及其它低中和化的人腺病毒，其可以用作主链载体，携带其它免疫原性腺病毒的至少knob结构域。有许多不同的组合，但限于腺病毒的至少六邻体蛋白应不遭遇高水平的预先存在的免疫性，同时至少knob结构域识别CAR受体，从而保证在施用所述载体的宿主中产生高免疫应答。本领域技术人员通过本领域的一般知识将能区别所述特征，以确定预先存在的免疫性，确定引起的免疫应答水平及获得本发明所述重组(嵌合)载体的策略。
Ad35k5疫苗载体的强力免疫原性提示Ad5纤维蛋白的功能相关作用。Ad5纤维knob决定与高亲和性受体CAR的结合，在病毒颗粒在细胞内有效运输至细胞核方面也起重要作用。尽管精确机制还未确定，但Ad35k5载体的增强的免疫原性很可能反映Ad5纤维knob的已知生物学功能。如本文所述，重组Ad35k5载体主要呈现重组Ad35载体的中和化模式，及有效地逃避低/中等水平的抗Ad5免疫性。这些观测结果与先前的研究一致，表明Ad5特异性NAb主要针对Ad5六邻体蛋白。支持这个模型的还有这样的观察结果，即含有Ad35纤维蛋白的Ad5载体不能避开抗Ad5免疫性(Ophorst et al.2004)。然而，如本文所述，高水平的抗Ad5免疫性事实上能降低Ad35k5载体的免疫原性，很可能反映了较低效价但可清楚检测到的NAb针对Ad5纤维蛋白。注意由于抗Ad5免疫性导致Ad35k5免疫原性的降低只是部分的，在特别高的Ad5特异性NAb效价下才能检测到。
Ad35k5载体的另一限制是其相对高的vp/pfu比率，其比观测到的Ad35载体的高大约10倍。这个观察提示病毒完整性和稳定性可以通过包含嵌合纤维蛋白而危及，尽管这仍需要研究和证实。
如本文所述，对比Ad5、Ad35k5和Ad35载体的免疫原性的恒河猴研究证实了在小鼠中获得的结果。这是相关的，因为小鼠缺少最佳的Ad35受体CD46并因此低估了Ad35载体的免疫原性。在恒河猴中，Ad5载体引起快速和高效价的载体特异性NAb，正如所期望的其有效地防止同源加强免疫。相反，Ad35和Ad35k5载体与Ad5载体相比均引起较低的载体特异性NAb效价，在再次施用同源载体之后其促进这些应答的加强。推测在接受Ad35k5载体的猴中观测到的强免疫应答很可能反映了这些载体初次的强应答及可以被有效加强的事实。
本发明证实可以构建衣壳嵌合重组Ad载体以组合不同Ad血清型的有益的免疫学和血清学性质。产生嵌合Ad载体代表了一个产生用于接种和基因治疗的改良的二代Ad载体的新策略。
根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及一种复制缺陷型重组腺病毒血清型35(Ad35)载体，其包含嵌合纤维蛋白，该嵌合纤维蛋白包含来自结合CAR的腺病毒血清型的至少knob结构域，其中所述重组载体进一步包含感兴趣的治疗核酸。治疗核酸是指编码可用于诊断、治疗和/或预防性治疗哺乳动物、优选人的治疗性蛋白质物质如蛋白质、肽或多肽的核酸。治疗性蛋白质的例子是在肿瘤接种中引起免疫应答的蛋白质。其它例子是可用于治疗遗传疾病的蛋白质，如用于基因治疗的那些。优选的治疗性蛋白质是衍生白或基于或者(直接)克隆自细菌、寄生虫或感染实体如病毒的蛋白质。腺病毒载体可高度适用于针对例如如下病毒的接种目的人免疫缺陷病毒(HIV)、SIV、Ebola病毒、狂犬病病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、丙肝病毒(HCV)等。可以在腺病毒核酸中被编码的HIV衍生的抗原的例子是nef、gag、pol和env。HSV抗原的例子是抗原9D。在本发明的载体中也可以使用来自如导致疟疾的寄生虫的治疗性蛋白质。可以在这些载体中克隆的特别优选的蛋白质是来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的蛋白质，如环子孢子(CS)蛋白和LSA-I。其它优选的蛋白质可以是来自分枝杆菌(Mycobacterium)菌株、特别是导致肺结核的如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的那些蛋白质。来自这种细菌的优选抗原是10.4、85A、85B和85C抗原，其因此也可用于本发明的载体中。用作标记以进行体外研究的蛋白质典型不被认为是治疗性蛋白质，因此GFP、荧光素酶或者CAT不被当做是治疗性的。
可用于表达抗原的合适启动子和聚(A)序列为本领域所熟知，包括但不限于CMV、Ad2 MLP、SV40等。合适的转录终止序列可例如衍生自SV40或BGH。所述抗原的编码序列可以是为在哺乳动物优选人中最佳表达而优化的密码子。密码子优化方法为本领域所熟知。
本发明涉及复制缺陷型重组腺病毒，选自腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50，所述腺病毒包含嵌合纤维蛋白，该嵌合纤维蛋白包含结合CAR的腺病毒血清型的至少knob结构域，其中所述重组载体进一步包含编码感兴趣的治疗性或抗原性蛋白质的异源核酸。优选的血清型是亚群B血清型，更优选血清型11、34和35，最优选血清型35(Ad35)。本发明涉及这些血清型，因为它们在非常低百分比的取自全世界健康个体的人血清样品中遭遇中和性的预先存在的免疫性。如本文所用，嵌合纤维蛋白是指包含来自至少两个不同腺病毒血清型的部分的纤维蛋白，其中knob结构域来自结合CAR的腺病毒。优选所述纤维蛋白的尾部结构域是主链载体的，这样通过与载体衣壳的适当相互作用而增加了载体的稳定性。在一个优选的实施方案中，结合CAR的knob结构域来自亚群C的腺病毒血清型、更优选来自血清型Ad5的纤维。
本文所用感兴趣的治疗性蛋白质涉及可用于哺乳动物治疗性治疗如基因治疗中的蛋白质。本文所用感兴趣的抗原性蛋白质涉及在宿主或宿主细胞中表达时而引起免疫应答的感兴趣的蛋白质。这种免疫应答对于不同的接种背景是必需的一个例子是肿瘤接种，其中针对感兴趣的抗原性蛋白质的免疫应答加强了表达该蛋白质的肿瘤细胞的除去，而另一优选的应用是在预防治疗中，如进行接种以预防或显著抑制病原体如病毒、细菌、酵母或寄生虫对宿主的感染。因此，优选所述感兴趣的抗原性蛋白质包含来自病毒、细菌、寄生虫或酵母的蛋白质。本发明的重组腺病毒也可以用于在治疗已经发生的感染的过程中引起针对感兴趣的抗原性蛋白质的免疫应答，因此预防复制、包装等。换句话说，所述载体也可用于预防病毒从已经感染的宿主传播至下一个宿主。
在一个实施方案中，本发明的重组腺病毒包含在异源启动子控制下的异源核酸。
在本发明的一个优选方面中，所述抗原性蛋白质包含来自病毒的蛋白质，其中所述病毒是逆转录病毒、HSV或Ebola病毒，如果所述抗原性蛋白质是逆转录病毒，则优选所述病毒是猿猴或人免疫缺陷逆转录病毒，其中所述异源核酸优选包含选自如下编码免疫缺陷病毒蛋白的一或多个基因gag、pol、env和nef。
在本发明的另一方面，所述感兴趣的抗原性蛋白质来自导致疟疾的寄生虫，其中所述蛋白质优选是来自疟原虫属、更优选恶性疟原虫的环子孢子蛋白或者肝特异性抗原(LSA-I，LSA-3)或其免疫原性部分。
本发明涉及用作药物的新的复制缺陷型重组腺病毒，其包含异源核酸和嵌合纤维，其中所述腺病毒选自腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。
本发明进一步涉及本发明的重组腺病毒载体在生产用于预防性或治疗性治疗疟疾感染、Ebola病毒感染、HSV感染、HCV感染或HIV感染的药物中的应用。
在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及一种嵌合复制缺陷型重组腺病毒，其包含来自Ad5的纤维的knob结构域及来自与Ad5不同的血清型的六邻体蛋白，所述knob结构域具有如图2B下划线处所示氨基酸序列，其中进一步优选所述六邻体蛋白来自低中和化的腺病毒血清型。低中和化的血清型是在少数健康个体样品中以NAb形式遭遇预先存在的中和活性的那些血清型。在一个特异的实施方案中，本发明涉及一种嵌合复制缺陷型重组Ad35载体，其包含Ad35六邻体和嵌合纤维蛋白，所述嵌合纤维蛋白具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列。
六邻体HVR交换由于优势的Ad5特异性NAb主要针对Ad5六邻体蛋白，因此有理由认为在六邻体中含有靶定突变交换的新的重组Ad5载体能逃避优势的Ad5六邻体特异性NAb。这不是一个新想法，在本领域中已经进行了一些尝试以产生这种“stealth”腺病毒载体。然而，如下所述，无一成功。
不同血清型的六邻体蛋白中99％以上的氨基酸可变性似乎集中在7个相对短的高变区(HVR)中，所述高变区由Crawford-Miksza和Schnurr(1996)鉴别位于六邻体暴露的表面上。这些作者对比了15种不同的腺病毒(AdI、Ad2、Ad5、Adβ、Ad8、Ad9、AdI2、AdI5、AdI6、Ad31、Ad40、Ad41、Ad4 8、BAV3和MAV1)的六邻体蛋白。所述7个HVR被鉴别是在环1和2(也称作11和12)的250个可变残基中，其中HVR1至HVR6在环1中，HVR7在环2中。Crystal及同事(见WO 98/40509；US 6,127,525；US 6,153,435)基于Crawford-Miksza et al.(1996)的发现，将主链载体(Ad5)的全部环1和2用Ad2的环1和2置换(Gall et al.1998)。也产生了其中仅环2被置换的载体。产生了存活的病毒。Ad2和Ad5均是亚群C腺病毒，即使在两个环均置换后仍存在交叉中和，表明至少当所述交换在相同亚群中时，这种交换未产生由针对野生型腺病毒六邻体蛋白的中和抗体的识别的能力降低或不能识别的载体。然而，为了试图获得这种载体，他们还尝试置换Ad5的环，将其用Ad7的环置换。这些尝试失败了，未产生存活的病毒，表明一种亚群与另一种亚群的交换是不可能产生的，至少基于Crawford-Miksza对HVR的鉴别是不可能的。当然，通过未来对病毒基因组结构的了解，可以通过普通的分子生物学技术实现必需的遗传修饰，产生应编码全部重组(嵌合)病毒的质粒/粘粒。然而，由于未知原因但很可能由于复杂的六邻体结构的关键因素及其在衣壳形成中的作用，当六邻体编码区被修饰时未获得存活的病毒(Rux et al.2003)。Gall et al.(1998)建议仅交换外部的环而不交换全部的六邻体。还提及了其它衣壳蛋白如五邻体可具有显著的中和表位以解释Ad5-Ad2交换的失败。
本发明人还试图产生基于Ad5的、携带嵌合六邻体蛋白的嵌合腺病毒，其包含Ad35或Ad4 8的HVR代替Ad5 HVR，如Crawford-Miksza and Schnurr(1996)及Rux and Bumett(2000)所指导。这些尝试失败了。这与Crystal等的发现一致，Crystal也不能产生其中不同亚群的六邻体部分被交换的任何重组病毒(见上述)。
为了解决这个问题，Rux et al.(2003)揭示了新的高分辨率晶体学精修，其由Ad2和Ad5六邻体结构组成以解析先前发现的Ad2和Ad5六邻体结构中的不同。这样产生了对六邻体蛋白内的区域的新的限定，表明有9个HVR而不是7个。Rux et al.(2003)还鉴别了当设计新的基于腺病毒的载体时不应被破坏的六邻体蛋白的部分。
本发明人还试图基于Rux et al.(2003)提供的限定产生嵌合腺病毒，其包含具有交换的HVR的嵌合六邻体蛋白。然而，再次未能产生存活的病毒。显然，基于本领域关于六邻体HVR的限定，不能产生具有一或多个在主链载体和另一血清型之间、至少在不同亚群腺病毒血清型之间被置换的HVR的重组腺病毒。
本发明人现在在人腺病毒中鉴别了与Crawford-Miksza andSchnurr(1996)鉴别的7个HVR及Rux et al.(2003)鉴别的9个HVR不同的7个HVR。本发明的广义限定在表II中示出，而更最小化的限定在表IV中示出。这些HVR的单独置换产生存活的病毒。本发明人的最大贡献是这是首次任何人均可以产生包含嵌合六邻体蛋白的嵌合腺病毒，其中不是全部的环均被交换，而是交换其中独特的HVR。这也是首次成功获得了包含嵌合六邻体蛋白的重组腺病毒，其中六邻体包含来自两个不同亚群的腺病毒血清型的部分。重新限定HVR的理论基础是使用保守的氨基酸作为结合点。然而不排除通过改变N和/或C末端的一或两或者也许甚至三个氨基酸可以产生存活的载体。然而，本领域先前提供的限定未足以提供具有嵌合六邻体的存活载体。然而本文提供的限定不必严格遵循，因为略微的改变也可以提供良好的结果(见表II与表IV的对比)。优选地，鉴别的HVR序列(SEQ ID NO17-79及88-150所示序列)是在血清型之间被交换的区域。
如实施例所述，构建基于Ad5的载体，其含有由Ad35(亚群B)或Ad4 8(亚群D)交换的一或多个HVR。显然，可以交换一或多个HVR。很可能NAb针对任何HVR，优选大多数(如果不是全部)来自罕见血清型的HVR代替主链载体的野生型HVR。另一方面，这种大规模交换可导致更难以产生存活的载体。本发明揭示了主链载体(例如Ad5)中鉴别的所有7个HVR均可以由罕见血清型(例如Ad4 8)的7个相应HVR置换。这也提示基于表IV的HVR*限定的交换也产生存活的病毒。
HVR之间的间隔区域优选保持主链血清型的区域，以保证蛋白质的正确折叠。尽管也可以使用其它通常使用及广泛应用的亚群C血清型如Ad2，但优选主链是Ad5。当交换HVR时，优选至少1个、更优选2个、甚至更优选3、4、5、6个及最优选7个HVR被交换。
如本发明所揭示，产生的Ad5HVR35和Ad5HVR4 8载体与重组Ad5载体相比在存在抗Ad5免疫性的条件下更具免疫原性，因为主要针对Ad5感染的个体中Ad5的六邻体蛋白的NAb不再能通过Ad35和Ad48的六邻体的HVR进行中和。这个特点支持了对取自所有已知罕见血清型的所有HVR均是正确的，所述血清型可以选自AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad4 9和Ad50。
如下文所示，含有Ad4 8的所有7个HVR代替Ad5的7个HVR的Ad5HVR48(1-7)病毒产生了不被通过先前注射Ad5病毒诱导的预先存在的免疫性干扰的病毒。这使得技术人员在众多背景中可以使用基于Ad5的载体，例如在初次-加强方案中，其中需要在初次载体与加强载体之间的受体识别保持相同。另一种应用是在已经遭遇野生型Ad5感染的个体中在治疗之前用基于Ad5的载体进行接种或者治疗性应用。
基于如本文所述HVR的鉴别，主链载体与其它腺病毒血清型之间的众多组合现在是可行的。这些知识可以外推至所有已知人和非人腺病毒的六邻体。无论何时需要初次-加强方案(不仅仅是其中需要基于Ad5载体的背景)，本文提供的知识均可以用于构建具有stealth能力即逃避在先前应用的病毒中存在的针对六邻体HVR的预先存在的免疫性的载体。应理解本发明揭示的嵌合HVR载体可进一步通过本领域已知方法修饰。例如，可以改变纤维以产生特异性靶向能力(例如来自亚群B病毒的纤维knob置于基于亚群C的载体上可以靶向平滑肌细胞、原代成纤维细胞、树突细胞等)。这种载体的例子是基于Ad5的载体，其包含来自例如Ad4 8的HVR及来自例如Ad35的至少纤维knob(受体识别的主要决定簇)。这种载体均在本发明关于包含其HVR是嵌合的六邻体的腺病毒载体的范围。
本领域技术人员现在借助于本文提供的知识能构建及产生存活的重组复制缺陷型腺病毒，其一或多个HVR由其它腺病毒的HVR置换。此外，本发明提供的HVR序列现在使得技术人员可以除去那些序列并使用六邻体中的这些位置导入其它物质，如靶向配体以将腺病毒靶向于感兴趣的细胞(在体内及在体外)、放射性结合位点以在体外追踪腺病毒及某些B细胞表位(如Worgall et al.2005所述)。
本发明涉及基于第一种亚群的血清型的重组复制缺陷型腺病毒的批次，所述腺病毒包含嵌合六邻体蛋白，其中所述六邻体蛋白包含来自所述第一种亚群的血清型的序列及来自第二种亚群血清型的至少一个高变区(HVR)序列，其中所述第一种和第二种亚群不相同。优选所述第一种亚群是亚群A、C、D、E或F。本发明也优选的是其中所述第二种亚群是亚群B或D的批次。更优选的是其中所述第一种亚群是亚群C及所述亚群C的血清型是Ad5及其中所述亚群B或D的血清型选自AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50的批次。
在本发明的一个优选实施方案中，所述嵌合六邻体蛋白包含所述第二种亚群血清型的前6个HVR序列(HVR1-HVR6)或者所有7个HVR序列(HVR1-HVR7)。
在另一个优选的实施方案中，所述六邻体蛋白在HVR序列之间保留主链病毒的氨基酸序列。因此，本文阐述的一或多个HVR序列可以被缺失、突变、被一接头置换或者被来自另一血清型的HVR序列置换，特别优选的是保留连接HVR的序列并不加改变。这使得技术人员可以产生由于通过非HVR序列提供的六邻体-主链结构而稳定的病毒。因此优选HVR序列之间的序列来自所述第一种亚群的血清型。
在高度优选的实施方案中，本发明提供了腺病毒批次，其中第一种亚群是亚群C，及其中所述第二种亚群血清型的至少一个HVR序列选自SEQ ID NO24-79和SEQ ID NO95-150。在更优选的实施方案种，所述HVR1序列选自SEQ ID NO17、24、31、38、45、52、59、66和73，其中HVR2序列选自SEQ ID NO18、25、32、39、46、53、60、67和74，其中HVR3序列选自SEQ ID NO19、26、33、40、47、54、61、68和75，其中HVR4序列选自SEQ ID NO20、27、34、41、48、55、62、69和76，其中HVR5序列选自SEQ ID NO21、28、35、42、49、56、63、70和77，其中HVR6序列选自SEQ ID NO22、29、36、43、50、57、64、71和78，及其中HVR7序列选自SEQ IDNO23、30、37、44、51、58、65、72和79。在另外优选的实施方案中，HVR1序列(HVR1*)选自SEQ ID NO88、95、102、109、116、123、130、137和144，其中HVR2序列(HVR2*)选自SEQ ID NO89、96、103、110、117、124、131、138和145，其中HVR3序列(HVR3*)选自SEQ ID NO90、97、104、111、118、125、132、139和146，其中HVR4序列(HVR4*)选自SEQ ID NO91、98、105、112、119、126、133、140和147，其中HVR5序列(HVR5*)选自SEQ ID NO92、99、106、113、120、127、134、141和148，其中HVR6序列(HVR6*)选自SEQ ID NO93、100、107、114、121、128、135、142和149，及其中HVR7序列(HVR7*)选自SEQ ID NO94、101、108、115、122、129、136、143和150。更优选地，在主链载体中缺失表II中的HVR1序列或者表IV中示出的那些HVR1序列。缺失HVR1区域的原因是根据腺病毒六邻体蛋白的晶体结构，HVR1的侧翼序列非常靠近，表示这些侧翼序列可以直接连接而不丧失结构，除了缺失之外。在另一个优选的实施方案中，表II中示出的HVR2序列或者表IV中示出的那些HVR2序列可以由短接头置换，更优选由两个氨基酸组成的接头置换，最优选由QG接头置换。同样，在晶体结构中HVR2侧翼序列也非常靠近。然而，由于看起来其与HVR1相比略微远隔，因此优选包括小的桥接接头(bridging linker)，优选是1、2、3或4个氨基酸的接头，更优选是2个氨基酸的接头。从六邻体中除去HVR可以是防止针对由HVR呈递的免疫原性决定簇的NAb攻击的理想解决方案。然而，考虑到晶体结构，从六邻体蛋白中缺失HVR3-7而不破坏其整体结构并因此在衣壳形成中发挥其功能和作用似乎是不可行的。
尽管Ad24的六邻体对于其HVR也是优选的，但是本发明人在提出申请时还未知这种特异的“罕见”血清型的六邻体蛋白的序列。然而，根据本文提供的教导，技术人员现在能确定任何腺病毒六邻体蛋白中的HVR，包括优选的血清型Ad24。Ad24的任一HVR的应用也是本发明的一部分。
本发明还涉及编码亚群B的人腺病毒血清型的六邻体的至少一个HVR序列的分离的核酸在构建嵌合六邻体蛋白中的应用，所述六邻体进一步包含亚群A、C、D、E或F的腺病毒的序列。此外，本发明涉及编码亚群D的人腺病毒血清型的六邻体的至少一个HVR序列的分离的核酸在构建嵌合六邻体蛋白中的应用，所述六邻体进一步包含亚群A、B、C、E或F的腺病毒的序列。优选所述至少一个HVR序列选自SEQ ID NO24-79和95-150。
表III概括了本发明的不同实施方案。该表示出了本发明涉及基于主链腺病毒的嵌合复制缺陷型腺病毒，该主链腺病毒包含血清型X的五邻体和六邻体蛋白，其中六邻体蛋白中的n个HVR是血清型Y的HVR，进一步包含纤维，其包含血清型F的尾部和轴和血清型K的knob，其中-X是选自人腺病毒1至51、猿猴血清型、犬血清型、绵羊血清型、猪血清型和牛血清型的腺病毒血清型；-Y是选自人腺病毒11、24、26、34、35、48、49和50的腺病毒血清型，其中X和Y可以相同或不同，其中n是0至7任何数目的HVR，条件是如果XΦY，则n＝1至7；-F是选自人腺病毒1至51、猿猴血清型、犬血清型、绵羊血清型、猪血清型和牛血清型的腺病毒血清型，其中F、X和Y可以相同或不同；及-K是主要使用CAR作为细胞受体的腺病毒血清型，其中K、F、X和Y可以相同或不同。优选与五邻体蛋白相互作用的纤维蛋白的尾部的至少部分在F不是X的情况中是血清型X的。
应理解主链腺病毒载体可以是可应用于人体的任何腺病毒(重组产生的，由此其在正常非包装细胞中不复制)。六个亚群A、B、C、D、E和F内的任何已知人腺病毒(血清型1至51)以及已知的猿猴腺病毒、犬腺病毒、牛腺病毒、绵羊腺病毒和猪腺病毒均可以用作主链载体，只要其是复制缺陷的及只要其可应用于人体治疗。所述主链载体通过缺失至少一个E1区的功能部分而是复制缺陷的，优选缺失全部的功能性E1区域。尽管所述主链载体典型包含另外的早期和晚期区域，但技术人员意识到通过其它方式补足某些必需的腺病毒蛋白的可能性，例如通过用辅助病毒或者通过使包装细胞转化由此使其包含稳定整合进其基因组中必需的核酸而补足。典型地，本发明的病毒包含具有E1缺失的腺病毒基因组，优选E3也缺失，以提供空间以将感兴趣的异源核酸克隆进E1区或E3区或这两者中。剩余的区域如E2、E4、ITR′s及晚期区域通常存在，尽管这些区域可以在包装细胞中在生产期间单独补足。所述载体优选包含E4orf6区域(也许来自另一血清型)，其与包装细胞系中存在的E1B-55K蛋白相容，如WO03/104467所揭示。这样当所述重组载体具有与已知包装系统如细胞PER.C6或293细胞中存在的Ad5的E1B-55K不相容的原始E4orf6区域时，可以在所述细胞中生产。
所述主链血清型在上文以X表示。另外，所述主链病毒可以工程化，由此其含有选自人AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50的一或多个腺病毒血清型的HVR(以血清型Y表示)。显然，当X时Y血清型之一时，HVR可以不进行工程化，因为这些血清型被认为是“罕见的”血清型，并且在人群大多数个体中仅遭遇较低的预先存在的免疫性。因此，当X是Y血清型之一时，交换的HVR的数目(由n表示的数目)可以是0，但也可以是1至7；而当X不是Y血清型之一时，则至少一个HVR来自Y血清型，其中逐渐优选多个HVR来自Y血清型，最优选所有七个HVR均被交换为Y血清型的相应区域。
本发明的主链病毒包含与主链病毒相同血清型的五邻体蛋白。所述主链病毒是嵌合的，是指六邻体是嵌合的(有一或多个HVR并交换或取代)和/或纤维蛋白是嵌合的和/或纤维蛋白来自与主链病毒不同的血清型。存在X＝Y＝F＝K的可能性，例如重组Ad4 8载体，因为Ad4 8结合CAR。然而，这种载体当n＝0时在上述含义中不是嵌合的。非嵌合的重组AdI1、Ad34、Ad35和Ad50不符合上述限定，因为纤维knob应总是来自优先结合CAR的血清型，而这些B亚群病毒则不是。
纤维来自以F表示的血清型，包含来自血清型F的尾部，包含来自血清型F的轴及包含来自以K表示的血清型的knob。显然，当K是与F相同的血清型时，所述纤维蛋白不是嵌合的。K是优先与CAR受体相互作用的血清型，K可以是与X相同的血清型或者与其不同。显然，某些人血清型如来自亚群B的那些血清型不优先与CAR相互作用，但是优选与另一种细胞受体如CD46相互作用。因此，当K与X相同时，则X不是亚群B腺病毒之一。同样，当K是与F不同的血清型时(及所述纤维因此是嵌合的)，与衣壳中五邻体相互作用的尾部的至少一部分是血清型X的，这样导致正确和稳定的衣壳形成。由于已知腺病毒的大多数衣壳蛋白编码基因在本领域中可获得，因此本领域技术人员可以鉴别每个已知的及将要被揭示的腺病毒的尾部、轴和knob区域。
本发明的嵌合复制缺陷型腺病毒的非限制性例子优选是Ad5HVRll(1-7)，Ad5HVR24(1-7)，Ad5HVR2 6(1-7)，Ad5HVR34(1-7)，Ad5HVR35(1-7)，Ad5HVR4 8(1-7)，Ad5HVR4 9(1-7)，Ad5HVR50(1-7)，Ad5HVRPan9(1-7)，Ad5HVR11(1-6)，Ad5HVR24(1-6)，Ad5HVR2 6(1-6)，Ad5HVR34(1-6)，Ad5HVR35(1-6)，Ad5HVR48(1-6)，Ad5HVR4 9(1-6)，Ad5HVR50(1-6)，Ad5HVRPan9(1-6)，Ad5HVR11(1)，Ad5HVR24(1)，Ad5HVR26(1)，Ad5HVR34(1)，Ad5HVR35(1)，Ad5HVR48(1)，Ad5HVR49(1)，Ad5HVR50(1)，Ad5HVRPan9(1)，Ad11k5，Ad24k5，Ad26k5，Ad34k5，Ad35k5，Ad48k5，Ad49k5，Ad50k5，Pan9k5，Ad11f5，Ad24f5，Ad26f5，Ad34f5，Ad35f5，Ad48f5，Ad4 9f5，Ad50f5，Pan9f5，Ad11k26，Ad34k26，Ad35k26，Ad50k26，Pan9k26，Ad11f26，Ad34f26，Ad35f26，Ad50f26，Pan9f26，Ad11k49，Ad34k49，Ad35k49，Ad50k49，Pan9k49，Ad11f49，Ad34f49，Ad35f49，Ad50f49，Pan9f49，Ad2HVR11(1-7)，Ad2HVR24(1-7)，Ad2HVR26(1-7)，Ad2HVR34(1-7)，Ad2HVR35(1-7)，Ad2HVR4 8(1-7)，Ad2HVR4 9(1-7)，Ad2HVR50(1-7)，Ad2HVRPan9(1-7)，Ad2HVR11(1-6)，Ad2HVR24(1-6)，Ad2HVR26(1-6)，Ad2HVR34(1-6)，Ad2HVR35(1-6)，Ad2HVR4 8(1-6)，Ad2HVR4 9(1-6)，Ad2HVR50(1-6)，Ad2HVRPan9(1-6)，Ad2HVR11(1)，Ad2HVR24(1)，Ad2HVR26(1)，Ad2HVR34(1)，Ad2HVR35(1)，Ad2HVR48(1)，Ad2HVR49(1)，Ad2HVR50(1)，Ad2HVRPan9(1)，Ad11k2，Ad24k2，Ad26k2，Ad34k2，Ad35k2，Ad48k2，Ad49k2，Ad50k2，Pan9k2，Ad11f2，Ad24f2，Ad26f2，Ad34f2，Ad35f2，Ad48f2，Ad49f2，Ad50f2和Pan9f2。
实施例实施例1Ad5、Ad35和AdI1的国际血清阳性率和NAb效价Ad特异性中和抗体(NAb)应答通过如Sprangers et al.(2003)所述的基于荧光素酶的病毒中和分析评定。简而言之，将A549人肺癌细胞以1×104个细胞/孔的密度铺板于96孔平板中，于200μl反应体积2倍系列稀释的血清中用E1缺失的不能复制的Ad-荧光素酶报道基因构建体感染，感染复数(moi)为500。在保温24小时后，细胞中荧光素酶活性使用Steady-Glo Luciferase Reagent系统(Promega)测定。90％中和效价是指中和90％的荧光素酶活性的最大血清稀释度。
除了WO 00/70071揭示的研究，进行实验以评定在发展中世界中对Ad5及另外的Ad血清型的血清阳性率和NAb效价。应用Sprangers et al.(2003)所述的基于荧光素酶的病毒中和分析，使用得自美国(N＝19)、海地(N＝67)、博茨瓦纳(N＝57)、赞比亚(N＝29)和南非(N＝59)的健康成人的血清样品。如图1A所示，在美国Ad5血清阳性率为50％，具有相对低的中位数效价。相反，在海地Ad5血清阳性率为82％、在博茨瓦纳为93％、在赞比亚为93％、在南非为88％。此外，这些样品中中位数Ad5-特异性NAb效价比在美国发现的中位数效价高10倍以上(图1B)。这些数据扩展了先前的发现(Kostense et al.2004；Vogels et al.2003)并证实Ad5-特异性NAb在发展中世界几乎是普遍的及高效价存在的。相反，AdI1和Ad35血清阳性率及效价在这些群体中很低。
实施例2Ad5特异性中和抗体的免疫优势靶位利用前述实施例中的样品进一步确定美国和撒哈拉以南非洲(sub-Saharan Africa)中Ad5-特异性NAb的优势抗原性靶位。假设Ad5与Ad35之间没有可检测的NAb交叉反应性，使用表达在病毒中和分析中作为靶位的荧光素酶的衣壳嵌合Ad5/Ad35病毒。在具有野生型生长动力学的完整病毒颗粒情况中，这些载体由Ad5和Ad35六邻体、五邻体、及纤维蛋白的不同组合组成(Havenga et al.2002；Reaet al.2001)。这项研究中使用的嵌合载体包括Ad5f35(含有Ad35纤维knob、轴及Ad35-Ad5嵌合尾部的Ad5)、Ad5f35p35(含有Ad35纤维和轴、Ad35-Ad5嵌合尾部及五邻体的Ad5)及Ad35f5(含有Ad5纤维knob、轴和Ad5-Ad35嵌合尾部的Ad35)。
如图1C所示，针对Ad5、Ad5f35和Ad5f35p35观测到相似的NAb效价，均基于Ad5。由于Ad5f35p35载体的衣壳含有Ad5六邻体而不是Ad35衍生的纤维和Ad35衍生的五邻体，因此这些数据提示多数Ad5-特异性NAb活性针对Ad5六邻体。针对重组Ad35f5(在此也称作Ad35fib5)也测定到较低但明显可检测到的效价，表明这些样品中Ad5纤维特异性NAb比Ad5六邻体特异性NAb的效价低5至10倍。使用这些病毒未检测到Ad5五邻体特异性NAb，但是针对Ad5f35和Ad5f35p35的相似的NAb效价提示五邻体特异性NAb在这种中和中至多起相对较小的作用。
实施例3Ad35f5和Ad35k5的产生重组的基于Ad35的疫苗在存在抗Ad5免疫性的情况中是免疫原性的。然而，重组Ad35疫苗在没有抗Ad5免疫性的情况中固有地比重组Ad5疫苗的免疫原性低(Barouch et al.2004)。这个问题现在通过构建衣壳嵌合重组Ad35载体而克服，所述载体中至少Ad35纤维knob由Ad5纤维knob置换(Ad35k5是指knob置换，Ad35f5是指大多数纤维置换)。
重组Ad35k5载体是通过用嵌合纤维蛋白编码基因置换Ad35纤维蛋白编码基因而产生的，所述嵌合纤维蛋白编码基因由与Ad5纤维knob(第133至314位氨基酸)连接的Ad35纤维尾部和轴(第1至132位氨基酸)组成。Ad5纤维特异性抗体不减弱重组Ad5疫苗免疫原性。Ad35纤维knob与CAR不相互作用，因为其是亚群B腺病毒(Roelvink et al.1998)，但是代之利用CD46作为其受体(Gagger et al.2003)。不同的纤维蛋白引导这些病毒进入不同的细胞内运输途径(intracellular trafficking pathway)。先前的研究已经示出Ad5纤维knob促进病毒快速从早期内体逃出进入胞质，导致病毒基因组有效地易位至细胞核中，而来自包括AdI1和Ad35的亚家族B腺病毒的纤维knob使得病毒颗粒保持在晚期内体中，并且大部分级分再循环回到细胞表面(Shayakhmetov et al.2003)。
如下克隆编码Ad35k5载体的重组核酸。编码Ad5纤维knob的区域通过PCR合成并作为BsiWI-Nhel片段克隆进pBR.Ad35.PacI-rITR.dE3质粒(＝WO 2004/001032中所述的pBr.Ad35.PRΔE3)以取代编码Ad35纤维knob的相应区域。然后将突变体pBR.Ad35k5.PacI-rITR.dE3质粒与pWE.Ad3 5.pIX-EcoRV(WO2004/001032)粘粒及包含SIVmac239 Gag基因的接头质粒pAdApt35-SIVGag共转染进PER.C6/55K细胞中(见WO 00/70071和WO 02/40665)，双重同源重组产生重组的Ad35k5-SIVGag载体。将这种载体经噬斑纯化、测序、扩增及通过CsCl梯度离心随后经技术人员已知的一般纯化方法学纯化。嵌合纤维的核苷酸序列示于图2A(SEQ ID NO1)，其氨基酸序列示于图2B(SEQ ID NO2)。
Ad35f5载体典型如WO 00/7007 1针对Ad35fib16及WO 00/03029针对Ad5fibXX所述产生；其中将编码与Ad5纤维轴和Ad5纤维knob连接的Ad5纤维的部分尾部的PCR产物置于Ad35纤维尾部的剩余部分中。使用E3缺失的主链载体及使用BsiWI和NheI作为限制/克隆位点进行克隆程序。对于载体而言详见于WO 03/104467和WO2004/001032所述。
详细而言，进行如下程序以构建pBr/Ad35.pacI-rITRfib5对质粒pBr/Ad35.PacI-rITRNotI(＝WO 2004/001032中所述的pBr/Ad35.PRn)进行PCR，使用含有BamHI和BsiWI位点的引物DF35-15′-CAC TCACCA CCT CCA ATT CC-3′(SEQ ID NO6)和DF35-25′-CGG GATCCC GTA CGG GTA GAC AGG GTT GAA GG-3′(SEQ ID NO7)。这个PCR产生大约650bp的DNA片段，从纤维35尾部区域开始，通过其导入BsiWI位点和BamHI位点。接着，对质粒pBr/Ad35.PRn进行PCR，使用含有BamHI和NheI位点的引物DF35-35′-CGG GATCCG CTA GCT GAA ATA AAG TTT AAG TGT TTT TAT TTA AAATCA C-3′(SEQ ID NO8)及引物DF35-45′-CCA GTT GCA TTGCTT GGT TGG-3′(SEQ ID NO9)。这个PCR产生大约1400bp的DNA片段，从纤维35的终止密码子之后开始至E4区域。将pBr/Ad35.PRn用MIuI和NdeI消化，从Ad35主链除去2850bp的DNA片段(因此除去大多数纤维35区域)。将DF35-1+DF35-2的PCR片段用MIuI和BamHI消化及将DF35-3+DF35-4的PCR片段用BamHI和NdeI消化。将这两个PCR片段均连接进切割的pBr/Ad35PRn质粒，产生pBr/Ad35PRndFIB构建体。然后，使用新导入的BsiWI和NheI位点通过以Ad5 DNA作为模板产生PCR产物将Ad5纤维序列导入Ad35主链中，使用引物35F5-5-F5′-CGG GAA CGT ACG ACA CGGAAA CCG GTC CTC C-3′(SEQ ID NO10)和3 5F5-R5′-CGG CTAGCT AGC TTA TTC TTG GGC AAT GTA TGA AA-3′(SEQ ID NO11)产生所述PCR产物。之后，如针对pBr/Ad35PRNdE3构建体所述缺失E3区域。
本领域技术人员通过应用常规的分子克隆和腺病毒产生知识能产生这些克隆、插入片段、产生PCR产物及缺失某些片段和最后在包装细胞系中产生病毒。此外，获得可在体内和体外应用的腺病毒批次的生产和纯化方法也为本领域所熟知。
本发明论述的所有载体均是通过使用一般的CsCl纯化方法获得的，发现其在PER.C6/55K包装细胞系中稳定传代至少5代以上(数据未示出)。Ad35k5载体的生长速度和产量与亲代Ad35载体相似(数据未示出)。然而，Ad35k5载体(100-1000)与Ad35载体(10-100)相比，病毒颗粒(vp)与噬斑形成单位(pfu)的比率高大约10倍。
还研究了载体是否仍能通过其天然或取代的纤维knob识别其各自的受体(Ad5纤维结合CAR，Ad35纤维结合CD46)。用嵌合载体以及原始的基于Ad5和Ad35的载体确定了这些特异性相互作用(数据未示出)。
根据相同的策略，产生基于嵌合复制缺陷型Ad35的病毒，其包含Ad26或Ad49的knob。这些病毒被称作Ad35k26和Ad35k49，并且使用了罕见血清型Ad26和Ad49的纤维knob的CAR结合能力以及也是罕见血清型的主链载体衣壳中存在的六邻体蛋白，在此通过Ad35例证。分别代表Ad35k26和Ad35k49嵌合纤维的核酸序列和氨基酸序列示于图2E至2H。
对比Ad35k5、Ad35k26和Ad35k49病毒在体外提供转基因表达的能力。所有载体均携带SIVGag转基因。将7.5×104个A549细胞用2ml体积中的主毒种病毒(master virus seed stock viruses)(未知浓度的病毒)感染2小时。然后洗涤细胞并培养48小时。使用2F12抗p27单克隆抗体通过胞内染色随后通过流式细胞测量术分析评价Gag染色。这个实验的限制是未使用病毒颗粒的特定数目，因此不能明确推断Ad35k49与其它载体相比是否生长为较高效价或者其是否具有较高特异活性。在任何情形中，这种载体在复制/生长或者表达水平方面似乎比其它载体具有某些优势。图16示出Ad35k49的三个代表性批次与Ad35k5和Ad35k26的代表性批次相比示出显著较高的胞内表达水平。重组的腺病毒载体Ad35k49是本发明优选的实施方案。
为了在包装细胞中良好地生产腺病毒载体，本领域认识到通常通过将其基因稳定整合进包装细胞的基因组中而获得的E1B-55K蛋白应与通过病毒载体的E4区域产生的E4orf6蛋白相容。先前发现Ad35的E4orf6蛋白与通常在已知包装细胞如293细胞和PER.C6细胞中可获得的E1B-55K蛋白不相容(见WO 03/104467；WO 2004/001032；WO 2004/018627；WO 95/34671)。为了回避使用基因组中整合了来自Ad35的E1B-55K的新细胞系，并因此可以使得技术人员可以使用如PER.C6细胞提供的那些确定的生产平台，产生其中Ad35主链的E4orf6区域用来自Ad5的E4orf6区域置换的其它构建体，与WO03/104467所详细描述的内容一致。E4orf6区域的置换应用于所有基于Ad35的载体中，但是没有进一步用于本文所述的免疫原性研究和靶向研究中。
实施例4重组Ad35f5和Ad35k5与Ad5和Ad35的免疫原性对比载体的免疫原性通过对比携带嵌合纤维的载体与Ad5-SIVGag和Ad35-SIVGag而评定。
将从未进行过实验的小鼠(N＝5只/组)经肌内用1010vpAd5-SIVGag、Ad35-SIVGag、Ad35.BSU.SIVGag和Ad35fib5.BSU.SIVGag免疫。术语BSU是指在腺病毒基因组核酸中使用内源pIX启动子，其保证在基于Ad35的重组病毒生产期间pIX基因的正确表达。关于BSU构建体的详细描述见WO 2004/001032所述。将对照小鼠(N＝3只/组)用空白Ad5和Ad35载体免疫。28天后，取血样及如下文所述使用SIV gag ELIspot分析确定免疫应答。
图3示出这些实验的结果，表明所有载体与空白载体相比均能诱导关于SIV gag蛋白质的正确的T细胞应答，表明所述插入体在注射小鼠后提供了免疫原性蛋白质。
将另一组从未进行过实验的小鼠(N＝8只/组)用109vp或者108vp的Ad5-Gag、Ad35-Gag和Ad35k5-Gag载体(均编码SIV gag蛋白)免疫。疫苗引起的CD8+T淋巴细胞应答通过Db/AL11四聚体结合分析使用如下方法评定制备在显性SIVmac239 Gag AL11表位肽(AAVKNWMTQTL；SEQ ID NO3；Barouch et al.2004)周围折叠的四聚体的H-2Dd复合物，并用于染色小鼠的P18-特异性CD8+T淋巴细胞，使用本领域已知方法进行。将小鼠血液收集在含有40U/ml肝素的RPMI 1640中。在裂解红细胞后，利用0.1μg的PE-标记的Dd/P18四聚体联合APC-标记的抗-CD8 alpha rnAb(Ly-2；Caltag，Burlingame，CA，USA)染色P18-特异性CD8+T淋巴细胞。将该细胞在含有2％FBS的PBS中洗涤并在含有1.5％多聚甲醛的0.5ml的PBS中固定。在FACS Calibur(Becton Dickinson)上通过双色流式细胞测量术分析样品。检测门控的(Gated)CD8+T淋巴细胞的Dd/P18四聚体的染色。从未进行过实验的CD8+T淋巴细胞用作阴性对照，呈现＜0.1％的四聚体染色。
如图4所示，所有3种疫苗在109vp高剂量均是相似免疫原性的(A)。重要的是，在108vp较低剂量(B)，由重组Ad35k5-Gag引起的免疫应答比重组Ad35-Gag引起的那些免疫应答明显更强(在第14天小鼠组中平均四聚体应答p＜0.01，使用带Bonferroni校正的方差分析进行多重比较)，数量级与Ad5-Gag引起的那些应答几乎相似(p＝ns)。这与先前的观测结果(Barouch et al.2004；Lemckert et al.2005)一致。这些数据表明工程化Ad35载体，由此其携带亚群C腺病毒(例如Ad5)的knob结构域，导致其关于插入载体中的抗原的免疫原性改良。
这些实验在没有抗Ad5免疫性的情况下进行，示出Ad5和Ad35k5产生相似的免疫应答，而这些显著高于Ad35载体。重要的是注意Ad35k5载体携带Ad35六邻体，其在具有针对Ad5的六邻体蛋白的中和活性的个体中产生免疫应答方面增加较高的效力。因此，Ad35k5载体在存在抗Ad5免疫性的情况中比基于Ad5-和Ad35的载体明显更有效。Ad5在这些条件下由于其天然的六邻体蛋白而呈现较低的免疫原性，Ad35由于其天然纤维knob结构域而通常呈现较低的免疫原性。
不能排除纤维蛋白的中和抗体可以基于感染而产生。然而，相信在自然条件下这种中和活性最小，宿主的大部分免疫应答是针对六邻体蛋白。重要的是注意其中对比重组载体与预先用亲代载体免疫的实验是在模拟自然(人)状况的条件下进行，其中野生型病毒感染天然宿主一或两次，诱导天然发生水平的中和抗体。在实验室背景中的小鼠中，通过多次注射及高效价施用可以产生极度的免疫应答。模拟自然状况的实验表明纤维蛋白的中和抗体是否确实对于中和所施用的腺病毒载体是重要的。他们还揭示了存在纤维的轴区域的重要性，该部分对于中和活性也典型是有用的。
我们推断包含通过CAR识别并感染宿主细胞的腺病毒(例如Ad2、Ad5等)的至少knob及进一步包含来自至少中和的血清型(例如AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50)的衣壳的主要免疫原性决定簇(即六邻体蛋白)的载体是极佳的接种载体，因为它们组合了在人群中低载体预先存在的免疫性、高抗原性插入体免疫应答、可再生的生产、有效转导和良好稳定性等迄今为止未知的优势。
实施例5Ad5、Ad35k5和Ad35在具有预先存在的免疫性的小鼠中的免疫原性接下来，评价抗Ad5免疫性对这些载体的免疫原性的影响。将C57/BL6小鼠组(N＝4只/组)在接种之前4周用1010vp Ad5-Empty预免疫一次以产生低/中等水平的抗Ad5免疫性。这些小鼠中Ad5特异性中和抗体(NAb)效价为64至128(Barouch et al.2004；Lemckert et al.2005；Sprangers et al.2003)。如图4C所示，由108Vp Ad5-Gag引起的四聚体+CD8+T淋巴细胞应答在这些小鼠中被基本消除。相反，108vp Ad35-Gag和Ad35k5-Gag应答基本不受这个水平的抗Ad5免疫性的影响。重要地，证实在免疫后第14天，在这些小鼠中Ad35k5-Gag的免疫原性强于Ad5-Gag(p＜0.001)和Ad35-Gag(p＜0.05)。
Ad35k5-Gag逃避低/中等水平抗Ad5免疫性的能力与先前发现Ad5特异性NAb主要针对Ad5六邻体蛋白(见上述；Sumida et al.2005)的发现一致。然而，在这项先前的研究中也检测到针对Ad5纤维蛋白的低水平NAb。因此在具有高水平抗Ad5免疫性的小鼠中重复这项实验。将小鼠在接种之前8周和4周用1010vp Ad5-Empty预免疫两次。这些小鼠中Ad5特异性NAb效价为8,192至16,384(Barouch et al.2004；Lemckert et al.2005；Sprangers et al.2003)，与在撒哈拉以南非洲个体中发现的最高效价相似(Kostense et al.2004；Sumida et al.2005)。如图4D所示，由Ad35k5-Gag引起的四聚体+CD8+T淋巴细胞应答在这些小鼠中被部分降低，与由Ad35-Gag诱导的那些应答相似(p＝ns)。因此，高水平的抗Ad5免疫性部分抑制了Ad35k5载体的免疫原性。
为了进一步详细评价由嵌合Ad35k5-Gag载体引起的载体特异性免疫性，进行异源初次-加强研究以及病毒中和分析。将从未进行过实验的C57/BL6小鼠组(N＝4只/组)在第0周用109vp Ad35k5-Gag初次免疫，然后在第4周用109vp Ad5-Gag或者Ad35-Gag加强。如图5A所示，由Ad35k5-Gag引起的四聚体+CD8+T淋巴细胞应答由Ad5-Gag而非Ad35-Gag有效加强。这些数据提示Ad35和Ad35k5诱导实质的交叉反应性抗载体免疫性，而Ad5和Ad35k5很大程度上是免疫学独特的。与这些观测结果一致，用Ad35k5-Gag免疫一次的小鼠产生与Ad35-Gag诱导的那些相似的Ad35特异性NAb，但是明显低于Ad5特异性NAb(图5B)。因此，Ad35k5载体呈现与Ad35载体而非Ad5载体更相似的血清学图谱(serologic profile)。
为了评价这些结果的可推广性，在不同品系小鼠中评价表达另一种抗原(EnvHIV-I 89.6P Env gp120，对于克隆的详细描述见本文及Vogels et al.2003所述)的Ad35k5载体的免疫原性。将从未进行过实验的Balb/c小鼠组(N＝4只/组)经肌内用109vp Ad5-Env、Ad35k5-Env或者Ad35-Env免疫一次。由Ad35k5-Env载体引起的细胞和体液免疫应答介于由Ad5-Env载体与Ad35-Env载体诱导的那些应答之间，通过IFN-γ ELISPOT分析(图6A)及Env特异性ELISA(图6B)测定。
如下进行ELISA。通过直接ELISA测定免疫的小鼠特异于HIV-IEnv或SIV Gag的血清抗体效价(Barouch et al.2003；Sumida et al.2005)。将用于PBS中的100μl/孔的1μg/ml重组HIV-I MN Env gp120或者SIVmac239 Gag p27多肽(ImmunoDiagnostics)包被过夜的96孔平板用含有2％BSA和0.05％Tween-20的PBS封闭2小时。然后将血清加入系列稀释液中，保温1小时。将该平板用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤3次，用过氧化物酶缀合的亲和性纯化的兔抗小鼠二级抗体(Jackson Laboratories，USA)的1∶2000稀释液保温1小时。将该平板洗涤3次，用四甲基联苯胺显色，用1％HCl终止，用Dynatech MR5000 ELISA平板读数器在450nm进行分析。
实施例6Ad5、Ad35k5和Ad35载体在恒河猴中的免疫原性为了证实在小鼠中的免疫原性研究，进行初步研究以评价这些载体在恒河猴中的免疫原性。将9只Mamu-A*01-阴性恒河猴(N＝3只/组)经肌内用表达SIV Gag和HIV-I Env的1011vp Ad5、Ad35或Ad35k5载体免疫。在第0周对恒河猴进行初次免疫及在第12周接受同源加强免疫。图7示出了这些动物中的抗原及载体特异性免疫应答。Gag-和Env-特异性细胞免疫应答通过混合肽IFN-γ ELISPOT分析量化，载体特异性NAb效价通过在免疫后的多个时间点基于荧光素酶的病毒中和分析确定。如上述进行中和分析。
正如所期望的，Ad5载体在初次免疫后引起高频率的ELISPOT应答(在第12周平均Gag+Env应答为538 SFC/106PBMC)，但是这些应答在同源加强免疫后基本不增加(在第16周平均为608 SFC/106PBMC；图7A)，大概反映了这些动物中高效价的Ad5-特异性NAb的快速产生(图7B)。相反，在初始免疫后Ad35载体引起抗原特异性ELISPOT应答比Ad5载体诱导的那些应答大约低2倍(在第12周平均为248 SFC/106PBMC)。令人感兴趣地，这些应答在同源加强免疫之后充分增加(在第16周平均为876 SFC/106PBMC；图7C)，与在这些动物中最初产生的较低效价的载体特异性NAb一致(图7D)。这些数据提示Ad35载体与Ad5相比在恒河猴中既引起较低的抗原特异性免疫应答，也引起较低的载体特异性免疫应答。
在初次免疫后，Ad35k5载体引起与Ad5载体诱导的那些应答相似的抗原特异性ELISPOT应答(在第12周平均为578 SFC/106PBMC；图7E)。重要地，这些应答在同源加强免疫之后充分增强(在第16周平均为1736 SFC/106PBMC)，大概反映了在这些猴中最初产生的相对低的载体特异性NAb(图7F)。事实上，在加强免疫之后，Ad35k5载体引起比Ad5和Ad35载体均高2倍的Gag-和Env-特异性ELISPOT应答。此外，Ad35k5载体在免疫后第16周引起强的分级(fractionated)CD4+和CD8+T淋巴细胞应答，通过ELISPOT分析使用CD8耗竭的和CD4耗竭的PBMC(图8A、B、C分别为Ad5、Ad35、Ad35k5)确定。
实施例7含有嵌合六邻体蛋白的重组Ad5载体的产生Crawford-Miksza和Schnurr(1996)所述的Ad2的、Rux和Burnett(2000)所述的Ad5的、Rux et al.(2003)所述的Ad5的及本发明所述的Ad5的HVR示于表I。根据本发明对HVR的限定，表II提供了人腺病毒Ad5、AdI1、Ad2 6、Ad35和Ad48及黑猩猩腺病毒68(Pan9)的7个HVR序列。还示出了各自的六邻体序列的特定位置。
构建基于Ad5的载体，其含有一或多个从Ad35(亚群B)或者Ad48(亚群D)中交换的HVR。
在本发明更“最小化的”的实施方案中，上述腺病毒血清型的HVR是略微较短的形式。这些HVR在表IV中用星号表示为HVR(1-7)*。在重组载体中最小化限定是HVR1*从主链中缺失，HVR2*用短的两个氨基酸间隔区(QG)取代，而HVR3*、HVR4*、HVR5*、HVR6*和HVR7*由其各自来自其它血清型的较短(*)对应物取代。更显著地，对HVR7的再定义更窄(对比表II和表IV)。
含有所需序列的部分六邻体基因通过GeneArt(Germany)合成，并作为ApaI-HpaI片段克隆进含有完整Ad5六邻体基因的穿梭质粒中。然后从该穿梭质粒中切下较大的AscI-AscI片段，用于取代Ad5粘粒pWE.Ad5.Af111-rITR.dE3(基于粘粒pWE.Ad5.Af111-rITR、缺失E3区域的载体，见WO 02/40665所述)中相应的Ascl-Ascl片段。然后将突变的Ad5粘粒与接头质粒pAdApt-Gag(编码猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的gag蛋白)一起共转染进PER.C6/55K细胞(在PER.C6细胞中具有来自Ad35的55K E1B基因，见WO 02/40665)中，同源重组产生重组的Ad5HVR35(1)-Gag、重组的Ad5HVR48(1)-Gag及重组的Ad5HVR4 8(1-7)-Gag病毒，其中“1”是指仅HVR1的取代，“1-7”是指所有7个单独的HVR的取代。将这些载体通过本领域已知的一般程序经噬斑纯化、测序、扩增并通过CsCl梯度离心纯化。Ad5HVR4 8(1-7)-Gag中六邻体的序列示于图11。
除了上述三种病毒之外，也产生了如下重组载体Ad5HVR35(1-6)、Ad5HVR35(1-7)(图12)、Ad5HVR11(1-6)、Ad5HVR11(1-7)(图13)、Ad5HVR26(1-6)、Ad5HVR26(1-7)(图14)、Ad5HVRPan9(1-6)和Ad5HVRPan9(1-7)(图15)。“1-6”是指HVR1-HVR6的取代，剩余亲代载体的HVR7。显然，基于一些可利用的亲代载体(如Ad2和Ad5)及一些已知的罕见血清型，根据本发明的教导可以产生更多种组合。可用于提供HVR以产生“stealth”样载体的其它罕见人腺病毒血清型是Ad24、Ad34、Ad4 9和Ad50。
实施例8Ad5、Ad5HVR48(1)和Ad5HVR48(1-7)病毒在从未进行过实验的小鼠和具有抗Ad5免疫性的小鼠中的免疫原性如上所述，在包装细胞中产生了存活的重组Ad5-Gag、Ad5HVR48(1)-Gag和Ad5HVR4 8(1-7)-Gag病毒。Ad5HVR48(1)-Gag的产量与重组Ad5-Gag病毒相似，而Ad5HVR4 8(1-7)-Gag病毒的生长速度、产量和vp/pfu比率比Ad5-Gag病毒低大约2倍。Gag表达首先在用109或1010vp的每种载体感染的A549细胞上检测。HPLC数据表明胞内Gag表达是足够的，在不同载体之间相似(数据未示出)，尽管从Ad5HVR4 8(1-7)-Gag中表达略低于Ad5-Gag。这可能与略低的生长速度相关。
病毒的免疫原性首先通过用109、108及107vp的每种载体免疫从未进行过实验的C57/BL6小鼠(4只小鼠/组)进行研究。疫苗引起的CD8+T淋巴细胞应答如上述通过Db/AL11四聚体结合分析评定2周。结果示于图9。显然，所有这三种载体在这些从未进行过实验的小鼠中均产生相似的免疫应答，尽管在生长速度和转基因表达中有少许差异。
随后，将C57/BL6小鼠分别在用感兴趣的病毒免疫之前8周和4周注射两次1010vp Ad5-Empty进行预免疫(Ad5 Nab效价8192至16384)，以产生针对基于Ad5载体的预先存在的免疫性。然后(首次预免疫后8周)，将小鼠如上述用109、10％和107vp的重组Ad5-Gag、Ad5HVR48(1)-Gag和Ad5HVR4 8(1-7)-Gag免疫。再一次，疫苗引起的CD8+T淋巴细胞应答如上述通过Db/AL11四聚体结合分析评定2周。结果示于图10。ELISPOT结果反映了所述四聚体分析结果，提供了相似结果(数据未示出)。
正如所期望的，Ad5-Gag载体在这些预免疫的小鼠中遭遇预先存在的免疫性，导致难以检测到的免疫应答。Ad5HVR48(1)-Gag病毒也不能回避高水平的抗Ad5免疫性，提示所述预先存在的免疫性至少非仅限于HVR1。重要地，Ad5HVR4 8(1-7)-Gag病毒的免疫原性不受Ad5诱导的预先存在的免疫性的影响，表明通过突变Ad5的7个六邻体HVR(如在本发明鉴别)并用罕见血清型(例如Ad48)的相应HVR取代其，产生不受针对野生型蛋白质的预先存在的免疫性妨碍的载体。在其中将小鼠用空白Ad5载体初次免疫两次的实验中获得相似结果，代表具有高水平预先存在的免疫性的状况(图21)。这个实验用每组4只C57/BL6小鼠进行。为小鼠组注射两次1010vpAd5-Empty进行预免疫，以诱导抗Ad5免疫性。用Ad5-Empty预免疫的小鼠的Ad5 NAb效价为8192-16384。然后将小鼠在第0天经肌内用109vp Ad35-Gag初次免疫，然后在第28天用109Vp Ad5-Gag、109vp Ad35-Gag或者109vp Ad5HVR4 8(1-7)-Gag加强。所有注射体积均是50μl。X轴上箭头表示免疫。在第0、7、14、21、28、35、42、49、56天取血样进行Db/AL11四聚体染色分析以量化疫苗引起的CD8+T淋巴细胞应答。在第56天，还进行IFN-γ ELISPOT分析，示出相似的结果(数据未示出)。Ad5-Gag不能加强应答，推测是由于预先存在的抗Ad5免疫性所致。Ad35-Gag也不能加强应答，推测是由于初次免疫诱导的抗Ad35免疫性所致。Ad5HVR4 8(1-7)有效加强该应答，证实这种载体起一些新血清型的作用。因此推断Ad5HVR4 8(1-7)在其中Ad5失败的背景及在其中异源载体(如Ad35)用作初次免疫载体的背景中可以作为有效的加强载体。组合先前的研究，我们推断由Ad5HVR48(1-7)代表的载体在其中Ad5失败的预先存在抗Ad5免疫性的背景中既是有效的初次免疫载体又是有效的加强载体。
现在这些结果使得人们可以在初次-加强背景中使用基于Ad5的载体，而受体识别(主要通过纤维和五邻体蛋白进行)保持不变。
表I人腺病毒Ad2(Crawford-Miksza and Schnurr，1996)、Ad5(Rux and Burnett，2000；Rux et al.2003)和Ad5(本发明)的六邻体蛋白中高变区的限定。基于Ad2序列，Rux and Burnett(2000)对Ad5的HVR的限定与Crawford-Miksza限定非常符合。注意在这个表中这些HVR限定由于缺少Rux and Burnett(2000)限定(HVRl137-181等.)中的初始甲硫氨酸残基而均有1个位置的改变。
表II
表II(续)
表III本发明的嵌合复制缺陷型腺病毒载体，包括所述载体中不同元件的鉴别
表IV
表IV(续)
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权利要求
1.一种复制缺陷型重组腺病毒，其选自腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50，所述腺病毒包含嵌合纤维蛋白，所述嵌合纤维蛋白包含来自结合CAR的腺病毒血清型的至少knob结构域，其中所述重组载体进一步包含编码感兴趣的治疗蛋白质或抗原性蛋白质的异源核酸。
2.权利要求1的重组腺病毒，其中所述knob结构域来自亚群C的腺病毒血清型。
3.权利要求2的重组腺病毒，其中所述亚群C血清型是Ad5。
4.权利要求1-3任一项的重组腺病毒，其中所述感兴趣的异源核酸在异源启动子的控制下。
5.权利要求1-4任一项的重组腺病毒，其中所述感兴趣的抗原性蛋白质包含来自病毒、细菌、寄生虫或酵母的蛋白质。
6.权利要求5的重组腺病毒，其中所述抗原性蛋白质包含来自病毒的蛋白质，其中所述病毒是逆转录病毒、HSV或Ebola病毒。
7.权利要求6的重组腺病毒，其中所述病毒是猿猴或人免疫缺陷逆转录病毒。
8.权利要求7的重组腺病毒，其中所述异源核酸包含一或多个基因，所述基因选自编码免疫缺陷病毒的gag、pol、env和nef蛋白的基因。
9.权利要求5的重组腺病毒，其中所述感兴趣的抗原性蛋白质来自寄生虫，其中所述寄生虫是导致疟疾的寄生虫。
10.权利要求9的重组腺病毒，其中所述蛋白质是来自疟原虫物种的环子孢子蛋白或者其免疫原性部分。
11.权利要求10的重组腺病毒，其中所述疟原虫物种是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。
12.权利要求1-11任一项的重组腺病毒，其被用作药物。
13.权利要求1-11任一项的重组腺病毒载体在生产用于预防或治疗疟疾感染、Ebola感染、HSV感染或HIV感染的药物中的应用。
14.一种嵌合的复制缺陷型重组腺病毒，其包含来自Ad5的纤维的具有如图2B下划线所示氨基酸序列的knob结构域和来自与Ad5不同的血清型的六邻体蛋白。
15.权利要求14的嵌合重组腺病毒，其中所述六邻体蛋白来自被较低中和的腺病毒血清型。
16.一种嵌合的复制缺陷型重组Ad35载体，其包含Ad35六邻体和嵌合纤维蛋白，所述嵌合纤维蛋白具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列。
17.基于第一亚群的血清型的重组复制缺陷型腺病毒批次，所述腺病毒包含一种嵌合六邻体蛋白，其中所述六邻体蛋白包含来自所述第一亚群的血清型的序列及来自第二亚群的血清型的至少一个高变区(HVR)序列，其中所述第一和第二亚群不相同。
18.权利要求17的腺病毒批次，其中所述第一亚群是亚群A、C、D、E或F。
19.权利要求17或18的腺病毒批次，其中所述第二亚群是亚群B或D。
20.权利要求18的腺病毒批次，其中所述第一亚群是亚群C，来自所述亚群C的血清型是Ad5。
21.权利要求19的腺病毒批次，其中所述来自亚群B或D的血清型选自AdI1、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。
22.权利要求17-21任一项的腺病毒批次，其中所述嵌合六邻体蛋白包含所述第二亚群血清型的前六个HVR序列(HVR1至HVR6)或者所有七个HVR序列(HVR1-HVR7)。
23.权利要求17-22任一项的腺病毒批次，其中HVR序列之间的序列来自所述第一亚群的血清型。
24.权利要求18的腺病毒批次，其中所述第一亚群是亚群C，其中来自所述第二亚群血清型的至少一个HVR序列选自SEQ IDNO24-79。
25.权利要求24的腺病毒批次，其中HVR1序列选自SEQ ID NO17、24、31、38、45、52、59、66和73，其中HVR2序列选自SEQID NO18、25、32、39、46、53、60、67和74，其中HVR3序列选自SEQ ID NO19、26、33、40、47、54、61、68和75，其中HVR4序列选自SEQ ID NO20、27、34、41、48、55、62、69和76，其中HVR5序列选自SEQ ID NO21、28、35、42、49、56、63、70和77，其中HVR6序列选自SEQ ID NO22、29、36、43、50、57、64、71和78，其中HVR7序列选自SEQ ID NO23、30、37、44、51、58、65、72和79。
26.权利要求18的腺病毒批次，其中所述第一亚群是亚群C，其中来自所述第二亚群的血清型的至少一个HVR序列选自SEQ IDNO95-150。
27.权利要求26的腺病毒批次，其中所述HVR1序列选自SEQID NO88、95、102、109、116、123、130、137和144，其中HVR2序列选自SEQ ID NO89、96、103、110、117、124、131、138和145，其中HVR3序列选自SEQ ID NO90、97、104、111、118、125、132、139和146，其中HVR4序列选自SEQ ID NO91、98、105、112、119、126、133、140和147，其中HVR5序列选自SEQ ID NO92、99、106、113、120、127、134、141和148，其中HVR6序列选自SEQ ID NO93、100、107、114、121、128、135、142和149，其中HVR7序列选自SEQ ID NO94、101、108、115、122、129、136、143和150。
28.权利要求17-27任一项的腺病毒批次，其中缺失HVR1序列。
29.权利要求17-28任一项的腺病毒批次，其中HVR2序列由接头取代，优选由两个氨基酸的接头、更优选由氨基酸QG取代。
30.编码亚群B的人腺病毒血清型的六邻体的至少一个HVR序列的分离的核酸在构建嵌合六邻体蛋白中的应用，所述六邻体进一步包含来自亚群A、C、D、E或F腺病毒的序列。
31.编码亚群D的人腺病毒血清型的六邻体的至少一个HVR序列的分离的核酸在构建嵌合六邻体蛋白中的应用，所述六邻体进一步包含来自亚群A、B、C、E或F腺病毒的序列。
32.权利要求30或31的应用，其中所述至少一个HVR序列选自SEQ ID NO24-79和95-150。
33.一种基于主链腺病毒的嵌合的复制缺陷型腺病毒，其包含血清型X的五邻体和六邻体，其中六邻体蛋白中的n个HVR是血清型Y的HVR，进一步包含纤维，所述纤维包含血清型F的尾部和轴及血清型K的knob，其中X是选自人腺病毒1至51、猿猴血清型、犬血清型、绵羊血清型、猪血清型和牛血清型的腺病毒血清型，Y是选自人腺病毒11、24、26、34、35、48、49和50的腺病毒血清型；其中X和Y可以相同或不同，且其中n表示从0至7的任何数目的HVR，条件是如果XΦY，则n＝1至7；F是选自人腺病毒1至51、猿猴血清型、犬血清型、绵羊血清型、猪血清型和牛血清型的腺病毒血清型；其中F、X和Y可以相同或不同；及K是主要使用CAR作为细胞受体的腺病毒血清型，其中K、F、X和Y可以相同或不同。
34.权利要求33的嵌合的复制缺陷型腺病毒，其中在F不是X的情况中，与五邻体蛋白相互作用的纤维蛋白的尾部的至少一部分是血清型X的。
全文摘要
本发明涉及基于遭遇少数人群中预先存在的免疫性的腺病毒并且携带嵌合衣壳的重组腺病毒载体。所述嵌合衣壳包含纤维蛋白和六邻体蛋白质，所述纤维蛋白至少具有能结合柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)的人腺病毒的knob结构域，所述六邻体蛋白来自遭遇少数人群中预先存在的免疫性的腺病毒血清型。
文档编号A61K48/00GK101072879SQ200580035136
公开日2007年11月14日 申请日期2005年10月12日 优先权日2004年10月13日
发明者曼佐·扬斯·埃姆科·海文加, 丹·巴罗什 申请人:克鲁塞尔荷兰公司, 贝斯以色列护理医疗中心有限公司