专利名称：一种治疗和/或预防乙肝的药物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种治疗和/或预防乙肝的药物。
背景技术：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的，是一个严重的公共卫生问题，对人类健康的威胁很大。感染乙型肝炎后，部分患者将发展成为慢性持续性感染状态，有的可能演变为肝硬变或原发性肝细胞癌。我国是乙型肝炎病毒感染高流行区，人群感染率为60％，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)人群携带率为10％。目前，据估计，全世界共有3亿HBsAg携带者，而我国就占其中的三分之一，乙型肝炎传播已成为影响人口素质的重要问题。
作为疫苗可预防的疾病，乙肝疫苗的接种是控制乙型肝炎最有效的措施。进入80年代，乙型肝炎基因重组疫苗的发展非常迅速，自1981年起，默克公司成功研制出乙型肝炎基因S蛋白在酵母中表达后与铝佐剂配伍的基因重组疫苗并商品化后，对全球乙型肝炎的预防和控制起重要作用。
目前用于乙肝疫苗商品化的佐剂仅有铝佐剂，通常为氢氧化铝或磷酸铝。铝佐剂的优点有吸附并储存抗原延长抗原作用时间，能增强APC细胞对抗原的递呈能力，其最主要的优点是能增强体液免疫反应。其最大的缺点是不能增强细胞免疫反应，尤其是不能增强细胞毒淋巴细胞杀伤反应。
由于我国乙肝病毒人群携带率为10％，不仅造成乙型肝炎病毒传播的巨大威胁，同时对于这些携带者而言，其健康一直受到极大的威胁和危害。所以治疗乙肝病毒携带者已成为世界一大难题。现在临床上基于干扰素，或干扰素加抗病毒药物的治疗方案只有30％的有效率，并在停药后病毒反弹，所以总体治疗效果不尽理想。
有效的治疗手段应是基于激发病毒携带者体内的免疫系统。国际上公认的评价治疗性乙肝疫苗的指标是抗原专一性的细胞免疫反应，尤其是要激发高水平的乙肝专一性CD8阳性CTL细胞活性，并分泌高水平的γ-干扰素等有效免疫组分。
国际上虽然有报道利用乙肝病毒S或C抗原为免疫源与不同免疫增强剂配合，以提高激活机体的细胞免疫水平，但临床效果仍然在评价中。
现有上市的乙肝疫苗是基于乙肝病毒S抗原与铝佐剂配伍的形式，其缺点限制了其疫苗用于乙肝治疗发案的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的治疗和/或预防乙肝的药物。
本发明所提供的治疗和/或预防乙肝的药物包括左旋咪唑及其衍生物和乙肝疫苗。
所述乙肝疫苗可为乙肝病毒S抗原(HBsAg)、乙肝病毒preS1抗原或乙肝病毒preS2抗原。
所述左旋咪唑衍生物可为盐酸左旋咪唑或磷酸左旋咪唑。
所述左旋咪唑及其衍生物和乙肝疫苗的质量比可为250-2500∶1-50；优选为100-150∶5-20。
所述治疗和/或预防乙肝的药物还包括铝佐剂。
所述铝佐剂与乙肝疫苗的质量比可为10∶1-500∶1，优选为75-150∶1。
所述治疗和/或预防乙肝的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
所述治疗和/或预防乙肝的药物的用量一般为0.06-0.6μg/kg体重/次，每7-30天给药一次，一般共需2-6次。
IgG、IgG1和IgG2a抗体定量检测实验、RT-PCR检测细胞因子表达实验和流式细胞仪检测CD8细胞内IFN-γ表达实验均表明LMS能够使乙肝疫苗诱导机体免疫向Th1型方向发展；T淋巴细胞扩增实验表明LMS能够使乙肝疫苗对机体产生明显的特异性淋巴细胞扩增反应；流式细胞仪检测体外CTL实验表明LMS及其衍生物能够增强乙肝疫苗对体外的CTL反应；流式细胞仪检测树突状细胞CD11分子表达实验表明LMS能够增强APC细胞对抗原的递呈。
本发明利用左旋嘧唑及其衍生物与现有的乙肝疫苗组合，使现有的乙肝疫苗成为乙肝治疗的药物。其作用主要是通过激活与提高机体的细胞免疫反应，尤其是高水平的乙肝专一性CD8阳性CTL细胞活性，同时分泌γ-干扰素等有效免疫组分而达到的。本发明的药物，不仅使用方便，成本低，而且易于推广。
图1为定量ELLISA检测IgG、IgG1和IgG2a含量结果图2为淋巴细胞扩增反应结果图3A和图3B为RT-PCR检测细胞因子的表达结果图4A和图4B为体外CTL反应结果图5为流式细胞仪检测IFN-γ表达结果图6为CD11c表达结果图7为盐酸左旋咪唑和乙肝疫苗混合或分开注射小鼠的IgG含量具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、LMS增强乙肝疫苗细胞免疫的动物实验左旋咪唑(LMS)为南京白敬宇制药厂公司制品，批号为2002-12-06。氢氧化铝佐剂(alum)为北京华尔顿科技服务公司制品，批号为1999-10-20，浓度为2mg/ml。CpG序列5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′(CpG-ODN 1826)，全链硫代修饰，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并纯化。rHBsAg纯抗原购自华北制药集团，经CHO细胞表达，并用HPLC系统纯化得到rHBsAg纯抗原。
4-6周龄雌性C57BL/6小鼠，分9组，每组5只，实验分组见表1。每只小鼠第0天首次肌肉注射，第14天再次肌肉注射一次，每次注射的药剂200ul，分为如表1所示的9种第1组注射rHBsAg 2ug/只，第2组注射rHBsAg 2ug/只+0.5％LMS/只，第3组注射rHBsAg 2ug/只+CpG 10ug/只，第4组注射rHBsAg 2ug/只+alum 0.3mg/只，第5组注射rHBsAg 2ug/只+alum 0.3mg/只+0.5％LMS/只，第6组注射rHBsAg 2ug/只+alum 0.3mg/只+CpG 10ug/只，第7组注射rHBsAg2ug/只+alum 0.3mg/只+CpG 10ug/只+0.5％LMS/只，第8组注射0.5％LMS/只，第9组注射CpG 10ug/只。
表1注射分组(200ul)
1、IgG、IgG1和IgG2a抗体定量检测首次肌肉注射后21天采血分离血清，定量ELISA法分别检测IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。以2ug/ml rHBsAg抗原包被96孔酶标板中的48孔，在同一块96孔酶标板上用2ug/ml兔IgG(Sigma)包被另外48孔，4℃过夜，3％牛血清白蛋白37℃封闭2h；PBST(0.05％Tween 20溶于PBS)洗涤4次；将小鼠血清按1∶100倍稀释，将小鼠抗兔IgG(Sigma)从100ng/ml按2倍稀释10个梯度，37℃孵育1h；PBST洗涤4次，每次5分钟；加羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgG、IgG1和IgG2a抗体(Sigma)(均按1∶4000稀释)，37℃孵育1h。每孔加入底物TMB，37℃避光显色5-15min，加入终止液2mol/L H2SO4，每孔50μl，终止显色，置于450nm/620nm测定每孔光密度值，做出标准曲线，计算出抗体含量。结果如图1所示，表明免疫抗原组(rHBsAg)产生低水平的IgG和IgG2a；抗原加LMS(rHBsAg+LMS)能产生较高水平的IgG和IgG2a，且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，IgG2a的水平有了显著的提高(P＜0.05)；乙肝疫苗加LMS能显著的增强IgG和IgG2a水平(P＜0.01)，而IgG1没有明显的变化。与CpG的实验组(rHBsAg+CpG)相比，抗原加LMS(rHBsAg+LMS)也能产生类似的IgG和IgG2a水平的结果；当LMS、CpG、alum和乙肝疫苗(rHBsAg+alum+CpG+LMS)一起免疫时，IgG2a明显降低；上述结果表明，LMS能够使乙肝疫苗诱导机体免疫向Th1型方向发展(图1)。
2、T淋巴细胞扩增首次肌肉注射后21天处死小鼠，在无菌条件下，取小鼠脾脏，研碎，用红细胞裂解液除去红细胞，并过尼龙柱除去B细胞制成单细胞悬液，PBS液洗3次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×106个/ml，每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中一份加rHBsAg抗原至终浓度为5μg/ml，一份加ConA至终浓度为5μg/ml作为阳性对照，一份加BSA至终浓度为2μg/ml作为阴性对照，另一份不加刺激物，培养48h后，每孔加入20μl的MTS/PMS混合液，培养4h后，酶标仪读取492nm处的OD值，计算刺激指数(stimulated index，SI)，SI＝(实验组OD-培养基OD)/(细胞OD-培养基OD)。结果如图2所示，表明免疫抗原组(rHBsAg)仅能产生低水平的淋巴细胞扩增，而抗原加LMS(rHBsAg+LMS)能产生较高水平的淋巴细胞扩增(P＜0.05)，且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，明显的提高乙肝疫苗的淋巴细胞扩增(P＜0.05)；并且乙肝疫苗加LMS同时能明显的增强乙肝疫苗的淋巴细胞扩增，(P＜0.05)；与CpG的实验组(rHBsAg+CpG)相比，LMS也能产生类似的淋巴细胞扩增结果；当LMS、CpG、alum和乙肝疫苗(rHBsAg+alum+CpG+LMS)一起免疫时，淋巴细胞扩增反应明显降低；LMS上述结果表明，LMS能够使乙肝疫苗对机体产生明显的特异性淋巴细胞扩增反应(图2)。
3、RT-PCR检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达首次肌肉注射21天，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，用Trizol(北京鼎国生物公司)提淋巴细胞的总RNA，进行逆转录得到cDNA，通过PCR检测持家基因HPRT的表达，调节各组cDNA的浓度一致，各组cDNA进行特异引物PCR扩增IL-2，IFN-γ和IL-4，PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统照相。PCR反应条件和引物序列见表2。
表2.PCR引物
RT-PCR检测结果如图3A和图3B所示，表明免疫抗原组(图3A中rHBsAg)仅有低水平IL-2和IFN-γ表达，而抗原加LMS(图3A中rHBsAg+LMS)有较高水平IL-2和IFN-γ表达，且与铝佐剂乙肝疫苗组(图3A中rHBsAg+alum)相比，明显的提高乙肝疫苗的IL-2和IFN-γ的表达；并且乙肝疫苗加LMS同时能明显的增强乙肝疫苗的IL-2和IFN-γ表达；与CpG的实验组(图3B中rHBsAg+CpG)相比，LMS也能产生类似的IL-2和IFN-γ表达；上述结果表明，LMS能够很好的诱导乙肝疫苗产生IL-2和IFN-γ，与抗体亚型的检测完全一致，进一步证明LMS能够使乙肝疫苗对机体免疫向Th1型方向发展。图3A中， 为正常老鼠对照；图3B中， 为正常老鼠对照。
4、流式细胞仪检测体外CTL小鼠首次肌肉注射后21天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，并稀释成1×107个/ml作为效应细胞。靶细胞EL4培养至状态良好，取1×106个靶细胞置于1mlRPMl1640培养基(含10％小牛血清)中，并加入20μg乙肝S抗原短肽(aa208～215)(为上海吉尔生化有限公司，货号为52633)，37℃，5％的CO2的细胞培养箱中培养1hr，PBS洗3次，3mM的DIOC(3，3’-二十八烷基高氯酸氰蓝，sigma公司)10μL，37℃染色15min，PBS洗3次；靶细胞重悬为1×105个/ml。将靶细胞和效应细胞按1∶3、1∶11、1∶33和1∶100的数量比混合，37℃，5％的CO2的细胞培养箱中培养4hr，同时做自然杀伤和最大杀伤的对照(自然杀伤放在4℃，最大杀伤的对照加入20μL的皂素)，4hr后加入PI(碘化丙啶，sigma)至终浓度为2μg/ml 37℃染色5min，流式细胞进行检测；杀伤效率＝(实验组杀伤比例-自然杀伤比例)/(最大杀伤比例-自然杀伤比例)×100％。结果如图4A和图4B所示，表明免疫抗原组(rHBsAg)能产生低水平的CTL反应，而抗原加LMS(rHBsAg+LMS)能产生较高水平的CTL反应，且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，明显的提高乙肝疫苗CTL反应；并且乙肝疫苗加LMS同时能显著的增强乙肝疫苗的CTL反应；与CpG的实验组(rHBsAg+CpG)相比，LMS也能产生类似的CTL反应；当LMS、CpG、alum和乙肝疫苗(rHBsAg+alum+CpG+LMS)一起免疫时，与rHBsAg+alum+CpG相比CTL反应有所降低；结果表明LMS能够增强乙肝疫苗对体外的CTL反应。图4A和图4B中，E∶T表示效应细胞和靶细胞的数量比。
5、流式细胞仪检测CD8细胞内IFN-γ表达CTL反应与免疫系统的IFN-γ表达密切相关，是反映CTL反应的一种重要的细胞因子。
小鼠在首次肌肉注射后21天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，按1×106个细胞加入10-6mol的乙肝S抗原短肽(aa208～215)(为上海吉尔生化有限公司，货号为52633)，刺激12～14hr后，2μL100μg/ml的莫能菌素作用2hr，PBS洗3次，抗Fcγ抗体(eBioscience)4℃封闭15min，PBS洗3次，抗CD8-PE抗体(eBioscience)4℃染色30min，PBS洗3次，4％多聚甲醛4℃固定10min，PBS洗3次，0.1％皂素破膜10min，PBS洗3次，抗IFN-γ-FITC抗体(eBioscience)染色15min，PBS洗3次，流式细胞仪检测。结果如图5所示，表明抗原组(rHBsAg)有低水平IFN-γ表达，而抗原加LMS(rHBsAg+LMS)能有较高的IFN-γ；且与铝佐剂乙肝疫苗组(rHBsAg+alum)相比，明显的提高乙肝疫苗的IFN-γ的表达；并且乙肝疫苗加LMS同时能明显的增强乙肝疫苗的IFN-γ表达；与CpG的实验组(rHBsAg+CpG)相比，LMS也能产生类似的IFN-γ表达。上述结果表明，LMS能够很好的诱导乙肝疫苗产生IFN-γ，与CTL反应的结果一致，LMS能够使乙肝疫苗疫诱导机体向Th1型方向发展(图5)。图5中的百分数为表达IFN-γ的CD8+细胞所占的百分数； 表示正常老鼠对照，FL2-H表示表示FL2探测器所检测的红色荧光，FL1-H表示表示FL1探测器所检测的绿色荧光。
6、流式细胞仪检测树突状细胞CD11分子表达小鼠在首次免疫后3天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，用抗CD11c-FITC抗体(eBioscience)，4℃染色30min，PBS洗3次，流式细胞仪检测。结果如图6所示，表明免疫抗原组(rHBsAg)能表达低水平的CD11c，而抗原加LMS(rHBsAg+LMS)有较高水平的CD11c表达；与乙肝疫苗组相比，明显的提高乙肝疫苗CD11c的表达；并且乙肝疫苗加LMS同时能显著的增强乙肝疫苗的CD11的表达；与CpG的实验组(rHBsAg+CpG)相比，LMS也能诱导产生类似的CD11c的表达；上述结果表明LMS能够增强APC细胞对抗原的递呈(图6)。图6中的百分数为表达CD11c树突状细胞所占百分数； 表示空白对照，M1表示被染色的阳性细胞，Counts表示相对细胞数，FL1-H表示FL1探测器所检测的绿色荧光。
实施例2、左旋咪唑与乙肝疫苗分开注射与混合注射动物的效果区别盐酸左旋咪唑为南京白敬宇制药厂公司制品。氢氧化铝佐剂(alum)为北京华尔顿科技服务公司制品，批号为1999-10-20，浓度为2mg/ml。CpG序列5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′(CpG-ODN 1826)，全链硫代修饰，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并纯化。乙肝疫苗是抗原rHBsAg与氢氧化铝佐剂配伍疫苗，其中，rHBsAg与氢氧化铝的质量比为1∶75，购自华北制药集团，天坛生物制品厂。
4-6周龄雌性C57BL/6小鼠，分9组，每组5只，实验分组见表3。每只小鼠第0天首次肌肉注射，第14天再次肌肉注射一次。注射方式分为混合注射和分开注射两种。混合注射方式为每次在小鼠的同一个部位同时肌肉注射乙肝疫苗(1ug/只，100μl/只)和盐酸左旋咪唑(浓度为0.25％-2％，100μl/只)。分开注射方式为盐酸左旋咪唑和乙肝疫苗分开免疫，即每只小鼠的左腿注射乙肝疫苗100μl(1ug/只)，每只小鼠的右腿注射100μl盐酸左旋咪唑(浓度为0.25％-2％)。
表3.注射分组
1、IgG抗体定量检测首次注射后21天采血分离血清，定量ELISA法检测IgG抗体水平。以2ug/mlrHBsAg抗原包被96孔酶标板中的48孔，在同一块96孔酶标板上用2ug/ml兔IgG(Sigma)包被另外48孔，包被4℃过夜，3％牛血清白蛋白37℃封闭2h；PBST(0.05％Tween 20溶于PBS)洗涤4次；将小鼠血清按1∶100倍稀释，将小鼠抗兔IgG(Sigma)从100ng/ml按2倍稀释10个梯度，37℃孵育1h；PBST洗涤4次，每次5分钟；加羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgG(Sigma)(均按1∶4000稀释)，37℃孵育1h。每孔加入底物TMB，37℃避光显色5-15min，加入终止液2mol/L H2SO4，每孔50μl，终止显色，置于450nm/620nm测定每孔光密度值，做出标准曲线，计算出抗体含量。IgG检测结果如图7所示，表明第2次注射后7天，当盐酸左旋咪唑和乙肝疫苗混合注射时，与仅用疫苗免疫组相比，1％盐酸左旋咪唑加疫苗显著的提高了IgG水平，而2％盐酸左旋咪唑加疫苗则降低了IgG水平；当分开注射时，与仅用疫苗免疫组相比，1％盐酸左旋咪唑也能显著的提高了IgG水平，而2％盐酸左旋咪唑则降低了IgG水平。上述结果表明，1％盐酸左旋咪唑混合或分开注射均能够增强乙肝疫苗的体液免疫。图7中，LMS+vaccine表示盐酸左旋咪唑和乙肝疫苗混合注射，LMS/vaccine表示盐酸左旋咪唑和乙肝疫苗分开注射。
2、流式细胞仪检测细胞因子的表达小鼠在首次肌肉注射后21天处死，按步骤2的方法得到T淋巴细胞，按1×106个细胞加入10-6mol的乙肝S抗原短肽(aa 208～215)(为上海吉尔生化有限公司，货号为52633)，刺激12～14hr后，2μL100μg/ml的莫能菌素作用2hr，PBS洗3次，抗Fcγ抗体(eBioscience)4℃封闭15min，PBS洗3次，抗CD4抗体4℃染色30min，PBS洗3次，加入荧光染料PE与羊抗小鼠IgG桥联的二抗(美国eBioscience公司)4℃染色30min，4％多聚甲醛4℃固定10min，PBS洗3次，0.1％皂素破膜10min，PBS洗3次，抗IFN-γ-FITC抗体(eBioscience公司)或同型抗体染色15min，PBS洗3次，流式细胞仪检测CD4细胞IFN-γ的表达，用荧光染料FITC与羊抗小鼠IFN-γ抗体(eBioscience公司)检测CD8细胞IFN-γ的表达，CD4细胞的IL-4则是固定和破膜以后将用荧光染料FITC与羊抗小鼠IL-4抗体(eBioscience公司)染色30min，PBS洗3次，流式细胞仪检测。
CD8细胞内IFN-γ表达检测结果表明，0.25％、1％和2％盐酸左旋咪唑和乙肝疫苗混合注射和0.5％、1％盐酸左旋咪唑与乙肝疫苗分开注射均能增强IFN-γ水平；CD4细胞内IFN-γ表达结果表明，0.25％、0.5％和1％盐酸左旋咪唑和乙肝疫苗混合注射和0.5％、1％盐酸左旋咪唑与乙肝疫苗分开注射均能增强CD4细胞内IFN-γ的表达；CD4细胞内IL-4表达结果表明，0.25％、0.5％、1％和2％盐酸左旋咪唑和乙肝疫苗混合注射和0.5％、1％盐酸左旋咪唑与乙肝疫苗分开注射均能增强CD4细胞内IL-4的表达。上述结果表明，在特定的盐酸左旋咪唑浓度下，不管是混合还是分开注射，LMS能够很好的促进乙肝疫苗诱导CD8细胞表达IFN-γ，同时也能增强CD4细胞表达IL-4和IFN-γ。
权利要求
1.一种治疗和/或预防乙肝的药物，包括左旋咪唑及其衍生物和乙肝疫苗。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于所述乙肝疫苗为S抗原、乙肝病毒preS1抗原或乙肝病毒preS2抗原。
3.根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于所述左旋咪唑衍生物为盐酸左旋咪唑或磷酸左旋咪唑。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于所述左旋咪唑及其衍生物和乙肝疫苗的质量比为250-2500∶1-50。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于所述左旋咪唑及其衍生物和乙肝疫苗的质量比为100-150∶5-20。
6.根据权利要求3所述的药物，其特征在于所述治疗和/或预防乙肝的药物还包括铝佐剂。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述铝佐剂与乙肝疫苗的质量比为10∶1-500∶1。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于所述铝佐剂与乙肝疫苗的质量比为75-150∶1。
全文摘要
本发明公开了一种治疗和/或预防乙肝的药物。该治疗和/或预防乙肝的药物包括左旋咪唑及其衍生物和乙肝疫苗。IgG、IgG1和IgG2a抗体定量检测实验、RT－PCR检测细胞因子表达实验和流式细胞仪检测CD8细胞内IFN－γ表达实验均表明LMS能够使乙肝疫苗诱导机体免疫向Th1型方向发展；T淋巴细胞扩增实验表明LMS能够使乙肝疫苗对机体产生明显抗原特异性的淋巴细胞扩增反应；流式细胞仪检测体外CTL实验表明LMS及其衍生物能够增强乙肝疫苗对体外抗原特异性的CTL反应；流式细胞仪检测树突状细胞CD11分子表达实验表明LMS能够增强ARC细胞对抗原的递呈。
文档编号A61P31/20GK1824303SQ20051013238
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者王宾, 俞庆龄, 杜小刚 申请人:中国农业大学