专利名称：以病毒衣壳制备pH响应的药物释放系统的利记博彩app
技术领域：
本发明属于制备受控于环境酸碱性的药物可控释放系统的技术领域，特别是利用病毒外壳孔道对pH值的响应性，来构建对药物可控释放的体系。
背景技术：
药物控制释放系统是替代常规药物制剂，能够在指定的酸时间或身体部位释放的药物。而通过对光、温度、电场和pH值等物理刺激在能作出响应的控释药物就构成了智能药物释放体系。例如，pH值响应药物释放体系适用于利用消化道各处pH值的不同进行定点释放(参见Gupta，P.，Vermani，K.& Garg，S.Hydrogelsfrom controlled release to pH-responsive drug delivery.DrugDiscov.Today 2002，7569-579；——Stayton，P.S.，El-Sayed，M.E.，Murthy，N.，Bulmus，V.，Lackey，C.，Cheung，C.& Hoffman，A.S.’Smart’deliverysystems for biomolecular therapeutics.Orthod.Craniofac.Res.2005，8219-225；——Dufresne，M.H.，Garrec，D.L.，Sant，V.，Leroux，J.C.&Ranger，M.Preparation and characterization of water-soluble pH-sensitivenanocarriers for drug delivery.Int.J.Pharm. 2004，27781-90)，一些聚合物水凝胶在胃液中处于收缩状态，可阻止内部药物的释放；而在肠液中，聚合物膨胀，可释放出内部的药物(参见Kim，B. & Peppas，N.A.In vitrorelease behavior and stability of insulin in complexation hydrogels as oraldrug delivery carriers.Int.J.Pharm.2003，26629-37；——Morishita，M.，Lowman，A.M.，Takayama，K.，Nagai，T. & Peppas，N.A.Elucidation ofthe mechanism of incorporation of insulin in controlled release systemsbased on complexation polymers.J.Control Release.2002，8125-32；——Lowman，A.M.，Morishita，M.，Kajita，M.，Nagai，T.，Peppasm，N.A.Oral delivery of insulin using pH-responsive complexation gels.J.Pharm.Sci.1999，88933-937)。反之，肿瘤细胞的周围一般比正常细胞的略显酸性，用在酸性膨胀，碱性收缩的聚合物亦可使药物在肿瘤细胞周边释放(参见Gillies，E.R. & Frechet，J.M.pH-Responsive copolymer assemblies forcontrolled release of doxorubicin.Bioconjug Chem. 2005，16361-368；——Le Garrec，D.，Taillefer，J.，Van Lier，J.E.，Lenaerts，V.，Leroux，J.C.Optimizing pH-responsive polymeric micelles for drug delivery in acancer photodynamic therapy model.J.Drug Target.2002，10429-437)。上述药物释放系统均是以人工合成的聚合物固定药物，以实现药物的可控制释放的。
病毒，作为一种天然的半生命体微生物，其大小在10～300nm之间。病毒粒由中心的核酸(RNA或DNA)和蛋白质外壳所构成。如果除去内部的核酸，病毒内部就会形成一个由外壳蛋白质围绕起来的空壳。而外壳蛋白质之间有许多通向病毒内部的缝隙或孔道。这些孔道的大小会随着环境的变化而发生改变，从而改变其通透性和与外界的传质。豇豆退绿斑驳病毒(CCMV)是结构已知的植物病毒。对空壳CCMV的制备和材料封装已经进行了研究。(参见Speir，J.A.，Munshi，S.，Wang，G.，Baker，T.S. & Johnson，J.E.Structures of the native andswollen forms of cowpea chlorotic mottle virus determined by X-raycrystallography and cryo-electron microscopy.Structure 1995，363-78；Douglas，T. & Young.M.Host-guest encapsulation of materials by assembledvirus protein cages.Nature 1998，393152-155)由于空壳病毒可捕捉和装载分子、高分子和纳米物质，并且它的孔道能够随着介质酸碱性的转换而打开和闭合。这样，利空壳病毒来封装药物就可制备出纯粹由天然物质构成的，pH值响应性的药物释放系统。
发明内容本发明目的是制备出一种不含有人工合成聚合物的药物释放系统，解决现有技术中药物释放系统与生物体的不相容、难降解和毒副作用等问题。并利用空壳病毒表面孔道在不同pH值环境下的开关转换，以达到控制药物释放量的目的。
本发明提供的以病毒衣壳制备pH响应的药物释放系统，其具体制备过程如下——病毒自组装和纯化在乙酸钠-氯化钠缓冲液(pH 4.8)中悬浮0.5～5.0mg/mL的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析15～20h，使空壳病毒颗粒组装起来；组装的混合物载入10～40％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38,000rpm下离心4～6h；梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份；——单体的封装在5℃下，在20～30mL的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，加入10～20mg上步收集物空壳豇豆退绿斑驳病毒和36～45mg水溶性药物，在摇床上孵化3～4h；然后，用乙酸钠-乙酸缓冲液降低体系的pH值至4.5；在Centricon 100中过滤，并用乙酸钠-乙酸缓冲液洗涤；样品随后载入10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分离；收集280nm吸收峰的梯度馏分，得到药物释放系统。
上述水溶性药物可以但不限于氯霉素、5-(1-甲基丁基)-5-(2-丙烯基)-2，4，6-(1H，3H，5H)-嘧啶三酮的钠盐即商品名为司可巴比妥钠、或6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-6，8-二脱氧-D-赤式-a-D-半乳辛吡喃糖苷盐酸盐一水合物即商品名为盐酸林可霉素。
本发明的优点和积极效果CCMV病毒为植物病毒，且不含有核酸，对人体无感染性。病毒空壳由蛋白质构成。由此可避免人工合成聚合物载体在药物释放系统中的一些弊端，如与生物体的不相容，不易降解等。此外，该药物释放系统可根据不同的pH环境来控制氯霉素药物的释放量。在酸性环境下，由于孔道闭合，氯霉素释放缓慢；而在碱性环境下，孔道张开，氯霉素则迅速释放。此类药物释放体系可模拟pH响应药物“开-关”释放系统。
图1是pH响应的病毒衣壳的氯霉素释放曲线图。
具体实施方式实施例11.病毒自组装和纯化从纯化了的外壳蛋白来组装空壳病毒粒。在乙酸钠-氯化钠缓冲液(pH 4.8)中悬浮0.5mg/mL的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析15h，使空壳病毒颗粒组装起来。组装的混合物载入10～40％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38000r.p.m.下离心4h。梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份。
2.氯霉素的封装在5℃下，在20mL的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，加入10mg空壳豇豆退绿斑驳病毒和36mg氯霉素，在摇床上孵化3h。然后，用乙酸钠-乙酸缓冲液降低体系的pH值至4.5。在Centricon 100中过滤，并用乙酸钠-乙酸缓冲液洗涤。样品随后载入如前所述的10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分离。收集280nm吸收峰的梯度馏分。
3.氯霉素的释放在10mL的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和乙酸钠-乙酸缓冲液(pH 4.5)缓冲液中分别加入5mg封装了氯霉素的空壳豇豆退绿斑驳病毒。置于37℃的摇床孵化，每间隔15min分别取0.5mL的释放介质以备检测，为保持释放介质的体积恒定，需补充等量的新鲜释放介质。所取出的释放介质定容至10mL，用紫外-可见分光光度计在293nm处监测氯霉素的释放量，参见图1。
实施例21.病毒自组装和纯化在乙酸钠-氯化钠缓冲液(pH 4.8)中悬浮3mg/mL的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析15h，使空壳病毒颗粒组装起来。组装的混合物载入10～40％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38000r.p.m.下离心4h。梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份。
2.司可巴比妥钠的封装在5℃下，在25mL的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，加入15mg空壳豇豆退绿斑驳病毒和40mg司可巴比妥钠[5-(1-甲基丁基)-5-(2-丙烯基)-2，4，6-(1H，3H，5H)-嘧啶三酮的钠盐]，在摇床上孵化4h。然后，用乙酸钠-乙酸缓冲液降低体系的pH值至4.5。在Centricon 100中过滤，并用乙酸钠-乙酸缓冲液洗涤。样品随后载入如前所述的10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分离。收集280nm吸收峰的梯度馏分。
实施例31.病毒自组装和纯化在乙酸钠-氯化钠缓冲液(pH 4.8)中悬浮5mg/mL的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析15h，使空壳病毒颗粒组装起来。组装的混合物载入10～40％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38000r.p.m.下离心4h。梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份。
2.盐酸林可霉素的封装在5℃下，在30mL的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，加入20mg空壳豇豆退绿斑驳病毒和45mg盐酸林可霉素[6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-6，8-二脱氧-D-赤式-a-D-半乳辛吡喃糖苷盐酸盐一水合物]，在摇床上孵化4h。然后，用乙酸钠-乙酸缓冲液降低体系的pH值至4.5。在Centricon100中过滤，并用乙酸钠-乙酸缓冲液洗涤。样品随后载入如前所述的10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分离。收集280nm吸收峰的梯度馏分。
权利要求
1.一种以病毒衣壳制备pH响应的药物释放系统，其特征是该系统的具体制备过程如下——病毒自组装和纯化在乙酸钠-氯化钠缓冲液(pH 4.8)中悬浮0.5～5.0mg/mL的空壳豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白质，在4℃下将悬浮液透析15～20h，使空壳病毒颗粒组装起来；组装的混合物载入10～40％蔗糖梯度，并用超速离心转子在38,000r.p.m.下离心4～6h；梯度分层，收集280nm紫外吸收峰的层份；——单体的封装在5℃下，在20～30mL的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，加入10～20mg上步收集物空壳豇豆退绿斑驳病毒和36～45mg水溶性药物，在摇床上孵化3～4h；然后，用乙酸钠-乙酸缓冲液降低体系的pH值至4.5；在Centricon 100中过滤，并用乙酸钠-乙酸缓冲液洗涤；样品随后载入10～40％蔗糖梯度，进行超速离心分离；收集280nm吸收峰的梯度馏分，得到药物释放系统。
2.根据权利要求1所述的pH响应的药物释放系统，其特征是水溶性药物为氯霉素、5-(1-甲基丁基)-5-(2-丙烯基)-2，4，6-(1H，3H，5H)-嘧啶三酮的钠盐即司可巴比妥钠、或6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-6，8-二脱氧-D-赤式-a-D-半乳辛吡喃糖苷盐酸盐一水合物即盐酸林可霉素。
全文摘要
一种以病毒衣壳制备pH响应的药物释放系统。本发明将氯霉素封装在豇豆退绿斑驳病毒空壳中，利用豇豆退绿斑驳病毒空壳表面的孔道在碱性环境中张开，酸性环境下关闭的特点，制备pH响应药物控制释放系统。此类药物释放体系可模拟pH响应药物“开－关”释放系统。该药物释放系统在碱性条件下氯霉素的释放率高于酸性条件。
文档编号A61P31/04GK1814293SQ20051012220
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月6日 优先权日2005年12月6日
发明者黄积涛, 郑嗣华, 张嘉琪, 黄卫洪, 谢秀荣 申请人:天津理工大学