专利名称：肿瘤的基因治疗，即利用编码免疫刺激性细胞因子的单链负链rna病毒载体进行的治疗的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及肿瘤的基因治疗，即利用编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体进行的治疗。
背景技术：
近年来，针对癌症利用免疫细胞因子的免疫疗法倍受关注。例如、对于包括外科手术、放射线治疗、以及化学疗法等在内的多种方法都不能治疗的恶性肿瘤之一—麦芽细胞肿瘤(Glioblastoma multiforme；GBM)(Shapiro，W.R.，Arch.Neurol.，56429-432，1999)，为了能够治疗该类恶性肿瘤，摸索了利用基因导入的治疗战略。(Ram，Z.et al.，Cancer Res.，5383-88，1993；Sampson，J.H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310399-10404，1996；Herrlinger，U.et al.，Cancer Gene Ther.，4345-352，1997；Seleh，M.et al.，J.Natl.Cancer Inst.，91438-445，1999；Giezeman-Smits，K.M.et al.，Cancer Res.，602449-2457，2000)。以在体内动物模型的研究结果为基础，发现有几种基因治疗战略很有前途，但是它们的治疗效果几乎在所有的情况下都收效甚微，主要是因为基因导入水平低而引起的。阻碍基因治疗适用成功的最大障碍是重组病毒载体不能扩散到整个肿瘤内部，以及在体内中的导入效率很低。(Ram，Z.et al.，Nat.Med.，31354-1361，1997)。为了发展基因治疗，有必要开发一种新的载体系统，该载体具有能够安全有效的将基因导入到靶细胞内的功能。
非专利文献1Shapiro，W.R.，Arch.Neurol.，56429-432，1999非专利文献2Ram，Z.et al.，Cancer Res.，5383-88，199非专利文献3Sampson，J.H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310399-10404，199非专利文献4Herrlinger，U.et al.，Cancer Gene Ther.，4345-352，199非专利文献5Seleh，M.et al.，J.Natl.Cancer Inst.，91438-445，1999
非专利文献6Giezeman-Smits，K.M.et al.，Cancer Res.，602449-2457，2000非专利文献7Ram，Z.et al.，Nat.Med.，31354-1361，199发明的公开本发明要解决的课题本发明以提供一种肿瘤处置方法为课题该处置方法包含利用编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体的方法。此外，本发明还以提供肿瘤处置用的组合物和试剂盒，以及其制造方法为课题该组合物和试剂盒包含编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体。
课题的解决手段单链负链RNA病毒是指以单链负链RNA为基因组的包被病毒，该病毒具有很高的感染性，并且具有在细胞质中高表达搭载基因的能力。近年来，随着对单链负链RNA病毒基因组进行分子生物学操作的发展，使将非病毒性基因附加地插入到病毒基因组内成为可能。并且，作为基因导入方法，使开发一种新型病毒载体成为可能(Bitzer，M.et al.，J.Gene Med，.5543-553，2003)。
单链负链RNA病毒的复制链是在细胞质中进行的，因此不会整合到感染细胞的基因组DNA中，从这点可以确保基因治疗临床应用方面的安全性问题。该病毒作为利用细胞培养生产重组治疗蛋白，或细胞因子或趋化因子的手段，在生产适于免疫基因治疗应用的适当的分泌蛋白质时是非常有用的。单链负链RNA病毒具有下述几项优点，(i)由于复制链是在细胞质中排他式进行的，所以没有整合入基因组DNA中的危险，(ii)导入效率不依赖于靶细胞的细胞周期，(iii)不会出现与不同的病毒基因组或者野生型病毒发生同源性重组现象，(iv)侵入细胞内部时，只需要极短的接触时间，(v)具有较广的宿主细胞域，并可在细胞内以较高强度且可调节式的表达病毒编码的基因。
本发明的发明者们为了验证通过使用单链负链RNA病毒载体进行细胞因子的基因导入来治疗肿瘤的基因治疗战略的可行性，将搭载有免疫刺激性细胞因子基因的SeV载体导入肿瘤内来检测其抗肿瘤效果。构筑搭载有免疫刺激性细胞因子之一的白细胞介素-2(IL-2)基因的SeV，将该SeV病毒载体给药到大鼠脑肿瘤模型的脳内时(I.C.)，发现通过SeV向肿瘤内部进行的细胞因子基因导入，可以显著抑制肿瘤的增殖。另外，把经照射的野生型9L细胞注射到末梢进行疫苗接种后，将IL-2表达SeV载体注入到固定的脑肿瘤时，发现肿瘤增殖明显减少，在被调查的10只大鼠中有3只的脑肿瘤消失了。在免疫组织化学解析中，经IL-2表达SeV载体处理的肿瘤，有较高水平的CD4+以及CD8+T细胞的浸润。如上所述，我们认为使用SeV载体向脑肿瘤进行基因导入，可以获得显著的治疗效果。将编码有免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体导入到肿瘤内的方法，可望成为对肿瘤进行治疗的新的基因治疗战略。
也就是说，本发明涉及利用编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体处置肿瘤的方法，以及涉及包含利用编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体处置肿瘤时的组合物及试剂盒等，在申请项的各项中，有更具体的记载。另外本发明还涉及在权利要求项的各项中记载的一个或者多个(或者全部)发明的所望组合而成的发明，特别是涉及引用同一独立项(关于在其他项中不包含记载的发明的项)的项(附属项)中记载的一个或者多个(或者全部)发明的所望组合而成的发明。各独立项记载的发明中，也有包括其附属项任意组合而成的发明。也就是说，本发明也包含以下发明。
〔1〕一种抗肿瘤处置方法，该方法包含将编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体，或导入该载体的细胞给药到肿瘤部位的步骤；〔2〕记载〔1〕中的方法，还包含使用肿瘤抗原或者该抗原表达载体进行免疫的步骤；〔3〕记载〔2〕中的方法，其中所述方法是将肿瘤抗原或者该抗原表达载体通过皮下接种进行免疫的方法；〔4〕记载〔2〕或〔3〕中的方法，其中所述肿瘤抗原是失去增殖能力的肿瘤细胞或者肿瘤细胞的溶解物；〔5〕记载〔1〕-〔4〕中任何一种方法，其中所述肿瘤为脑肿瘤；〔6〕记载〔1〕-〔4〕中任何一种方法，其中所述免疫刺激性细胞因子是白细胞介素-2；〔7〕一种抗肿瘤组合物，该组合物包含以编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体，或以导入该载体的细胞为有效成分；〔8〕记载〔7〕中的组合物，其中所述免疫刺激性细胞因子为白细胞介素-2；〔9〕一种抗肿瘤处置用试剂盒，该试剂盒包含(a)编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体，以及(b)肿瘤抗原或者表达该抗原的载体。
〔10〕记载〔9〕中的试剂盒，其中所述免疫刺激性细胞因子为白细胞介素-2。
发明效果根据本发明，已经证实单链负链RNA病毒载体可以向脑内肿瘤有效导入免疫刺激性细胞因子基因，同时还证实了I.C.给药编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体具有显著的抗神经胶肿瘤效果，特别是，与由肿瘤抗原进行免疫接种组合时，可以完全消除脑内固定肿瘤。如上所述，在神经胶肿瘤组织中适当分泌免疫刺激性细胞因子，在消除脑内固定肿瘤方面可以起到充分动员细胞杀伤性T细胞的作用，这在s.c.给药经照射的全肿瘤细胞疫苗进行免疫的动物实验中已做了报道。(Iwadate，Y.et al.，Cancer Res.，618769-8774，2001)。例如，即使处于免疫特权状态(immunologically privileged state)下，局部表达例如IL-2等具有趋化作用的分子，在有效促进效果细胞向肿瘤组织移动时，脑肿瘤可以具有全身性免疫的感受性(susceptible)。在本发明中，单链负链RNA病毒载体在神经胶肿瘤组织中，可以实质性的表达IL-2蛋白质。而IL-2蛋白质的局部浓度可以显著诱导免疫细胞，其结果达到了能抑制脑肿瘤增殖所必要的程度。如前所述，本发明的方法是特别有效于免疫特权状态下的脑内肿瘤的治疗手段。
附图简述
图1是对仙台病毒载体基因组构造模式的描述。表示了搭载有lacZ或者人IL-2基因的野生型SeV、和M及F基因两种基因缺失型SeV载体。将lacZ或者人IL-2基因的ORF片段，与SeV特异性转录调节信号序列的结束以及开始信号一起插入到3起始端′(ld)和NP基因之间。
图2是将lacZ-SeV/ΔMΔF载体in situ给药大鼠脑组织(上图)以及在脑内增殖7天的9L脑肿瘤(下图)的X-Gal染色图。载体给药后的第4、7、及14天后，进行了X-Gal染色(x200倍)。脑组织以及脑肿瘤，都在载体给药7天后观察到最大限度的β-半乳糖苷酶的表达或蓄积，该表达程度可持续到第14天。
图3是hIL2-SeV/ΔMΔF的i.c.给药，以及经照射9L细胞的s.c.免疫治疗的全9L脑肿瘤MRI图像(Gd-DTPA注入后的前头部的T1强调像)。白色区域是经Gd-DTPA强调的肿瘤部位。在组合治疗中，10只试验大鼠中有3只，在肿瘤细胞接种后第三周出现了脑内固定肿瘤，在第四周时该肿瘤被完全消除。(Rat#3，Rat#5，Rat#10)。
图4在肿瘤细胞接种后的第三周，使用Gd强调MRI对9L脑肿瘤平均体积进行了评价。和s.c.免疫组合进行hIL2-SeV/ΔMΔF的i.c.给药时(86.5±63.8mm3，n＝10)，与未处理时(286±51.2mm3，n＝10)，s.c.免疫单独使用时(197±48.9mm3，n＝10)、lacZ-SeV/ΔMΔF的i.c.给药和s.c.免疫组合时(233±73.2mm3，n＝6)或者hIL2-SeV/ΔMΔF的i.c.单独给药(256±53.2mm3，n＝6)时相比较，肿瘤显著缩小。各个横扛用平均±S.E表示。
图5是在第0天使用9L细胞进行i.c.接种，在第3天给药载体和/或用经照射肿瘤细胞进行免疫的大鼠的Kaplan-Meier生存曲线。未处置对照(白色圆形)、s.c.免疫单独处置(黑色圆形)、lacZ-SeV/ΔMΔF的i.c.给药和s.c.免疫(黒色三角)、hIL2-SeV/ΔMΔF单独i.c给药(白色三角)、hIL2-SeV/ΔMΔF的i.c.给药和s.c.免疫的组合(黒色四角)。根据log-rank test的统计分析结果，显示进行hIL2-SeV/ΔMΔF的i.c.给药和s.c.免疫处置的大鼠，与其他处置群相比，其生存时间被显著延长(p＜0.05)。
图6为9L脑肿瘤中IL-2表达的免疫组织化学分析结果。将hIL2-SeV/ΔMΔF i.c.给药到9L脑肿瘤中。A；x100倍、B；x200倍。IL-2蛋白质扩散表达。
图7为进行了lacZ-SeV/ΔMΔF的i.c.给药以及经照射的9L细胞的s.c.免疫，(A)hIL2-SeV/ΔMΔF的单独i.c.给药，(B)以及hIL2-SeV/ΔMΔF的i.c.给药和s.c.免疫的组合(C)处置的大鼠的CD4、CD8、以及NK细胞抗原表达的免疫组织化学分析结果。(倍率为200倍)。与用其他方法处置的肿瘤相比，在用SeV/IL-2载体i.c.给药以及经s.c.免疫处置的肿瘤内观察到了显著的CD4+T细胞以及CD8+T细胞的浸润。
本发明的的最佳实施例本发明是涉及包含将编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatorycytokines)的单链负链RNA病毒载体，或将导入该载体的细胞给药到肿瘤部位的步骤。搭载有免疫刺激性细胞因子基因的单链负链RNA病毒载体，在导入该载体的靶肿瘤内可诱导免疫应答，显著有效抑制肿瘤的增殖。这里所谓的抗肿瘤处置，是指对肿瘤的出现和/或增殖有抑制作用。也就是说，在肿瘤组织，或肿瘤可疑部位，或者曾经去除过肿瘤的部位，通过将编码免疫刺激性细胞因子(immunostimulatory cytokines)的单链负链RNA病毒载体，或者导入该载体的细胞进行局部给药，在给药部位诱导抗肿瘤免疫应答，可以抑制肿瘤的产生(包括再发)或者增殖(包括转移)。载体的导入，可以在体内或者回体方式进行。在体内给药时，可以将该载体直接注入到肿瘤部位；在回体给药时，首先将该载体在体外导入细胞内，然后将该细胞再注入到肿瘤部位。所谓肿瘤部位，是指肿其瘤本身，去除肿瘤的部位，或者其附近区域。这里的附近区域是指，从载体导入细胞中分泌出来的免疫刺激性细胞因子，可以到达的肿瘤或其除去部位的区域。优选离肿瘤或者肿瘤除去部位5mm以内、例如3mm以内、2mm以内、或者1mm以内。载体或者载体导入细胞可溶解或悬浮于所望承运体(例如，培养基、生理盐水、血液、血浆、血清、体液等所望的生理性水溶液)中，将其直接注入到肿瘤或其附近区域进行治疗。本发明的方法，使有效治疗和预防肿瘤成为可能。
使用简单的技术即可高效率地递送基因，是通过单链负链RNA病毒载体转导基因的重要优势之一。通过逆转录病毒载体等进行的基因转导，一般效率很低，在优化的基因转导中有必要对其进行离心和浓缩，但是离心操作经常使病毒滴度下降。另外，为了高效率地进行感染，有必要使用有毒性的药剂——聚乙烯布伦。(Bunnell，B.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，927739-7743；Chuck，A.S.，Hum.Gene Ther.，1996，7743-750；Chinnasamy，D.et al.，Blood 2000，961309-1316；Fehse，B.et al.，Br.J.Haematol.，1998，102566-574)。此外，对于回体给药方法，在细胞被感染后，需要进行细胞筛选的步骤，该细胞是转导了基因的细胞。与此相比，单链负链RNA病毒载体不需要特别的试剂，只要简单接触细胞即可达到更加有效的递送基因的目的。并且，其感染效率非常高，通常，在感染载体后不需要使用试剂进行基因转导细胞的筛选。进一步，通过单链负链RNA病毒载体递送基因时，在极短的细胞暴露时间里(30分以下)，即可达到最佳的转导效率。从临床方面考虑时，上述特征，可以使回体以及体内等的给药操作简单化，并使得由操作导致的细胞损伤等的不良影响被降到最低点。
在回体进行载体感染时，MOI(多重感染度；每个细胞的感染病毒数量)优选在1～500、更优选2～300、更优选法3～200，进一步优选5～100，最优选7～70。载体和靶细胞的接触时间即使很短也很充分，例如1分或以上、更优选3分或以上、5分或以上、10分或以上、或者20分或以上的接触时间、但是例如1～60分左右、更进一步5分～30分钟左右也可。当然，也可接触更久，例如几天或者更长时间也可。作为细胞，可以使用给药患者由来的细胞，例如优选使用来自患者的成纤维细胞的初代培养细胞。或者，也可利用变种(xenogeneic)细胞以及同种异系(allogeneic)细胞(Iwadate，Y.etal.，Cancer Res.，618769-8774，2001)。该变种(xenogeneic)或者同种异系(allogeneic)细胞，在回体注入后，可望被宿主的免疫反应排除。细胞在导入载体的前后，通过UV、X射线、或者gamma射线照射等使其分裂能力缺损之后，对肿瘤进行回体给药。
载体中搭载的免疫刺激性细胞因子，是指诱导免疫细胞分化和/或增殖的细胞因子，也可利用具有抗肿瘤作用的细胞因子。上述细胞因子，是从T细胞，NK细胞、单核细胞，吞噬细胞等中产生的，包括诱导T细胞分化和/或增殖的细胞因子等。免疫刺激性细胞因子基因，例如可以使用根据基因序列设计的引物，通过对从T细胞中提取的cDNA等进行PCR扩增而分离。具有抗肿瘤效果的细胞因子在同业者中是已知的，在本发明中，可以优选使用该等细胞因子。在本发明中，特别优选的免疫刺激性细胞因子，具体地，包括可使免疫系细胞游走以及粘附的白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-12(IL-12)、颗粒球集落刺激因子(GM-CSF)、以及白细胞介素-23(IL-23)等。另外、也可以利用Fas配体(Fas-L)。IL-2的cDNA例如在登录号NM 000586(protein ID NP 000577)、IL-4的cDNA例如在登录号M13982(protein ID AAA59149)、以及M23442(protein IDAAA59150)、IL-12(p35+p40)例如在AF180562(protein ID AAD56385)(p35)以及AF180563(protein ID AAD56386)(p40)、GM-CSF例如在M11220(protein ID AAA52578)、以及A14305(protein ID CAA01150)、IL-23(p19+p40)例如在AF301620(protein ID AAG37232)(p19)以及AF180563(与p40IL-12のp40相同)、Fas-L例如在D38122(protein ID BAA07320)中被描述。因此，在本发明中，也可将编码上述免疫刺激性细胞因子氨基酸序列的所望核酸整合到载体中使用。
据报道，上述细胞因子可引起免疫系细胞的游走以及粘附，特别是关于IL-2，IL-4，GM-CSF、在脑肿瘤动物模型中显示了有效性。(IL-2Iwadate，Y.et al.，Cancer Res.，618769-8774(2001)；IL-2，IL-4，GM-CSFSampson，J.H.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，10399-10404(1996)；GM-CSFHerrlinger，U.et al.，Cancer Gene Ther.4，345-352(1997)；IL-4Seleh，M.et al.，J.Natl.Cancer Inst.91，438-445，(1999)；IL-4Giezeman-Smits，K.M.et al.，Cancer Res.60，2449-2457(2000))。关于IL-23、在大脑的自我免疫疾患中，观察到了参与免疫系细胞游走的有力证据(Becher B.et al.，J Clin Invest.112(8)，1186-91(2000))。另外、关于Fas-L、显示其有趋化作用(Silvestris F et al.，Br J Haematol.122(1)39-52.(2003))。关于针对肿瘤IL-2等引起的免疫系统的活化、可以参照以下文献(Iwadate，Y.et al.(2000)Cancer Gene Ther.7，1263-1269；Iwadate，Y.et al.(2001)Cancer Res.61，8769-8774；Iwadate，Y.et al.(2002)Int.J.Mol.Med.10，741-747；Iwadate，Y.et al.(1997)Oncology(Basel)54，329-334；Iwadate，Y.et al.(2003)Int.J.Oncol.23，483-488)。
在本发明中使用的细胞因子，可以是来自人，也可以是来自其他的哺乳动物，例如，小白鼠、大鼠、兔子、猪、猴等灵长类动物。另外，本发明中的细胞因子，只要可维持其生物学活性，也可以包含天然细胞因子的异体。例如，N末端或者C末端的1～数个残基(例如2、3、4、5、或者6个残基)的氨基酸被缺失或者被附加的多肽，以及1～数个残基(例如2、3、4、5、或者6个残基)的氨基酸被置换的多肽等都可以使用。细胞因子的生物学活性，可以根据众所周知的细胞因子活性测试方法进行测定。或者，也可以根据在本说明书中记载的抑制肿瘤的测试方法进行测定。编码与天然细胞因子具有相同生物活性的这些异体的基因，根据本发明的方法，通过单链负链RNA病毒载体给药到肿瘤中，可望获得与天然细胞因子具有等同的抑制肿瘤增殖的抗肿瘤效果。天然细胞因子的异体，包括天然细胞因子的片断、结构类似物、派生体、以及与其他多肽融合的蛋白质(例如，具有异种信号肽的细胞因子、或者融合了抗体片断的多肽等等)。具体地，本发明使用的细胞因子，可以包括包含置换，缺失和/或附加于天然细胞因子或其片段内的一个或以上的氨基酸序列在内，与天然细胞因子具有相同生物活性的多肽。所谓片断，是指包括天然细胞因子多肽的一部分的多肽，例如包括N末端缺失体或者C末端缺失体。具有生物活性的细胞因子片断，通常包括天然多肽(分泌后的成熟型状态)70％或以上，优选80％或以上，更优选90％或以上的连续区域。
氨基酸序列的异体，可以通过例如在编码天然多肽的DNA中导入突变的方法来制备。(Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel et al.(1987)Methods Enzymol.154367-382；Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)；U.S.Pat.No.4,873,192)。作为不影响其生物活性进行置换氨基酸的指导原则，例如可以使用Dayhoff(Dayhoff et al.(1978)in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))等的。
对于被修饰的氨基酸数量并没有特别限制，例如天然成熟型多肽的全氨基酸序列的30％或以下，优选25％或以下，更优选20％或以下，更优选15％或以下，最优选10％或以下；例如，在15个氨基酸或以下，优选10个氨基酸或以下，更优选8个氨基酸或以下，更优选5个氨基酸或以下，最优选3个氨基酸或以下。在置换氨基酸时，通过置换侧链性质相似的氨基酸，可望维持其蛋白质活性。该置换在本发明中被称为保存置换。保存置换例如有，碱性氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酸)、非电荷极性氨基酸(例如赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如，丙氨酸、颉氨酸、白氨酸、异白氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫基丁氨酸、色氨酸)、β分支氨基酸(例如苏氨酸、颉氨酸、异白氨酸)、以及芳香族氨基酸(例如，酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等，可以在各组内部的氨基酸之间进行置换等。另外，例如，在BLOSUM62置换矩阵(S.Henikoff and J.G.Henikoff.1992，Proc.Acad.Natl.Sci.USA 8910915-10919)中、可以在有正值关系的氨基酸之间进行置换。
另外，在细胞因子异体中，例如包含与天然型多肽的氨基酸序列具有较高同源性的氨基酸序列的多肽。作为较高同源性是指，例如具有70％或以上，优选75％或以上，更优选80％或以上，更优选85％或以上，更优选90％或以上，更优选93％或以上，更优选95％或以上，最优选96％或以上的相同氨基酸序列。氨基酸序列的相同性，例如可以利用BLASTP程序(Altschul，S.F.et al.，1990，J.Mol.Biol.215403-410)来测定。例如NCBI(National Centerfor Biothchnology Information)的BLAST网页中，将包括Low complexity等所有过滤器关掉、使用默认参数进行检索。(Altschul，S.F.et al.(1993)NatureGenet.3266-272；Madden，T.L.et al.(1996)Meth.Enzymol.266131-141；Altschul，S.F.et al.(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402；Zhang，J.&Madden，T.L.(1997)Genome Res.7649-656)。例如利用BLAST 2 sequences程序(Tatiana A et al.(1999)FEMS Microbiol Lett.174247-250)制成两组序列的对比排列，然后就可以确定这些序列之间的同一性。对空隙的处理与对错配的处理相同。例如，计算所有天然型细胞因子(分泌后的成熟型状态)氨基酸序列的同一性数值。具体地，针对天然型细胞因子(分泌后的成熟型状态)的完整氨基酸数量，计算其中一致的氨基酸数量的比例。
另外，合适的异体，例如包含与天然细胞因子的基因编码区域的一部分或者全部，在严格条件下可杂交的核酸编码的多肽，与天然型细胞因子具有同等生物活性的多肽。在杂交时，例如包含从天然细胞因子基因的编码区域序列或其互补序列的核酸，或者从作为杂交对象核酸的任何一方来调制探针，通过检测其是否与另一方核酸杂交来进行鉴定。严格杂交条件，例如包括5xSSC、7％(W/V)SDS、100mg/ml变性鲑精DNA、5xDenhardt’s液(1xDenhardt’s溶液，其中含0.2％聚乙烯吡硌烷酮，0.2％牛血清白蛋白、以及0.2％Ficol)的溶液中、在60℃(优选65℃，更优选68℃)下进行杂交，其后在与杂交相同温度下，在2xSSC溶液中(优选1xSSC，更优选0.5xSSC，最优选0.1xSSC)振荡洗涤2小时。
本发明中使用的细胞因子，最优选为白细胞介素(IL)-2。IL-2作为IL-2受体(IL-2受体alpha、beta、以及gamma)的配体发挥作用，是调节T细胞的增殖以及分化的细胞因子(Kuziel，W.A.and Gree，W.C.(1991)，Interleukin-2，in The Cytokine Handbook，A.Thompson(Ed.)，San Diego，Calif，Academic Press，pages 83-102；Waldmann，T.A.，1993，Immunol.Today，14264)。IL-2主要通过CD4+T细胞产生、作为自我分泌型增殖因子发挥作用。IL-2还作用于包含CD4+以及CD8+两种细胞在内的其他T淋巴细胞。另外，IL-2还诱导使T细胞的包括辅助细胞以及细胞杀伤性细胞等亚群活化的局部炎症反应。IL-2还刺激自然杀伤(NK)细胞的增殖以及活化。经修饰的可表达IL-2的肿瘤细胞、刺激对肿瘤的免疫反应并抑制肿瘤的增殖。人IL-2(成熟型)cDNA的碱基序列的序列号如1，IL-2的氨基酸序列的序列号如2所示。在本发明中，优选使用编码序列号2中记载的氨基酸序列的基因。
另外，在本业者中已知许多具有生物活性的异体。在本发明中可以使用的IL-2的异体、例如也包含欧洲专利申请136,489，91,539，88,195，109,748，美国专利4,518,5844，588,584，4,752,585，4,931,543，5,206,344，国际专利申请WO 99/60128，特开昭61-78799，Wang，et al.Science(1984)2241431-1433内记载的异体。例如，包含使N末端的Ala缺失的IL-2片断，缺损了4个氨基酸的片断(特开昭60-126088)，缺损了羧基末端的片断(特开昭60-126088)，天然型分泌后的多肽的第125位半胱氨酸被丝氨酸或者丙氨酸等中性氨基酸置换的多肽(des-ala-1，ser-125 IL-2或者des-ala-1，ala-125 IL-2)美国专利4,518,584以及4,588,584)，104位的甲硫基丁氨酸被丙氨酸等中性氨基酸置换的多肽(des-ala-1，ala-104)等。另外，除此之外，还可以利用保持IL-2生物活性的所望异体。IL-2的生物活性，例如，可以通过使用众所周知的试验方法对IL-2依赖性细胞杀伤性T细胞或者辅助T细胞的增殖刺激能力进行测定来验证。(Gillis et al.，J.Immunol.(1978)1202027-2032；Watson，J.，J.exp.Med.(1979)15701510-1519)。
利用编码上述细胞因子的cDNA，构筑表达该细胞因子的重组负链RNA病毒。单链负链RNA病毒，是指包含以负链RNA(与编码病毒蛋白的(+)子链互补的(-)子链)为基因组的病毒。负链RNA(miners strand RNA)又称否定链RNA(Negative strand RNA)。在本发明中使用的负链RNA病毒，特别是指例如单链负链RNA病毒(也称非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。所谓「单链负链RNA病毒」，是指以单链负链[也就是负链]RNA为基因组的病毒。这样的病毒当中，包括属于副粘病毒科(包含副粘病毒属；副粘病毒，麻疹病毒属，腮腺炎病毒属，以及肺病毒属等)，棒状病毒科(包含弹状病毒属；水泡病毒属，狂犬病病毒属，以及Ephemerovirus属等)，费罗病毒科(Filoviridae)，正粘病毒科(包含正粘病毒属；流感病毒A，B，C，以及Thogoto-样病毒属等)，布尼亚病毒科(包含布尼亚病毒属；布尼亚病毒，亨德拉病毒属，内罗病毒属，以及白蛉热病毒属等)，沙粒病毒科(Arenaviridae)等科的病毒。
另外，所谓单链负链RNA病毒载体，是以单链负链RNA病毒为骨骼，将基因导入细胞内的载体。此处的[感染力]是指，单链负链RNA病毒载体具有细胞粘附能力，并在粘附后向细胞内部转导载体中所含的基因的能力。本发明的单链负链病毒载体，可以是具有传播能力，也可以是不具有传播能力的缺损型载体。所谓「具有传播能力」是指，病毒载体在感染宿主细胞后，在该细胞中可以复制病毒，并生产感染性病毒粒子的过程。
所谓重组病毒是指，通过重组多核苷酸构筑的病毒、或者该病毒的扩增产物。重组多核苷酸是指，两端或者一端和自然状态一样，没有结合的多核苷酸。具体地，重组多核苷酸是指，人为地改变(切割或/和结合)多核苷酸链的结合方式的多核苷酸。重组多核苷酸，可以通过组合使用多核苷酸合成、核酶处理、连接酶处理等，众所周知的基因重组方法来制备。重组病毒，使通过基因操作构筑的编码病毒基因组的多核苷酸表达，并使病毒再构筑而获得。例如，已知从编码病毒基因组的cDNA进行病毒再构筑的方法。(Y.Nagai，A.Kato，Microbiol.Immunol.，43，613-624(1999))。
本发明中的基因是指遗传物质，编码转录单位的核酸。基因可以是RNA，也可以是DNA。在本发明中，编码蛋白质的核酸被称为该蛋白质的基因。另外，一般来说，基因也可以不编码蛋白质，例如也可以利用编码核糖体或者反义链RNA等机能RNA的基因。基因通常是天然或者人工设计的序列。此外，在本发明中，「DNA」是包含单链DNA以及双链DNA。另外，所谓编码蛋白质是指、为使多核苷酸能够在适当的条件下表达该蛋白质，使其包含编码该蛋白质氨基酸序列的ORF的正义链或者反义链。
本发明中，优选的单链负链RNA病毒，例如可以是副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙台病毒(Sendai virus)，鸡新城疫病毒(Newcastledisease virus)，流行性腮腺炎病毒(Mumps virus)，麻疹病毒(Measles virus)，RS病毒(Respiratory syncytial virus)，牛疫病毒(rinderpest virus)，犬瘟热病毒(distemper virus)，猴副流感病毒(SV5)，人副流感病毒1，2，3型，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)，棒状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus)，狂犬病病毒(Rabies virus)等。
如果进一步举例说明本发明中可以利用的病毒，包含例如仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，犬瘟热病毒(PDV)，牛瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛疫病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，尼派病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，流行性腮腺炎病毒(Mumps)以及新城疫病病(NDV)等。更优选的例如，包含仙台病毒(SeV)，人副流感病毒1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，犬瘟热病毒(PDV)，牛瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛疫病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，以及尼派病毒(Nipah)等病毒。
优选属于副粘病毒亚科(包括肺呼吸病毒属，腮腺炎病毒属以及麻疹病毒属)的病毒或者其诱导体，更优选属于来呼吸道合胞病毒属(genusRespirovirus)(也称副粘病毒属(Paramyxovirus))的病毒或者其诱导体。在诱导体中，包含为了不损害病毒的基因导入能力而对病毒基因进行改变以及化学修饰的病毒等。可适用于本发明的呼吸道合胞病毒属的病毒，例如包含人流感病毒1型(HPIV-1)，人流感病毒3型(HPIV-3)，牛流感病毒3型(BPIV-3)，仙台病毒(也称Sendai virus；鼠流感病毒1型)，以及猴流感病毒10型(SPIV-10)等。在本发明中的副粘病毒，最优选的是仙台病毒。该病毒可来源于天然株，野生型株、变异株、实验室传代株、以及人为构筑的病毒株等。
单链负链RNA病毒载体，在其病毒基因组RNA中以反义编码搭载基因。所谓病毒基因组RNA，是指具有与单链负链RNA病毒的病毒蛋白质一起形成核糖核蛋白复合体(RNP)，并且通过该蛋白质表达基因组中的基因，同时该RNA还具有被复制后形成子RNP功能的RNA。一般来说，单链负链RNA病毒的基因组是由下述基本构造构成的，即在3′leader区域和5′trailer区域之间，病毒基因逐次以反义序列排列。在每个基因的ORF之间，有转录终结序列(E序列)-介入序列(I序列)-转录开始序列(S序列)存在，由此编码每个基因ORF的RNA可以分别作为顺反子被转录。本发明中的病毒包含的基因组RNA，通过由该RNA编码的基因群的表达以及RNA自身的自律性复制，以反义形式编码必要的病毒蛋白-N(病毒核蛋白)、P(磷脂酶小亚基)、以及L(磷脂酶大亚基)。另外，该基因组RNA可编码病毒粒子形成时所必要的M(基质蛋白)蛋白，也可以不编码。进一步地，该RNA可编码病毒粒子感染时必要的包被蛋白，也可以不编码。单链负链病毒的包被蛋白，包含例如使细胞膜融合的蛋白-F(融合蛋白)蛋白以及粘附于细胞所必需的HN(血凝素和神经氨酸酶)蛋白。但是，在有些细胞中，病毒感染时并不需要HN蛋白(Markwell，M.A.et al.，Proc.Natil.Acad.Sci.USA 82(4)978-982(1985))，而只有F蛋白即可进行感染。另外、也可以编码除了F和/或HN蛋白以外的病毒包被蛋白。如此，基因组RNA可以是将天然病毒基因组适当进行改变的RNA(WO00/70055，WO00/70070)。
本发明的单链负链RNA病毒，可以是例如由单链负链RNA病毒的基因组RNA和病毒蛋白质形成的复合体，即核糖核蛋白(RNP)。RNP可以通过与所望的转导试药一起导入到细胞中。该RNP、具体地，是包含例如单链负链RNA病毒的基因组RNA、N蛋白、P蛋白、以及L蛋白的复合体。RNP被导入细胞后、通过病毒蛋白的作用，从基因组RNA中转录编码病毒蛋白的顺反子的同时，基因组自身也被复制形成子RNP。关于基因组RNA的复制，针对该RNA的复制数量的增加，可以通过RT-PCR或者RNA点杂交等进行检测确认。
另外，本发明的单链负链RNA病毒，优选具有感染能力的单股负链RNA病毒粒子。所谓病毒粒子，是指通过病毒蛋白的作用从细胞中释放出来的包含核酸的微小粒子。所谓感染性，是指通过单链负链RNA病毒保持的对细胞的粘附能力以及细胞膜融合能力，可以把病毒内部的核酸导入到粘附着的细胞内部的能力。单链负链RNA病毒的病毒粒子，包含将基因组RNA和病毒蛋白的上述RNP由来自细胞膜的脂质膜(叫做包被)包被的构造。本发明中的单股负链RNA病毒，可以是具有传播能力，或者也可以是没有传播能力的缺损型病毒。所谓「具有传播能力」是指，病毒在感染宿主细胞时，在该细胞中病毒被复制，并生产感染性病毒粒子的过程。
例如，属于副粘病毒亚科的各病毒中的每个基因，一般情况下表示如下。并且，NP基因用″N″来表示。
呼吸道病毒属NPP/C/VMF HN-L
腮腺炎病毒属NPP/V MF HN(SH)L麻疹病毒属 NPP/C/VMF H -L例如，仙台病毒的每个基因的碱基序列的数据库的序号为关于NP基因M29343、M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046，X17218、关于P基因M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，X17008、关于M基因D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056、关于F基因D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，X02131、关于HN基因D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131、关于L基因，要参照D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，X58886。另外，例如编码其他病毒的病毒基因，关于N基因，CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；SeV，X00087；SV5，M81442；以及Tupaia，AF079780、关于P基因、CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X68311；SeV，M30202；SV5，AF052755；以及Tupaia，AF079780、关于C基因CDV，AF014953；DMV，Z47758；HPIV-1.M74081；HPIV-3，D00047；MV，ABO16162；RPV，X68311；SeV，AB005796；以及Tupaia，AF079780、关于M基因CDV，M12669；DMV Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z47977；PDV，X75717；RPV，M34018；SeV，U 31956；以及SV5，M 32248、关于F基因，CDV，M 21849；DMV，A J224704；HPN-1.M 22347；HPIV-2，M 60182；HPIV-3.X 05303，HPIV-4a，D 49821；HPIV-4b，D 49822；Mumps，D 86169；MV，A B003178；NDV，AF 048763；PDPR，Z 37017；PDV，AJ224706；RPV，M 21514；SeV，D 17334；以及SV5，AB 021962、关于HN(H或者G)基因CDV，AF112189；DMV，AJ 224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB 006954；Mumps，X 99040；MV，K 01711；NDV，AF 204872；PDPR，Z 81358；PDV，Z36979；RPV，AF 132934；SeV，U 06433；以及SV-5，S 76876。但是，已知关于每个病毒都有数个病毒株，根据毒株的不同，也存在除上述以外的序列组成的基因。
编码该等病毒蛋白的ORF以及外来基因的ORF，在基因组RNA中通过上述的E-I-S序列以反义形式被配置。在基因组RNA中，离3′距离最近的ORF仅在3′leader区域和该ORF之间需要配置S序列，E以及I序列都是没有必要的。另外，基因组RNA中离5′距离最近的ORF在5′trailer区域和该ORF之间，只需要有E序列即可，I以及S序列是没有必要的。另外在两个ORF之间，例如可以利用IRES等序列，将它们以同一顺反子进行转录。在该情况下，这两种ORF之间不需要E-I-S序列。例如，野生型副粘病毒，其典型的RNA基因组是继3′leader区域之后，以反义形式编码的N、P、M、F、HN、以及L蛋白等6种ORF被逐次排列，在其后面，有5′trilar末端区域。本发明的基因组RNA，病毒基因的配置可以不受上述限制，优选，与野生型病毒相同，继3′leader区域之后，使编码N、P、M、F、HN、以及L蛋白的ORF顺次排列，在其后，配置5′trailer区域。在某种特定病毒中，病毒基因与前述是不同的，在该情况下，也与上述方法相同，优选将各个病毒基因按与野生型同样进行配置。通常，保持N、P、以及L基因的载体在细胞内自律地从RNA基因组中表达基因，基因组RNA被复制。进而，通过F以及HN基因等编码包被蛋白的基因，以及M基因的作用，可以形成感染性病毒粒子，并被释放到细胞外。因此，该载体被称为具有传播能力的病毒载体。载体中搭载的细胞因子基因，如后所述，可以插入到该基因组的非蛋白编码区域中。
另外，本发明的单链负链RNA病毒，可以是缺损了任一的野生型病毒所含有基因的病毒。例如，非活化或者缺失了M、F、或者HN基因，或者它们的组合的病毒载体也可以优选用于本发明中。该病毒的再构筑，例如可以通过外来地供给缺损的基因产物来进行。如此制备出来的病毒，与野生型病毒一样，可以粘附于宿主细胞并引起细胞融合，但由于导入细胞内的病毒基因组缺损了病毒基因，所以不能形成与最初具有同样感染力的子病毒粒子。因此，作为仅具有一次性基因导入能力的较为安全的病毒载体是十分有用的。从基因组中缺损的基因，例如可以是F基因、HN基因、M基因、或者它们的任意组合。例如，表达缺损了F蛋白的重组单链负链RNA病毒基因组的质粒，通过与F蛋白的表达载体，以及与NP、P、以及L蛋白的表达载体同时转染宿主细胞，可以重新构筑重组病毒。(WO 00/70055，WO00/70070，WO 03/025570；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。另外，再如、也可以使用其染色体中整合了F基因的宿主细胞来制备病毒。在病毒生产细胞中表达的该等蛋白群，其氨基酸序列可以不是来自病毒序列其本身，但只要其核酸导入活性和天然型等同或更高，就可以导入变异，或者代用其他病毒的同源基因。
另外，本发明中使用的病毒载体，可以制备成包含与病毒基因组由来病毒包被蛋白不同来源的包被蛋白的重组病毒。例如，在病毒再构筑时，通过在细胞内表达作为基本骨骼的病毒基因组中编码的原有包被蛋白以外的包被蛋白，可以制备拥有所望的包被蛋白的重组病毒。对于上述的蛋白并没有特殊的限制。可以使用具有细胞感染能力的所望的蛋白。例如，其他病毒的包被蛋白，例如，水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可以来自任意的VSV株。例如，可以利用来自Indiana血清型株(J.Virology 39519-528(1981))的VSV-G蛋白，不限于此。另外，本发明的载体，可以包含来自其他病毒的包被蛋白的任意组合。例如，该蛋白优选，来自感染人细胞的病毒的包被蛋白。关于该蛋白，并没有特殊的限制，例如也可以是逆转录病毒中的双嗜性病毒包被蛋白。作为逆转录病毒的双嗜性病毒包被蛋白，例如可以使用来自鼠白血病病毒(MuLV)4070A株的包被蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10A1的包被蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux，R.K.et al.，J.Virol.705701-5705(1996))。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白、EB病毒的gp350，gp220蛋白。作为嗜肝DNA病毒科的蛋白，可以举出B型肝炎病毒的S蛋白等。该蛋白质也可以制成上述蛋白的细胞外领域与F蛋白或者HN蛋白的细胞内领域相结合的融合蛋白来使用。如此，本发明中使用的病毒载体可以是假型病毒载体，其包含如VSV-G蛋白等来自基因组由来病毒以外的病毒的包被蛋白。将病毒的基因组RNA，设计成不编码该等蛋白的基因组时，病毒粒子感染细胞后，不会从该病毒载体中表达上述蛋白。
另外，本发明中使用的病毒载体可以包含下列物质例如，包被表面上附有能与特定细胞粘附的粘附因子，配体，受体等蛋白质，抗体或其片断，或者在胞外区域拥有上述蛋白，在胞内区域拥有来自病毒包被的多肽的嵌合型蛋白等。据此，可以调节病毒载体的感染特异性。该等蛋白可由病毒基因组编码，也可以在病毒再构筑时，通过病毒基因组以外的基因(例如，其他的表达载体或者宿主染色体上等含有的基因)表达来提供。
另外，病毒载体，为了降低例如病毒蛋白质引起的免疫抗原性能，或者为了提高RNA的转录效率或者复制效率，包含在病毒内的任意病毒基因可以从野生型基因变化而来。具体地，例如改变复制因子——N、P、以及L遗传因子中的至少一个、来提高转录或者复制功能。另外，包被蛋白之一的HN蛋白质具有红血球凝集素——血凝(hemagglutinin)活性和神经氨酸酶(neuraminidase)活性两种活性，例如可以通过减弱前者的活性，来提高血液中病毒的安稳定性。也可以例如通过改变后者的活性来调节感染能力。另外，通过改变F蛋白，可以调节细胞膜的融合能力。另外，例如，解析容易成为细胞表面抗原分子的F蛋白和/或HN蛋白的抗原表位，利用这个可以制造减弱与这些蛋白相关的抗原提示能力的重组病毒媒介。
另外，单链负链RNA病毒载体的附属基因可以缺损。例如，通过敲除SeV的附属基因之一的V基因，培养细胞中的基因的表达以及复制并没有受到阻碍，小鼠等宿主的SeV的病原性显著减少(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.717266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；Curran，J.et al.，WO01/04272，EP1067179)。这种弱毒化的载体作为体内或者回体的低毒性基因导入用病毒载体，是非常有用的。
单链负链RNA病毒作为优异的基因导入的载体，仅在宿主细胞细胞质中进行转录/复制，由于没有DNA相，所以也不会发生向染色体组的整合现象。(integration)(Lamb，R.A.and Kolakofsky，D.，ParamyxoviridaeThe virusesand their replication.InFields BN，Knipe DM，Howley PM，(eds).Fields ofvirology.Vol.2.Lippincott-Raven PublishersPhiladelphia，1996，pp.1177-1204)。因此，不会在染色体组异常引起的的癌化以及不死化等现象的安全方面出现问题。单链负链RNA病毒的这些特征，大大地提高了将其载体化时的安全性。异种基因表达的结果中，例如，即使使仙台病毒(SeV)连续多代传代，碱基的变异也几乎不能得到确认，基因组的稳定性高，经过长时间的观察发现插入的异种基因很安定的事实。(Yu，D.et al.，GenesCells 2，457-466(1997))。另外，由于不存在粒子的构造蛋白，而具备了导入基因的大小或者粒子形成的弹性(flexibility)等性能上的优点。如此，单链负链RNA病毒载体可以作为人类的抗肿瘤基因治疗用的新型高效率载体而极为有用。具有传播能力的SeV载体，可以导入至少4kb的外来基因，通过附加转录单位，可以同时表达两种以上的基因。
另外，仙台病毒对于啮齿类来说具有病原性，会引起肺炎，但对人类来说没有病原性。因此，该观点支持通过将野生型仙台病毒经鼻给药到非人类灵长类中，没有显示出严重的有害作用的报告。(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15533-540，1997；Bitzer，M.et al.，J.Gene Med，.5543-553，2003)。仙台病毒的这些特征，使得仙台病毒载体可以应用到人类的治疗，由此，仙台病毒载体在以人类癌症为对象的基因治疗上，是很有前途的选择之一。
病毒载体在基因组RNA中编码细胞因子的基因。包含了细胞因子的重组病毒载体，是通过向上述病毒载体的基因组中插入细胞因子基因而得到的。细胞因子基因的插入位置可以选择，例如病毒基因组的蛋白质非编码区域的所望部位，例如可以向基因组RNA的3′leader区域和距离3′端最近的病毒蛋白质ORF之间，各个病毒蛋白质ORF之间，和/或距离5端最近的病毒蛋白质ORF和5′trailer区域之间插入。另外，缺损F或者HN基因等的基因组中，可以向缺损区域插入编码细胞因子的核酸。向副粘病毒导入外来基因时，插入到基因组的核苷酸片断的链长应该为六的倍数。(Journal of Virology，Vol.67，No.8，4822-4830，1993)。在插入的细胞因子基因和病毒ORF之间，应设计E-I-S序列。通过E-I-S序列，可以一前一后并列地插入2个或者2个以上的外来基因。
装载于载体的外来基因的表达水平，可以通过附加在基因上游(即单链负链(否定链)的3′的一边)的转录开始序列的种类来调节。(WO01/18223)。另外，可以通过基因组上的外来基因的插入位置来控制，插入部位离单链负链的3′端越近其表达水平就越高，插入部位离5′端越近其表达水平也越低。如此，为了获得所望的基因表达量，并且为了使该基因与其前后的编码病毒蛋白的基因的组合变得最适合，对外来基因的插入位置可以进行适当地调节。一般认为取得较高水平的外来基因的表达是有利的，因此，将外来基因与效率高的转录开始序列连结后，插入到单链负链基因组的3端是最适合的。具体地，插入到3′leader区域和距离3′端最近的病毒蛋白质ORF之间。或者，可以插入到距离3′端最近的病毒蛋白质基因和第二近的病毒蛋白质基因之间，或者从3′端到第二及第三近的病毒基因之间。野生型副粘病毒中，距离基因组的3′端最近的病毒蛋白质基因是N基因，第二近的基因是P基因，第三近的基因是M基因。反过来说，不希望导入基因高表达时，例如，也可以通过把外来基因的插入位置设定在单链负链染色体组尽量靠近5′端的一侧，把转录开始序列设定成效率较低的等，将其在病毒载体中的表达抑制在很低的水平，以达到最恰当的效果。
当把编码外来基因的核酸插入基因组中时，作为附加的S序列，例如可以使用单链负链的所望的S序列，如果是仙台病毒，优选使用3′-UCCCWVUUWC-5′(W＝A或者C；V＝A，C，或者G)(序列序号3)的排列。特别是，可以优选3′-UCCCAGUUUC-5′(序列序号4)，3′-UCCCACUUAC-5′(序列序号5)、以及3′-UCCCACUUUC-5′(序列序号6)。如果将这些序列用正链编码的DNA序列来表时，分别为5′-AGGGTCAAAG-3′(序列序号7)，5′-AGGGTGAATG-3′(序列序号8)，以及5′-AGGGTGAAAG-3′(序列序号9)。作为仙台病毒载体的E序列，例如3′-AUUCUUUUU-5′(序列序号10)(在正链编码的DNA中，最优选5′-TAAGAAAAA-3′(序列序号11))。I序列是例如任意的3种碱基，具体地，优选使用3′-GAA-5′(正链DNA中是5′-CTT-3′)。
为了制备单链负链病毒载体，在哺乳动物细胞中，在包含单链负链RNA病毒基因组RNA的RNP再构成时所必需的病毒蛋白质，即在N、P、以及L蛋白质存在的情况下，使编码单链负链RNA病毒的基因组RNA的cDNA得到转录。可以通过转录生成单链负链基因组(也就是与基因组相同的反义链)，或者可以生成单链正链(反义基因组，基因组RNA的互补链)，进行病毒RNP的再构成。为了提高载体的再构成效率，优选生成单链正链。RNA末端应与天然的病毒基因组相同，尽量正确地反映3′leader序列和5′trilar序列的末端。为了正确地控制转录产物的5′端，例如作为转录开始部位，利用T7 RNA转录酶识别序列，可以在细胞内表达该转录酶。为了控制转录产物的3′端、例如在转录产物的3′端事先编码自我切割型酶性核酸(核酶，ribozyme)、通过该核酶(ribozyme)可以正确地切割出3′末端(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997、Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587以及Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466)。核酶，可以使用来自三角洲肝炎病毒的反义链(antigenomic strand)的核酶(ribozyme)。
例如重组仙台病毒，依照Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997、Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587以及Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466的记载，可以进行如下构筑。
首先，准备包含目标外来基因cDNA碱基序列的DNA试料。DNA试料在25ng/ml以上浓度时，可以通过电泳来确认其为单一的质粒。下面，以利用NotI部位，向编码病毒基因组RNA的DNA中插入外来基因来说明如何构建。在目标cDNA碱基序列中含有NotI识别序列时，优选事先通过利用部位特异性变异导入法等，另外还要不使编码的氨基酸序列发生变化的前提下改变碱基序列来除去NotI部位。从该材料中，通过PCR对目标基因片断进行扩增来回收。通过在两个引物的5′端中事先附加上NotI序列，使被扩增的片断的两端具有NotI序列。并且，在被插入到病毒基因组上后的外来基因的ORF和其两侧的病毒基因的ORF之间，配置有E-I-S序列，使引物中包含E-I-S序列。合成的DNA长度，其碱基序列数量应设计为包含附加了的E-I-S序列在内的最终插入片断的链长为六的倍数。(所谓「六的规则(rule of six)」；Kolakofski，D.et al.，J.Virol.72891-899，1998；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993)。E-I-S序列，例如在插入片断的核苷酸DNA的3′端，仙台病毒的单链负链的S序列、I序列、以及E序列、例如可以分别使用为5′-CTTTCACCCT-3′(序列序号12)、5′-AAG-3′、以及5′-TTTTTCTTACTACGG-3′(序列序号13)。
PCR，通常可以使用Taq合成酶或者其他的DNA合成酶等。扩增了的目标片断被NotI消化后，插入到pBluescript等质粒载体的NotI部位。用测序仪确认得到的PCR产物的碱基序列后，选择序列正确的质粒。从该质粒中使用NotI切出该插入片断后，将其插入到包含基因组cDNA的质粒的NotI部位进行克隆。另外，也可以不通过质粒载体直接插入到基因组cDNA的NotI部位，来获取重组仙台病毒cDNA。
例如，如果是重组仙台病毒基因组cDNA，可以按照文献记载的方法进行构筑。(Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466，1997；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997)。例如，在外来基因的正义链3′端，合成连接有E-I-S序列的双链DNA。把该DNA插入到编码基因组单链正链的cDNA的所望的S序列的3′端即可。例如，在编码单链正链基因组的cDNA中，在所望的病毒蛋白编码序列和其转录S序列之间，事先制备限制酶识别序列(例如NotI识别序列)，通过利用限制酶识别部位，将编码外来基因-E-I-S序列的DNA插入到指定部位(Tokusumi，T.et al.(2002)Virus Res 86(1-2)，33-8)。
如上所述，在病毒蛋白质(L、P、以及N)存在的条件下，通过在细胞内转录编码病毒基因组RNA的DNA，可以对病毒载体进行再构筑。重组病毒的再构筑可以利用众所周知的方法进行。(WO97/16539；WO97/16538；WO03/025570；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.134195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.145773-5784；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.et al.，1996，GenesCells 1569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404)。通过上述方法，可以使包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛疫病毒(rinderpest virus)、仙台病毒等在内的单链负链RNA病毒从DNA再构筑。按照该等方法，可以对本发明的病毒进行再构筑。但在编码病毒基因组的DNA中缺损了F基因、HN基因、和/或M基因时，不会形成感染性的病毒粒子。另一方面，在宿主细胞中导入并使这些缺损了的基因和/或编码其他病毒包膜蛋白的基因等进行表达，可以形成具有感染性的病毒粒子。(Hirata，T.et al.，2002，J.Virol.Methods，104125-133；Inoue，M.et al.，2003，J.Virol.776419-6429)。在抗肿瘤试剂的制备上，本発明涉及编码免疫刺激细胞因子的单链负链RNA病毒载体的应用。另外，本发明还涉及在抗肿瘤试剂的制备上，编码免疫刺激细胞因子的单链负链RNA病毒的病毒基因组RNA或者编码互补与RNA的DNA的应用。本发明的抗肿瘤试剂被用做肿瘤的预防和/或治疗用的医药试剂。
具体制备程序为，(a)使编码单链负链RNA病毒基因组RNA(单股负链RNA)或者其互补链(单链正链)DNA在表达N、P、以及L蛋白质的细胞中进行转录的步骤，(b)从该细胞或者其培养上清中，对包含该基因组RNA的复合体进行回收的步骤。为了进行转录、将编码基因组RNA的DNA连接到适宜的启动子的下游。被转录的基因组RNA在N、L、以及P蛋白存在的条件下，被复制，形成包含该等蛋白质的RNP复合体。之后，在M、HN、以及F蛋白存在的条件下，形成被包膜包围的病毒粒子。编码基因组RNA的DNA，例如与T7启动子的下游连结，通过T7 RNA合成酶转录成RNA。作为启动子，除了包含T7合成酶的识别序列以外，还可以利用所望的各种启动子。或者，可以将在试管内转录合成的RNA向细胞转染来制备。
来自DNA的基因组RNA的转录，最初需要T7 RNA合成酶等，可以通过导入表达该合成酶的质粒或者病毒载体来供给，或者，例如，为了诱导表达，可以事先将其导入细胞染色体中，通过在病毒再构筑时进行诱导表达来供给。另外，基因组RNA，以及病毒再构筑时必要的病毒蛋白质，通过例如导入表达它们的质粒来供给。
为了向细胞内导入表达基因组RNA的DNA，可以使用例如，磷酸钙法(Graham，F.L.and Van Der Eb，J.，1973，Virology 52456；Wigler，M.andSilverstein，S.，1977，Cell 11223)、各种转染试剂的方法，或者电气穿孔法等。关于磷酸钙法，例如可以按照Chen以及Okayama(Chen，C.and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.72745)、在2-4％CO2、35度、15-24小时、沉淀混合液体中的DNA浓度为20-30mg/ml的条件下实施。关于转染试剂，可以使用DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885 M.W.5×105)、DOTMA(Roche)、SuperfectTM(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)等方法。为了防止转染试剂和DNA的复合体在核内体中被分解，可以加入氯奎(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。另外，电气穿孔法在没有细胞选择性这点上具有很广泛的应用性，可以通过优化脉冲电流的持续时间，脉冲的形状，电场(电极间的差、电压)的强度，缓冲液的导电率，DNA的浓度，细胞的密度来使用。向细胞内转导载体再构筑用DNA时，出于操作简便而且为了便于可以利用数量较多的细胞对多数的检体进行检查，使用转染试剂的方法是最合适的。优选，SuperfectTMTransfection Ragent(QIAGEN，Cat No.301305)、或者DOSPER LiposomalTransfection Reagent(Roche，Cat No.1811169)可以使用，但不限制此。
来自cDNA的病毒再构筑，具体地可以按如下方法进行。
在24孔到6孔的多孔培养皿或者100mm培养皿等中，利用含有10％牛胎儿血清(FCS)以及抗生物质(100U/ml青霉素G以及100mg/ml链霉素)的最少需要培养基(MEM)，把来自猴肾的细胞株LLC-MK2(ATCC CCL-7)培养至满底，例如在1mg/ml补骨脂素(psoralen)存在的条件下，用紫外线(UV)照射处理20分，使2PFU/细胞感染的表达T7RNA合成酶的重组痘病毒vTF7-3失活(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126，1986、Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579，1996)。补骨脂素(psoralen)的添加量以及UV照射时间都可以进行适当地调整。感染1小时后，将2-60mg，更优选3-20mg的编码重组仙台病毒基因组RNA的DNA与病毒RNP生成时必要的编码病毒蛋白的质粒(0.5-24mg的pGEM-N、0.25-12mg的pGEM-P、以及0.5-24mgのpGEM-L)(Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579，1996)一起，通过使用Superfect(QIAGEN社)的lipofectin法等进行转染。使编码N、P、以及L蛋白的表达质粒的量比为，优选例如2∶1∶2，质粒的量为例如，在1-4mgのpGEM-N、0.5-2mgのpGEM-P、以及1-4mg的pGEM-L左右进行适当调整。
转染了的细胞，可以根据需要，使用100mg/ml的利福平(rifampicin)(Sigma)以及阿糖胞苷(AraC)、或者更优选在仅含有40mg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，不含血清的MEM中培养，为了将由痘病毒引起的细胞毒性控制到最低，使病毒的回收率最大化，来设定药剂的最适合的浓度(Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1569-579)。转染后培养48-72时間左右后，回收细胞，进行反复三次的冻结融解，破坏细胞后，把含有RNP的破碎物添加到LLC-MK2细胞中，再一次进行转染，培养。或者，回收培养上清后添加到LLC-MK2细胞的培养液中，进行感染，培养。转染，例如可以与Lipofectamine或者多聚阳性脂质体(polycationic liposome)等一起形成复合体，导入细胞。具体地，可以利用各种转染试剂。例如，DOTMA(Roche)、SuperfectTM(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche #1811169)等。为了防止在核内体(endosome)中被分解，可以加入氯喹(chloroquine)(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。在RNP被导入的细胞中，进行RNP中的病毒基因的表达以及RNP的复制过程，由此病毒被增幅。通过将稀释得到的病毒溶液(培养上清)(例如106倍)反复进行再增幅，可以完全除去痘病毒vTF7-3。再增幅，例如可以反复进行三次以上。得到的载体可以在-80度下保存。为了再构筑缺损了编码包膜蛋白质的基因的没有传播能力的病毒，可以利用表达包膜蛋白质的LLC-MK2细胞，或者与包膜表达质粒一起转染为好。另外，对进行了转染的细胞，通过与表达包膜蛋白质的LLC-MK2细胞进行覆层培养，可以使包膜基因缺损型病毒得到增幅。(参照国际公开序号WO00/70055以及WO00/70070)。
回收了的病毒的力价，例如，可以通过CIU(Cell-Infected Unit)测定或者红血球凝集活性(HA)的测定来决定(WO00/70070；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1569-579；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virusof Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306，1999)。另外，关于搭载了GFP(绿色荧光蛋白质)等标记基因的载体可以通过直接记数感染细胞来定量力价(例如作为GFP-CIU)。这样测定出来的力价可以和CIU同等对待(WO00/70070)。
病毒再构筑时，对于再构筑用宿主细胞没有特别的限制。例如，在仙台病毒载体等的再构筑中，可以使用来自猴肾脏的LLC-MK2细胞以及CV-1细胞、来自田鼠肾脏的BHK细胞等培养细胞、和来自人的细胞等细胞。通过使上述细胞表达适当的包膜蛋白，可以获得包含该蛋白的感染性病毒粒子。另外，为了大量地获取仙台病毒载体，使从上述宿主中得到的病毒载体在发育鸡卵中进行感染，可以使载体增幅。使用鸡卵的病毒载体的制造方法已经被开发(中西等人编，(1993)，「神经科学研究的先进技术议定书III，分子神经细胞生理学」，卫生社，大阪，pp.153-172)。具体地，例如，把受精卵放入培养器中，在37-38度的温度下，培养9-12天，使胚胎成长。然后，将病毒载体向尿膜腔中接种后，培养卵(例如三天时间)，使病毒载体繁殖。培养时间等的条件，可以根据重组仙台病毒的不同而不同。其后，回收含有病毒的尿液。尿液中的仙台病毒载体的分离/精制等可以按照通常方法进行。(田代真人，「病毒实验议定书」，永井、石滨监修，medicalview社，pp.68-73，(1995))。
例如，缺损了F基因的仙台病毒载体的构筑和调制可以按照如下方法进行(参照WO00/70055以及WO00/70070)。
<1>F基因缺损型仙台病毒基因组cDNA以及F表达质粒的构筑将仙台病毒(SeV)全长基因组cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 782813-2820)(「pSeV18+b(+)」也叫做「pSeV18+」)的cDNA在SphI/KpnI中消化，回收片断(14673bp)，在pUC18中进行克隆，作为质粒pUC18/KS。F基因缺损部位的构筑在上述的pUC18/KS上进行。F基因的缺损通过PCR-连接酶法的组合来进行，除去F基因的ORF(ATG-TGA＝1698bp)，例如，在atgcatgccggcagatga(序列序号14)进行连结，构筑F基因缺损型SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔF)。由F基因的上游[forward5′-gttgagtactgcaagagc/序列序号15，reverse5′-ttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/序列序号16]，F基因的下游[forward5′-atgcatgccggcagatga/序列序号17，reverse5′-tgggtgaatgagagaatcagc/序列序号18]的引物对扩增的PCR产物在EcoT22I中进行连结。由此获得的质粒用SacI和SalI进行消化后，回收包含F基因缺损部位区域的片断(4931bp)，在pUC18中进行克隆，作为pUC18/dFSS。然后，pUC18/dFSS在DraIII中进行消化，回收片断，与包含pSeV18+的F基因的区域的DraIII片断进行置换，连接，得到质粒pSeV18+/ΔF。外来基因，插入到例如pUC18/dFSS的F基因缺损部位上的限制酶Nsil以及NgoMIV部位上。为此，例如，可以把外来基因片断在以NsiI识别序列为末端的引物以及以NgoMIV识别序列为末端的引物对中进行增幅。
<2>诱导表达SeV-F蛋白的辅助细胞的制作如下构筑表达仙台病毒的F基因(SeV-F)的Cre/loxP诱导型表达质粒把SeV-F基因在PCR中进行扩增，然后插入到通过Cre DNA重组酶而使基因产物被诱导表达而设计的质粒pCALNdlw(Arai，T.et al.，J.Virology 72，1998，p1115-1121)的特异性SwaI部位，构筑质粒pCALNdLw/F。
为了从F基因缺损基因组回收感染病毒粒子，建立了表达SeV-F蛋白的辅助细胞株。细胞，例如，可以使用常用于SeV繁殖的来自猴肾脏的细胞株LLC-MK2细胞。LLC-MK2细胞在添加了10％左右热处理的不动化牛胎儿血清(FBS)、青霉素G钠50单位/ml，以及链霉素50mg/ml的MEM中，在37度，5％CO2下进行培养。由于SeV-F基因具有细胞破坏性，使用通过CreDNA重组酶诱导表达F基因产物而设计的上述质粒pCALNdLw/F。通过磷酸钙法(mammalian transfection kit(Stratagene))，SeV-F基因产物按照众所周知的操作规程对LLC-MK2细胞进行基因导入。
用10cm培养皿培养LLC-MK2细胞直到长满底至40％，导入10mg的质粒pCALNdLw/F后，在含有10ml的10％FBS的MEM培养基中，在37度的5％CO2的保温容器中，培养24小时。24小时后，剥离细胞，悬浮于10ml的培养基中，用5个10cm的浅底培养皿，5ml的1个，2ml的2个，0.2ml的2个顺次排开，在10ml含有1200mg/ml的G418(GIBCO-BRL)，和10％FBS的MEM培养基中进行培养，每2天交换1次培养基，持续培养14天后，进行基因稳定导入株的选择。对于在该培养基中生长出来的对G418表现有抗性的细胞克隆进行回收。回收了的各个克隆物在10cm的培养皿上继续扩大培养，直到长满底。
F蛋白的诱导表达是使细胞在6cm的浅底培养皿中长满底后，通过将腺病毒AxCANCre按照齐藤等人的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121(1998))例如以moi＝3进行感染获得。
<3>F基因缺损型SeV病毒的再构筑以及增幅将上述插入了外来基因的pSeV18+/ΔF的质粒按照如下方法转染到LLC-MK2细胞中。将LLC-MK2细胞以5×106cells/皿的浓度铺于100mm平板上。利用T7 RNA转录酶进行基因组RNA转录时，细胞培养24小时后，用MOI2左右的用补骨脂素(psoralen)和长波长紫外线(365nm)处理20分钟后的表达T7RNA转录酶的重组痘病毒(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))，在室温下进行1小时的感染。对痘病毒的紫外线照射，例如可以使用15个瓦特电子管中有5个电子管安装有UV Stratalinker 2400(目录序号400676(100V)，Stratagene社，La Jolla，CA，USA)。将细胞用不含血清的MEM洗净后，将表达基因组RNA的质粒、以及分别表达单链负链RNA病毒的N、P、L、F、以及表达HN蛋白质的质粒用适当的转染药剂对该细胞中进行转染。对于质粒的数量比并没有特殊限制，但最优选的比例按顺序为6∶2∶1∶2∶2∶2。例如，将表达基因组RNA的质粒、N、P、L、以及表达F加上HN蛋白质的表达质粒(pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L以及pGEM/F-HN；WO00/70070，Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))分别以12mg，4mg，2mg，4mg以及4m/皿的量比进行转染。经过数小时的培养后，在不含血清的MEM中反复两次清洗细胞后，在含有40mg/mL的阿糖胞苷(AraCSigma，St.Louis，MO)以及7.5mg/ml的胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中进行培养。细胞回收后，将沉淀物质悬浮于OptiMEM中(107细胞/ml)。反复三次进行冻结融解，与lipofection试剂DOSPER(Roche #1811169)混合，(106cells/25 micro-lDOSPER)在室温下放置15分钟后，在上述克隆的表达细胞中进行转染(106细胞/孔，12孔平板培养皿)，在不含血清的MEM(含有40mg/ml AraC，7.5mg/ml的胰蛋白酶)中培养，回收上清。F以外的基因，例如缺损HN或者M基因的病毒也可以相同的方法调制。
F基因的缺失或者HN基因的缺失使SeV载体不具备传播性，另外，M基因缺失在抑制感染细胞中的粒子形成方面很有效。另外，缺损F、HN、以及M的至少两个基因的任意组合的载体，其安全性更能得到保障。例如，缺失了M以及F基因的SeV(SeV/ΔMΔF)是没有传播性并且不形成病毒粒子的载体。SeV/ΔMΔF在体外以及体内，都保持了较高水平的感染性以及基因表达能力，该水平同野生型SeV载体具有相同的水平。SeV/ΔMΔF的这些特征为SeV在抗肿瘤处置应用的安全性问题上提供了更进一步的保障。
在调制病毒基因缺损型载体时，例如，对于不包含在载体里的病毒基因组上的缺损了的病毒基因，通过同时将两种或者两种以上的载体向同一细胞进行导入，分别从不同的载体上表达缺损了的病毒蛋白来进行供给，互补形成具有感染力的病毒粒子，复制循环运转，病毒载体被增幅。也就是说，把两种或者两种以上的本发明的病毒载体以病毒蛋白互补的方式组合转染的话，就可以大批量并且低成本的生产各个病毒基因缺损型病毒载体的混合物。这些病毒由于缺损了病毒基因，与不缺损病毒基因的病毒相比，基因组的大小偏小，可以搭载较大的外来基因。另外，根据病毒基因的缺损，这些没有繁殖能力的病毒在细胞外部被稀释后，保持共感染的难度很大，也就是说具有不稔性，在环境投放管理上占优势。
如果按照本说明书中记载的病毒制备方法，本发明的病毒载体，例如可以1×105CIU/ml或以上、优选1×106CIU/ml或以上、更优选5×106CIU/ml或以上、更优选1×107CIU/ml或以上、更优选5×107CIU/ml或以上、更优选1×108CIU/ml或以上、最优选5×108CIU/ml或以上的力价释放到产生病毒细胞的细胞外液中。病毒的力价可以根据本说明书以及其他记载的方法来测定。(Kiyotani，K.et al.，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)。
为了使回收的病毒载体达到基本纯，可以对其进行纯化。纯化方法包括过滤，离心分离，吸附，以及柱层吸纯化等众所周知的纯化/分离方法，或者通过上述任意的组合来进行。所谓「基本纯」是指在包含病毒载体的溶液中，该病毒为主要成分。例如，基本纯的病毒载体组成物质，在其包含溶液的全蛋白质中，(但是要去除作为稳定剂添加的蛋白质)病毒载体蛋白质的比例为10％或以上(重量/重量)、优选20％或以上、更优选50％或以上、更优选70％或以上、更优选80％或以上、更优选90％或以上。例如，副粘病毒载体，作为具体的纯化方法，例如可以使用纤维素硫酸酯或者架桥多糖硫酸酯的方法(特公昭62-30752号公报、特公昭62-33879号公报、以及特公昭62-30753号公报)、以及褐藻多糖硫酸酯和/或吸附其分解物质的方法(WO97/32010)等，但不限于此。
在制备含有本发明的病毒载体的组成物质时，载体可以根据需要在药理学容许的范围内与承运体或者溶媒组合。所谓「药理学容许范围内的承运体或者溶媒」，是指可以与载体一起给药，不会有意阻碍由载体介导的基因导入的材料。作为这样的承运体或者溶媒、例如可以使用灭菌水，氯化钠溶液，葡萄糖溶液，葡萄糖以及氯化钠、含乳酸的林格氏溶液、培养基、血清、磷酸盐缓冲液(PBS)等，把它们与载体按适宜比例混合制成制剂。另外，本发明的组成物质可以包含脱离子水、葡萄糖水溶液等的承运体或者溶媒。另外，可以包含核糖体的膜稳定剂(例如，胆固醇等固醇类)。另外，可以包含抗酸化剂(例如，维生素或者维生素E等)。进一步地，可以包含其他的植物油，悬浮剂，界面活性剂，稳定剂，消毒剂等药剂。另外，也可以添加保鲜剂和其他添加剂。本发明的组成物，通常是以水溶液、胶囊、悬浮液、糖浆等的形态存在。另外，本发明的组成溶液也可以是冻干剂，或者空气溶胶形态的组成物，作为稳定剂可以包含山梨糖醇，蔗糖，氨基酸以及各种蛋白质等。本发明是与包含编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体的抗肿瘤制剂有关的。另外，本发明是与包含编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体被导入的细胞的抗肿瘤制剂有关的。本发明的包含载体的组合物以及本发明的载体导入细胞作为抗肿瘤药剂是很有用的。另外，本发明的载体组成物以及本发明的载体导入的细胞作为抗肿瘤疫苗是很有用的。为了提高抗原性，载体组成物以及细胞可以添加细胞因子、霍乱毒素、沙门氏菌毒素等。另外疫苗可以由明矾、不完全Freund′s乳化剂、MF59(油乳浊液)、MTP-PE(来自细胞壁的胞壁酰三肽，muramyl tripeptide)、以及QS-21(来自soapbark tree Quilaja saponaria)等的乳化剂组合而成。
另外、给药组成物或者细胞时，组合提高佐剂效果的细胞因子是很有效的。作为这种基因，例如i)单链IL-12(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15)8591-8596，1999)、ii)干扰素-gamma(美国专利第5,798,100号)、iii)颗粒球集落刺激因子(GM-CSF)、iv)GM-CSF和IL-4的组合(J.Neurosurgery90(6)，1115-1124(1999))等。
单链负链RNA病毒载体的体内的给药量因疾患、患者的体重、年龄、性别、症状、给药组合物的形态、给药方法、导入基因等不同而不同，如果是本业者，可以根据实际进行适当的调整。给药途径可以进行适当的选择，例如利用注射器或者导管向肿瘤注射。被给药的载体优选浓度大约为105CIU/ml-1011CIU/ml、更优选107CIU/ml-109CIU/ml、最优选1×108CIU/ml-5×108CIU/ml，在药理学上可容许的承运体中给药。在人体中，优选一回的给药量为2×105CIU-2×1011CIU；给药次数为一次或者在临床上可容许的副作用的范围，反复多次进行；一天的给药次数与此相同。关于人类以外的动物，例如，可以用靶动物与人的体重比或者投放目标部位的容积比(例如平均值)来换算上述给药量，给药换算后的量。并且，具有传播性的单链负链RNA病毒载体给药到固体或者细胞后，有必要抑制治疗结束后的病毒载体的繁殖时，可以给药RNA依赖性RNA转录酶阻碍剂，可以不对宿主造成阻碍而很特异地抑制病毒载体的繁殖。在回体给药时，在体外(例如，试管或者浅底平板内)使靶细胞接触载体。优选MOI在1-500之间给药、更优选2-300、更优选3-200、更优选5-100、更优选7-70。
将编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体或者导入该载体的细胞向肿瘤部位给药时，优选与肿瘤抗原或者表达该抗原的载体引起的免疫组合使用。如实施例，将本发明的载体体内给药与肿瘤抗原的免疫组合的治疗与载体的单独给药相比，前者发挥了更高的抗肿瘤作用。接种肿瘤抗原或者表达肿瘤抗原的载体，可以在给药编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体的同时给药，也可以在其前后进行。给药编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体，与肿瘤抗原或者表达肿瘤抗原的载体的接种间隔，例如在7天以内、优选6日以内、5日以内、4日以内、3日以内、或者2日以内、更优选24小时以内。用于肿瘤抗原的免疫的抗原，例如有失去增殖能力的肿瘤细胞、或者肿瘤细胞溶解物等。优选使用失去增殖能力的肿瘤细胞，可用加热处理，放射线处理，或者抗生物质C等方法处理。例如，利用X射线照射时，可以进行总放射线量为700-3300Rad的照射。抗生物质C处理法，例如可以向细胞中添加25-50mg/ml的抗生物质C、在37度下、进行30-60分钟的保温处理。加热处理方法是例如，在50-65度下进行20分钟的加热处理。另外，取代利用肿瘤细胞的方法，可以利用目标肿瘤细胞表达的肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是天然或者重组多肽。或者，可以给药表达了肿瘤抗原的载体。作为表达肿瘤抗原的载体，没有特别限制，例如，可以使用质粒，病毒载体，裸DNA等，对于给药个体可以给药具有表达肿瘤抗原能力的所望的表达载体。该载体包含在适当的启动子(例如SV40启动子、CAG启动子、CMV启动子、EF1启动子、LTR启动子)的下游，与编码肿瘤抗原的核酸连结起来的核酸。或者，使用病毒载体时，在可调控各个病毒载体的表达的调节序列的控制下，将编码肿瘤抗原的核酸与其连结起来。载体的给药可以体内或者回体方式进行。肿瘤抗原根据治疗对象癌可以进行适当地选择，作为肿瘤抗原，例如与卵巢癌等相关连的Muc-1或者类似Muc-1的粘蛋白串联重复肽(mucin tandem repeat peptide)(美国专利第5,744,144号)、引起子宫颈癌的人乳头肿瘤病毒蛋白质E6以及E7、肿瘤抗原MART-1、MAGE-1、-2、-3、gp100以及酪氨酸酶(tyrosinase)、前列腺癌抗原PSA、其他还有CEA(Kim，C.et al.，Cancer Immunol.Immunother.47(1998)90-96)、以及Her2neu(HER2p63-71、p780-788；Eur.J.Immunol.2000；303338-3346)等。肿瘤抗原的接种部位可以进行适当地选择，例如，在经皮内，鼻腔内，经气管支，筋内，腹腔内，静脉内，或在皮下等进行。最优选皮下接种。对肿瘤细胞或者其溶解物进行接种时，接种量一般可以为105-109细胞、优选106～108细胞、更优选107细胞。本发明是与包含编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体、以及肿瘤抗原或者表达该抗原的载体的抗肿瘤处置试剂盒有关的。该试剂盒是包装有编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体、以及肿瘤抗原或者表达该抗原的载体的。该试剂盒，例如还包含该单链负链RNA病毒载体的包装容器和肿瘤抗原或者表达该抗原的载体的包装容器。该包装容器被用在本说明书记载的组合处置中。
本发明的抗肿瘤处置方法适用于所望的固态肿瘤，特别是适用于中枢神经系统组织(包含脑实质内或者实质外)的肿瘤的处置，例如适用于神经胶肿瘤、转移性脑肿瘤、骨髓芽肿、胚细胞瘤、脑膜瘤、下垂体腺瘤、以及神经鞘肿等脑肿瘤在内。尤其适用于神经胶质瘤(glioma)的处置。编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体在治疗脑肿瘤上，具有高效率的将基因导入细胞内的能力，可以在末梢诱导活化的主要免疫细胞向脑肿瘤组织的有意的移动。另外，通过与肿瘤抗原的免疫接种组合，可以抑制脑肿瘤的增殖。关于中枢神经导入载体，可以参考以下文献(Bitzer，M.et al.J.Gene Med.5543-553，2003；Li，H.O.et al.，J.Virol.746564-6569，2000；Inoue，M.et al.，Mol.Ther.5S174，2002；Shirakura，M.et al.，Exp.Animal 52119-127，2003；Suzuki，S.et al.，Eur.J.Neurosci.132299-2308，2001)。
关于作为本发明的抗肿瘤处置的对象生物，没有特别限制，其中包含了包括人类以及非人类哺乳动物在内的所望的哺乳动物，具体包括人类，小白鼠，大鼠，狗，猪，猫，牛，兔子，山羊，绵羊，猴子等。
实例以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不仅仅局限于下述实施例。还有，在本说明书中引用的文献全部作为本说明书的一部分包括在内。将小白鼠的9L的神经胶肉瘤(gliosarcoma)细胞悬浮于含有10％FCS的Dulbecco′s modified Eagle medium培养基中，在含有5％CO2的湿润空气中保持。把体重200以及240g(7-8周龄)的雄Fisher 344小白鼠按以下记载进行实验。这些动物都是按照Laboratory Animal Resources Commission Standards(实验动物资源委员会标准)、在specific pathogen-free(SPC；特定病原体)的环境下饲养的。将动物麻醉，然后固定在定位固定装置上。将穿头孔(burr hole)在适当的位置打开(前囟(bregma)后方4mm、正中线偏右3mm)。从硬膜到腹部侧面(ventral)3mm的位置处，插入量液针、用微型注射器(HarvardApparatus，South Natick，MA)、对10ml的培养基中含有的105的同源的9L肿瘤细胞进行缓慢地持续五分钟的注射。(第0天)。治疗步骤在9L肿瘤细胞的脑内(i.c.)接种三天后(day 3)开始。在动物中，进行SeV18+hIL2/ΔMΔF或者SeV18+lacZ/ΔMΔF的脑内给药(i.c.transplantation)、和/或照射了的野生型9L肿瘤细胞的皮下免疫(s.c.immunization)操作。脑内移植过程中，将10mlPBS中的1×107CIU的各SeV向与上述同样的定位固定坐标移植。在皮下免疫过程中，对野生型9L细胞用30Gy进行照射，把含有1×106经照射的9L细胞的100ml培养基在下腹部(lower abdominal quadrant)进行接种(Iwadate，Yet al.，Cancer Res.，618769-8774，2001)。对接种了肿瘤细胞的全部动物每隔七天进行一次MRI检查、来评估i.c.肿瘤的体积。向用50mg/kg的戊巴比妥(pentobarbital)麻醉了的小白鼠注射0.2mlのGd-DTPA(0.8-1.0ml/kg)、用1.5T的MR装置(Sigma Advantage，General Electric，Milwaukee，WI)，获得冠状断面T1重要画像(TR 500 msec，TE 11 msec，3mm厚，gapless)。肿瘤的体积(mm3)是作为在各MR画像区域(mm2)内Gd-DTPA强调部位的和计算出来的。用MRI估计的肿瘤体积与画像解析结束后得到的实际的肿瘤重量是呈线形相关的(Namba，H.et al.，Human Gene Ther.，71847-1852，1996)。各组的肿瘤体积解析是根据单变量分散分析来实施的。(一元配置分散分析(One-factor ANOVA))。
到小白鼠出现重度麻痹(paresis)上、运动失调(ataxia)、眼睛周围外皮的形成(periophtalmic encrustations)、或者体重减少到20％为止，每天对其进行观察。这种动物的平均寿命由于还不到一天，所以将其死亡当日定为死亡日。生存解析是根据Kaplan-Meier法的log-rank tes进行的。向有肿瘤的小白鼠的上行大动脉中注入百分之四的帕拉甲醛，取出脑部。将脑标职制成15mm厚的冻结切片，与抗CD4细胞(W3/25，Serotec，Oxford，UK)、抗CD8细胞(OX-8，Serotec)、抗NK细胞(1.2.3，Serotec)、以及抗人IL-2(DAKO，Tokyo，Japan)单克隆抗体反应后，与西洋芥末过氧化物酶結合山羊抗小鼠IgG(MBL，Nagoya，Japan)反应，用3，3′-diaminobenzidinetetrahydrochloride(Sigma，St.Louis，MI)进行染色。根据X-Gal的组织染色可以检测出β-半乳糖苷酶。装载人IL-2基因的重组负链RNA病毒载体的构筑仙台病毒(SeV)全长基因组的基因顺序为3′端的leader(ld)，接下来是病毒基因核蛋白(NP)，磷酸酶小亚基(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，血凝活性和神经氨酸酶hemagolchain-noiraminidaza(HN)，以及磷酸酶小亚基(L)、最后是连接在5′端的trailer(tr)(图1)。在实验中使用使M基因以及F基因两者缺失的SeV载体(SeV/ΔMΔF)。由于F蛋白在病毒感染时是必要的，而且M蛋白作用于病毒的粒子形成以及出芽(budding)，所以SeV/ΔMΔF是非传播性的，并且不会产生来自感染细胞的病毒粒子。装载人IL-基因的SeV/ΔMΔF载体(hIL-2-SeV/ΔMΔF)以及装载lacZ基因的SeV/ΔMΔF载体(lacZ-SeV/ΔMΔF)按照以前记载的方法进行构筑(Inoue，M.et al.，J.Virol.，776419-6429，2003；Inoue，M.et al.，Mol.Ther.，5S174，2002)。具体来说，用包含有SeV特殊转录调节信号序列的带有tag的NotI引物对5′-ACTTGCGGCCGCGTTTAAACGGCGCGCCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3′(序列序号19)以及5′-ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGATTTAAATGGCGCGCCA-3′(序列序号20)，扩增人IL-2(Accession numberA14844)cDNA。将扩增片断插入到原来的pSeV18+/ΔMΔF的NotI部位。如此构筑hIL-2-SeV/ΔMΔF的cDNA(phIL2-SeV/ΔMΔF)。lacZ-SeV/ΔMΔF的cDNA(placZ-SeV/ΔMΔF)也同样以lacZ扩增片断进行构筑(Li，H.O.et al.，J.Virol.，746564-6569，2000)。使表达T7 RNA转录酶的痘病毒vTF7-3(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，838122-8126，1986)在LLC-MK2细胞中感染后，将phIL2-SeV/ΔMΔF，以及placZ-SeV/ΔMΔF向细胞中进行转染。由T7RNA 转录酶驱动转录的hIL2-SeV/ΔMΔF和lacZ-SeV/ΔMΔF的RNA基因组被共转染了的各质粒中驱动表达的N、P、及L蛋白质包被，封装(encapsulate)(Ikeda，Y.et al.，Exp.Eye Res.，7539-48，2002)。回收的SeV载体用表达M及F蛋白的包装细胞进行增幅(Inoue，M.et al.，J.Virol.，776419-6429，2003；Inoue，M.et al.，Mol.Ther.，5S174，2002)。病毒的力价基于其感染性，作为细胞感染单位(CIU；细胞感染单位)进行记载。SeV载体在使用之前在-80℃下保存。通过SeV载体进行β-半乳糖苷酶基因的脑内导入根据lacZ-SeV/ΔMΔF(SeV/LacZ亦略记)注入后第4、7、及14天后取出的正常脑组织或者脑肿瘤，来调查通过SeV载体进行的β-半乳糖苷酶基因的脑内导入的效率。注入脑肿瘤组织时，典型地注入载体的组织外观为，呈现散在的由注入lacZ-SeV/ΔMΔF的导入肿瘤细胞和其子孙细胞形成的X-gal阳性细胞集落(图2)。从散在的X-gal染色集落之间，可以看到非导入肿瘤细胞。β-半乳糖苷酶的表达或者积蓄在病毒注入7天后达到最大量，表达水平可以持续到第14天(图2)。关于向肿瘤周围的正常脑组织的导入，除去脉络丛，没有在其他的在肿瘤周围的组织中观察到。注入正常脑组织时，与肿瘤内注入时具有等同的效率，观察到了向神经以及神经胶质(glia)细胞的导入。载体的实质内注入，没有将基因导入到上衣细胞里。hIL2-SeV/ΔMΔF载体的i.c.给药的抗肿瘤效果在脑内接种了9L神经肿瘤的小鼠体内产生了具有增殖性的肿瘤(progressive)、接种后的25天内(day 25)所有的小鼠都死亡了。对与经过照射的全肿瘤细胞疫苗皮下免疫(s.c.)配合的hIL2-SeV/ΔMΔF(SeV/IL-2及略记)的i.c.给药的治疗效果，使用连续Gd加强MRI的肿瘤体积测量进行了调查(图3)。从9L肿瘤细胞接种后的3周内(day 21)，接受了hIL2-SeV/ΔMΔF的i.c.给药，以及s.c.免疫治疗的小鼠的肿瘤体积(86.5±63.8mm3，n＝10，onday 21)与未处理(286±51.2mm3，n＝10，on day 21)、仅s.c.免疫(197±48.9mm3，n＝10，on day 21)、lacZ-SeV/ΔMΔF的i.c注入和s.c.免疫的配合(233±73.2mm3，n＝6，on day 21)、或者仅注入hIL2-SeV/ΔMΔF的i.c.(256±53.2mm3，n＝6，on day 21)相比，可以看出有显著缩小(图4)。利用hIL2-SeV/ΔMΔF的配合治疗(combinatory treatment)，在21天内，有十分之三的小鼠的固定脑肿瘤完全消失(图3)。与此相比，hIL2-SeV/ΔMΔF单独的i.c.注入，或者单独的s.c.免疫的肿瘤平均体积与未处理的肿瘤相比有所缩小，但这些治疗效果与两者的配合治疗效果相比要低，而且没有观察到固定肿瘤的的完全消失(图4)。另外，如图5所示，具有肿瘤的小鼠的寿命与未处理组相比，hIL2-SeV/ΔMΔF单独的i.c.注入或者单独的s.c.免疫处置的小鼠有所延长，但是进行了hIL2-SeV/ΔMΔF载体的i.c.注入与s.c.免疫配合治疗的小鼠的寿命，与未处理组，或者进行了其他处置的小鼠的寿命相比，显著地被延长了。(p＜0.05，Logrank test)(图5)。将hIL2-SeV/ΔMΔF向固定肿瘤相反一侧半球注入时，肿瘤增殖没有受到影响。(没出示数据)。该结果揭显示为了达到显著的治疗效果，IL-2有必要在目标肿瘤的附近进行表达。免疫组织化学分析对脑肿瘤中IL-2蛋白的表达进行免疫组织化学分析。IL-2蛋白在注入hIL2-SeV/ΔMΔF载体的肿瘤内扩散表达得到了证实(图6)。进一步确认了CD4+T细胞、CD8+T细胞以及NK细胞的存在。hIL2-SeV/ΔMΔF载体的i.c.注入，以及s.c.免疫治疗的肿瘤中，观察到CD4+T细胞、CD8+T细胞、以及NK细胞的显著的浸润(图7)。这些细胞的迁移(migration)在进行lacZ-SeV/ΔMΔF载体的i.c.注入，以及s.c.免疫治疗，或者单独的hIL2-SeV/ΔMΔF载体的i.c.注入治疗的肿瘤中可检测到中等程度，但是配合治疗比单独治疗效果更显著。
根据本发明，提供了治疗肿瘤的最新方法。本发明的方法用简单的手法对肿瘤的增殖进行了有效的控制，所以很有可能被广泛的应用于癌症的治疗。
序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>肿瘤的基因治疗，即利用编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体进行的治疗。
<130>D3-A0309P<140>
<141>
<150>JP 2004-005186<151>2004-01-13<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>399<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(399)<223>
<400>1gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat48Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His1 5 10 15tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag96Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys20 25 30aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag144Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys35 40 45aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa192Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys50 55 60cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta240Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu65 70 75 80aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta288Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu85 90 95aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca336Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala100 105 110acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tgt caa agc atc384Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile115 120 125atc tca aca ctg act399Ile Ser Thr Leu Thr130<210>2<211>133<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
<400>2Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His1 5 10 15Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys20 25 30Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys35 40 45Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys50 55 60Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu65 70 75 80Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu85 90 95Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala100 105 110Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile115 120 125Ile Ser Thr Leu Thr130<210>3<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的例子<400>3ucccwvuuwc 10<210>4<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的例子<400>4ucccaguuuc 10<210>5<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的例子<400>5ucccacuuac 10<210>6<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的例子<400>6ucccacuuuc 10<210>7<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的例子<400>7agggtcaaag 10<210>8<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的例子<400>8agggtgaatg 10<210>9<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的例子<400>9agggtgaaag 10<210>10<211>9<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒E序列的例子<400>10auucuuuuu 9<210>11<211>9<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒E序列的例子<400>11taagaaaaa 9<210>12<211>10<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>仙台病毒S序列的例子<400>12ctttcaccct 10<210>13<211>15<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒E序列的例子<400>13tttttcttac tacgg 15<210>14<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的接头序列<400>14atgcatgccg gcagatga18<210>15<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>15gttgagtact gcaagagc18<210>16<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>16tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42<210>17<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>17atgcatgccg gcagatga18<210>18<211>21<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列<400>18tgggtgaatg agagaatcag c21<210>19<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>19acttgcggcc gcgtttaaac ggcgcgccat gtacaggatg caactcctgt c 51<210>20<211>63<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>20atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggattt aaatggcgcg 60cca6权利要求
1.一种抗肿瘤处置方法，该方法包括将编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体或者导入该载体的细胞给药到肿瘤部位的步骤。
2.权利要求1中的方法，其中所述方法包括使用肿瘤抗原或者表达该抗原的载体进行免疫的步骤。
3.权利要求2中的方法，其中所述方法是通过皮下接种的方式，使用该肿瘤抗原或者表达该抗原的载体进行免疫的方法。
4.权利要求2中的方法，其中所述该肿瘤抗原是失去增殖能力的肿瘤细胞或者肿瘤细胞溶解物。
5.权利要求1中的方法，其中所述肿瘤为脑肿瘤。
6.权利要求1中的方法，其中所述免疫刺激性细胞因子为白细胞介素-2。
7.一种抗肿瘤组合物，该组合物包含以编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体，或者以导入该载体的细胞为有效成分。
8.权利要求7中的组合物，其中所述免疫刺激性细胞因子为白细胞介素-2。
9.一种抗肿瘤处置的试剂盒，该试剂盒包含(a)编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体，及(b)肿瘤抗原或者表达该抗原的载体。
10.权利要求9中的试剂盒，其中所述免疫刺激性细胞因子为白细胞介素-2。
全文摘要
本发明提供了一种抗肿瘤处置方法，该方法包含将编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体，或导入该载体的细胞给药到肿瘤部位的步骤。本发明还提供了包括以编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体，或导入该载体的细胞等为有效成分的抗肿瘤组合物。此外，本发明还提供了包含编码免疫刺激性细胞因子的单链负链RNA病毒载体，以及肿瘤抗原或者表达该抗原的载体的抗肿瘤处置试剂盒。
文档编号A61K38/00GK1929867SQ200580008130
公开日2007年3月14日 申请日期2005年1月12日 优先权日2004年1月13日
发明者岩立康男, 山浦晶, 井上诚, 长谷川护 申请人:株式会社载体研究所