专利名称：包含vegf受体片段的优化融合蛋白质及其医疗应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及编码包含VEGF受体片段的优化重组融合蛋白的DNA序列、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的药物用途、含有该融合蛋白的药物及其制剂、及运载和表达该融合蛋白的基因治疗方法。
背景技术：
肿瘤快速生长的一个重要条件是血管新生(angiogenesis)(Hanahan et al，Cell，1996，86353-364)。大量的动物模型和人体临床试验已经证明，阻断肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻止肿瘤的生长和引发肿瘤细胞的死亡，从而达到对肿瘤的治疗效果。因此，抑制血管新生(anti-angiogenesis)是目前抗肿瘤新药研究的热点和最有前途的领域，此类生物新药中已经有一个获得了美国FDA的上市批准，同时还有十几种正在进行多种临床试验。另外，对于老年性视网膜血管病变(Age-related macular degeneration，简称为AMD、糖尿病视网膜病变、关节炎等多种与血管新生相关的疾病，抑制血管新生治疗新药也有广泛和重要的作用(Folkman，Nature Medicine，1995，127-31；Ferrara，Seminars in Oncology，2002，29(6sumppl)10-14)。
血管新生是一个有多种活性生物因子进行调控的复杂过程，其中一个关键环节是内皮细胞表面受体由多种生长因子相结合从而被激活，然后经细胞内酪氨酸磷酸化的信号传递系统控制内皮细胞活动，从而促使血管新生。多种生长因子中，血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor，简称为VEGF)是控制血管新生最重要的因子(Ferrara，Endocrine Reviews，2004，25(4)581-611)，其在几乎所有的人体肿瘤中都过量表达，是抗癌研究的一个重要分子靶标。VEGF在血管内皮细胞表面上有多种受体，其中包括VEGFR-1(又称为Flt-1)和VEGFR-2(又称为KDR或Flk-1)，它们的细胞外部分均由七个可与VEGF相结合的免疫球蛋白样区域(D1-D7)组成，细胞内部分均包括酪氨酸激酶基团。当受体被VEGF激活后，细胞内的酪氨酸激酶基团发生磷酸化，并导致一系列的信号传递，最终引发血管新生。
由于VEGF信号传递对血管新生的重要性，阻断VEGF或VEGF受体从而达到抑制血管新生具有重要的抗癌作用，同时也对其他包括视网膜血管病变等与血管新生相关的疾病有着重要的治疗作用。目前唯一被美国FDA批准的针对血管新生的抗癌药物就是特异性结合VEGF-A的单克隆抗体，其机理就是通过结合VEGF达到阻断VEGF与其受体结合的目的(Ferrara et al，Nature ReviewsDrug Discovery，2004，3391-400)。另一类可能效果更好的VEGF阻断剂是VEGF受体的细胞外片段，其具有天然的针对VEGF的高特异性(Kuo et al，Proceedings of the National Academy of Sciences，2001，984605-4610)。为了增加在血清中的半衰期和血清浓度，VEGF受体的细胞外片段往往和免疫球蛋白的Fc部分相连成融合蛋白，该融合蛋白可在体内二聚化，并具有和免疫球蛋白类似的优异药动学特性。研究表明，这种融合蛋白在体外可以中和VEGF，从而阻断VEGF信号传递和血管内皮细胞的增生，但是在动物试验中的抑制血管新生效果不够理想(Ferrar et al，Nature Medicine，1998，4336-340；Gerberet al，Nature Medicine，1999，5623-628；Gerber et al，Cancer Reserch，2000，606253-6258)，其原因可能是该种融合蛋白的结构不够稳定，从而影响它们的血清浓度及其对VEGF的亲和性，导致对VEGF的不完全阻断。
为了改进上述的VEGF受体的细胞外片段和Fc的融合蛋白，本发明提供了一个优化融合蛋白的方法，大大提高了融合蛋白的稳定性和生物活性，使得其在体外和动物内都可以更有效地结合和中和VEGF，阻断血管新生，抑制肿瘤发展。
发明内容
本发明目的之一是提供优化的包含VEGF受体细胞外片段和人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，其在体内外都具有优良的稳定性和生物活性，并能阻断VEGF信号传递，从而抑制血管新生和肿瘤发展。
本发明目的之二是提供编码所述融合蛋白的核苷酸序列。
本发明目的之三是提供含有编码所述融合蛋白的核苷酸序列，其表达载体和由该载体转化的重组体，以及表达细胞。
本发明的目的之四是提供该融合蛋白作为阻断血管新生的药物在治疗肿瘤和视网膜血管病变等相关疾病中的应用，还有包含上述融合蛋白及可药用载体的药物组合物及其在治疗相关疾病，特别是抗肿瘤的应用。
本发明的要点在于根据前人所尝试的VEGF受体细胞外片段和Fc的融合蛋白结构不稳定的特点，设计并建造了一系列优化了的肽连接段(peptide linker)插于VEGF受体的细胞外片段和Fc之间，使得VEGF受体的细胞外片段和Fc之间具有足够高的结构弹性和可塑性，从而大大增加了融合蛋白的稳定性，更重要的是，显著提高了与多种VEGF结合的亲和力。这种包含肽连接段的优化融合蛋白，和没有包含该肽连接段的融合蛋白相比，具有更高的生物活性和更长的血清半衰期，从而能够更有效地中和VEGF，抑制血管新生和肿瘤发展。
研究表明，VEGFR-1的N端第二个免疫球蛋白样区域D2对于VEGF的亲和性具有特别重要的作用，不包含D2的多种VEGF受体融合蛋白损失了绝大部分的VEGF亲和力，而包含D2的多种VEGF受体融合蛋白则保存了对VEGF的亲和力，因此，D2被认为对于结合VEGF起着决定性的作用。自然，D2和Fc的融合蛋白是作为VEGF阻断剂的首选，但是这种尝试失败了，单独的D2片段和Fc的融合蛋白丧失了大部分结合VEGF的活性(Davis-Smyth et al，United States Patent Application 0030092604)。在此失败的D2-Fc融合蛋白中，只有一个包含二个氨基酸(FE)的连接段位于D2片段和Fc之间，这可能就是其失败的原因。D2和Fc是二个独立的具有不同功能的区域，均必须形成各自稳定有活性的三维空间结构，特别是在二个Fc区域二聚化后，二个D2区域必须保持其结构稳定性和生物活性，从而保证其对VEGF的亲和力。而在此失败的D2-Fc融合蛋白中，D2和Fc间的二个氨基酸很可能不足以提供足够的结构空间来满足D2和Fc稳定结构的需要，使得D2、或Fc、或二者均不能形成稳定的结构，最终大大影响D2-Fc融合蛋白对VEGF的亲和力。本发明则提供了一系列弹性结构的优化肽连接段以连接D2和Fc，使得D2和Fc都有足够的空间来形成稳定的结构，从而保证了此优化的D2-Fc融合蛋白对VEGF的亲和力和生物活性，比原有的D2-Fc融合蛋白提高了约千倍的VEGF亲和力。
此弹性结构肽连接段的优化设计也可用于其他的VEGF受体细胞外片段和Fc的融合蛋白，以提高它们的稳定性和生物活性。一种已知的优良VEGF阻断剂是VEGFR-1的第二个免疫球蛋白样区域D2、VEGFR-2的第三个免疫球蛋白样区域D3、和Fc的融合蛋白，其对VEGF在体外的亲和力高达～1pM(Holashet al，Proceedings of the National Academy of Sciences，2002，99(17)11393-11398)。本发明利用了同样的优化设计，在此融合蛋白中的D2、D3和Fc之间插入了弹性结构的优化肽连接段以取代原有的三个氨基酸(GPG)后，发现其对VEGF的亲和力比原来的融合蛋白提高了10倍。
本发明描述的VEGF受体细胞外片段和Fc的优化融合蛋白是通过常规的基因重组技术所建造，具体实验步骤如《分子克隆》第三版(Joseph Sambrook，科学出版社)及类似的实验手册所记载。所用的VEGF受体细胞外片段和Fc是1. VEGFR-1的的第2免疫球蛋白样区域，表示为D2，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2. VEGFR-2的的第3免疫球蛋白样区域，表示为D3，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
3.人免疫球蛋白Fc来自于IgG1，表示为Fc，氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所述。
本发明优化的融合蛋白中所用的肽连接段是1. G9，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。
2. G12，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所述。
3. GS，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所述。
如图1所示，YY-001和YY-005是文献已记载过的融合蛋白。YY-001由VEGFR-1的的第2免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc所构成，表示为D2-Fc。YY-005由VEGFR-1的的第2免疫球蛋白样区域、VEGFR-2的的第3免疫球蛋白样区域、和人免疫球蛋白Fc所构成，表示为D2D3-Fc。本发明提供的优化融合蛋白则是在YY-001和YY-005中的Fc前插入了增加结构弹性的肽连接段1. YY-002D2-G9-Fc。
2. YY-003D2-G12-Fc。
3. YY-004D2-GS-Fc。
4. YY-006D2D3-G9-Fc。
5. YY-007D2D3-G12-Fc。
6. YY-008D2D3-GS-Fc。
其中YY-001到YY-008的编码DNA序列见序列表中的SEQ ID NO.7-14。
上述的优化融合蛋白及其编码DNA可通过常规的基因重组技术获得。所需编码VEGFR-1、VEGFR-2、和Fc的DNA序列由NCBI(National Center forBiotechnology Information)的GenBank中获得后，将编码上述优化融合蛋白的DNA序列由PCR合成后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学所常用的质粒、病毒或DNA片段。在编码上述优化融合蛋白的DNA序列的末端前加上蛋白分泌信号序列，以保证蛋白质从细胞中分泌出来。载体序列中包括用于驱动基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中有抗菌素抗性基因，以利于载体在宿主细胞，如细菌中繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。
由于VEGFR-1和VEGFR-2中各个免疫球蛋白样区域的氨基酸序列之间并没有绝对的分界，因此各免疫球蛋白样区域的氨基酸序列的长度可以有一定的变化。所以，本发明所涉及的优化融合蛋白质的氨基酸序列也可以有一定的变化，它们都属于本发明的范围。
上述优化融合蛋白中的Fc来自人免疫球蛋白IgG1，也可以是亚型IgG2、IgG3、IgG4、或者人免疫球蛋白IgM和IgA，该免疫球蛋白Fc片段可以为Fc全长或部分Fc序列，如选自CH2片断、CH3片断或绞合区域片段，它们都属于本发明的范围。
上述优化融合蛋白中的肽连接段目的在于提供更好的弹性和可塑性，因此其氨基酸序列和长度都可以有一定的变化，也可以由一个完全随机的肽链文库中筛选而得，它们都属于本发明的范围。
在完成含编码上述优化融合蛋白的DNA序列的质粒构建以后，即可用该重组载体转染或转化宿主细胞，表达相应的融合蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，可以是真核细胞也可以是原核细胞，它们包括(但不限于)哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫细胞等。由于本发明的优化融合蛋白质的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸，因此，哺乳动物细胞是表达这些蛋白质的最佳系统。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，例如293细胞、CHO细胞、SP20细胞、NS0细胞、COS细胞、BHK细胞或PerC6细胞等，许多其他细胞也可用于这些蛋白质的表达和生产，因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述优化融合蛋白的重组质粒可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，其中包括但不限于电钻孔法(electroporation)、脂质体介导法、钙介导法等。
一种较佳的表达方法是在已稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增，以提高相应重组融合蛋白的表达量，例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量；又例如对表达谷氨酰胺合成酶(GS)的稳定转染宿主细胞，利用增加培养液中甲硫氨酸亚砜(MSX)的浓度可扩增重组载体的拷贝数量。
哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如细菌、酵母或昆虫细胞等也能用于表达这些优化融合蛋白，它们也包括在本发明所能使用的细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的为高，但是，所表达的蛋白质缺乏糖基化或者所形成的糖链与哺乳动物细胞不同。
优化融合蛋白质表达后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测定细胞培养液中融合蛋白质的浓度。由于这些优化融合蛋白质包含免疫球蛋白Fc，因此可用蛋白A亲和层析法来提纯所表达的优化融合蛋白质。
从重组体培养液中获得相应的优化融合蛋白质后，可利用VEGF体外结合实验来检测和比较各种蛋白质对VEGF的亲和力。实验结果证明，与现有技术公开的YY-001和YY-005融合蛋白相比，本发明所构建的优化融合蛋白质大大提高了对VEGF的亲和力(见图2)。因此，本发明所构建的优化融合蛋白对VEGF具有更好的阻断作用，从而可以更有效地抑制血管新生，治疗与血管新生或者VEGF相关的疾病，它们包括但不限于各种肿瘤、视网膜血管病变AMD、糖尿病视网膜病变、关节炎、贫血或子宫内膜增殖症等。
本发明还提供了动物实验以证明本发明提供的优化融合蛋白质在活体内的抗血管新生作用。实验证明，在HCC Hep3B肝癌和Lovo大肠癌的小鼠模型中，本发明提供的融合蛋白都充分抑制了肿瘤的生长，而且效果明显好于现有技术的YY-001和YY-005融合蛋白，因此，本发明所构建的融合蛋白具有高效的抗癌能力。另外，在激光诱发脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，简称为CNV)小鼠模型中，本发明提供的优化融合蛋白YY-007通过腺相关病毒AAV2载体的表达，有效地抑制和预防了CNV的生成，因此，对视网膜血管病变拥有良好的医疗前景。
本发明还提供了以病毒载体来运载和表达这些优化融合蛋白的方法。这些载体包括腺相关病毒AAV，其中包括但不限于血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、和AAV9，和其他的病毒载体，包括但不限于腺病毒载体(adenoviral vectors)、反转录病毒载体(retroviral vectors)、单纯疱疹病毒载体(herpes simplex virus-based vectors，HSV)、和慢病毒载体(lentiviralvectors)。
本发明还提供了含有本发明融合蛋白和药用载体的药物组合物。该药物组合物可以按照制剂学常规技术制成各种形式的药物制剂，优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂。
本发明的药物组合物，其中还包括任何一种或几种其他的具有协同作用的抑制血管新生的药物，所述组合物可以和其他治疗方法一起治疗血管新生相关疾病，所述其他治疗方法选自化学疗法、反射疗法、基因疗法。
附表说明表1列举了多种优化融合蛋白体外结合VEGF的亲和力。
表2显示了腺相关病毒AAV2表达的YY-007在激光诱发CNV小鼠模型中预防CNV的明显效果。
表1.各融合蛋白的VEGF亲合力
表2.腺相关病毒AAV2表达的YY-007在小鼠眼内能够预防CNV的生成
图1为融合蛋白示意图VEGFR-1的第2免疫球蛋白样区域表示为D2，VEGFR-2的第3免疫球蛋白样区域表示为D3，人免疫球蛋白Fc区域表示为Fc，三种优化肽连接段表示为G9、G12、和GS。
图1描述了文献已记载过的VEGF受体细胞外片段和Fc的融合蛋白YY-001和YY-005的蛋白组成结构，及相应的包含肽连接段的优化融合蛋白的组成结构。
图2为各种融合蛋白在体外结合VEGF的比较图2-A.YY-002、YY-003、和YY-004的VEGF亲和力比YY-001提高了至少千倍。
图2-B.YY-006，YY-007、和YY-008的VEGF亲和力高达0.1pM，比YY-005提高了约10倍，其中YY-007和YY-008比YY-006的亲和力更稍高10％。
图2显示了在本发明一较佳实施例中多种VEGF受体细胞外片段和Fc的融合蛋白与VEGF在体外结合的试验结果，其中X轴代表融合蛋白的浓度(pM)，Y轴代表自由的VEGF的浓度(pM)。结果表明三种包含肽连接段的优化融合蛋白均大大提高了其对VEGF的亲和力，而三种不同肽连接段的优化融合蛋白之间则没有明显区别。其中YY-002，YY-003，YY-004比YY-001的VEGF亲和力提高了至少千倍，而YY-006，YY-007，YY-008比YY-005提高了10倍左右。
图3为优化融合蛋白有效地抑制HCC Hep3B肝癌在小鼠体内的生长YY-001和Fc对HCC Hep3B肝癌细胞的生长没有影响，YY-003和YY-005的效果相近，对肝癌细胞的生长有着显著的抑制作用，而YY-007的抗癌作用最佳，完全遏制了肝癌细胞的生长。
图3显示了包含肽连接段的优化融合蛋白能够更有效地抑制HCC Hep3B肝癌在小鼠体内的生长。
图4为优化融合蛋白有效地抑制Lovo大肠癌在小鼠体内的生长YY-001和Fc对Lovo大肠癌细胞的生长没有影响，YY-003和YY-005对肝癌细胞的生长有明显的抑制作用，而YY-007的抗癌作用最佳，完全遏制了Lovo大肠癌细胞的生长。
图4显示了包含肽连接段的优化融合蛋白能够更有效地抑制Lovo大肠癌在小鼠体内的生长。
图5为腺相关病毒AAV2表达的YY-007在小鼠眼内抑制CNV的生成CNV的面积由所有的激光灼烧点平均而得，各列中的数字代表检测过的眼睛总数。
图5显示了腺相关病毒AAV2表达的YY-007在激光诱发脉络膜新生血管CNV小鼠模型中能抑制CNV的生成。
具体实施例方式
以下实施例对本发明所涉及的优化融合蛋白构建、试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容及用途并不限制于实例的范围。
实施例1克隆编码优化融合蛋白的DNA序列及构建重组载体本发明中多种优化融合蛋白的编码DNA是通过聚合酶酶链反应(PCR)由VEGFR-1、VEGFR-2、和免疫球蛋白IgG1Fc的cDNA以不同的引物扩增而得。
本优选实施例所构建的八种融合蛋白的结构见附图1。
例1构建YY-001基因及重组载体YY-001由VEGFR-1的的第2免疫球蛋白样区域(D2)和人免疫球蛋白Fc融合而成，其N端加上了VEGFR-1的信号肽以保证其细胞外的分泌，在D2和Fc之间有一包含二个氨基酸(FE)的连接段。
其中信号肽的PCR片段(140bp)是以质粒pBLAST-hFLT-1(Invivogen公司)为模板和如下引物扩增而得引物15’-GAGCTCGAATTCGCAACCACCATGGTCAGCTACTGGGAC-3’引物25’-ATAAATATATAGATAGTCAGATCTGGATCTTTTAATTTTGATCCGGAACTAGATCCTGTG-3’其中D2的PCR片段(340bp)是以质粒pBLAST-hFLT-1(Invivogen公司)为模板和如下引物扩增而得引物35’-CTGACTATCTATATATTTATTAGTGATACCGGTAGACCTTTTGTAGAGATGTAC-3’引物45’-GTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTTCGAATTGTCGATGTGTGAGATAG-3’
其中Fc的PCR片段(724bp)是从人淋巴结cDNA(BD Clontech公司)为模板和如下引物扩增而得引物55’-CTATCTCACACATCGACAATTCGAAGACAAAACTCACACATGCCCAC-3’引物65’-AAGGGAATCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’然后D2-Fc的融合片段(1017bp)是以上述D2和Fc的PCR片段为模板，由引物3和引物6拼接PCR扩增所得。最后包括信号肽的D2-Fc的融合片段(1137bp)则是以上述信号肽的PCR片段和D2-Fc的融合片段为模板，由引物1和引物6拼接PCR扩增所得。
编码YY-001的DNA克隆由上述包括信号肽的D2-Fc融合片段的EcoRI和NotI酶切产物(1117bp)插入到载体质粒pCI-neo(Promega公司)的EcoRI和NotI酶切点所得。该重组质粒利用CMV启动子来表达YY-001，并包含SV40的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保证其最佳的表达量。该重组质粒还包含氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因以利于在细菌中的繁殖，和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于稳定转染哺乳细胞的选择。将编码YY-001的重组质粒转染E.coli(DH5α)后加入LB培养基培养过夜，由Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒后进行酶切及测序鉴定，所获得的编码YY-001的DNA序列如SEQ ID NO.7所述。
例2构建YY-002，YY-003，和YY-004基因及重组载体YY-002、YY-003、和YY-004类似于YY-001，也是由VEGFR-1第2免疫球蛋白样区域(D2)和人免疫球蛋白Fc融合而来，但是它们是在Fc前分别包含了G9、G12、和GS肽连接段的优化融合蛋白。它们的建造是以YY-001质粒为模板，通过拼接PCR(Bridge PCR)的方法构造而得。
YY-002编码DNA的建造首先以引物1和7，及引物8和9分别PCR扩增YY-001质粒得到二个PCR产物(460bp和244bp)，然后以它们为模板，以引物1和9进行拼接PCR所得(682bp)。
引物75’-CTCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCTTGTCGATGTGTGAGATAG-3’引物85’-GGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGACAAAACTCACACATGCC-3’
引物95’-GCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGC-3’随后AccIII和SacII酶切后(579bp)插入到YY-001质粒的AccIII和SacII酶切点，得到编码YY-002的重组质粒。转染E.coli(DH5α)后获得编码YY-002的重组质粒，所获得的编码YY-002的DNA序列如SEQ ID NO.8所述。
YY-003的建造与YY-002类似，只是以引物1和7，及引物10和9分别PCR扩增YY-005质粒后(460bp和253bp)，再以它们为模板，以引物1和9进行拼接PCR所得(691bp)。
引物105’-GGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGGCGGTGGTGACAAAACTCACACATGCC-3’AccIII和SacII酶切后(588bp)插入到YY-001质粒的AccIII和SacII酶切点，得到编码YY-003的重组质粒，所获得的编码YY-003的DNA序列如SEQ ID NO.9所述。
YY-004的建造与YY-002类似，只是以引物1和11，及引物12和9分别PCR扩增YY-005质粒后(464bp和256bp)，再以它们为模板，以引物1和9进行拼接PCR所得(700bp)。
引物115’-CCGCTGCCACCGCCACCGGAGCCACCTCCACCTTGTCGATGTGTGAGATAG-3’引物125’-TCCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCTGACAAAACTCACACATGCC-3’AccIII和SacII酶切后(597bp)插入到YY-001质粒的AccIII和SacII酶切点，得到编码YY-004的重组质粒，所获得的编码YY-004的DNA序列如SEQ ID NO.10所述。
例3构建YY-005基因及重组载体YY-005由VEGFR-1的第2免疫球蛋白样区域(D2)、VEGFR-2的的第3免疫球蛋白样区域(D3)、和人免疫球蛋白Fc融合而成，其N端加上了VEGFR-1的信号肽以保证其细胞外的分泌，在D2D3和Fc之间有一包含三个氨基酸(GPG)的连接段。编码YY-005的DNA是以D2、D3、和Fc的单独PCR片段为模板，通过拼接PCR(Bridge PCR)的方法构造而得。
其中D2的PCR片段(325bp)是以质粒pBLAST-hFLT-1(Invivogen公司)为模板和如下引物扩增而得引物135’-CTCGAGAATTCGCAACCTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3’引物145’-ACATCTATGATTGTATTGGTTTGTCGATGTGTGAGATAG-3’其中D3的PCR片段(340bp)是以质粒pBLAST-hFlk-1(Invivogen公司)为模板和如下引物扩增而得引物155’-ACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATG-3’引物165’-TTTTGTCGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3’其中Fc的PCR片段(712bp)是从人淋巴结cDNA(BD Clontech公司)以引物17和6扩增而得引物175’-AAAGGGCCCGGGCGACAAAACTCACACATGCCCACTGTGC-3’然后D2D3的融合片段(645bp)是以上述D2和D3的PCR片段为模板，由引物13和引物16拼接PCR扩增所得。D2D3-Fc的融合片段(1337bp)则是以上述D2D3的融合片段和Fc的PCR片段为模板，由引物13和引物6拼接PCR扩增所得。
编码YY-005的DNA克隆由上述D2D3-Fc融合片段的EcoRI和NotI酶切产物(1318bp)插入到载体质粒pCI-neo(Promega公司)的EcoRI和NotI酶切点所得。最后把以下的合成寡核苷酸直接插入到EcoRI和AccIII酶切点以加入VEGFR-1的信号肽正向链5’-AATTCGCAACCACCATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTAGTT-3’反向链5’-CCGGAACTAGATCCTGTGAGAAGCAGACAGCTGAGCAGCGCGCACAGCAGGACCCCGGTGTCCCAGTAGCTGACCATGGTGGTTGCG-3’将编码YY-005的重组质粒转染E.coli(DH5α)后加入LB培养基培养过夜，由Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒后进行酶切及测序鉴定，所获得的编码YY-005的DNA序列如SEQ ID NO.11所述。
例4构建YY-006，YY-007，和YY-008基因及重组载体YY-006、YY-007、和YY-008类似于YY--005，也是由VEGFR-1第2免疫球蛋白样区域(D2)、VEGFR-2的第3免疫球蛋白样区域(D3)、和人免疫球蛋白Fc融合而来，但是它们是在Fc前分别包含了G9、G12、和GS肽连接段的优化融合蛋白。它们的建造是以YY-005质粒为模板，通过拼接PCR(BridgePCR)的方法构造而得。
YY-006编码DNA的建造首先以引物13和18，及引物8和9分别PCR扩增YY-001质粒得到二个PCR产物(657bp和244bp)，然后以它们为模板，以引物13和9进行拼接PCR所得(879bp)。随后AccIII和SacII酶切后(852bp)插入到YY-005质粒的AccIII和SacII酶切点，得到编码YY-006的重组质粒，所获得的编码YY-006的DNA序列如SEQ ID NO.12所述。
引物185’-CTCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCCTTTTCATGGACCCTGAC-3’YY-007的建造与YY-006类似，只是以引物13和18，及引物10和9分别PCR扩增YY-001质粒后(657bp和253bp)，再以它们为模板，以引物13和9进行拼接PCR所得(888bp)。AccIII和SacII酶切后(861bp)插入到YY-005质粒的AccIII和SacII酶切点，得到编码YY-007的重组质粒，所获得的编码YY-007的DNA序列如SEQ ID NO.13所述。
YY-008的建造与YY-006类似，只是以引物13和19，及引物12和9分别PCR扩增YY-001质粒后(661bp和256bp)，再以它们为模板，以引物13和9进行拼接PCR所得(897bp)。AccIII和SacII酶切后(870bp)插入到YY-005质粒的AccIII和SacII酶切点，得到编码YY-008的重组质粒，所获得的编码YY-008的DNA序列如SEQ ID NO.14所述。
引物195’-CCGCTGCCACCGCCACCGGAGCCACCTCCACCCTTTTCATGGACCCTGAC-3’
实施例2优化融合蛋白在细胞中的表达和提纯本发明中多种优化融合蛋白是在293细胞和CHOS细胞中表达并分泌到培养液中的，并利用葡萄球菌A蛋白亲和层析的方法纯化所得。
例5融合蛋白在293T细胞中的瞬时表达本发明中的YY-001到YY-008重组质粒建造后，通过用质粒DNA提纯药盒(QIAGEN公司)提取高纯度质粒DNA，然后利用Lipofectamine 2000质粒转染药盒(INVITROGEN公司)将该重组质粒DNA导入293细胞(ATCC机构)中，在无血清培养液293SFMII(INVITROGEN公司)中培养三天后收集包含表达了优化融合蛋白的上清液。此方法可用于获取少量的优化融合蛋白，其浓度可用ELISA法定量确定。
例6融合蛋白在CHOS细胞中的稳定表达将编码YY-001到YY-008的重组高纯度质粒利用Lipofectamine 2000质粒转染药盒(Invitrogen公司)导入CHOS细胞(Invitrogen公司)中，在无血清培养液CHOS SFMII(Invitrogen公司)中培养二天后加入新酶素，用有限密度稀释法进行克隆培养，大约14天后挑取新酶素抗性克隆进行细胞的扩大培养并在液氮中冷冻收藏。稳定转染后的CHOS细胞可在转鼓培养瓶中培养生产优化融合蛋白，此方法可用于获取大量的优化融合蛋白，其浓度可用ELISA法定量确定。
例7融合蛋白的纯化包含融合蛋白的细胞培养液可采取葡萄球菌A蛋白亲和层析的方法进行纯化。将蛋白A-Sepharose层析柱以PBS缓冲液洗以平衡后，以2毫升/分钟的速度将超滤器浓缩过的培养液上样，用PBS缓冲液洗直至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测)，然后用100mM的柠檬酸(PH 3)洗脱结合蛋白，立刻以足够多的2MIris进行中和。纯化后的融合蛋白可用ELISA法或A280吸收法确定浓度，并可置-20℃储存。
实施例3融合蛋白与VEGF的体外结合实验本发明利用高特异性和高灵敏度的VEGF检测药盒(R&D Systems公司)来确定各融合蛋白和VEGF的亲和力。实验中，将不同浓度(0到1000pM)的YY-001到YY-008融合蛋白和10pM的人VEGF165(Sigma公司)在室温下相混合，培养过夜后用VEGF检测药盒来检测没有被融合蛋白结合的自由VEGF浓度。原始实验结果在图2显示，经Prism4软件(GraphPad公司)Sigmoidal非线性拟合后所得到的亲和力及其标准偏差在表1中显示。
其中现有技术公开的融合蛋白YY-001在这个实验条件下没有可检测到的亲和力，而包含肽连接段G9、G12、和GS的优化融合蛋白YY-002、YY-003、YY-004都显示了优良的VEGF亲和力，大约为1pM，比YY-001提高了至少千倍以上。另外，现有技术公开的融合蛋白YY-005的亲和力也是1pM左右，与之类似的包含肽连接段G9、G12、和GS的优化融合蛋白YY-006、YY-007、YY-008的VEGF亲和力则提高了约十倍，高达0.1pM，其中YY-007和YY-008比YY-006的VEGF亲和力更是高大约10％。
实施例4优化融合蛋白能有效地抑制小鼠肿瘤的生长人类肿瘤细胞在BALB/C裸鼠(Simonsen Labratories公司)体内生长的异种移植(Xenograft)模型是与人体肿瘤最为接近的动物肿瘤模型。本发明利用了二种人类肿瘤细胞，HCC Hep3B肝癌和Lovo大肠癌细胞在裸鼠体内建立了肿瘤模型，并以本发明中的优化融合蛋白作为VEGF阻断剂用来抑制肿瘤的生长。
例8制备含融合蛋白的注射剂优化融合蛋白的注射剂可由多种配方制备而成，通常该融合蛋白的浓度为0.1mg/ml到100mg/ml，另外的成分包括但不限于各种载体蛋白、缓冲剂、电解质离子、和缓释剂。其中一种较佳的配方为20mg/ml的优化融合蛋白、5mM Phosphate、5mM Citrate、100mM NaCl、0.1％Tween 20、20％Sucrose、pH6.0，按照注射剂的常规制备方法制成。
例9优化融合蛋白能有效地抑制HCC Hep3B肝癌在裸鼠内的生长本实验中挑选生长良好的BALB/C裸鼠，每只在背部皮下注射2×106HCC Hep3B肝癌细胞，0.05ml，在尾静脉注射提各种融合蛋白，用量为2mg/kg，每周两次一直到第七周，对照组注射相同剂量的人免疫球蛋白Fc。肿瘤的体积每周按W×(L)2/2的方法测量一次，实验结果如图3所示。现有技术公开的YY-001和Fc对照组一样对肿瘤的生长没有抑制作用，此结果和YY-001没有可观察到的VEGF亲和力一致。而类似于YY-001的优化融合蛋白YY-003则表现出了显著的抗癌作用，同时，现有技术公开的，和YY-003具有相近VEGF亲和力的YY-005也表现出了类似的抗癌功能，进一步证明了这些融合蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用与它们对VEGF的亲和力成正比。同时，本发明所提供的VEGF亲和力最高的优化融合蛋白YY-007显示了卓越的抗癌作用，七周内注射它们的小鼠中几乎观察不到肿瘤的生长。
例10优化融合蛋白能有效地抑制Lovo大肠癌在裸鼠内的生长本实验过程如同上例，只是在每只裸鼠皮下注射了5×106Lovo大肠癌细胞。同样在尾静脉注射提各种融合蛋白，用量为2mg/kg，每周两次一直到第七周，对照组注射相同剂量的人免疫球蛋白Fc。肿瘤的体积每周测量一次，实验结果如图4所示。同上例的结果类似，这些融合蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用与它们对VEGF的亲和力成正比。YY-001和Fc对照组没有抗癌作用，YY-003和YY-005都显示了良好的抗癌效果，而YY-007则显示了最优的抗癌效果，完全抑制了肿瘤细胞在小鼠体内的生长。
实施例5以腺相关病毒AAV表达优化融合蛋白及其医疗应用腺相关病毒AAV在体内本身不能复制、可以感染多中人体细胞、并能在体内长期表达重组蛋白，因此在基因治疗上有着广泛的用途。本发明应用表达优化融合蛋白的腺相关病毒在视网膜血管病变AMD的小鼠模型CNV中取得了良好的治疗效果。
例11重组AAV载体的构造表达优化融合蛋白YY-007的腺相关病毒AAV2是利用AAV Helper-free药盒(Invitrogen公司)建造而得，此药盒包括三种质粒，pAAV-MCS、pAAV-RC、和pHelper，以及AAV-293细胞，它通过同时转染这三种质粒到AAV-293细胞中的方法来获得重组AAV2病毒。需要表达的重组蛋白必须克隆到pAAV-MCS中的CMV启动子和hGH的多聚腺苷酸(PolyA)序列之间以保证其最佳的表达。
本发明中以EcoRI和XbaI酶切表达YY-007的重组质粒后，将得到的～1.4kb DNA片段克隆到pAAV-MCS的EcoRI和XbaI酶切位点，以获得重组质粒pAAV-YY-007，然后将其和pAAV-RC、pHelper一起转染到AAV-293细胞中获得了表达YY-007的重组AAV2病毒。
例12重组AAV2表达的YY-007在小鼠中能够抑制CNV的生成本实验在小鼠通过激光诱发脉络膜新生血管CNV以建立视网膜血管病变AMD的动物模型。小鼠被盐酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉后，以1％托品酰胺散瞳，然后如文献(Tobe et al，American Journal of Pathology，1998，1531641-1646)所述，在每只眼睛的三个不同位置激光光凝破坏Bruch膜。激光光凝(激光功率120mW，曝光时间0.1s，光斑直径75μm)通过裂隙灯和手提聚焦镜灼烧到距离视神经2-3个视盘直径的9点、12点、和3点钟位置。Bruch膜破裂产生的气泡是一个诱发脉络膜新生血管的重要指标，因此本实验仅包括了产生气泡的灼烧点。激光光凝后，小鼠的右眼由玻璃体腔注射5微升共5×109个AAV2-YY-007病毒体，左眼作为对照组不接受任何处理。二个星期后，小鼠被处死并如文献(Mori et al，Investigative Ophthalomology & Visual Science，2002，43(6)1994-2000)所述方法检测脉络膜新生血管的程度，结果如图5所显示，YY-007能够抑制激光诱发CNV的生成。
例13重组AAV2表达的YY-007在小鼠中能够预防CNV的生成本实验中通过重组AAV2在小鼠眼睛内表达YY-007后，再接受激光诱发脉络膜新生血管CNV，以检测YY-007对CNV的预防效果。小鼠的右眼由玻璃体腔注射5微升共5×109个AAV2-YY-007病毒体，左眼作为对照组不接受任何处理。二个月后，如同例12，激光光凝破坏Bruch膜二个星期后检测CNV的生成。结果如表2所显示，YY-007具有明显的预防CNV的效果。
综上所述，本发明所提供的包含肽连接段的优化融合蛋白质大大提高了结构的稳定性和对VEGF的亲和性，并能在体内阻断血管新生。在动物模型中，这些优化融合蛋白能够高效地抑制肿瘤的生长，可用于多种肿瘤的治疗，也可以有效的治疗视网膜血管病变AMD，是可能用于治疗多种与VEGF相关疾病的高校血管新生抑制剂。
序列表<110>余波、童丽琴<120>包含VEGF受体片段的优化融合蛋白质及其医疗应用<160>14<210>1<211>93<212>PRT<213>人工序列<400>1Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr1 5 10 15Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile20 25 30Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly35 40 45Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala50 55 60Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly65 70 75 80His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr85 90 93<210>2<211>102<212>PRT<213>人工序列<400>2Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys1 5 10 15Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp20 25 30Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val35 40 45Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu50 55 60
Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr65 70 75 80Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe85 90 95Val Arg Val His Glu Lys100 102<210>3<211>227<212>PRT<213>人工序列<400>3Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly1 5 10 15Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met20 25 30Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His35 40 45Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val50 55 60His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr65 70 75 80Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly85 90 95Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile100 105 110Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val115 120 125Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser130 135 140Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu145 150 155 160Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro165 170 175Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val180 185 190Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met195 200 205His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser2l0 215 220Pro Gly Lys225 227
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421 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac481 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat541 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc601 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac661 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa721 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg781 acctgcctag tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg841 cagccggaga acaactacaa ggccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc901 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc961 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg1021 ggtaaatga<210>8<211>1050<212>DNA<213>人工序列<400>81 tccggatcaa aattaaaaga tccagatctg actatctata tatttattag tgataccggt61 agaccttttg tagagatgta cagtgaaatc cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg121 gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt181 ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa cgcataatct gggacagtag aaagggcttc241 atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat301 gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca catcgacaag gtggaggcgg aggtggcgga361 ggtggagaca aaactcacac atgcccactg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg421 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag481 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac541 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc601 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag661 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa721 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg781 accaagaacc aggtcagcct gacctgccta gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc841 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca aggccacgcc tcccgtgctg901 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag961 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag1021 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga<210>9<211>1059<212>DNA<213>人工序列<400>9
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权利要求
1.一种融合蛋白质，由来自VEGF受体的不同片段与人免疫球蛋白Fc构成，其特征在于，受体片段和Fc之间由一个优化肽连接段相连，该肽连接段选自以下组a.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，表示为G9；b.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，表示为G12；c.Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser，表示为GS；d.任何一个长度为4到30的氨基酸序列，其具有弹性结构并能增加融合蛋白的结构稳定性和生物活性。
2.如权利要求1所述的融合蛋白质，其中VEGF的受体片段选自以下组a.VEGFR-1的的第2免疫球蛋白样区域，表示为D2，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；b.VEGFR-2的的第3免疫球蛋白样区域，表示为D3，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述；c.包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、和VEGFR-4的所有VEGF受体的细胞外免疫球蛋白样区域。
3.如权利要求1所述的融合蛋白质，其中人免疫球蛋白Fc来自于IgG1，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所述。
4.如权利要求1所述的融合蛋白质，表示为YY-002D2-G9-FcYY-003D2-G12-FcYY-004D2-GS-FcYY-006D2D3-G9-FcYY-007D2D3-G12-FcYY-008D2D3-GS-Fc其中D2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；D3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述；Fc的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所述；G9，G12，GS的氨基酸序列如权利要求1所述。
5.如权利要求3所述的融合蛋白质，其中该免疫球蛋白Fc片段是编码Fc全长序列或部分Fc序列。
6.编码权利要求1-5的融合蛋白质的重组DNA，其DNA序列见序列表中的SEQID NO.8，9，10，12，13，14。
7.包含权利要求6所述重组DNA的重组载体，该载体选自质粒、病毒或DNA片段。
8.如权利要求7中的重组载体，其中所述病毒是腺相关病毒，包括血清型1、2、5、6、7、和8。
9.含权利要求7所述重组载体的重组体，其中宿主细胞是真核细胞或原核细胞，包括应用了DHFR/MTX或GS/MSX基因扩增系统的宿主细胞。
10.权利要求1-5中任一项所述融合蛋白质在制备抑制血管新生的药物中的应用。
11.如权利要求10的应用，其中所述抑制血管新生的药物是治疗血管新生相关疾病的药物，所述血管新生相关疾病包括肿瘤、视网膜血管病变、糖尿病视网膜病变、关节炎、贫血或子宫内膜增殖症。
12.一种药物组合物，包括如权利要求1-5中任一项所述融合蛋白质及药学上可接受的载体，所述组合物是注射剂、粉针剂、冷冻干燥剂或鼻腔喷雾剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，还包括任何一种或几种其他的具有协同作用的抑制血管新生的药物，所述组合物可以和其他治疗方法一起治疗血管新生相关疾病，所述其他治疗方法选自化学疗法、反射疗法、基因疗法，所述血管新生疾病包括肿瘤、视网膜血管病变、糖尿病视网膜病变、关节炎、贫血或子宫内膜增殖症。
全文摘要
本发明提供了一系列全新的VEGF受体片段和人免疫球蛋白Fc的优化融合蛋白，它们包含了一系列弹性结构的肽连接段，大大提高了融合蛋白的结构稳定性和生物活性，使得这些优化融合蛋白具有更高的VEGF亲和力，并能在体内更有效地抑制血管新生，达到治疗多种肿瘤和视网膜血管病变AMD等与VEGF相关疾病的效果。本发明包括这些能抑制血管新生的优化融合蛋白、及其编码重组DNA序列和表达载体、该重组蛋白的药物用途、含有该重组蛋白的药物及其制剂，及运载和表达该重组蛋白的基因治疗方法。
文档编号A61K39/395GK1793179SQ200510115530
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月4日 优先权日2005年11月4日
发明者余波, 童丽琴 申请人:余波, 童丽琴