专利名称：其表面上固定有促骨生长肽的骨移植材料和支架材料的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及骨移植材料和用于组织工程应用的支架，在其表面固定有促骨生长肽(osteogenesis-promoting peptides)，更具体而言，涉及骨移植材料和用于组织工程应用的支架(下文中，称为支架)，在其表面固定有诱导细胞粘着的肽和/或细胞因子衍生的肽。
背景技术：
支撑牙齿的牙周组织通常包括齿槽骨、在齿槽骨和牙齿之间形成牙周膜的牙周韧带组织和结缔组织。由于牙周炎的发展而导致的齿槽骨的缺损包括牙周韧带组织的缺损，并且，在治疗牙周炎后，由于结缔组织的过分生长，在牙周韧带缺损部位不能对齿槽骨和牙周韧带组织实施正常修复。而且，即使新骨形成了，外周韧带组织不能正常分化，以致造成牙齿功能的丧失。
为了解决这些问题，在引导牙周再生中，积极尝试了用人造屏障膜和自体移植来诱导组织的完全再生或新形成。而且，为了骨组织的再生，组织工程支架被用作骨移植材料。自从近十年报道了一些通过引入骨移植材料和支架来表明有效诱导牙周组织和骨组织的案例以来(Camelo，M.et.al，International J.Periodont.Restorative Dent.21109，2001)，已经使用了不同材料，包括由牛骨制备的骨粉颗粒，作为骨材料和组织工程支架用于组织再生。
同时，为了改善用于骨再生的骨移植材料和支架的效果，目前进行了将能改善组织再生的材料附着到骨移植材料和支架的研究。在这些材料中，报道了细胞外基质或特异性组织生长因子具有良好的损坏骨的修复和再生能力，它们对组织再生的良好能力也在实际的临床试验结果中得到了证实。
然而，存在的缺点是大多数细胞外基质和生长因子相对昂贵，且在具有几十kDa分子量的高分子量活体中不稳定，从而导致其活性降低。特别地，存在的问题是它们会在几分钟内消失，以致为了获得所期望的治疗效果而高剂量地施用，如此以来，便引起了副作用。
近来，尝试了简单应用这些材料来减少缺陷，所述的简单应用是指把组织生长因子加到用于引导骨再生的骨移植材料和用于组织工程中的聚合体支架中，从而诱导组织生长因子的缓释。
而且，已证实了这些尝试的某些效果。然而，缺陷在于，把组织生长因子与这些骨移植材料进行物理混合的结果是，在初始应用时，生长因子发生突释，以致在治疗期间很难使组织生长因子维持其有效浓度。
发明内容
因此，本发明人已经作出了多方面的努力来解决在现有技术中存在的上述问题，结果发现，在其表面固定有能达到组织再生效果的组织生长因子的活性位点肽和细胞外基质蛋白的骨移植材料和支架显示了稳定、持久的药理作用，即使在其上粘着的是低浓度水平的肽也能产生如此效果。本发明是基于这一发现而完成的。
本发明的一个目的是提供用于组织工程应用的骨移植材料和支架，即使其上固定着低浓度水平的诱导细胞粘着的肽和/或组织生长因子衍生的肽，仍可达到所期望的组织再生效果。
为了达到上述目的，本发明提供了用于组织工程应用的骨移植材料和支架，其具有在其表面固定的诱导细胞粘着的肽和/或组织生长因子衍生的肽。特别地，本发明提供了骨移植材料和支架，在其表面固定有具有药理活性的诱导细胞粘着的肽和/或组织生长因子衍生的肽，因而该骨移植材料和该支架具有药理活性，从而可提高它们对骨组织再生或其它组织再生的功效。诱导细胞粘着的肽或组织生长因子衍生的肽是通过分离和提取具有生理活性的细胞因子的活性位点氨基酸序列，并对提取物实施化学修饰以维持其活性结构而获得。
特别地，诱导细胞粘着的肽优选为具有RGD氨基酸序列的肽。更优选地，所述氨基酸序列为CGGRGDS(SEQ ID NO1)或CGGVACDCRGDCFC(SEQ ID NO2)，用以维持RGD氨基酸序列的结构稳定性。而且，组织生长因子衍生的肽为从组织生长因子的活性位点确定并化学合成的肽。优选地，其选自下列肽中的至少一个
骨形态发生蛋白(BMP)-2、4和6[SEQ ID NO3表示BMP-2，SEQ ID NO4表示BMP-4和SEQ ID NO5表示BMP-6]中任何一个的2-18位氨基酸序列；BMP-2的16-34位氨基酸序列(SEQ ID NO6)、47-71位氨基酸序列(SEQID NO7)、73-92位氨基酸序列(SEQ ID NO8)、88-105位氨基酸序列(SEQ IDNO9)、283-302位氨基酸序列(SEQ ID NO10)、335-353位氨基酸序列(SEQID NO11)和370-390位氨基酸序列(SEQ ID NO12)；BMP-4的74-93位氨基酸序列(SEQ ID NO13)、293-313位氨基酸序列(SEQ ID NO14)、360-379位氨基酸序列(SEQ ID NO15)和382-402位氨基酸序列(SEQ ID NO16)；BMP-6的91-110位氨基酸序列(SEQ ID NO17)、397-418位氨基酸序列(SEQID NO18)、472-490位氨基酸序列(SEQ ID NO19)和487-510位氨基酸序列(SEQ ID NO20)；和BMP-7的98-117位氨基酸序列(SEQ ID NO21)、320-340位氨基酸序列(SEQ ID NO22)、390-409位氨基酸序列(SEQ ID NO23)和405-423位氨基酸序列(SEQ ID NO24)；(b)骨涎蛋白的62-69位氨基酸序列(SEQ ID NO25)、139-148位氨基酸序列(SEQ ID NO26)、259-277位氨基酸序列(SEQ ID NO27)、199-204位氨基酸序列(SEQ ID NO28)、151-158位氨基酸序列(SEQ ID NO29)、275-291位氨基酸序列(SEQ ID NO30)、20-28位氨基酸序列(SEQ ID NO31)、65-90位氨基酸序列(SEQ ID NO32)、150-170位氨基酸序列(SEQ ID NO33)和280-290位氨基酸序列(SEQ ID NO34)；(c)转化生长因子的242-250位氨基酸序列(SEQ ID NO35)、279-299位氨基酸序列(SEQ ID NO36)和343-361位氨基酸序列(SEQ ID NO37)；(d)血小板源生长因子的100-120位氨基酸序列(SEQ ID NO37)和121-140位氨基酸序列(SEQ ID NO39)；(e)酸性成纤维细胞生长因子的23-31位氨基酸序列(SEQ ID NO40)和97-105位氨基酸序列(SEQ ID NO41)；(f)碱性成纤维母细胞生长因子的16-27位氨基酸序列(SEQ ID NO42)、37-42位氨基酸序列(SEQ ID NO43)和107-112位氨基酸序列(SEQ ID NO45)；(g)牙本质涎蛋白的255-275位氨基酸序列(SEQ ID NO46)、475-494位氨基酸序列(SEQ ID NO47)和551-573位氨基酸序列(SEQ ID NO48)；
(h)肝素结合性EGF样生长因子的63-83位氨基酸序列(SEQ ID NO49)、84-103位氨基酸序列(SEQ ID NO50)和121-140位氨基酸序列(SEQ ID NO52)；(i)钙粘蛋白EGF LAG七传G型受体3(cadherin EGF LAG seven-passG-type receptor 3)的326-350位氨基酸序列(SEQ ID NO53)、351-371位氨基酸序列(SEQ ID NO54)、372-400位氨基酸序列(SEQ ID NO55)、401-423位氨基酸序列(SEQ ID NO56)、434-545位氨基酸序列(SEQ ID NO57)、546-651位氨基酸序列(SEQ ID NO58)、1375-1433位氨基酸序列(SEQ IDNO59)、1435-1471位氨基酸序列(SEQ ID NO60)、1475-1514位氨基酸序列(SEQ ID NO61)、1515-1719位氨基酸序列(SEQ ID NO62)、1764-1944位氨基酸序列(SEQ ID NO63)和2096-2529位氨基酸序列(SEQID NO64)；和(j)成骨细胞特异性钙粘蛋白(OB-cadherin)的54-159位氨基酸序列(SEQID NO65)、160-268位氨基酸序列(SEQ ID NO66)、269-383位氨基酸序列(SEQ ID NO67)、384-486位氨基酸序列(SEQ ID NO68)和487-612位氨基酸序列(SEQ ID NO69)。
更优选地，在肽的N末端附加有一个有间隔基(CGG-)，该间隔基是由一个半胱氨酸和两个甘氨酸组成，这样可易于使肽被化学固定在骨移植材料和支架上。
本发明的活性肽是通过下述方法制得的合成组织生长因子全氨基酸序列中的每一个10-20氨基酸序列，使合成的氨基酸序列接受细胞粘着试验来筛选具有最高活性的氨基酸序列，然后对所筛选的氨基酸序列的末端实施化学修饰，以便使其易于化学固定在骨移植材料和支架上。这样，该骨移植材料能仅用在其表面的最少的氨基酸序列来维持活性，同时降低由于体内掺合与药物的使用而造成的组织生长因子的损耗及副作用，从而提供有利于治疗效果的其它优点。
在本发明中，如果在本技术领域使用，可使用所有类型和种类的骨移植材料和支架。这些骨移植材料和支架的优选的实例包括衍生自生物体的骨矿物粉、源于自体骨、牛骨和猪骨的多孔块状物(porous blocks)、合成羟基磷灰石粉和多孔块状物、磷酸三钙粉和多孔块状物、磷酸二氢钙粉和多孔块状物、由二氧化硅制备的骨移植材料、由二氧化硅和聚合物的混合物制备的骨充填移植材料、由包括壳聚糖、聚乳酸的生物相容性聚合体制备的细颗粒和多孔支架、钛和立体支架。在这一方面，优选地，骨移植材料和支架的表面被修饰，从而使活性肽易于粘着在其表面。根据本发明的用于组织工程应用的支架包括屏障膜、牙植入物用于牙周骨再生的牙植入物等。
屏障膜的优选实例包括，但不限于由聚乳酸制备的多孔膜、由壳多糖或壳聚糖的纳米纤维制备的再生膜、由壳多糖或壳聚糖制备的膜状屏障膜。而且，作为植入物，优选使用钛植入物，但不限于此。在这一方面，植入物的表面优选被氧化修饰和硝化修饰，从而使活性肽易于粘着在其表面。
与组织生长因子本身相比，根据本发明的肽对体内酶促反应更敏感，并且具有较低的体内免疫原性。当活性肽被固定在用于组织再生的骨移植材料、支架、屏障膜或植入物的表面和用于外科手术时，活性肽的想要的浓度可局部出现并表现出活性，这样可提高它们的治疗效果。因此，该活性肽具有适宜的用于骨组织与牙周组织的再生和修复性能。
本发明的具有游离氨基或在N末端具有半胱氨酸的肽易于通过交联剂固定在骨移植材料和支架的表面。适宜用于本发明的交联剂包括，但不限于1，4-二-马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1，11-二-马来酰亚胺基四甘醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二酰亚胺盐酸化物(EDC)、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯](SMCC)和硫代-SMCC、琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺基]己酸酯(SPDP)和硫代-SPDP、间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和硫代-MBS、琥珀酰亚胺基[4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯](SMPB)和硫代-SMPB。
另外，所述肽是化学连接到骨移植材料和支架的表面，因此，它们以优选0.1-10mg/cm2，更优选1-5mg/cm2的量在其表面。
附图简述
图1显示了固定在根据本发明的骨移植材料上的肽的电子表面分析(electronic surface analysis)结果。图1中，(A)显示在其表面未固定有肽的骨移植材料的电子表面分析结果，(B)显示在其表面固定有含硫肽的骨移植材料的电子表面分析结果。
图2显示共焦激光扫描显微图，该图显示本发明的骨移植材料的细胞粘着方式。图2(A)显示细胞粘着到不具有固定肽的骨移植材料上的细胞粘着方式，图(B)和(C)分别显示在具有源自BMP和骨涎蛋白的肽固定的骨移植材料的表面上的细胞粘着方式。
图3为显示了在具有固定肽的本发明的骨移植材料的表面上定量分析细胞粘着的结果图。
图4为一张照片，该照片显示了在收集的细胞中骨组织分化标记物smad1、5和8蛋白的量的蛋白质印迹的测量结果，所述细胞是在将细胞配发在本发明的骨移植材料上，并培养所配发的细胞一定时间后收集的(Con一种不具有固定肽的骨移植材料；BMP一种具有BMP衍生的肽固定在其上的骨移植材料；BSP一种具有固定在其上的涎蛋白衍生的肽的骨移植材料)。
图5为显示本发明的骨移植材料在兔颅骨缺陷方面的骨再生能力的一些照片。图5中，(A)显示不具有固定在其上的肽的本发明的骨移植材料(HA)在兔颅骨缺陷方面的骨再生能力，(B)显示本发明的具有固定在其上的肽的骨移植材料(HA)在兔颅骨缺陷方面的骨再生能力。新骨(New Bone)表示由固定在骨移植材料表面的肽生成的骨。
发明详述下面，本发明将通过更具体的实施例来进一步详细描述。然而，对本领域的普通技术人员而言显而易见的是，这些实施例显然仅用于阐述的目的，而不构成对本发明范围的限制。
实施例1细胞粘着RGD肽在源于牛骨的骨矿物颗粒上的固定在减压条件下，用乙醇冲洗源于牛骨的骨矿物颗粒，然后，将其放置于100℃的真空烘箱中20小时，以便除去其表面的杂质。用3-氨丙基乙氧基硅烷(APTES)的己烷溶液处理该骨矿物表面，然后洗涤。这可导致在其表面形成胺残基，然后给其中加入交联剂BMB，使其连接。使与交联剂连接的骨矿物颗粒与SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的肽反应12小时，然后洗涤。这样可得到在其表面固定有肽的骨矿物颗粒。
实施例2细胞粘着RGD肽在合成的羟基磷灰石和磷酸三钙上的固定在减压条件下，用乙醇洗涤合成的羟基磷灰石骨移植粉和磷酸三钙骨移植粉，然后将其放置于100℃的真空烘箱中，以除去表面杂质。用3-氨丙基乙氧基硅烷(APTES)的己烷溶液处理该骨矿物表面，然后洗涤。这可导致在其表面形成胺残基，然后给其中加入交联剂BMB，使其连接。使与交联剂连接的骨矿物颗粒与SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的肽反应12小时，然后进行洗涤。这样就得到了在其表面固定有肽的骨矿物颗粒。
实施例3细胞粘着RGD肽在骨移植材料壳聚糖上的固定具有RGD将由壳聚糖制备的以粉状或多孔支架形式的骨移植材料加入到2ml的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，以水合其表面。往该溶液中加入作为交联剂的硫代-SMCC，其浓度为5mg/ml，然后搅拌所得的混合物2小时，从而在壳聚糖骨移植材料的表面引入功能基团。在室温下反应2小时后，洗涤壳聚糖骨移植材料，然后使其与10mg的SEQ ID NO1的肽的100μl磷酸盐缓冲液反应24小时。接着，洗涤反应物，即得到具有固定在其上的肽的壳聚糖骨移植材料。
实施例4细胞粘着RGD肽在聚乳酸骨移植材料上的固定将聚乳酸型移植粉或多孔支架加入至磷酸盐缓冲液(pH4.7)中，以水合其表面，然后与20mg/ml胱胺盐酸盐溶液反应。向上述溶液中滴加EDC，以活化在骨移植材料表面上的羧酸。使该混合物反应24小时，洗涤，与二硫苏糖醇(DTT)溶液(30mg/ml)反应24小时，从而把硫氢基引入到聚乳酸的表面。修饰的聚乳酸移植材料与细胞粘着RGD肽(SEQ ID NO1)混合，从而骨移植材料的硫氢基和肽之间引入S-S键，这样可将肽固定在移植材料上。
实施例5组织生长因子衍生的肽在骨矿物颗粒上的固定为在该实施例中作为组织生长因子衍生的肽使用，肽是通过在每个SEQID NO3和SEQ ID NOS6-9的氨基酸序列的N末端添加CGG间隔基而进行化学合成的，所述SEQ ID NO3和SEQ ID NOS6-9的氨基酸序列包含骨形态发生蛋白BMP-2的细胞粘着和活化域，以便在N末端引入半胱氨酸。
在减压条件下，用乙醇洗涤源于牛骨的骨矿物颗粒，然后置入100℃真空烘箱中20小时，以除去其表面的杂质。用3-氨丙基乙氧基硅烷(APTES)的己烷溶液处理骨矿物颗粒的表面，然后洗涤。这样导致在颗粒表面形成氨基残基，然后，加入浓度为5mg/ml的作为交联剂的硫代-SMCC。搅拌该混合物2小时，以便引入功能基团至骨移植材料的表面。室温下反应2小时后，洗涤骨移植材料，使其与10mg肽的100μl磷酸盐缓冲液反应，然后再洗涤。这样就制得具有固定在其上的肽的骨移植材料。
实施例6组织生长因子衍生的肽在合成骨移植材料颗粒上的固定在该实施例中，使用了与实施例5中相同的肽作为组织生长因子衍生的肽。在减压条件下，使用乙醇洗涤合成的羟基磷灰石和磷酸三钙的无机质颗粒，其作为合成骨移植材料，然后置于100℃的真空烘箱20小时，以便除去其表面杂质。颗粒的表面用3-氨丙基乙氧基硅烷(APTES)的己烷溶液处理，然后洗涤。这可在颗粒表面形成胺残基，加入5mg/ml作为交联剂的硫代-SMCC。搅拌该混合物2小时，以在骨移植材料的表面引入功能基团。室温下反应2小时后，洗涤骨移植材料，然后使其与10mg的肽的100μl磷酸盐缓冲溶液反应24小时，然后再洗涤。这样就制得具有固定在其上的组织生长因子衍生的肽的骨移植颗粒。
实施例7组织生长因子衍生的肽在骨移植材料和壳聚糖支架上的固定将由壳聚糖制备的骨移植材料和支架加至2ml的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，以水合其表面，加入硫代-SMCC，其浓度为5mg/ml。搅拌混合物2小时，以在壳聚糖骨移植材料的表面上引入功能基团。室温下反应2小时后，洗涤壳聚糖骨移植材料，然后使其与10mg实施例5中的组织生长因子衍生的肽的100μl磷酸盐缓冲溶液反应，然后洗涤。这样可制得具有固定在其上的肽的壳聚糖骨移植材料和支架。
实施例8组织生长因子衍生的肽在聚乳酸的骨移植材料和支架上的固定将聚乳酸的骨移植粉或多孔支架加入至磷酸盐缓冲液(PH4.7)中，以水合其表面，然后与20mg/ml胱胺盐酸盐溶液反应。向该反应溶液中滴加交联剂EDC，以活化在聚乳酸的骨移植材料表面上的羧酸。反应24小时后，洗涤所得物，并使所得物与1ml二硫苏糖醇(DTT)溶液(30mg/ml)反应24小时，从而把硫氢基引入至聚乳酸的表面。骨移植材料与组织生长因子衍生的肽相混合，所述肽是具有CGG间隔基连接在其上的SEQ ID NO8的肽，从而自发地在骨移植材料和肽之间引入S-S键，这样将肽固定在骨移植材料上。
实施例9骨涎蛋白衍生的肽在骨矿物颗粒上的固定为在该实施例中作为骨涎蛋白衍生的肽使用，化学合成了如下各肽SEQID NO15的肽、包含具有用于诱导钙化的活性域结构的肽、包含细胞粘着功能位点的SEQ ID NO27的肽。
在减压的条件下，用乙醇洗涤源于牛骨的骨矿物颗粒，然后放置于100℃的烘箱20小时，以便除去其表面的杂质。用3-氨丙基乙氧基硅烷(APTES)的己烷溶液骨矿物颗粒的表面，然后洗涤。这样，在其表面形成胺残基，然后，加入5mg/ml的交联剂硫代-SMCC。搅拌所得的混合物2小时，以便给骨移植材料的表面引入功能基团。反应后，洗涤骨移植材料，然后使其与由10mg骨涎蛋白的100μl磷酸盐缓冲液溶液反应24小时，然后再洗涤。这样制得具有固定在其上的肽的骨矿物颗粒。
实施例10骨涎蛋白衍生的肽在合成的骨移植颗粒上的固定在该实施例中，使用与实施例9中使用的相同的肽。在减压条件下，用乙醇洗涤羟基磷灰石和磷酸三钙矿物颗粒，然后放置于100℃的真空烘箱中20小时，以便除去其表面的杂质。用3-氨丙基乙氧基硅烷(APTES)的己烷溶液处理颗粒表面，然后洗涤。这样在颗粒表面形成胺残基，然后，加入5mg/ml的交联剂硫代-SMCC。搅拌该混合物2小时，以在骨移植材料的表面引入功能基团。反应完全后，洗涤骨移植材料，加入10mg与实施例9中所使用的相同的肽的100μl磷酸盐缓冲液溶液，并允许反应24小时。洗涤反应物，这样就制得具有固定在其上的肽的骨矿物颗粒。
实施例11包含骨涎蛋白的粘着和活化位点的肽在壳聚糖骨移植材料上的固定在该实施例中，使用与实施例9中使用的相同的肽。将壳聚糖骨移植材料和支架加入至2ml磷酸盐缓冲液(PH7.4)中，以水合其表面。往上述所得溶液加入5mg/ml的交联剂硫代-SMCC，搅拌2小时，以将功能基团引入至骨移植材料的表面。反应完全后，洗涤壳聚糖骨移植材料，然后加入10mg肽的100μl磷酸盐缓冲溶液，并使它们反应24小时，然后洗涤。这样就获得具有固定在其上的肽的壳聚糖骨移植材料和支架。
实施例12包含骨涎蛋白的粘着和活化位点的肽在聚乳酸的骨移植材料和支架上的固定在该实施例中，使用与实施例9中使用的相同的肽。将聚乳酸骨移植粉或支架加入至磷酸盐缓冲液(PH4.7)中，以水合其表面，然后与20mg/ml胱胺盐酸盐溶液发生反应。向上述反应溶液中滴加EDC，以活化聚乳酸骨移植材料表面上的羧酸。反应24小时后，洗涤反应产物并加入1ml二硫苏糖醇(DTT)溶液(30mg/ml)，并使它们反应24小时，从而把硫氢基引入至骨移植材料和支架的表面。骨移植材料和支架与肽相混合，以便自发地在骨移植材料和肽之间引入S-S键，这样就将肽固定在骨移植材料上。
实施例13促骨生长肽在壳聚糖屏障膜上的固定把壳聚糖屏障膜加入至2ml磷酸盐缓冲液(PH7.4)中，以水合屏障膜的表面。往上述溶液中加入5mg/ml交联剂硫代-SMCC，搅拌该混合物2小时，以引入功能基团至屏障膜的表面。反应完全后，洗涤屏障膜，给其中分别加入由各5ml的肽溶于100μl磷酸盐缓冲液而制得的溶液，该肽是具有SEQ IDNO1的细胞粘着肽、在实施例9中用的BMP-2衍生的肽以及在实施例9中用的骨涎蛋白的肽的100μl磷酸盐缓冲溶液，并使它们反应达24小时。洗涤后，即得到具有固定在其上的肽的屏障膜。
实施例14促骨生长肽在聚乳酸屏障膜上的固定将聚乳酸屏障膜加入至磷酸盐缓冲液(pH 4.7)中，以水合其表面，然后与20mg/ml胱胺盐酸盐反应。往反应混合物中滴加交联剂EDC，以活化在聚乳酸表面上的羧酸。反应24小时后，洗涤屏障膜，给其中加入1ml DTT溶液(30mg/ml)，并使它们发生反应24小时，以引入硫氢基至屏障膜的表面。所得屏障膜与SEQ ID NO1的细胞粘着肽、用实施例5中的BMP-2衍生的肽和在实施例9中使用的的骨涎蛋白衍生的肽中的每一个相混合，从而自发地在在屏障膜和肽之间引入S-S键，这样就把肽固定在屏障膜上。
实施例15促骨生长肽在钛植入物上的固定用氮等离子体处理由钛制备的植入物的表面，从而在其表面形成胺基。把5mg/ml的交联剂硫代-SMCC加至植入物中，搅拌2小时，从而把功能基团引入至其表面。反应完全后，洗涤植入物，给其中加入各5ml的肽溶于100μl磷酸盐缓冲液而制得的溶液，该肽是具有SEQ ID NO1的细胞粘着肽、在实施例5中用的源于BMP-2的肽以及在实施例9中用的源于骨涎蛋白的肽中，并使它们发生反应达24小时。洗涤得到的植入物，这样就能得到具有固定在其上的肽的植入物。
测试试验1对根据本发明的骨移植材料的表面的分析为了分析在实施例1-12中制备的每一个具有固定在其上的肽的骨移植材料的表面，用2％的戊二醛溶液固定骨移植材料。用1％的四氧化锇溶液处理被固定的骨移植材料，然后洗涤，脱水和烘干。
用XPS方法分析所制备的骨移植材料的表面，该方法使通过鉴定固定在某一物质表面上的成分来确定键的存在与否。在这方面，键的存在与否取决于硫的存在与否，因为根据本发明，在骨移植材料和固定在骨移植材料上的肽之间存在二硫键。
图1显示对固定在本发明的壳聚糖骨移植材料上的肽的分析结果。在图1中，(A)显示由未经过肽修饰的壳聚糖制备的骨移植材料的表面，(B)显示具有固定在其表面的含硫的肽的骨移植材料。如图1所示，可以观察到硫存在于具有固定在其上的肽的骨移植材料的表面，这说明肽已经被固定。而且，为了确定在骨移植材料的整个表面区域中存在肽的固定比例，测量了硫在具有固定在其上的肽的骨移植材料中的含量。结果如下面的表1所示，在不具有肽的壳聚糖中未检测到硫，而在具有固定在其上的肽的壳聚糖中，检测到8.66％的硫。
表1
测试实施例2本发明的骨移植材料的细胞粘着测试将成骨细胞(MC3T3细胞系)接种到实施例3、7和11中制备的固定肽在其上的骨移植材料上，然后培养1天又4小时。用2％的戊二醛溶液固定具有培养的成骨细胞的骨移植材料。把用1％的triton X-100处理的荧光标记鬼笔环肽溶液加到固定的骨移植材料中，从而染色细胞质。接着，当样品被洗涤和固定后，用共焦激光扫描显微镜可以观察到粘着到骨移植材料上的细胞(图2)。
在图2中，(A)显示与不具有肽的骨移植材料的细胞粘着，(B)和(C)分别显示与具有BMP衍生的肽和骨涎蛋白衍生的肽固定在其上的骨移植材料的细胞粘着。结果是，对于不具有固定在其上的肽的骨移植材料，可观察到细胞的球状和不稳定的粘着；然而，在具有BMP衍生的肽和具有骨涎蛋白衍生的肽的骨移植材料的表面，可观察到细胞的稳定粘着(包括在培养细胞4小时后，大多数细胞的细胞质的延展)。
图3显示对于细胞粘着的定量分析结果。如图3所示，相对不具有固定在其上的肽的骨移植材料而言，被肽修饰的壳聚糖骨移植材料显示了细胞粘着的显著升高，而且这种升高在任一浓度下与被固定的肽的量成正比。
实施例3确定分化标记蛋白在根据本发明的具有固定在其上的肽的骨移植材料表面上培养的成骨细胞的表达为了确定分化标记蛋白在根据本发明的具有固定在其上的肽的骨移植材料表面上培养的成骨细胞的表达，通过Western杂交分析分化标记蛋白smad 1、5和8的表达水平。
把成骨细胞接种到骨移植材料和具有固定在其上的肽的骨移植材料的表面，然后培养2周。培养后，提取细胞中的总蛋白，并通过测量在280nm下的吸收值而对总蛋白进行定量。取2μl蛋白溶液(1mg/ml)，并在聚丙稀酰胺凝胶上进行电泳，然后与分化标记蛋白smad 1、5和8的抗体反应。接着，使蛋白质溶液与标记的二抗(secondary antibody)反应，观察到由于凝胶的展开而出现的蛋白质带，测定它们的浓度。
结果如图4所示，相对在不具有固定在其上的肽的骨移植材料上培养的细胞而言，在具有固定的肽的骨移植材料的表面上培养的smad蛋白的表达显著升高。这表明，对于生长在具有在其表面上固定有组织生长因子衍生的肽的骨移植材料的表面生长的细胞而言，其以易于进行的方式而分化成骨组织。
测试实施例4具有固定在其上的肽的骨移植材料对兔颅骨再生的影响将在实施例1-5中制备的具有固定的肽的骨移植材料移植到兔颅骨环形缺损处(rabbit cranial circular defects)，以检测它们的骨再生能力。在被麻醉兔的颅部位点，形成了直径为8mm的颅骨环形缺损。将骨移植材料和具有固定的肽的骨移植材料以50mg/缺损的用量移植至骨缺损处，并且把骨膜和表皮双层相互缝合在一起。移植两周后，杀死该动物，将从该动物身上所采集的样品用福尔马林溶液固定，然后包埋组织，以制备厚度为20μl的样品。用碱性品红和甲苯胺蓝染色所制备的样品，因而制备非脱钙样品。运用光学显微镜来给所制备的样品拍照。
图5显示具有固定的肽的骨移植材料的骨再生效果。如图5所示，本发明的具有促骨生长肽粘着在其表面的骨移植材料用于图颅骨缺损(B)，其相对不具有肽的骨移植材料(A)而言，在两周内显示了显著的骨再生能力。
尽管本发明参照某些具体特征详细地进行了描述，但是对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，其仅仅是作为优选的实施方案，并没有限定本发明的范围。因此，本发明的基本范围将通过附加的权利要求书及其等同物来限定。本领域的普通技术人员应当理解在不背离附加的权利要求书中描述的本发明的范围和精神内，对本发明作出简单的修饰、改变和添加是可能的。
工业实用性如上所述，本发明提供具有用诱导细胞粘着的肽和/或组织生长因子衍生的肽固定在其表面上的骨移植材料和支架，它们即使在低浓度剂量水平上也可取得理想的组织再生效果。
本发明的用于组织工程应用的骨移植材料和支架具有固定在其表面的促骨生长肽，其能促进细胞粘着和细胞分化为骨组织，并且能防止根据现有技术的简单掺合而导致的组织生长因子的快速降解以及由于组织生长因子渗漏至体内而导致的副作用。而且，它们可极大降低由于大量使用组织生长因子来提高其局部浓度而造成的成本。
序列表<110>首尔国立大学工业基金会<120>其表面上固定有促骨生长肽的骨移植材料和支架材料<130>PP-B0100<140>PCT/KR2005/000801<141>2005-03-18<150>10-2004-19010<151>2004-03-19<160>69<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>7<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>含RGD的肽<400>1Cys Gly Gly Arg Gly Asp Ser1 5<210>2<211>11<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>含RGD的肽<400>2Val Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys1 5 10<210>3<211>17<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-2的部分肽<400>3Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His1 5 10 15Pro
<210>4<211>14<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-4的部分肽<400>4Cys Ser Pro Lys His His Pro Gln Arg Ser Arg Lys Lys Asn1 5 10<210>5<211>13<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-6的部分肽<400>5Cys Ser Ser Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg Arg His1 5 10<210>6<211>17<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-2的部分肽<400>6Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His1 5 10 15Ala<210>7<211>25<212>PRT<213>人造序列
<220>
<223>BMP-2的部分肽<400>7Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile1 5 10 15Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn20 25<210>8<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-2的部分肽<400>8Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser1 5 10 15Met Leu Tyr Leu20<210>9<211>18<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-2的部分肽<400>9Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr1 5 10 15Gln Asp<210>10<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-2的部分肽
<400>10Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg1 5 10 15His Pro Leu Tyr20<210>11<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-2的部分肽<400>11Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser1 5 10 15Met Leu Tyr Leu20<210>12<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-7的部分肽<400>12Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr1 5 10 15Gln Asp Met Val Val20<210>13<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-4的部分肽<400>13
Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile1 5 10 15Ser Met Leu Tyr Leu20<210>14<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白的部分肽<400>14Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg1 5 10 15Arg His Ser Leu Tyr20<210>15<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-4的部分肽<400>15Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile1 5 10 15Ser Met Leu Tyr Leu20<210>16<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-4的部分肽<400>16Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr1 5 10 15
Gln Glu Met Val Val20<210>17<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-6的部分肽<400>17Tyr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu Tyr Phe20<210>18<211>22<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-6的部分肽<400>18Val Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ala Cys1 5 10 15Arg Lys His Glu Leu Tyr20<210>19<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-6的部分肽<400>19Tyr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu Tyr Phe20
<210>20<211>24<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-6的部分肽<400>20Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr1 5 10 15Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys20<210>21<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-7的部分肽<400>21Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu Tyr Phe20<210>22<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-7的部分肽<400>22Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu1 5 10 15Tyr Val Ser Phe Arg20<210>23
<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-7的部分肽<400>23Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu Tyr Phe20<210>24<211>19<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BMP-7的部分肽<400>24Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr1 5 10 15Arg Asn Met<210>25<211>8<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>25Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu1 5<210>26<211>10<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽
<400>26Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu1 5 10<210>27<211>18<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>27Tyr Glu Thr Tyr Asp Glu Asn Asn Gly Glu Pro Arg Gly Asp Thr Tyr1 5 10 15Arg Ile<210>28<211>6<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>28Glu Glu Gly Glu Glu Glu1 5<210>29<211>8<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>29Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu1 5<210>30<211>17<212>PRT<213>人造序列
<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>30Tyr Glu Ile Tyr Glu Ser Glu Asn Gly Glu Pro Arg Gly Asp Asn Tyr1 5 10 15Arg<210>31<211>9<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>31Lys Asn Leu His Arg Arg Val Lys Ile1 5<210>32<211>26<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>32Asp Ser Ser Glu Glu Asn Gly Asp Asp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu1 5 10 15Glu Glu Glu Thr Ser Asn Glu Gly Glu Asn20 25<210>33<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>33Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asn Glu Asn Glu Glu Ser1 5 10 15
Glu Ala Glu Val Asp20<210>34<211>11<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>骨涎蛋白部分肽<400>34Ser Glu Asn Gly Glu Pro Arg Gly Asp Asn Tyr1 5 10<210>35<211>9<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>TGF的部分肽<400>35Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr1 5<210>36<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>TGF的部分肽<400>36Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys1 5 10 15Cys Val Arg Gln Leu20<210>37<211>19<212>PRT<213>人造序列
<220>
<223>TGF的部分肽<400>37Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val1 5 10 15Pro Gln Ala<210>38<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>PDGF的部分肽<400>38Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Gln Glu Gln Arg20<210>39<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>PDGF的部分肽<400>39Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg1 5 10 15Arg Pro Pro Lys20<210>40<211>9<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>AFGF的部分肽
<400>40Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys1 5<210>41<211>8<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>AFGF的部分肽<400>41Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys1 5<210>42<211>12<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BFGF的部分肽<400>42Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys1 5 10<210>43<211>6<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BFGF的部分肽<400>43Pro Asp Gly Arg Val Asp1 5<210>44<211>7<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BFGF的部分肽<400>44
Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu1 5<210>45<211>6<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>BFGF的部分肽<400>45Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr1 5<210>46<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>牙本质涎蛋白的部分肽<400>46Glu Asp Glu Gly Ser Gly Asp Asp Glu Asp Glu Glu Ala Gly Asn Gly1 5 10 15Lys Asp Ser Ser Asn20<210>47<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>牙本质涎蛋白的部分肽<400>47Asp Asp Ala Asn Ser Glu Ser Asp Asn Asn Ser Ser Ser Arg Gly Asp1 5 10 15Ala Ser Tyr Asn20<210>48<211>23
<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>牙本质涎蛋白的部分肽<400>48Asp Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser1 5 10 15Ser Asp Ser Asp Ser Ser Asp20<210>49<211>22<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>肝素结合性表皮生长因子的部分肽<400>49Asp Leu Gln Glu Ala Asp Leu Ala Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser1 5 10 15Lys Pro Gln Ala Leu Ala20<210>50<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>肝素结合性表皮生长因子的部分肽<400>50Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys1 5 10 15Gly Leu Gly Lys20<210>51<211>13<212>PRT<213>人造序列
<220>
<223>肝素结合性表皮生长因子的部分肽<400>51Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys1 5 10<210>52<211>20<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>肝素结合性表皮生长因子的部分肽<400>52Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro1 5 10 15Gly Tyr His Gly20<210>53<211>25<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>53Pro Gln Tyr Asn Tyr Gln Thr Leu Val Pro Glu Asn Glu Ala Ala Gly1 5 10 15Thr Ala Val Leu Arg Val Val Ala Gln20 25<210>54<211>21<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>54Asp Pro Asp Ala Gly Glu Ala Gly Arg Leu Val Tyr Ser Leu Ala Ala1 5 10 15
Leu Met Asn Ser Arg20<210>55<211>29<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>55Ser Leu Glu Leu Phe Ser Ile Asp Pro Gln Ser Gly Leu Ile Arg Thr1 5 10 15Ala Ala Ala Leu Asp Arg Glu Ser Met Glu Arg His Tyr20 25<210>56<211>23<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>56Leu Arg Val Thr Ala Gln Asp His Gly Ser Pro Arg Leu Ser Ala Thr1 5 10 15Thr Met Val Ala Val Thr Val20<210>57<211>112<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>57Glu Gln Ala Gln Tyr Arg Glu Thr Leu Arg Glu Asn Val Glu Glu Gly1 5 10 15Tyr Pro Ile Leu Gln Leu Arg Ala Thr Asp Gly Asp Ala Pro Pro Asn
20 25 30Ala Asn Leu Arg Tyr Arg Phe Val Gly Pro Pro Ala Ala Arg Ala Ala35 40 45Ala Ala Ala Ala Phe Glu Ile Asp Pro Arg Ser Gly Leu Ile Ser Thr50 55 60Ser Gly Arg Val Asp Arg Glu His Met Glu Ser Tyr Glu Leu Val Val65 70 75 80Glu Ala Ser Asp Gln Gly Gln Glu Pro Gly Pro Arg Ser Ala Thr Val85 90 95Arg Val His Ile Thr Val Leu Asp Glu Asn Asp Asn Ala Pro Gln Phe100 105 110<210>58<211>106<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>58Ser Glu Lys Arg Tyr Val Ala Gln Val Arg Glu Asp Val Arg Pro His1 5 10 15Thr Val Val Leu Arg Val Thr Ala Thr Asp Arg Asp Lys Asp Ala Asn20 25 30Gly Leu Val His Tyr Asn Ile Ile Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe35 40 45Ala Ile Asp Ser Leu Thr Gly Glu Ile Gln Val Val Ala Pro Leu Asp50 55 60Phe Glu Ala Glu Arg Glu Tyr Ala Leu Arg Ile Arg Ala Gln Asp Ala65 70 75 80Gly Arg Pro Pro Leu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Ala Ser Ile Gln Val85 90 95
Val Asp Ile Asn Asp His Ile Pro Ile Phe100 105<210>59<211>59<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>59Asp Asp Asn Val Cys Leu Arg Glu Pro Cys Glu Asn Tyr Met Lys Cys1 5 10 15Val Ser Val Leu Arg Phe Asp Ser Ser Ala Pro Phe Leu Ala Ser Ala20 25 30Ser Thr Leu Phe Arg Pro Ile Gln Pro Ile Ala Gly Leu Arg Cys Arg35 40 45Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Asp Phe Cys Glu50 55<210>60<211>37<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>60Glu Leu Asp Leu Cys Tyr Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys1 5 10 15Ala Arg Arg Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Val Cys Arg Pro Arg Phe Thr20 25 30Gly Glu Asp Cys Glu35<210>61<211>40<212>PRT<213>人造序列
<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>61Glu Ala Gly Arg Cys Val Pro Gly Val Cys Arg Asn Gly Gly Thr Cys1 5 10 15Thr Asp Ala Pro Asn Gly Gly Phe Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Gly20 25 30Ala Phe Glu Gly Pro Arg Cys Glu35 40<210>62<211>205<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>62Val Ala Ala Arg Ser Phe Pro Pro Ser Ser Phe Val Met Phe Arg Gly1 5 10 15Leu Arg Gln Arg Phe His Leu Thr Leu Ser Leu Ser Phe Ala Thr Val20 25 30Gln Gln Ser Gly Leu Leu Phe Tyr Asn Gly Arg Leu Asn Glu Lys His35 40 45Asp Phe Leu Ala Leu Glu Leu Val Ala Gly Gln Val Arg Leu Thr Tyr50 55 60Ser Thr Gly Glu Ser Asn Thr Val Val Ser Pro Thr Val Pro Gly Gly65 70 75 80Leu Ser Asp Gly Gln Trp His Thr Val His Leu Arg Tyr Tyr Asn Lys85 90 95Pro Arg Thr Asp Ala Leu Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ser Lys Asp Lys100 105 110Val Ala Val Leu Ser Val Asp Asp Cys Asp Val Ala Val Ala Leu Gln115 120 125
Phe Gly Ala Glu Ile Gly Asn Tyr Ser Cys Ala Ala Ala Gly Val Gln130 135 140Thr Ser Ser Lys Lys Ser Leu Asp Leu Thr Gly Pro Leu Leu Leu Gly145 150 155 160Gly Val Pro Asn Leu Pro Glu Asn Phe Pro Val Ser His Lys Asp Phe165 170 175Ile Gly Cys Met Arg Asp Leu His Ile Asp Gly Arg Arg Val Asp Met180 185 190Ala Ala Phe Val Ala Asn Asn Gly Thr Met Ala Gly Cys195 200 205<210>63<211>181<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>63Pro His His Phe Arg Gly Asn Gly Thr Leu Ser Trp Asn Phe Gly Ser1 5 10 15Asp Met Ala Val Ser Val Pro Trp Tyr Leu Gly Leu Ala Phe Arg Thr20 25 30Arg Ala Thr Gln Gly Val Leu Met Gln Val Gln Ala Gly Pro His Ser35 40 45Thr Leu Leu Cys Gln Leu Asp Arg Gly Leu Leu Ser Val Thr Val Thr50 55 60Arg Gly Ser Gly Arg Ala Ser His Leu Leu Leu Asp Gln Val Thr Val65 70 75 80Ser Asp Gly Arg Trp His Asp Leu Arg Leu Glu Leu Gln Glu Glu Pro85 90 95Gly Gly Arg Arg Gly His His Val Leu Met Val Ser Leu Asp Phe Ser
100 105 110Leu Phe Gln Asp Thr Met Ala Val Gly Ser Glu Leu Gln Gly Leu Lys115 120 125Val Lys Gln Leu His Val Gly Gly Leu Pro Pro Gly Ser Ala Glu Glu130 135 140Ala Pro Gln Gly Leu Val Gly Cys Ile Gln Gly Val Trp Leu Gly Ser145 150 155 160Thr Pro Ser Gly Ser Pro Ala Leu Leu Pro Pro Ser His Arg Val Asn165 170 175Ala Glu Pro Gly Cys180<210>64<211>36<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>钙粘蛋白，EGF LAG七传G型受体3的部分肽<400>64Cys Pro Cys Arg Pro Gly Ala Leu Gly Arg Gln Cys Asn Ser Cys Asp1 5 10 15Ser Pro Phe Ala Glu Val Thr Ala Ser Gly Cys Arg Val Leu Tyr Asp20 25 30Ala Cys Pro Lys35<210>65<211>106<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>成骨细胞特异性钙粘蛋白的部分肽<400>65Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile Glu Glu Tyr Thr Gly Pro1 5 10 15
Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser Asp Ile Asp Ser Gly Asp20 25 30Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Gly Ala Gly Thr Ile Phe35 40 45Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala Thr Lys Thr Leu Asp50 55 60Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met Ala Gln Ala Val Asp Arg65 70 75 80Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Val Lys Val85 90 95Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe100 105<210>66<211>109<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>成骨细胞特异性钙粘蛋白的部分肽<400>66Leu His Glu Thr Tyr His Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly1 5 10 15Thr Ser Val Ile Gln Val Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr20 25 30Gly Asn Ser Ala Lys Leu Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr35 40 45Phe Ser Val Glu Ala Gln Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn50 55 60Met Asp Arg Glu Ala Lys Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys65 70 75 80Asp Met Gly Gly His Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr
85 90 95Ile Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe100 105<210>67<211>115<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>成骨细胞特异性钙粘蛋白的部分肽<400>67Pro Gln Arg Leu Tyr Gln Met Ser Val Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly1 5 10 15Glu Glu Val Gly Arg Val Lys Ala Lys Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn20 25 30Gly Leu Val Thr Tyr Asn Ile Val Asp Gly Asp Gly Met Glu Ser Phe35 40 45Glu Ile Thr Thr Asp Tyr Glu Thr Gln Glu Gly Val Ile Lys Leu Lys50 55 60Lys Pro Val Asp Phe Glu Thr Glu Arg Ala Tyr Ser Leu Lys Val Glu65 70 75 80Ala Ala Asn Val His Ile Asp Pro Lys Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe85 90 95Lys Asp Thr Val Thr Val Lys Ile Ser Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro100 105 110Pro Met Phe115<210>68<211>106<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>成骨细胞特异性钙粘蛋白的部分肽
<400>68Pro Met Phe Leu Ala Pro Ser Tyr Ile His Glu Val Gln Glu Asn Ala1 5 10 15Ala Ala Gly Thr Val Val Gly Arg Val His Ala Lys Asp Pro Asp Ala20 25 30Ala Asn Ser Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Asp Arg His Thr Asp Leu Asp35 40 45Arg Phe Phe Thr Ile Asn Pro Glu Asp Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys50 55 60Pro Leu Asp Arg Glu Glu Thr Ala Trp Leu Asn Ile Thr Val Phe Ala65 70 75 80Ala Glu Ile His Asn Arg His Gln Glu Ala Gln Val Pro Val Ala Ile85 90 95Arg Val Leu Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro100 105<210>69<211>126<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>成骨细胞特异性钙粘蛋白的部分肽<400>69Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile Cys Glu Ser Asp Gln Thr1 5 10 15Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr Ile Ser Ala Asp Asp Lys20 25 30Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile Phe Ser Leu Pro Pro Glu35 40 45Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg Asp Asn Arg Asp Asn Thr50 55 60Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe Ser Arg Gln Lys Gln Asp
65 70 75 80Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp Gly Gly Ile Pro Pro Met85 90 95Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys Val Cys Gly Cys Asp Val Asn100 105 110Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu Ala Tyr Ile Leu Asn115 120 12权利要求
1.骨移植材料，其表面上固定有诱导细胞粘着的肽和/或组织生长因子衍生的肽。
2.根据权利要求1的骨移植材料，其中，诱导细胞粘着的肽具有RGD氨基酸序列。
3.根据权利要求2的骨移植材料，其中，诱导细胞粘着的肽具有CGGRGDS(SEQ ID NO1)或CGGVACDCRGDCFC(SEQ ID NO2)氨基酸序列。
4.根据权利要求1的骨移植材料，其中，组织生长因子衍生的肽选自下列肽中的至少一个(a)骨形态发生蛋白(BMP)-2、4和6[SEQ ID NO3表示BMP-2，SEQ IDNO4表示BMP-4和SEQ ID NO5表示BMP-6]中任何一个的2-18位氨基酸序列；BMP-2的16-34位氨基酸序列(SEQ ID NO6)、47-71位氨基酸序列(SEQ ID NO7)、73-92位氨基酸序列(SEQ ID NO8)、88-105位氨基酸序列(SEQ ID NO9)、283-302位氨基酸序列(SEQ ID NO10)、335-353位氨基酸序列(SEQ ID NO11)和370-390位氨基酸序列(SEQ ID NO12)；BMP-4的74-93位氨基酸序列(SEQ ID NO13)、293-313位氨基酸序列(SEQ ID NO14)、360-379位氨基酸序列(SEQ ID NO15)和382-402位氨基酸序列(SEQ IDNO16)；BMP-6的91-110位氨基酸序列(SEQ ID NO17)、397-418位氨基酸序列(SEQ ID NO18)、472-490位氨基酸序列(SEQ ID NO19)和487-510位氨基酸序列(SEQ ID NO20)；和BMP-7的98-117位氨基酸序列(SEQ IDNO21)、320-340位氨基酸序列(SEQ ID NO22)、390-409位氨基酸序列(SEQID NO23)和405-423位氨基酸序列(SEQ ID NO24)；(b)骨涎蛋白的62-69位氨基酸序列(SEQ ID NO25)、139-148位氨基酸序列(SEQ ID NO26)、259-277位氨基酸序列(SEQ ID NO27)、199-204位氨基酸序列(SEQ ID NO28)、151-158位氨基酸序列(SEQ ID NO29)、275-291位氨基酸序列(SEQ ID NO30)、20-28位氨基酸序列(SEQ ID NO31)、65-90位氨基酸序列(SEQ ID NO32)、150-170位氨基酸序列(SEQ ID NO33)和280-290位氨基酸序列(SEQ ID NO34)；(c)转化生长因子的242-250位氨基酸序列(SEQ ID NO35)、279-299位氨基酸序列(SEQ ID NO36)和343-361位氨基酸序列(SEQ ID NO37)；(d)血小板源生长因子的100-120位氨基酸序列(SEQ ID NO37)和121-140位氨基酸序列(SEQ ID NO39)；(e)酸性成纤维细胞生长因子的23-31位氨基酸序列(SEQ ID NO40)和97-105位氨基酸序列(SEQ ID NO41)；(f)碱性成纤维母细胞生长因子的16-27位氨基酸序列(SEQ ID NO42)、37-42位氨基酸序列(SEQ ID NO43)和107-112位氨基酸序列(SEQ ID NO45)；(g)牙本质涎蛋白的255-275位氨基酸序列(SEQ ID NO46)、475-494位氨基酸序列(SEQ ID NO47)和551-573位氨基酸序列(SEQ ID NO48)；(h)肝素结合性EGF样生长因子的63-83位氨基酸序列(SEQ ID NO49)、84-103位氨基酸序列(SEQ ID NO50)和121-140位氨基酸序列(SEQ ID NO52)；(i)钙粘蛋白EGF LAG七传G型受体3的326-350位氨基酸序列(SEQ IDNO53)、351-371位氨基酸序列(SEQ ID NO54)、372-400位氨基酸序列(SEQID NO55)、401-423位氨基酸序列(SEQ ID NO56)、434-545位氨基酸序列(SEQ ID NO57)、546-651位氨基酸序列(SEQ ID NO58)、1375-1433位氨基酸序列(SEQ ID NO59)、1435-1471位氨基酸序列(SEQ ID NO60)、1475-1514位氨基酸序列(SEQ ID NO61)、1515-1719位氨基酸序列(SEQ IDNO62)、1764-1944位氨基酸序列(SEQ ID NO63)和2096-2529位氨基酸序列(SEQID NO64)；和(j)成骨细胞特异性钙粘蛋白(OB-cadherin)的54-159位氨基酸序列(SEQID NO65)、160-268位氨基酸序列(SEQ ID NO66)、269-383位氨基酸序列(SEQ ID NO67)、384-486位氨基酸序列(SEQ ID NO68)和487-612位氨基酸序列(SEQ ID NO69)。
5.根据权利要求4的骨移植材料，其中组织生长因子衍生的肽在N末端附加有半胱氨酸。
6.根据权利要求5的骨移植材料，其中附加的半胱氨酸是CGG间隔基形式。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的骨移植材料，其中骨移植材料选自下述中的任意一种源自生物体的骨矿物粉和源于自体骨、牛骨和猪骨的多孔块状物、合成的羟基磷灰石粉和多孔块状物、磷酸三钙粉和多孔块状物、磷酸一钙粉和多孔块状物、由二氧化硅制备的骨移植材料、由二氧化硅和聚合物的混合物制备的骨充填移植材料、由包括壳聚糖、聚乳酸的生物相容性聚合体制备的细颗粒和多孔支架、和钛，以及立体支架。
8.根据权利要求5的骨移植材料，其中骨移植材料的表面固定有交联剂。
9.根据权利要求8的骨移植材料，其中交联剂选自下述任意一种或多种1，4-二-马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1，11-二-马来酰亚胺基四甘醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二酰亚胺盐酸化物(EDC)、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯](SMCC)和硫代-SMCC、琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺基]己酸酯(SPDP)和硫代-SPDP、间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和硫代-MBS、琥珀酰亚胺基[4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯](SMPB)和硫代-SMPB。
10.用于组织工程用途中的支架，其表面上固定有诱导细胞粘着的肽和/或组织生长因子衍生的肽。
11.根据权利要求10的用于组织工程应用中的支架，其中，诱导细胞粘着的肽具有RGD氨基酸序列。
12.根据权利要求11的用于组织工程应用的支架，其中，诱导细胞粘着的肽具有CGGRGDS(SEQ ID NO1)或CGGVACDCRGDCFC(SEQ ID NO2)氨基酸序列。
13.根据权利要求10的用于组织工程应用的支架，其中，组织生长因子衍生的肽选自下列肽中的至少一个(a)骨形态发生蛋白(BMP)-2、4和6[SEQ ID NO3表示BMP-2，SEQ IDNO4表示BMP-4和SEQ ID NO5表示BMP-6]中任何一个的2-18位氨基酸序列；BMP-2的16-34位氨基酸序列(SEQ ID NO6)、47-71位氨基酸序列(SEQ ID NO7)、73-92位氨基酸序列(SEQ ID NO8)、88-105位氨基酸序列(SEQ ID NO9)、283-302位氨基酸序列(SEQ ID NO10)、335-353位氨基酸序列(SEQ ID NO11)和370-390位氨基酸序列(SEQ ID NO12)；BMP-4的74-93位氨基酸序列(SEQ ID NO13)、293-313位氨基酸序列(SEQ ID NO14)、360-379位氨基酸序列(SEQ ID NO15)和382-402位氨基酸序列(SEQ IDNO16)；BMP-6的91-110位氨基酸序列(SEQ ID NO17)、397-418位氨基酸序列(SEQ ID NO18)、472-490位氨基酸序列(SEQ ID NO19)和487-510位氨基酸序列(SEQ ID NO20)；和BMP-7的98-117位氨基酸序列(SEQ IDNO21)、320-340位氨基酸序列(SEQ ID NO22)、390-409位氨基酸序列(SEQID NO23)和405-423位氨基酸序列(SEQ ID NO24)；(b)骨涎蛋白的62-69位氨基酸序列(SEQ ID NO25)、139-148位氨基酸序列(SEQ ID NO26)、259-277位氨基酸序列(SEQ ID NO27)、199-204位氨基酸序列(SEQ ID NO28)、151-158位氨基酸序列(SEQ ID NO29)、275-291位氨基酸序列(SEQ ID NO30)、20-28位氨基酸序列(SEQ ID NO31)、65-90位氨基酸序列(SEQ ID NO32)、150-170位氨基酸序列(SEQ ID NO33)和280-290位氨基酸序列(SEQ ID NO34)；(c)转化生长因子的242-250位氨基酸序列(SEQ ID NO35)、279-299位氨基酸序列(SEQ ID NO36)和343-361位氨基酸序列(SEQ ID NO37)；(d)血小板源生长因子的100-120位氨基酸序列(SEQ ID NO37)和121-140位氨基酸序列(SEQ ID NO39)；(e)酸性成纤维细胞生长因子的23-31位氨基酸序列(SEQ ID NO40)和97-105位氨基酸序列(SEQ ID NO41)；(f)碱性成纤维母细胞生长因子的16-27位氨基酸序列(SEQ ID NO42)、37-42位氨基酸序列(SEQ ID NO43)和107-112位氨基酸序列(SEQ ID NO45)；(g)牙本质涎蛋白的255-275位氨基酸序列(SEQ ID NO46)、475-494位氨基酸序列(SEQ ID NO47)和551-573位氨基酸序列(SEQ ID NO48)；(h)肝素结合性EGF样生长因子的63-83位氨基酸序列(SEQ ID NO49)、84-103位氨基酸序列(SEQ ID NO50)和121-140位氨基酸序列(SEQ ID NO52)；(i)钙粘蛋白EGF LAG七传G型受体3的326-350位氨基酸序列(SEQ IDNO53)、351-371位氨基酸序列(SEQ ID NO54)、372-400位氨基酸序列(SEQID NO55)、401-423位氨基酸序列(SEQ ID NO56)、434-545位氨基酸序列(SEQ ID NO57)、546-651位氨基酸序列(SEQ ID NO58)、1375-1433位氨基酸序列(SEQ ID NO59)、1435-1471位氨基酸序列(SEQ ID NO60)、1475-1514位氨基酸序列(SEQ ID NO61)、1515-1719位氨基酸序列(SEQ IDNO62)、1764-1944位氨基酸序列(SEQ ID NO63)和2096-2529位氨基酸序列(SEQID NO64)；和(j)成骨细胞特异性钙粘蛋白(OB-cadherin)的54-159位氨基酸序列(SEQID NO65)、160-268位氨基酸序列(SEQ ID NO66)、269-383位氨基酸序列(SEQ ID NO67)、384-486位氨基酸序列(SEQ ID NO68)和487-612位氨基酸序列(SEQ ID NO69)。
14.根据权利要求4的用于组织工程应用的支架，其中组织生长因子衍生的肽在N末端附加有半胱氨酸。
15.根据权利要求5的用于组织工程应用的支架，其中附加的半胱氨酸是CGG间隔基的形式。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的用于组织工程应用的支架，其中骨移植材料选自下述中的任意一种源自生物体的骨矿物粉和源于自体骨、牛骨和猪骨的多孔块状物、合成的羟基磷灰石粉和多孔块状物、磷酸三钙粉和多孔块状物、磷酸一钙粉和多孔块状物、由二氧化硅制备的骨移植材料、由二氧化硅和聚合物的混合物制备的骨充填移植材料、由包括壳聚糖、聚乳酸的生物相容性聚合体制备的细颗粒和多孔支架、和钛、以及立体支架。
17.根据权利要求10的用于组织工程应用的支架，用于组织工程应用的支架是屏障膜或植入物。
18.根据权利要求17的用于组织工程应用的支架，其中屏障膜是由聚乳酸制成的多孔膜；由几丁质或壳聚糖的纳米纤维制成的再生膜；或由几丁质或壳聚糖制成的膜状屏障膜。
19.根据权利要求17的用于组织工程应用的支架，其中植入物是钛植入物。
20.根据权利要求17的用于组织工程应用的支架，其中植入物的表面通过氧化和硝化进行修饰，从而使活性肽易于粘着在其表面。
21.根据权利要求10的用于组织工程应用的支架，其中骨移植材料的表面固定有交联剂。
22.根据权利要求21的用于组织工程应用的支架，其中交联剂选自下述中的一种或多种1，4-二-马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1，11-二-马来酰亚胺基四甘醇(BM[PEO]4)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二酰亚胺盐酸化物(EDC)、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯](SMCC)和硫代-SMCC、琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺基]己酸酯(SPDP)和硫代-SPDP、间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和硫代-MBS、琥珀酰亚胺基[4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯](SMPB)和硫代-SMPB。
全文摘要
本发明涉及用于组织工程应用的骨移植材料和支架，在其表面固定有促骨生长肽。更具体而言，本发明涉及用于组织工程应用的骨移植材料和支架，在其表面固定有诱导细胞粘着的肽和/或组织生长因子衍生的肽。借助固定在其表面上的促骨生长肽，本发明的用于组织工程应用的骨移植材料和支架能提高与再生相关的细胞的移行、增殖和分化，从而最终使组织再生最大化。而且，固定在表面的肽具有小分子量，表明减少了施用于人体时产生免疫反应的风险，并能以稳定的形式存在于体内，从而显示出持久效果。因此，当用于牙周组织、齿槽骨和其它的骨组织的再生时，肽使得实施外科手术更方便，并能显示高的疗效。
文档编号A61C8/00GK1933859SQ200580008894
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月18日 优先权日2004年3月19日
发明者朴玧贞, 郑钟平, 李承晋, 李相勋 申请人:首尔国立大学工业基金会