专利名称：使用气溶胶化抗凝血酶治疗急性肺损伤的利记博彩app
优先权要求
本申请要求USSN 60/538,678的优先权，其在2004年1月23日提交，其内容经引用并入本文。
背景技术：
在炎性肺病中，可以在气道里观察到纤维蛋白。已知肺泡纤维蛋白的形成被作为急性和/或慢性肺病的检验标志。在炎性病况中，因为肺部血管渗透性的增加，血浆渗出液进入气道中。渗出血浆中的纤维蛋白原将通过表达在激活的肺泡巨噬细胞(1)和上皮细胞(2)上的组织因子被激活，这导致气道中的血块形成。支气管内的纤维蛋白在肺部病理学中有几个作用。首先，它阻塞了通气。我们已经表明，在绵羊吸入烟和染上肺炎后，超过40％的支气管和细支气管被含纤维蛋白的凝块(cast)阻塞(3)。当肺的一些部分被阻塞时，因为通气/每错配(ventilation/per mismatch)，气体交换下降。如果病人被机械通气，肺的通气部分将被过度伸展，这是气压性创伤的一个原因。第二，纤维蛋白抑制表面活性剂的活性(4)。已经知道肝素雾化可有效预防气道阻塞和随后的急性肺损伤(5)。然而，有一篇报道提示肝素雾化对吸入烟诱导的急性肺损伤是无效的(6)。我们认为这种不一致的原因是因为肝素抗凝血能力是抗凝血酶依赖的，在其他工作中没有恰当地考虑到抗凝血酶活性。
纤维蛋白凝块导致气道阻塞在吸入烟诱导的急性肺损伤(ALI)中是一个严重的问题。预防气道凝块可能对临床效果是重要的。我们已经报道了肝素喷雾可以有效预防绵羊吸烟模型中气道阻塞。但是，由于肝素的抗凝血性是抗凝血酶依赖的，肝素不总是有效，可以通过使用本发明的方法提高治疗效果。
抗凝血酶是生理性丝氨酸蛋白酶抑制剂，不仅阻断凝血酶而且阻断凝血因子Xa、Ixa、XIa和XIIa。肝素将抗凝血酶的抑制反应加快了几千倍。因此，在气道中没有适当水平的抗凝血酶时，气溶胶化的肝素将不抑制纤维蛋白的形成，导致烟或者燃烧引起的肺损伤治疗几乎没有改善。根据本发明，我们证实抗凝血酶喷雾在治疗吸入烟损伤和/或燃烧诱导的损伤时更加有效和可靠，并要求保护更有效治疗这些肺损伤的方法。
发明内容
本发明部分基于发现气溶胶化抗凝血酶III(ATIII)可以有效治疗肺病、例如肺炎症和损伤。已经发现在治疗急性败血性肺损伤中，较低剂量的气溶胶化ATIII比较高剂量的静脉注射ATIII更加有效。因此，吸入施用ATIII比静脉施用提供更有效的肺病治疗，如肺炎症和损伤。
根据本发明抗凝血酶的优选实施方案，发现专门气溶胶化的抗凝血酶比肝素或其他药剂是更有效防止气道阻塞的抗凝血剂。当在吸入烟诱导ALI的绵羊模型中，测试比较气溶胶化抗凝血剂与argatroban(一种特异性合成凝血酶抑制剂)时，发现也是如此。
抗凝血酶和argatroban喷雾都抑制气道阻塞和减少气体交换。除此之外，抗凝血酶似乎有抗炎症作用，这将减少肺炎症和随后的水肿形成。
因此，一方面，本发明特征在于治疗具有肺病如肺炎症和/或损伤的对象的方法，其包括吸入施用治疗有效量的ATIII。肺病可以是急性或者慢性。在一个实施方案中，肺病是急性肺损伤，例如，败血性急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、或气道阻塞。肺损伤和/或炎症可以是由于例如暴露于外用试剂，例如毒性剂(如肺炎假单胞菌)、烟或石棉。在另一些实施方案中，肺病可以是例如肺或胸膜瘤，间质性肺病和/或组织性胸膜炎(organizing pleuitis)。
在一个实施方案中，使用喷射气溶胶或超音速喷雾器系统、或通过干粉吸入系统施用ATIII。这样的气雾给药系统是已知的。
在一个实施方案中，ATIII是人ATIII。ATIII可以是天然来源的，例如来自血浆，或重组生产的。血浆来源的ATIII是可商业获得的。在一个优选实施方案中，抗凝血酶是转基因生产的，例如，从转基因产乳动物如奶牛、山羊、兔子、小鼠的乳汁中获得ATIII。在美国专利号5,843,705中描述了在转基因动物的乳汁中生产ATIII的方法，其内容经引用并入本文。
在一个优选实施方案中，向对象施用包括ATIII和药物可接受载体的气溶胶组合物。药物可接受载体的实例包括水和盐水。
在一个实施方案中，通过吸入周期性向对象施用ATIII，例如按照规律性间隔向对象施用ATIII。例如，可以在肺炎症和/或损伤发作时、然后在除此施用后固定间隔时间向对象施用气溶胶ATIII，例如可以每1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、一天两次、或一天3、4、5、6次经吸入施用ATIII。给药期间可以是超过24、48、72、96、120、144或168个小时的期间。在另一个实施方案中，根据需要向对象经吸入施用ATIII，例如在肺炎症或损伤的一个或者更多连续或者复发性症状出现时进行ATIII给药。
有效剂量的ATIII，例如转基因生产的ATIII，可以是在10-300U/kg、25-125U/kg、50-100U/kg、或60-75U/kg体重之间。在另一方面，有效剂量可以超过约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg，但是少于150mg/kg、100mg/kg、70mg/kg。
在一个优选实施方案中，治疗相同的疾病，例如为了对肺炎症或损伤的一种或更多症状有相同作用，使用气溶胶ATIII的剂量少于静脉注射ATIII剂量的10％、20％、30％、40％、50％、60％。
根据本发明，抗凝血酶和argatroban喷雾都抑制气道阻塞和减少气体交换。此外，抗凝血酶还具有额外和增强的抗炎症作用，其导致更好地减少肺炎症和随后水肿形成。而且当抗凝血酶和argatroban一起使用来治疗因为吸入烟和/或燃烧导致的肺损伤时还有协同作用。
在另一个实施方案中，本发明特征在于治疗肺损伤的药盒。该药盒优选包括治疗有效量的气溶胶形式的ATIII和使用说明。气溶胶优选还包括药物可接受的载体。药物可接受的载体的实例包括水和盐水。
在一个实施方案中，有效剂量的ATIII，例如，转基因产生的ATIII，可以是在10-300U/kg、25-125U/kg、50-100U/kg、或60-75U/kg体重之间。在另一方面，有效剂量可以多于1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg，但是少于150mg/kg、100mg/kg、70mg/kg。
在一个优选实施方案中，该药盒是用于治疗急性或者慢性肺病的药盒。优选地，肺病是急性肺损伤，例如败血性急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。肺损伤和/或炎症可以是由于例如暴露于外用试剂，例如毒性剂(如肺炎假单胞菌)、烟或石棉。在另一些实施方案中，肺病可以是如肺或胸膜瘤、间质性肺病和/或组织性胸膜炎。
在一个实施方案中，药盒包括在喷射气溶胶或超音速喷雾系统、或干粉吸入系统中的ATIII。
在一个实施方案中，药盒包括气溶胶形式的人ATIII。ATIII可以是天然来源的，例如来自血浆，或重组生产的。在一个优选实施方案中，抗凝血酶III是转基因生产的，例如从转基因的产奶动物如奶牛、山羊、兔、小鼠的乳汁中获得ATIII。
在下面的附图和说明中有对本发明的一个或更多实施方案的细节。从说明和附图、以及权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。
图1.血气和肺功能。显示PaO2/FiO2比率(A)和肺分流(shunt fraction)(B)的变化。空心方框表示受损的和盐水处理对照组(n＝6)，空心菱形表示受损的和ATIII处理对照组(n＝6)，实心圆形表示受损的和argatroban处理组(n＝6)。数据表示为平均值±SE。*表示与盐水处理组相比的差异(p＜0.05)。
图2.气道阻力。气道阻力通过计算气道压力变化(ΔAP)进行评价。ΔAP计算如下ΔAP＝[峰值AP]-[平台值AP]。空心方框表示受损的和盐水处理组(n＝6)，空心菱形表示受损的和ATIII处理对照组(n＝6)，实心圆形表示受损的和argatroban处理组(n＝6)。数据表示为平均值±SE。
图3.肺的组织病理学评分。在烟和细菌攻击后24小时，评价在充血、水肿、炎症和出血方面的组织病理学变化。每种评分的总和计算为总组织学评分(A)。从我们的历史数据(n＝6)表示来自假损伤组的数据。ATIII对每种组织学变量的影响，如充血(Con)、水肿(Ed)、炎症(Inf)和出血(Hem)显示在B中。白色条代表受损和盐水处理组(n＝6)，黑色条代表受损和ATIII处理组(n＝6)。数据表示为平均值±SE。*表示与假损伤组相比的差异(p＜0.05)。
图4.显微评价气道阻塞。估算气道阻塞百分比。在支气管和细支气管水平上分析数据，表示为平均值±SE。*表示与盐水处理组相比的差异(p＜0.05)。
图5.肺的湿/干重比率。无血的肺湿/干重比率计算作为肺水肿或肺水含量的指数。数据表示为平均值±SE。*表示与盐水处理组相比的差异(p＜0.05)。
图6.血浆中硝酸盐和亚硝酸盐(NOx)水平的变化。空心方框代表盐水处理组(n＝6)；空心菱形代表ATIII处理组(n＝6)，实心圆形表示argatroban处理组(n＝6)。*表示与盐水处理组相比的差异(p＜0.05)。
图7显示的是通过核移植产生克隆动物过程的一般性图示。
具体实施例方式 以下缩写在说明书中具有指定的含义 缩写关键词 体细胞核移植(SCNT) 核移植(NT) 合成输卵管液(SOF) 胎牛血清(FBS) 聚合酶链式反应(PCR) 牛血清白蛋白(BSA) 术语解释 牛的——各种牛物种的或与之相关的。
生物液——由生物体如哺乳动物、鸟、两栖动物或爬行动物产生的水性溶液，它含有在水溶液中的细胞分泌的蛋白质。实例包括乳汁、尿、唾液、精液、阴道液、关节滑液、淋巴液、羊水、血液、汗液和泪液；以及由植物产生的水性溶液，包括，比如渗出液和吐出液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜。
生物液产生细胞——浸在生物液中并向生物液中分泌蛋白质的细胞。
生物药物——意思是指其起源、合成或制造涉及使用微生物、重组动物(包括但不限于嵌合体或转基因动物)、核移植、微注射或细胞培养技术的任何药物、治疗剂、疫苗或医学有用的组合物。
山羊的——各种山羊物种的或与之相关的。
编码——一般指以可翻译形式存在的序列信息，通常可操作地连接至启动子。当功能性启动子增强序列的转录或表达时，该序列可操作地与启动子连接。由于同样的信息内容以容易接近的形式存在，特别是当与促进正义联表达的序列连接时，反义链也被认为编码该序列。使用标准或修饰的遗传密码可转换该信息。
表达载体——遗传工程改造的质粒或病毒，比如来源于噬菌体、腺病毒、逆转录酶病毒、痘病毒、疱疹病毒或人工染色体，其用于将可操作性连接至启动子的ATIII蛋白质编码序列转移入宿主细胞中，使得编码的重组ATIII蛋白在宿主细胞中表达。
功能蛋白质——具有生物或其他活性或用途的蛋白质，与内源性生产时可见的相似。
载波片——用于间隔固定距离的平行电极的玻璃片。细胞偶联体放置在电极之间接受激活电流。
同源序列——指当比较时显示相似性的遗传序列。核酸中同源性的标准可以是本领域一般使用的同源性标准或者是杂交条件。对于核酸来说基本同源意味着，当比较时，任选地当比对时可以有适当的核苷酸插入或缺失，区段或其互补链具有至少约60％的残基、通常至少约70％、更通常至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95至98％的核苷酸是一致的。作为替代，当区段在选择性杂交条件下与一条链或其互补链杂交时，存在基本同源。当发生比整体缺乏特异性更有选择性的杂交时，存在杂交选择性。典型地，当在一段至少14个核苷酸链上具有至少约55％同源性时，优选至少约65％，更优选至少约75％，最优选至少约90％，将发生选择性杂交。
先导序列或“信号序列”——编码蛋白质分泌信号、并且当操作性连接至下游编码ATIII蛋白质的核酸分子时指导ATIII分泌的核酸序列。先导序列可以是天然的人ATIII先导序列，人工来源的先导序列，或者可以作为用于指导ATIII编码序列转录的启动子从相同基因获得，或者可以从细胞正常分泌的另一种蛋白质获得。
产乳细胞——分泌蛋白质到乳汁中的细胞(例如乳腺上皮细胞)。
乳汁特异性启动子——天然指导分泌蛋白质到乳汁的细胞(例如乳腺上皮细胞)中基因表达的启动子，例如，包括酪蛋白启动子，如α-酪蛋白启动子(如αS-1酪蛋白启动子和αS2-酪蛋白启动子)、β酪蛋白启动子(如，山羊β酪蛋白基因启动子(DiTullio，BIOTECHNOLOGY 1074-77，1992)、γ酪蛋白基因启动子、和κ酪蛋白基因启动子；乳清酸蛋白(WAP)启动子(Gorton et al.，BIOTECHNOLOGY 51183-1187，1987)；β-乳球蛋白启动子(Clark et al.，BIOTECHNOLOGY 7487-492，1989)；α-乳清蛋白启动子(Soulier et al.，FEBS LETTS.29713，1992)。也包括在乳腺组织中特异性激活从而可用于本发明的启动子，例如，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的长末端重复启动子。
核移植——指一种克隆方法，其中核从供体细胞被移植至去核卵母细胞中。
可操作性连接——基因和一或多种调节序列以这种方式连接，当适当的分子(比如翻译激活蛋白)结合至该调节序列上时，其允许基因表达。
绵羊的——绵羊的、与之相关或与之相似的。
单性生殖的——胚胎从未侵入精子的卵母细胞的发育。
药物纯的——表示适于确定无疑的生物学测试以及适于适当施用以治疗人患者的蛋白质。基本药物纯的意味着至少约90％纯的。
猪的——猪的或与之类似的。
启动子——足以指导转录的最小序列。本发明中也包括足以提供启动子依赖性基因表达的启动子元件，这些元件可以控制细胞类型特异性、组织特异性、时间特异性表达、或可被外部信号或药剂诱导表达；这些元件可以位于天然基因的5′端或3′端或内含子序列区域中。
蛋白质——如本文所用含义包括糖蛋白，以及具有附加物的蛋白质。这也包括保持生理功能的片段性或截短的多肽。
治疗有效量——治疗性分子或其片段的量，当施用于患者时，可以抑制或刺激由该分子调节的生物活性。
转化、“转染”、或“转导”——将外来分子引入细胞中的任何方法。脂质体转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、核移植(参见例如Campbell et al.BIOL.REPROD.49933-942，1993；Campbell et al.，NATURE 385810-813，1996)，原生质体融合、磷酸钙沉淀、转导(如噬菌体、腺病毒、逆转录酶病毒或其他病毒递送)、电穿孔、和基因枪(biolistic)转化仅仅是本领域技术人员已知可以使用的方法中的几种。
转化细胞或转染细胞——借助重组DNA技术已经引入编码ATIII的核酸分子的细胞(或其后代)。所述核酸分子可以稳定地整合入宿主染色体，也可以附加体形式维持。
转基因——核酸分子的任何部分，所述核酸分子人工插入细胞或其祖先并成为由该细胞发育的动物的基因组的一部分。这样的转基因可以包括对该转基因动物是部分或完全外源(即外来的)的基因，或可以代表与该动物的内源性基因具有一致性的基因。
转基因的——细胞或其祖先中已经人工插入核酸分子的任何细胞，其中所述核酸分子已经成为从该细胞发育的动物的基因组的一部分。
转基因生物——已经实验转入其他生物的遗传材料的生物，除了其遗传背景已经含有的遗传信息以外，使宿主获得转入基因的遗传信息。
有蹄动物——有蹄且典型食草的四足哺乳动物的或与之相关的，包括但不限于绵羊、猪、山羊、牛和马。
载体——如本文所用表示质粒、噬菌体DNA、或其他DNA序列，其(1)能够在宿主细胞中复制、(2)能够转化宿主细胞、和(3)含有适于鉴定转化细胞的标志物。
根据本发明，已经发现使用气溶胶形式的ATIII可以比静脉注射ATIII更低的剂量降低急性败血性肺损伤。因此本发明特征在于包括ATIII的气溶胶制剂，以及使用这种气溶胶形式ATIII治疗具有肺病如肺损伤或炎症的对象的方法。
重组人抗凝血酶(“ATIII”)和argatroban喷雾都能在烟吸入损伤及随后肺炎之后有效地防止气道阻塞以及增进气体交换。并且，ATIII降低肺炎症和随后的水肿形成。ATIII的量少于静脉注射的有效量。根据本文提供的数据和根据本发明的一个优选实施方案，没有观察到任何不利作用，包括出血倾向。因此使用气溶胶化的ATIII喷雾是一种新的更有效的治疗吸入烟的治疗策略。
本文所用术语“治疗”(″treat″或″treatment″)是指缓解或减少与肺病相关的一个或更多症状。例如，肺损伤和/或炎症的症状包括1)肺部气体交换减少；2)肺分流减少；3)细胞外纤维蛋白沉积；4)血管通透性增加；5)脂蛋白表面活性剂沉积降低；6)组织重建；7)凝集；和/或8)肺泡张力增加。如本文所用，气溶胶化形式ATIII有效治疗肺病的量，或“治疗有效量”指ATIII气溶胶的量，当单剂或多剂量施用于对象时，可有效治愈、缓解、减轻或改善本文所述肺病对象至超过缺乏这种治疗时的期望。
ATIII可以单独给药，例如，以干粉制剂，或与药物可接受载体一起。药物可接受载体包括例如无菌水、盐水和醇。ATIII气溶胶药物组合物可以进一步包括其他治疗剂(例如缓解或减少肺炎症或损伤的其它药剂)、或其他药物辅助剂、稀释剂等。ATIII可以例如作为与脂质体的复合物或包裹在脂质体中给药。
对于吸入给药，化合物可以从含有合适抛射剂如气体如二氧化碳的加压容器或分配器、或从喷雾器中以气溶胶喷雾形式递送。如本文所用，术语“气溶胶”是指固体或液体颗粒在空气中的分散体，颗粒大小足够小，随之具有低沉降速度，从而具有相对的空气分散稳定性(参见Knight，V.，VIRAL AND MYCOPLASMALINFECTIONS OF THE RESPIRATORY TRACT.1973，Lea and Febiger，Phila.Pa.，pp.2)。
可以通过气体压力或超声波实现ATIII的雾化。一般来讲，喷雾器是一种可施用气溶胶的设备。喷雾器可以是任何类型，它们的结构对于本领域技术人员来讲是已知的，这些设备都是可商业获得的。可以通过使用多种已知的雾化技术雾化含ATIII的溶液来制备本发明的气溶胶。一种雾化系统是“wo-phase”系统，它由液体抛射剂中的活性成分的溶液或悬液组成。在加压容器中同时存在液相和气相，当容器的阀门打开时，释放出含溶液或悬液的液体抛射剂。这可以生成精细的气溶胶雾或气溶胶湿喷雾。
有多种喷雾器可用于产生气溶胶，包括小容量喷雾器。压缩剂驱动的喷雾器结合喷射技术，并使用压缩空气或医用氧气产生气溶胶。商品设备可以从以下获得Healthdyne Technologies Inc.；Invacare Inc.；Mountain Medical Equipment Inc.；PariRespiratory Inc.；Mada Mediacal Inc.；Puritan-Bennet；Schuco Inc.；OmronHealthcare Inc.；DeVilbiss Health Care Inc；和Hospitak Inc.。超声喷雾器，例如带有高频振动石英晶体的超声型喷雾器液也可以用来递送ATIII。
这种ATIII气溶胶的毒性和治疗效果可以通过标准的药学方法用细胞培养或实验动物确定，例如确定LD50(群体的50％致死的剂量)和ED50(群体的50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，它可以表示为LD50/ED50。优选表现高治疗指数的化合物。尽管可以使用表现毒副作用的化合物，需要仔细设计给药系统，使这些化合物靶向受影响组织的部位，以使对未感染细胞的潜在破坏最小，从而减少副作用。
来自细胞培养实验和动物研究的数据可以用于制定在人体上使用的剂量范围。这些化合物的剂量优选处于包括ED50而很少或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所用剂量形式和所用给药途径在此范围内变化。对用于本发明方法的任何化合物，治疗有效剂量可以从细胞培养实验中做初步估计。剂量可以配制成在动物模型中实现循环血浆浓度范围包括细胞培养中确定的IC50(也就是实现症状的半数最大抑制的测试化合物浓度)。这样的信息可以用来更准确地确定人身上的有用剂量。血浆水平可以测定，例如通过高效液相色谱测定。
测定ATIII剂量的其它方法包括在使用ATIII治疗前测量对象的循环ATIII水平。基于循环ATIII水平，ATIII的剂量可以调节为超过初始循环水平的50％、100％、150％、250％、300％。
施用的气溶胶制剂的量典型范围是在约10U/kg至250U/kg体重，优选约25U/kg至175U/kg体重。
技术人员将知道，某些因素可以影响有效治疗对象所需要的剂量和时间安排，包括但不限于疾病或紊乱的严重性、先前的治疗、对象的一般健康和/或年龄、存在的其他疾病。而且，用治疗有效量的蛋白质、多肽或抗体治疗对象可以包括单次治疗，或优选包括一系列治疗。
实施例1 重组生产的ATIII溶解在盐水中(42mg/ml)。使用母绵羊(n＝24)。48次呼吸棉花烟(＜40℃)之后，向双肺中输注P.aeruginosa(5×1011)。所有动物都用100％O2机械通气(Tidal体积15ml/kg，30次呼吸/分钟，PEEP 5cmH2O)。在损伤后2、4、8、12、16、20小时，用超声喷雾器喷雾重组抗凝血酶(n＝6)、argatroban(n＝8)、或相同体积的生理盐水(n＝10)。在研究期间没有动物死亡。PaO2/FiO2比率，肺分流，组织学气道阻塞评分都被抗凝血酶和argatroban降低。但是组织病理学变化和肺湿/干重比率只被抗凝血酶降低，而不被argatroban降低。
材料和方法 材料 人重组抗凝血酶(ATIII)(7，8)获赠于GTC Biotherapeutics(Framingham，MA)。Argatroban是从Daiichi Pharmaceutical Co.(Tokyo，Japan)购买的。所有其它试剂都是分析级的。
动物准备 德克萨斯大学医学部动物保护和使用委员会(The Animal Care and UseCommittee of The University of Texas Medical Branch)批准了本草稿中报告的试验。所有动物都按照美国生理学会和国立卫生研究院(the American Physiological Society和the National Institutes of Health)建立的准则操作。如前所述，在氟烷麻醉下手术准备24只母绵羊用于研究(9)。测量了基线心血管数据后，绵羊接受如前所述的吸入烟和细菌输注的组合损伤(3)。该动物模型表现了严重急性肺损伤以及过度的心血管反应，这模拟人的败血性病况。
简而言之，在棉花烟暴露(4组，每组12次呼吸，＜40℃)之后，将P.aeruginosa(5×109/kg)输注入支气管内。在烟吸入和细菌输注后，动物随机地分配到两个治疗组，ATIII喷雾组(n＝6)，argatroban-喷雾组(n＝8)，和盐水喷雾对照组(n＝10)。在整个24小时研究期间所有动物都用100％O2机械通气(Tidal体积12-15ml/kg，30次呼吸/分钟，PEEP 7.5cmH2O)。Tidal体积调节到维持PaCO2正常。注入足够体积的Ringer乳酸盐溶液以防止血细胞比容增加。开始时，灌输2ml/kg/h的Ringer乳酸盐，然后我们基于血细胞比容的水平逐步调节到10ml/kg/h。盐水处理对照组、抗凝血酶治疗组、和argatroban治疗组的体重(kg)分别是39.3±3.1、37.2±2.6、和36.2±1.4(没有显著性差异)。
治疗 将重组人抗凝血酶(rhAT)溶解到蒸馏水中(250mg/30mL)。然后，ATIII溶液和60ml盐水混合，每4个小时喷雾15ml含41.7mg ATIII的混合溶液。argatroban和盐水混合(10mg/90ml)，每4小时喷雾15ml(含1.67mg)。对照组以相同的方式接受15ml盐水喷雾。溶液用超声喷雾器(Ultra-Neb99，DeVilbiss Co.，Somerset，PA)雾化，如前所示将其与气管支气管树相连(10)。喷雾器得到的颗粒大小报告为小于4微米。在攻击后一小时开始喷雾，此后每四小时一次。
血浆NO2/NO3(NOx)测量 如前所述用化学发光NO分析器(Antek，model 7020)测量血浆中NOx(氮氧化物代谢物的总量)的浓度(11)。
血液培养和凝集参数 培养动脉血来测试菌血症(Septi-check，Becton Dickinson，Sparks，MD)。在基线和3、6、12和24小时仔细从股动脉导管抽取肝素化血样。
使用Hemochron 801型(International Technidyne Co.，Edson，NJ)在基线、损伤后12小时和24小时监测活化凝血时间。
在基线、和损伤后6小时和24小时收集柠檬酸化血浆用于抗凝血酶测试。用发色底物(S-2765，Diagnostica Stago，Parsippany，NJ)测量抗凝血酶的活性。数据表示为正常标准血浆的％。
肺组织学和免疫组织化学 由不知道动物分组情况的病理学家对来自右侧低肺叶的肺切片进行组织评分(5)。实质对于充血、水肿、炎症和出血的变化根据0-4分量表分级(0正常；4严重)。也根据前述评价形成凝块导致的气道阻塞(3)。
气道压力 峰值和平台期气道压力用呼吸机(Servo Ventilator 900C，Seimens-Elema，Sweden)监测。由于气道峰值压力反映了气道阻力之和顺应性的总和，而平台期压力主要反映了气道顺应性，我们从峰值压力减去平台期压力(Δ气道压力)。因此，Δ气道压力是气道阻力的指数。
统计学分析 用统计学软件StatView 5.0(SAS Institute，Cary，NC)进行分析。数据表示为平均值±SEM。用重复测试方差分析(ANOVA)或带Tuckey’s post hoc检验的ANOVA来比较各组之间的数据。用非成对数据的Student Newman-Keuls检验各个时间点处进行适当的组间比较。在组织学研究中，进行非参数Mann-Whitney U检验。p值＜0.05被认为有统计学显著性。
结果 在盐水处理组、ATIII处理组、和argatroban处理组的羧基血红蛋白(％)的峰值水平分别是58.6±8.2、65.7±7.2、和57.5±6.1(没有显著性差异)，这提示所有分组几乎接受相同量的烟吸入。在24小时研究期间没有动物死亡。
血液培养 如方法部分在研究期间的几个时间点仔细取冬麦血样品用于细菌培养。在所有的基线样品中P.aeruginosa显阴性。在24小时研究期间，P.aeruginosa在盐水对照组中检测到33％(3/10)，但在ATIII和argatroban组中检测到0％。虽然在ATIII和argatroban处理组中百分比较低，但是和盐水处理组相比没有统计学差异。
肺部气体交换 在所有组受攻击后，PaO2/FiO2(P/F)比率显著下降。但是，在rhAT-喷雾组和argatroban-喷雾组中下降得明显更少(图1A)。ATIII和argatroban所致气体交换减弱程度大约相同(图1A)。肺分流在攻击后显著增加，但是在ATIII或argatroban喷雾组(图1B)中增加明显更少。
气道压力 在研究中，峰值和平台期气道压力用呼吸机监测。计算气道压力变化(＝[峰值压力]-[平台期压力])用于分析气道阻力。气道压力变化在盐水处理对照组中逐渐增加。虽然各组之间没有统计学差异(图2)，ATIII处理组和argatroban处理组显示气道压力变化没有增加。
肺组织病理学 在烟和细菌攻击后24小时，在受影响绵羊的肺中有显著的炎症反应，其特征在于间质和气体空间中的细胞浸润。这些浸润物主要由嗜中性粒细胞组成。也观察到间质水肿、血管充血和出血。根据充血、水肿、炎症和出血的严重性和范围，暴露于烟和细菌后的组织学评分显著更高(图3A)。我们历史的假损伤和假处理的动物(n＝7)在所有单个组织病理学评分中表现为1.0或更小。ATIII组在充血、水肿、炎症和出血的每种评分更低，但没有达到统计学差异。
argatroban显示了和盐水对照几乎相同的评分。有意思的是，出血评分在ATIII处理组和argatroban处理组中不是都更高而是都更低。计算组织学总评分(图3B)。由于每种充血、水肿、炎症、和出血评分为从0(正常)到4(强烈)，组织学总评分的最大值是16。在ATIII处理组中显著更低(图3B)。作为比较，argatroban喷雾没有减少组织学总评分(图3B)。历史假损伤组(n＝7)中是3.3±0.7。
支气管和细支气管被嗜中性粒细胞浸润、脱落的支气管上皮细胞、粘液和纤维蛋白阻塞。在盐水处理组中在支气管和细支气管水平上都发现超过30％截面积的气道阻塞(图4)。ATIII喷雾在支气管水平显著抑制气道阻塞。argatroban同时在支气管和细支气管水平上显著抑制阻塞(图4)。
肺湿/干重比 和历史性假损伤数据(湿/干比＝3.70±0.17，n＝7)相比，在烟吸入接着支气管输注细菌后24小时，肺湿/干重比显著增加。这种增加被ATIII喷雾显著减弱，但没有被argatroban显著减弱(图5)。
硝酸盐/亚硝酸盐(NOx)水平的变化 攻击后，血浆NOx水平增加了基线水平的2-3倍。ATIII组在最初3小时显示出类似的增加，但是在后面阶段直至24小时增加显著更少(图6)。Argatroban似乎在6-15小时期间Nox水平较低，但它随后达到了盐水处理组相同的程度。在argatroban处理组与盐水处理组之间没有显著的统计学差异(图6)。
血计数和凝血参数 基线白细胞和血小板的数量在各组之间没有差别。白细胞的数量在受损后24小时显著减少(表1)。白细胞数的减少在ATIII组不严重(表1)。Argatroban不影响白细胞数的减少。血小板计数在受损后也明显减少。ATIII没有阻止这种减少(表1)。argatroban轻微地阻止了血小板的减少。
虽然没有统计学差异，但是受损后在所有组中有延长激活凝血时间的趋势(表2)。在各组之间没有观察到统计学差异(表2)。
讨论 气道中形成纤维蛋白已知被当作急性/慢性肺损伤的标志(12)。在败血性疾病中，血管通透性增加，含纤维蛋白原的血浆进入气道，受细胞因子的刺激而表达组织因子(12)。因此，纤维蛋白原容易在气道中凝集。在气道中形成纤维蛋白是通过两种方式引起肺损伤的原因。首先，它阻塞气道部分并抑制气体交换。其次，纤维蛋白抑制表面活性剂的活性，它是肺膨胀不全的一种因素。当给患者或者动物机械通气时，气道阻塞也引起呼吸机诱发的肺损伤。过度拉伸肺的通气部分诱导趋化因子，如白细胞间介素8(13，14)。
我们已经证实肝素喷雾可以有效防止气道阻塞和提高气体交换(5)。我们确定肝素喷雾预防纤维蛋白凝集的形成，并减弱急性肺损伤。但是肝素的抗凝血性质是抗凝血酶依赖的。根据本发明，在实验动物上引发烟吸入、肺损伤和肺炎，是设计用来模拟发生在人身上的相同损伤或者疾病状态。根据该模型，测量并比较血浆抗凝血酶活性。
根据本发明的一个优选实施方案，血浆抗凝血酶活性的基线值在损伤后逐渐降低，24小时后达到约50％(15)。在烧伤或败血症患者中报道了类似现象。在这样的条件下，未见到肝素的作用。根据本发明的权利要求，我们证实输注ATIII对治疗肺损伤是有效的(15)。基于该静脉内研究，已经确定更低剂量范围的ATIII由喷雾器直接送入气道也是有效的。这就是我们设计本研究的原因。我们也计算了施用的气溶胶化ATIII的量(mol)，并测试了具有大致相同抗血栓能力的argatroban的作用。
抗凝血酶是主要生理抗凝血剂之一。除了抑制多种凝血因子如凝血酶、Fxa、FXIa、FXIIa和FIXa之外，抗凝血酶已知具有一些抗炎性(18)。多种动物和临床研究表明静脉内施用抗凝血酶有益于败血症(19)、内毒素休克(20)、肾缺血一再灌注损伤(21)和烧伤(22)。现在考虑有两种作用机制。第一，抗凝血酶促进环前列腺素从内皮细胞中的释放(23)。由于环前列腺素抑制细胞因子生成、粘附分子表达和血小板凝集，抗凝血酶通过环前列腺素间接抑制炎症反应。第二，最近发现称为syndecan-4的抗凝血酶受体(24)。当抗凝血酶结合到syndecan-4上时，它在白细胞和内皮细胞中抑制核因子kappa B的转位并抑制炎症信号的转导(25，26)。因此，抗凝血酶通过抑制NF-kappa B活化而直接改变炎症过程。
argatroban为抑制凝血酶活性而设计，其特异性非常高(27)。和抗凝血酶相比，argatroban是很小的分子(分子量为527Da)，直接抑制凝血酶。很少有关于argatroban消炎作用的报道。我们认为在抗凝血酶和argatroban之间的这些差异可能显示了对吸入损伤的不同作用。在本研究中，ATIII和argatroban都相同程度地抑制烟吸入和肺炎之后的气道阻塞。结果ATIII和argatroban都减少了肺部气体交换。当它们一起使用的时候，它们表现出协同作用/对于气道阻塞，argatroban在防止凝块形成上比rhAT更加有效。由于argatroban比ATIII要小，它是非蛋白质材料，可以更好地传送。然而，根据本发明的改进，组织病理学分析显示ATIII改善了组织学变化，但是argatroban没有。和此结果一致的是，ATIII喷雾提高了肺湿/干重比，而argatroban没有。从这些观察中，我们能够推测ATIII和argatroban的抗凝血能力都抑制气道纤维蛋白的形成，并减弱气体交换。此外，ATIII具有抗炎症性质，可以改善肺炎症和随后的肺水肿形成。与argatroban处理组相比，ATIII处理组中白细胞计数降低的严重性要小，也表明ATIII能抑制炎症反应。
作为本发明的一部分，ATIII和argatroban也降低了败血症的发病率。当气道被阻塞时，细菌清除被中断，封闭的非呼吸区域将是细菌生长的温床。因此我们认为抑制气道阻塞不仅有益于气体交换，而且有益于预防系统性细菌转位和败血症。
如我们在图6中所示那样，气溶胶化rhAT显著抑制血浆NOx的增加，一氧化氮(NO)形成的指数。NO是由一氧化氮合酶(NOS)的3种异构体合成，已知内皮细胞NOS(eNOS)和神经元NOS(nNOS)是组成型NOS(cNOS)，所有时间都表达。第三种异构体被称为诱导型NOS(iNOS)。iNOS被炎症细胞因子如组织坏死因子-α诱导。在本研究中，ATIII抑制NO的形成，特别是在后12小时的实验中，但是未在最初12小时里抑制其形成，提示ATIII抑制iNOS的表达。我们已经表明iNOS表达不仅仅来自肺泡巨噬细胞，而且也来自肺泡上皮细胞(28)。由于有报道说抗凝血酶抑制NFkB活化(18)，我们已经确定喷雾化ATIII抑制来自气道上皮细胞的iNOS表达。 表I血计数变化 平均值±SE.*p＜0.05比 盐水表2 活化凝血时间的变化 平均值±SE(秒) *p＜0.05比 盐水 即使ATIII总剂量是以前静脉研究中的一半(参见Murakami(2001)AM.J.RESP.CRIT.CARE MED.163A553)，结果也比静脉给药更有效。没有观察到不利作用。因此，气溶胶化ATIII在绵羊烟吸入和肺炎之后的败血性急性肺损伤中是有用的。
已经描述了本发明的许多实施方案。然而，可以知道，在不脱离本发明的精神和范围下可以进行多种修改。因此，其他实施方案也在下面的权利要求范围内。
根据本发明用于转基因动物的方法，通过转染感兴趣的蛋白质核酸构建体(例如，乳腺特异性转基因，将人甲胎蛋白-β-干扰素蛋白靶向至乳腺表达)创建适于体细胞核移植的转基因原代细胞系(来自山羊、牛、绵羊、猪或者任何其他非人类的脊椎动物来源)。这种转基因构建体既可以含有选择标记(比如新霉素、卡那霉素、四环素、嘌呤霉素、zeocin、潮霉素或其他选择标记)，也可以与能在细胞培养中表达选择标记的盒一起转染。
本发明提供含有本文所述核酸序列的表达载体，其可操作性连接至至少一个调节序列。许多这样的载体已经商品化，技术人员也很容易制备其他合适的载体。“可操作性连接”或“操作性连接”意思是指核酸分子以允许宿主生物表达该核酸序列的方式连接至调节序列。调节序列是本领域已知的，可以选择用来生产编码的多肽或蛋白质。因此，术语“调节序列”包括启动子、增强子、和描述于下文的其他表达调控元件Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS INENZYMOLOGY 185，(Academic Press，San Diego，Calif.(1990))。例如，可以使用天然的调节序列或对转化的宿主细胞为天然的调节序列。
应该知道表达载体的设计可以取决于这样的因素，比如选择待转化的宿主细胞和/或期望表达的蛋白质类型。例如，可以通过将克隆基因或其一部分连接入适于在原核细胞、或真核细胞或同时两者中表达的载体中，来生产本发明的多肽(ALABORATORY MANUAL，2nd Ed.，ed.Sambrook et al.(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)Chapters 16 and 17)。
选择期望核酸构建体的重组体菌落以后，分离并扩增细胞，根据本领域已知的方法取小份冷冻用作长期保存。可以使用标准的分子生物学方法表征选定的转基因细胞系(PCR、Southern印迹、FISH)。带有核酸携带感兴趣双功能蛋白质的核酸构建体的细胞系然后可以作为核供体用于本领域已知的体细胞核移植操作中，其中核酸构建体具有适当的拷贝数，一般具有单整合位点(尽管相同的技术可用于多整合位点的情形)。在核移植后，将胚胎转移至受体动物中，妊娠，从而获得活的转基因后代。典型地这种转基因后代仅在特定染色体上携带一个转基因整合，另外的同源染色体在相同位置不携带整合。因此，转基因后代对转基因是杂合体，满足维持当前对至少两个连续繁殖循环以产生纯合转基因动物的需要。
从生物液中纯化ATIII蛋白质 可以使用标准蛋白质纯化技术如亲合层析(例如参见Ausubel et al.，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1998；另见Lubon et al.，UNITED STATES PATENT5,831,141)或者本领域技术员已知的其它蛋白质纯化方法从转基因生物的生物液中纯化本发明的ATIII蛋白质。分离之后，如果需要，ATIII蛋白可以进一步纯化，例如用高效液相色谱(HPLC，例如参见Fisher，LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY，eds.Work and Burdon，Elsevier，1980)和/或切向流过滤。纯化后，ATIII蛋白质至少达到80％纯度，优选90％，更优选95％，最优选99％。
动物启动子 虽然可以使用任何分泌ATIII到乳汁中的启动子，可用于在乳腺组织中表达ATIII的启动子包括天然驱动乳腺特异性多肽如乳蛋白表达的启动子。例如，这些包括天然指导乳清酸蛋白(WAP)、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白表达的启动子(例如参见Drohan et al.，U.S.Patent No.5,589,604；Meade et al.，U.S.Patent No.4,873,316；和Karatzas et al.，U.S.Patent No.5,780,009)，另一些在美国专利No.5,750,172中有描述。乳清酸蛋白(WAP；GenbankAccession No.X01153)，啮齿类动物中主要的乳清蛋白，仅在妊娠晚期和哺乳期在乳腺中高水平地表达(Hobbs et al.，J.BIOL.CHEM.2573598-3605，1982)。对于期望的乳腺特异启动子的另一些信息参见Richards et al.，J.BIOL.CHEM.256526-532，1981(α-乳清蛋白大鼠)；Campbell et al.，NUCLEIC ACIDS RES.128685-8697，1984(大鼠WAP)；Jones et al.，J.BIOL.CHEM.2607042-7050，1985(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee & Rosen，J.BIOL.CHEM.25810794-10804，1983(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，BIOCHEM.J.242735-742，1987(人α-乳清蛋白)；Stewart，NUCLEIC ACIDS RES.123895-3907，1984(牛α-s1和κ-酪蛋白cDNAs)；Gorodetsky et al.，GENE 6687-96，1988(牛β-酪蛋白)；Alexander et al.，EUR.J.BIOCHEM.178395-401，1988(牛κ-酪蛋白)；Brignon et al.，FEBS LETT.18848-55，1977(牛α-S2酪蛋白)；Jamiesonet al.，GENE 6185-90，1987，Ivanov et al.，BIOL.CHEM.Hoppe-Seyler 369425-429，1988，和Alexander et al.，NUCLEIC ACIDS RES.176739，1989(牛β-乳球蛋白)；和Vilotte et al.，BIOCHIMIE 69609-620，1987(牛α-乳清蛋白)。各种乳蛋白基因的结构和功能已经综述于Mercier & Vilotte，J.DAIRY SCI.763079-3098，1993。如果另外的旁侧序列可用于优化表达，这样的序列可以使用已有序列作为探针进行克隆。可以使用已知的同源核苷酸序列或同源蛋白的抗体作为探针，通过筛选不同生物的文库来获得这些生物的乳腺特异性调节序列。
可用于将ATIII表达和分泌入乳中的信号序列是乳特异性信号序列。理想的是，信号序列选自乳特异性信号序列，也即选自编码分泌至乳中的产物的基因。最理想的是，乳特异信号序列与上述的乳特异性启动子相关。信号序列的大小对于本发明来说不是关键的。全部需要的就是序列应该有足够分泌ATIII的大小，例如分泌在乳腺组织中。例如，编码这些蛋白的基因的信号序列可用于本发明，酪蛋白，如α、β、γ、或κ酪蛋白，β乳球蛋白，乳清酸蛋白和乳清蛋白。也可以使用来自其他分泌蛋白的信号序列，比如肝细胞、肾细胞或胰腺细胞分泌的蛋白。
虽然可以使用将转基因产物分泌到尿中的任何启动子，但可用于在泌尿组织中表达重组多肽转基因的启动子是uroplakin和uromodulin启动子(Kerr et al.，NAT.BIOTECHNOL.1675-79，1998；Zbikowska，et al.，BIOCHEM.J.3657-11，2002；andZbikowski et al.，TRANSGENIC RES.11425-435，2002)。
虽然可以使用将转基因产物分泌到血液中的任何启动子，但可用于由产血液或产血清细胞(例如肝脏上皮细胞)将ATIII表达和分泌至血液中的启动子是白蛋白启动子(例如参见，Shen et al.，DNA 8101-108，1989；Tan et al.，DEV.BIOL.14624-37，1991；McGrane et al.，TIBS 1740-44，1992；Jones et al.，J.BIOL.CHEM.26514684-14690，1990；and Shimada et al.，FEBS LETTERS 279198-200，1991)。
在美国专利No.6,201,167中描述了可用于在精液中表达ATIII的启动子。有用的禽特异性启动子是卵清蛋白启动子和apo-B启动子。在本领域中已知其他禽特异性启动子。卵清蛋白启动子可用于指导表达ATIII，然后将其沉积于卵的卵白中。apo-B启动子也可用于指导在肝脏中表达重组多肽，在此它将最终沉积在卵黄中。禽卵是表达大量重组多肽的一种最佳载体，原因如下(1)大量蛋白质包装到每个卵中，(2)卵容易非侵入性收集，然后保存相当长的时间，和(3)和乳汁不同，卵是无菌的，不含有细菌污染物。特别地，对于每个卵，禽在输卵管中产生三克清蛋白，其中卵清蛋白超过50％。另三克在肝脏中产生(血清脂蛋白)并沉积在卵黄中。此外，由于它们与哺乳动物的进化距离，禽典型地不免疫识别哺乳动物蛋白，所以在禽中表达ATIII更少可能对禽的存活和健康具有任何有害的作用。
可用于本发明中的其他启动子包括诱导型启动子。一般来讲，在多数真核表达系统中，以组成型方式表达重组蛋白质。诱导型启动子或增强子元件的加入对ATIII的表达提供了时间或空间上的控制，并提供了表达的一种替代性机制。诱导型启动子包括热休克蛋白、金属硫蛋白和MMTV-LTR，而诱导型增强子元件包括蜕皮激素、muristerone A和四环素/强力霉素的这种元件。
Tet-On和Tet-Off基因表达系统(Clontech)是可用于本发明方法的诱导型系统的一个实例。该系统使用四环素(Tc)应答元件来维持ATIII表达在(组成型关闭，用Tc诱导)开启的模式或(组成型开启，用Tc或强力霉素抑制)关闭模式中。选择标记也可以并入ATIII转基因中，容易鉴定已经被转化的细胞。选择标记一般分成两个功能类型隐性和显性。隐性标记通常是编码宿主细胞(缺少“标记“产物或功能的细胞)中不生成的产物的基因。属于该类型的有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)、和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)的标记基因。显性标记包括编码提供对抑制生长化合物(抗生素，药物)抗性和/或允许宿主细胞在代谢限制性环境中生长的产物的基因。通常使用的该类型标记包括提供对氨甲蝶呤抗性的突变体DHFR基因；黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的gpt基因，它允许宿主细胞在含霉酚酸/黄嘌呤的培养基中生长；氨基糖苷3′-磷酸转移酶的neo基因，其可以提供对G418、庆大霉素、卡那霉素和新霉素的抗性。
核酸载体 在一些实施方案中，本发明涉及载体，或重组体表达载体，其中包含本文所述核酸分子的任一种。载体在本文中用于扩增编码蛋白质的DNA或RNA和/或用于表达编码SSTR蛋白的DNA。载体包括但不局限于质粒，噬菌体，粘粒，附加体，病毒颗粒或病毒，和可整合的DNA片段(也就是可以通过同源重组整合进宿主基因组的片段)。病毒颗粒包括但不局限于腺病毒，杆状病毒，细小病毒，疱疹病毒，痘病毒，腺相关病毒，Semliki森林病毒，痘苗病毒，逆转录酶病毒，微颗粒和裸DNA。在各种实施方案中，表达可以通过打靶配体靶向到特定细胞类型或细胞群体。表达载体包括但不局限性于pcDNA3(Invitrogen)和pSVL(Pharmacia Biotech)。其他表达载体包括但不局限于pSPORTTM载体，pGEMTM载体(Promega)，pPROEX载体TM(LTl，Bethesda，Md.)，BluescriptTM载体(Stratagene)，pQE.TM载体(Qiagen)，pSE420TM(Invitrogen)，和pYES2TM(Invitrogen)。表达构建体可以包含编码蛋白质的多核苷酸，其操作性连接至内源或外源表达调控DNA序列和转录终止子。因为很多载体中核酸插入的空间有限，所以希望插入较小的报告基因或者报告基因构建体。例如，可以使用删除全部或部分的生长激素抑制素受体羧基端。表达调控DNA序列一般包括启动子、增强子、操作子(operator)和调节元件结合位点，典型地基于待使用该表达构建体的表达系统进行选择。
启动子和增强子序列一般根据其增加基因表达的能力选择，而操作子序列一般根据其调节基因表达的能力选择。本发明的表达构建体也可以包括编码一种或多种选择标记的序列，这些标记允许鉴定携带这种构建体的宿主细胞。表达构建体也可以包括促进宿主细胞中同源性重组的序列。在多种实施方案中，构建体也可以包括在宿主细胞中进行复制的必要序列。
多种示例性组织特异性启动子列于此处(Pearse and Takor，1979；Nylen andBecker，1995)。虽然不是一个完整的清单，但是这些启动子是可用于本发明某些实施方案的启动子和增强子类型的示例。可用于本发明的其它启动子，对本领域的技术员而言也是容易知道的。
诱导型启动子包括但不局限于MT II、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)、c-jun、胶原酶、Stromelysin、鼠MX基因、GRP78基因、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、I型MHC基因H-2kB、HSP70、多育曲菌素、肿瘤坏死因子和促甲状腺激素-α。使用细胞特异性增强子和/或启动子可以实现细胞或组织特异性表达(一般参见，Huber et al.，ADV.DRUG DELIVERY REVIEWS 17279-292，1995)。
表达构建体可以用来生产编码蛋白，但也可以简单地用来扩增编码SSTR蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述载体是表达载体，其中所述多核苷酸可操作性连接至包含表达调控序列的多核苷酸。在一些实施方案中，自主复制重组表达构建体如质粒和病毒DNA载体并入多核苷酸。表达载体可以是可复制的DNA构建体，其中编码SSTR蛋白的DNA序列可操作性连接至能实现SSTR蛋白在合适宿主中表达的合适调控序列上。当DNA区域功能性互相关联时，它们是可操作性连接的。例如，如果启动子能调控编码序列的转录，则它可操作性连接至该编码序列。扩增载体不要求表达调控结构域，而只需要在宿主中复制的能力，这通常由复制起点提供，和帮助识别转化体的选择基因。表达载体对调控序列的需求将根据选定宿主和选定的转化方法而变化。一般来讲，调控序列包括转录启动子、任选的调控转录的操作子序列、编码合适的mRNA核糖体结合的序列和调控转录与翻译终止的序列。
在多种实施方案中，载体可以包含有被宿主生物识别的启动子。启动子序列可以是原核的、真核的、合成的或病毒的。合适的原核序列的实例包括λ噬菌体的启动子(THE BACTERIOPHAGE LAMBDA，Hershey，A.D.，Ed.，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1973)；LAMBDA II，Hendrix，R.W.，Ed.，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1980)；和Benoist et al.，The trp，recA，heat shock，and lacZ promoters of E.coli and the SV40 early promote，NATURE，290304-310，(1981)。其他的启动子包括但不局限于小鼠乳腺肿瘤病毒、人免疫缺陷病毒的长末端重复、maloney病毒、巨细胞病毒立即早期启动子、EpsteinBarr病毒、劳斯肉瘤病毒、人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白。
载体中也可以包括其他调节序列。合适的调节序列的实例以噬菌体MS-2的复制酶基因和λ噬菌体的基因cII的Shine-Dalgarno为代表。Shine-Dalgarno序列后可以直接跟随编码SSTR蛋白质的DNA，导致成熟SSTR蛋白质的表达。
并且，合适的表达载体可以包括筛选转化宿主细胞的适当标记。使用在Sambrook et al.，supra描述的以及本领域技术人员所熟知的多种技术的任一种实现选定宿主的转化。
复制起始也可以通过构件包括外源起始的载体来提供或者由宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体整合到宿主细胞染色体中，后者可以是足够的。作为替代，相对于使用含病毒复制起始的载体，本领域技术人员可以通过用选择标记和编码SSTR蛋白的DNA共转化的方法来转化哺乳动物细胞。合适标记的实例是二氢叶酸还原酶或者胸苷激酶(参见美国专利No.4,399,216)。
编码报告蛋白融合体如SSTR2蛋白质的核苷酸序列，可以根据常规技术与载体DNA重组，包括平端或粘端连接、限制性酶消化以提供合适末端、适当的填充粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不期望连接、和用适当连接酶连接。这些技术公开于Sambrooket al.，supra中，并且是本领域公知的。构建哺乳动物表达载体的方法也已经公开，例如在Okayama et al.，MOL.CELL.BIOL.，3280，(1983)；Cosman et al.，MOL.IMMUNOL.，23935，(1986)；和Cosman et al.，NATURE，312768，(1984)。
转基因构建体优选包括启动子下游的先导序列。当可操作性连接至编码本发明ATIII蛋白质的下游核酸分子时，先导序列是编码蛋白质分泌信号的核酸序列，并指导ATIII分泌。先导序列可以从用来指导编码ATIII核酸分子转录的启动子的相同基因中得到(例如，编码乳特异性蛋白的基因)。作为替代，可以使用编码天然人ATIII蛋白质分泌信号(Genbank Accession No.V01514中氨基酸1-19)的先导序列。
治疗应用 这里的组合优选用于体外处理这些组织培养物。但是这种组合也可有效地用于体内应用。根据意图使用的体内给药方式，所用组合物可以是固体、半固体或液体剂量形式，例如片剂、丸剂、粉末、胶囊、凝胶、软膏、液体、或悬液等。组合物优选以单位剂量形式给药，所述单位剂量形式适于单次施用精确剂量。根据期望的剂型，组合物也可以包括药物接受的载体或稀释剂，所述稀释剂被定义为通常用来配制动物或人用药物组合物的水基载体。选择稀释剂使得其不影响人甲胎蛋白的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液、和Hank溶液。相同的稀释剂可以用来重构冻干的人甲胎蛋白。此外，药物组合物也可以包括其他医药剂、药物剂、载体、辅料、无毒、非治疗性、无免疫原性稳定剂等。这些稀释剂或载体的有效量将是可有效获得关于组分溶解性、生物活性等的药物可接受制剂的量。
本发明的组合物可以借助气溶胶化、喷雾化、肺部、胃肠道外或口腔施用以及其它系统性形式施用于人患者，用于因烟吸入和/或烧伤造成的急性肺损伤。
细菌表达 通过插入编码期望蛋白的结构DNA序列、以及以可操作性阅读框形式的合适的翻译起始和终止信号和功能性启动子，可以构建用于细菌的表达载体。载体将包含一个或更多表型选择标记和复制起始来保证载体的维持，如果需要，也提供在宿主中扩增。虽然其他也可以作为选择，但用于转化的合适原核宿主包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单孢菌、链霉菌和葡萄球菌属的多种物种。在一个优选实施方案中，原核宿主是大肠杆菌。
细菌载体可以是，例如，基于噬菌体、质粒或者粘粒。这些载体可以包含选择标记和细菌复制起始，它们可来自商品化质粒，其典型含有公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件。这样的商品载体包括，例如，GEM1(Promega Biotec，Madison，Wis.，USA)、pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pKK232-8、pDR540和pRIT5(Pharmacia)。根据本发明优选的载体是THE Pt7I表达载体。
这些“骨架”部分与适当的启动子和待表达结构序列组合。细菌启动子包括lac、T3、T7、lambda PR或PL、trp和ara。T7是一个优选的细菌启动子。
在转化适当的宿主菌株并且宿主菌株生长到适当的细胞密度后，经适当方法(例如，温度转换或者化学诱导)去抑制/诱导选定的启动子，继续培养细胞一段时间。典型地，通过离心、物理或化学方法破碎来收获细胞，所得粗提取物用于进一步纯化。
真核表达 多种哺乳动物细胞培养系统也可以用来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括选定的小鼠L细胞，如胸苷激酶阴性(TK)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶-阴性(APRT)的细胞。其他实例包括Gluzman，Cell 23175(1981)描述的COS-7猴肾成纤维细胞系和能表达相容载体的其它细胞系，比如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。特别地，对于酵母而言，可以提及酵母属Saccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Schwanniomyces或Hansenula。能用于本发明的真菌中，更特别地可以提及Aspergillus ssp或Trichoderma ssp。
哺乳动物表达载体将包含复制起始、合适的启动子和增强子，也可以包含任何必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′旁侧非转录序列。来自SV40病毒基因组的DNA序列，例如，SV40起始、早期启动子、增强子、剪接和多聚腺苷酸化位点可以用来提供需要的非转录遗传元件。
哺乳动物启动子包括β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸启动子。其他包括HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录酶病毒的LTR、和小鼠金属硫蛋白-1。哺乳动物载体的实例包括pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。在一个优选实施方案中，哺乳动物表达载体是pUCIG-MET。选择标记包括CAT(氯霉素转移酶)。
可用于本发明框架内的核酸序列可以用多种方法制备。一般地，它们可以通过按读码框组装编码多肽每个功能部分的序列来获得。后者可以靠本领域技术人员的技术分离出来，例如直接从细胞信使RNA(mRNA)中分离出来，或者从互补DNA(cDNA)文库中再次克隆，或者作为替代它们可以完全是合成的核苷酸序列。而且，可以知道，核苷酸序列也可以接着被修饰，例如，通过基因工程技术，以得到所述序列的衍生物或变体。
治疗性组合物 可以根据已知的制备药用组合物的方法来配制本发明蛋白质，由此本发明的分子或其功能性衍生物可以与药物接受载体混合。合适的载体以及它们的配方，包括其他人蛋白如人血清白蛋白，已经描述，例如，从而形成适于有效给药的药物可接受组合物，这种组合物将含有有效量的一或多种本发明蛋白质以及适量的载体。
根据本发明使用的药物组合物可以以常规方式用一或多种生理可接受载体或赋形剂配制。因此，双功能分子及其生理可接受的盐和溶剂化物溶剂可以配制成用于经吸入或吹入法(通过口或鼻)给药或经口、含服、胃肠道外或直肠给药。
对于口服给药，例如，药物组合物采用例如片剂或胶囊形式，它们可以经常规方法用药物接受的赋形剂制备，如粘合剂(如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(如月桂基硫酸钠)。片剂可以用本领域公知的方法包衣。例如，口服液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或悬液形式，或者它们可以干产品提供，使用前再用水或其它合适载体重构。这种液体制剂可以经常规方式用药物可接受添加剂来制备，如悬浮剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏油、油酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(如对羟基苯甲酸甲基或丙基酯或山梨酸)。制剂也可以含有适当的缓冲盐、呈味剂、着色剂和增甜剂。
口服制剂可以可以合适地配制成控制释放活性化合物。对于含服给药，组合物可以采取经常规方式配制的片剂或锭剂形式。
对于吸入给药，根据本发明使用的双功能分子可以方便地使用适当抛射剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾形式递送。对于压力气溶胶，剂量单位可以由提供计量定量的阀确定。胶囊和药筒(cartridges)，如由明胶制成用于吸入器或吹入器的，可以配制成含所述化合物和合适的粉末基如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本发明的双功能蛋白质可以配制成用于经注射进行胃肠道外给药，如用推注或连续输注。注射制剂可以含外加防腐剂的单位剂量形式提供，如在安瓿或多剂量容器中。组合物可以采用油或水载体的悬剂、溶液或乳液形式，可以含有剂型助剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。做为替代，活性组分可以是粉末形式，使用前用合适载体如无菌无热原水重构。
这些化合物也可以配制成直肠组合物，如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。
除了前面描述的剂型外，双功能分子也可以配制成贮库(depot)制剂。这种长效作用制剂可以经植入(如皮下或肌肉)或经肌肉注射给药。因此，例如，化合物可以与适当聚合物或疏水材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或配制成微溶性衍生物，如微溶性盐。
如果需要，组合物可以在包或分配器中提供，其可以含有一或更多含活性成分的单位剂量形式。所述包例如可以含有金属或塑料箔，如气泡包。所述包或分配器可以附带使用说明。
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权利要求
1.治疗对象中急性肺损伤的方法，包括
吸入施用治疗有效量的抗凝血酶III，从而治疗肺损伤。
2.权利要求1的方法，其中肺损伤是败血性急性肺损伤。
3.权利要求1的方法，其中肺损伤是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
4.权利要求1的方法，其中肺损伤士是对暴露于毒性剂的应答。
5.权利要求1的方法，其中毒性剂是肺炎假单胞菌。
6.权利要求1的方法，其中肺损伤是对一或多次烟和石棉的应答。
7.权利要求1的方法，其中抗凝血酶III用超声雾化器给药。
8.权利要求1的方法，其中抗凝血酶III是血浆来源的抗凝血酶III。
9.权利要求1的方法，其中抗凝血酶III是重组生产的抗凝血酶III。
10.权利要求9的方法，其中重组生产的抗凝血酶III是转基因生产的抗凝血酶III。
11.权利要求1的方法，其中向对象施用超过一个剂量的抗凝血酶III。
12.权利要求1的方法，其中抗凝血酶III以约10-300U/kg体重的剂量给药。
13.权利要求1的方法，其中抗凝血酶III以约25-125U/kg体重的剂量给药。
14.权利要求1的方法，其中肺损伤用ATIII和argatroban一起治疗。
15.权利要求1的方法，其中治疗的肺损伤由烟吸入引起。
16.权利要求1的方法，其中肺损伤由对肺的烧伤引起。
17.用含有蛋白质的组合物治疗人急性肺损伤的方法，所述蛋白质由包含ATIII的转基因DNA构建体编码。
18.用含有蛋白质的组合物治疗人急性肺损伤的方法，所述蛋白质由包含ATIII的转基因DNA构建体编码，改进包括用所述蛋白质的基本药物纯的组合物以及有效量argatroban治疗患者。
全文摘要
本发明特征在于通过经肺递送施用抗凝血酶III治疗具有肺疾病如肺炎症和损伤的对象。
文档编号A61K38/48GK1946419SQ20058000816
公开日2007年4月11日 申请日期2005年1月14日 优先权日2004年1月23日
发明者村上和纪, 佩伦雷·恩赫巴塔, 罗伯特·A·科克斯, 哈尔·A·霍金斯, 莉莲·D·特拉伯, 丹尼尔·L·特拉伯 申请人:Gtc生物治疗有限公司