专利名称：替莫唑胺－8－羧酸水溶性衍生物的制备方法,抗癌活性,和在制备抗癌药物制剂中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明公开几类替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物，它们的制备方法，它们的抑制癌细胞生长的活性，抑制动物体内癌组织生长的活性，它们作为新的抗癌活性化合物在制备抗癌药物制剂和治疗癌症中的应用。
背景技术：
本发明是CN02131346.6，WO2004028534，CN2004100686807和US 11/074037的继续.
替莫唑胺为一种烷化剂型抗癌药物，具有广谱抗肿瘤活性[L.H.Tsang，et al.Cancer ChemotherPharmacol.27(1991)342-346]，尤其是对神经胶质瘤(脑癌)和黑色素瘤(皮肤癌)有特效。替莫唑胺的胶囊剂已在欧美批准用于治疗恶性神经胶质瘤。相同剂型在我国也已批准上市。II期临床[N.M.Bleehen，etal.J.Clin.Oncol.13(1995)910-913]和III期临床[M.R.Middleton，et al.J.Clin.Oncol.18(2000)158-166]结果显示替莫唑胺对恶性黑色素瘤有效。黑色素瘤是转移快，同时多转移到深度神经组织和脑组织的恶性癌症.虽然口服替莫唑胺生物利用度近于100％，但口服替莫唑胺常产生包括白细胞减少、恶心、呕吐、脱发、红疹及便秘的副反应，口服替莫唑胺也显示剂量限制的骨髓毒性[A.M.Heimberger，etal.Clin.Can.Res.6(2000)4148-4153].同时一些病人不适应和不能耐受口服给药.替莫唑胺基本上属于非溶解性物质，既在水中和常见的有机溶剂中都不溶(水中的溶解度为0.3％(w/w)左右).即使在二甲基亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)等优良的两性溶剂中溶解度也只有3-5％左右.同时，溶解态的替莫唑胺稳定性较差.静脉滴注时，替莫唑胺的血药浓度呈双指数(biexponentially)趋势递减，半衰期1.8小时(Newlands，et al.，Br.J.Cancer，287-291，65，1992).由于替莫唑胺非溶解性，一次性局部注射大剂量的药物是不可能.因此，虽然替莫唑胺表现出对神经胶质瘤(glioma)，恶性神经胶质瘤(malignantglioma)，黑色素瘤(melanoma)，间皮瘤(mesothelioma)，皮瘤(sarcoma)，淋巴组织瘤(lymphoma)，白血病(leukemia)，直肠和卵巢癌(carcinoma of the colon and ovary)的抑制活性，但是，他的应用仅限于神经胶质瘤.为此，替莫唑胺的剂型研究都围绕在降低毒性，在保证药物稳定的情况下增加药物浓度，寻找一次可以大剂量给药和增加药物半衰期的机制，以及如何实现多渠道方便给药。
WO 03072082叙述的替莫唑胺水溶性制剂，即在使用大量的助溶剂和大量的稳定剂的情况下，替莫唑胺的浓度达到2.5mg/ml.Sampson[J.H.Sampson，et al.Can.Res.5(1999)1183-11886]在用大鼠研究替莫唑胺腱鞘注射给药时证明替莫唑胺溶液腱鞘注射剂可以降低副反应，同时指出受注射体积(40μl)的限制，浓度为3.1mg/ml的常规制剂无效，溶解度好的微晶剂型，在浓度为11mg/ml-33mg/ml时可以达到有效的治疗效果.但是，微晶剂型制备难度大，设备复杂，造价高.至今没有产品上市.因此，开发稳定，高浓度的替莫唑胺注射制剂满足临床上常规静脉给药和用于特殊渠道给药，尤其是腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等局部注射给药，是替莫唑胺类药物剂型研究中的一个重要的课题。
WO2004028534揭示了替莫唑胺局部缓释埋植片剂型，适合于手术后埋植于颅腔发挥长期治疗效果.文献报道替莫唑胺-8-羧酸具有同替莫唑胺相同的抑制淋巴癌细胞的活性(Cancer Chemother Pharmacol，1990，26，429-436).CN02131346.6，CN2004100686807和US 11/074037进一步揭示了替莫唑胺-8-羧酸和替莫唑胺抑制神经胶质瘤(脑癌)和黑色素瘤(皮肤癌)的活性相同，并且以替莫唑胺酸作为抗癌母体药物，设计了适合透皮给药的替莫唑胺-8-羧酸酯.替莫唑胺-8-羧酸酯在酯酶作用下易转化成抗癌活性化合物替莫唑胺酸，在动物实验中证明经透皮给药，替莫唑胺-8-羧酸酯有效的抑制黑色素瘤生长。
虽然替莫唑胺-8-羧酸的抗癌活性是明确的，而且它本身是酸，但是，是否可以将它转变成水溶性衍生物仍然是不确定的.原因是替莫唑胺类化合物对亲核基团非常敏感，正是由于它们的这种对亲核基团的敏感性，才使它们在体内能够成功的释放出烷化剂，有效的杀伤癌细胞.也正是因为替莫唑胺类化合物对亲核基团的敏感性使得它们在许多溶剂(例如，醇类，DMSO，DMF)中分解，更不能同碱性介质接触.因此，通常的酸碱反应生成盐和水的机制制备替莫唑胺-8-羧酸水溶性盐衍生物是行不通的.此外，替莫唑胺-8-羧酸不溶于有机溶剂，所以通常用于制备有机酸类药物(如青霉素类)盐的方法，即将酸性药物先溶于有机溶剂中，然后加入脂溶性有机酸盐利用强弱酸置换的原理使酸性药物转化成盐，从有机溶剂中沉淀出来的方法也不适用于制备替莫唑胺-8-羧酸水溶性盐。
发明内容
本发明公开的几类替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物，它们具有良好的水溶性，同时具有与替莫唑胺，替莫唑胺-8-羧酸相同的体内外抑制癌组织和癌细胞生长的活性.使用这些替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物制备水性基质的抗癌药物制剂时，不需要助溶剂即可以达到40mg/ml-1000mg/ml的药物剂量，完全适合各种环境的注射使用，尤其是腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等局部注射给药.其中第二类(式II)和第三类(式III)的水溶液极其稳定，可在室温保存。
本发明叙述中所涉及的替莫唑胺(TMZ)的化学结构式如下(式IV)，通用的化学名是8-酰胺-3-甲基咪唑[5，1-d]并[1，2，3，5]四嗪-4(3H)-酮(8-carbamoyl-3-methylimidazo[5，1-d]-1，2，3，5-tetrazine-4(3H)-one)。
式IV本发明叙述中所涉及的替莫唑胺酸(TMZA)的化学结构式如下(式V)，通用的化学名是3，4-二氢-3-甲基-4-氧-咪唑[5，1-d]并[1，2，3，5]四嗪-8-羧酸(3，4-dihydro-3-methyl-4-oxoimidazo[5，1-d]-1，2，3，5-tetrazine-8-carboxylic acid)。
式V一.本发明中的第一类替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物是替莫唑胺-8-羧酸金属盐水溶性衍生物(式I) 式I其中X可以是O和S；M+是金属离子，包括铝(aluminium)，钙(calcium)，锂(lithium)，镁(magnesium)，钾(potassium)，钠(sodium)，锌(zinc)离子和其它所有药物上可以接受的金属离子.替莫唑胺-8-羧酸水溶性金属盐衍生物(式I)是由替莫唑胺-8-羧酸与相应金属的弱酸盐，主要是碳酸氢盐[Mn(HCO3)mm and n＝1or 2]，碳酸盐(MnCO3，n＝1 or 2)或有机酸盐(包括乙酸盐，油酸盐、硬脂酸盐、亚麻酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、酒石酸盐、山梨酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐)反应形成水溶液，过滤后，冷冻干燥制得.使用碳酸盐和碳酸氢盐的优势是水溶液系统中不残留多余的阴离子酸根，因为生成的碳酸以二氧化碳和水的形式排出.使用有机酸盐时，生成的有机酸以酸的形式存在于系统中，尚有保护替莫唑胺-8-羧酸盐母核的作用.替莫唑胺-8-羧酸水溶性金属盐衍生物是类白色粉末，有时会略带黄或粉色，在干燥和避光的室温环境下稳定.最佳的储存条件是封闭于干燥的惰性气体避光瓶中，置于冰箱中保存.使用时，加入适量的水性基质即可在室温环境下它们水溶液含量的半衰期150小时。因此，替莫唑胺-8-羧酸水溶性金属盐衍生物适合与制成水性基质的注射剂用于静脉滴注，皮下，腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等局部注射给药，也适合与制成水溶液当作手术后清洗剂，清洗手术部位和周围清除脱落的癌细胞。
二.本发明中第二类替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物是替莫唑胺-8-羧酸与的广义的LEWIS碱性有机化合物(R)形成的(式II) 式II式II中R---H是由R提供电子形成的配位键(氢键).LEWIS碱包括所有的能给出电子的化学物质，如单一的元素，单一分子，和带电性的离子.有机LEWIS碱化合物的碱性几乎都是有机化合物上杂原子(如氮，磷，氧，硫)的孤电子对造成的.这些杂原子所处的化学环境决定它们给出电子的能力.给出电子的能力的强弱与其碱性成正比，即给出电子的能力越强，碱性越强；给出电子的能力越弱，碱性越弱.有机LEWIS碱化合物通过给出电子对与另一个能接受电子对的化合物形成非共价，非离子键的配位键，使两个分子在结合处产生相反的电性中心.这两个相反的电性中心通过与水分子中相应的正负电性中心按异性相吸的原理水化，达到水中溶解的效果.按理论上讲替莫唑胺-8-羧酸中酸根上的氢可以接受任何一个原子提供的电子对，也就是说任何一个有机LEWIS碱化合物都可能同替莫唑胺-8-羧酸形成配位键的盐，达到水中溶解的效果.
1.本发明中一类首选与替莫唑胺-8-羧酸结合的LEWIS碱有机化合物是碱性和中性胺基酸，精胺酸(arginine)，组胺酸(Histidine)，赖胺酸(Lysine)，脯胺酸(Proline)，丝胺酸(serine)等.胺基酸属于生物体的内原性物质，是生物体生长和维持必须的物质，不会对生物体产生不良影响。因此，它们非常适合与替莫唑胺-8-羧酸形成水溶性衍生物供癌症病人使用。
2.本发明中另一类首选的LEWIS碱性有机化合物是常用来制备有机盐的有机胺化合物，包括尿素(urea)，苄星(benzathine)，氯普鲁卡因(chloroprocaine)，胆碱(choline)，二羟乙基胺(diethanolamine)，乙二胺(ehtyldiamine)，甲基葡胺(meglumine)，普鲁卡因(procaine).这些有机胺化合物已经用于药物制剂，在确定的浓度情况下不会对人体产生不良影响。
3.本发明中另一类首选与替莫唑胺-8-羧酸结合的LEWIS碱有机化合物是临床使用的碱性抗癌药物，包括氮芥(2，2’-dichloro-N-methyldiethyamine)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯(glyciphosphofamide)，消瘤芥(nitrocaphane)，L-苯丙氨酸氮芥(melphalan)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，异磷酰胺(ifosfamide)，尼氮芥(nimustine)，地吖醌(diaziquone)，卡波醌(carboquone)，三胺硫磷(tris(1-aziridinyl)phosphine sulphide)，曲他胺(triethylene melamine)，六甲三聚氰胺(N，N，N’，N’，N”，N”，-hexamethyl-1，3，5-triazine-2，4，6-tramine)，博来霉素(bleomycin)，平阳霉素(bleomycin A5)，培洛霉素(peplomycin)，自力霉素(mitomycin)，阿霉素(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，去甲柔红霉素(idarubicin)，阿柔比星(aclarubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，更生霉素(dactinomycin)，丙卡巴肼(procarbazine)，达卡巴嗪(dacarbazine)，顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)，甲氨喋呤(methotrexate)，砒曲克新(piritrexim)，三甲曲沙(trimetrexate)，5-氟尿嘧啶(fluorouracil)，蚨喃氟尿嘧啶(tegafur)，卡莫氟(carmofur)，azaguanine，巯嘌呤(mercaptopurine)，硫唑嘌呤(azathioprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)，脱氧肋间型霉素(2’-deoxycoformycin)，氨甲酰基胺(hydroxycarbamine)，阿糖胞苷(cytarabine)，胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)，喜树碱(camptothecin)，羟基喜树碱(hydroxycamptothecin)，长春花碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，长春稀碱(vinorelbine)，长春地新(vindesine)，依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(teniposide)，秋水仙碱(colchicine)，三尖杉酯碱(harringtonine)，高三尖杉酯碱(homoharringtonine)，亮丙瑞林(leuprorelin)，曲普瑞林(triptorelin)，布舍瑞林(buserelin)，高舍瑞林(goserelin)，那法瑞林(nafarelin)，奥曲酞(octretide).这些碱性抗癌药物中的很多成员临床上是以有机盐的形式使用的，因此它们没有困难同替莫唑胺-8-羧酸形成水溶性盐.虽然每一个药物都有自己的主要适用症，实践已经证明两个或多个药物同时使用会产生协同作用，增强药效.几种抗癌药物联合使用，增强抗癌活性的实例很多.替莫唑胺和一种或多种抗癌药物同时使用产生协同作用增强药效已经有报道，例如US 6642211描述的替莫唑胺与胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)，WO 9707804描述的替莫唑胺与顺铂(cisplatin)，WO 0152882描述的替莫唑胺与干扰素聚乙二醇聚合物(pegylated interferon)，US 2002172662描述的替莫唑胺与α-干扰素，WO 0243720描述的替莫唑胺与酞胺哌啶酮(thalidamide).但是还没有像本发明中将一个酸性的抗癌药物同一个碱性的抗癌药物通过形成水溶性盐一同使用的.本发明的这个创造性的实践不仅为替莫唑胺-8-羧酸与碱性的抗癌药物的联合使用开辟了一个新途径，也为其它抗癌药物乃至所有酸碱药物的联合使用开辟了一个新天地.每一个药物的生物有效剂量和治疗指数是不同的，也就是使用的治疗剂量是不同的.因此在将一个酸性药物同一个碱性的药物制备成盐的时候，使用的比例要根据每一个药物的使用的治疗剂量来决定.本发明在制备替莫唑胺-8-羧酸同一个碱性的抗癌药物水溶性盐时，先根据替莫唑胺-8-羧酸和碱性的抗癌药物的治疗剂量算出每一个的摩尔数，二个药物摩尔数的差值将使用另外一个碱性或酸性药物赋形剂补足.在本发明中用于补足的碱性药物的碱性赋形剂即是上述的碱性，中性胺基酸和常用来制备有机盐的有机胺化合物，用于补足的酸性药物的赋形剂的酸包括卤氢酸，磷酸，乙酸盐，油酸、硬脂酸，亚麻酸、富马酸、苯甲酸、酒石酸、山梨酸、乳酸、柠檬酸和其它所有药学上可以接受的酸.因此使用替莫唑胺-8-羧酸与这些碱性抗癌药物形成的水溶性盐产生协同作用，增强抗癌活性是本发明的重要创造之一。
4.本发明中另一类首选与替莫唑胺-8-羧酸结合的LEWIS碱有机化合物是碱性的DNA烷基化修复酶抑制剂，包括(1)O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(ATase，O6-alkylguanine DNA alkyltransferase)抑制剂，包括O6-苯基鸟嘌呤(O6-benzylguanine)，O6-噻吩甲基鸟嘌呤(O6-thenylguanine)，O6-(4-溴-噻吩甲基)鸟嘌呤(O6-4-bromothenylguanine)，O6-(5-噻唑甲基)鸟嘌呤[O6-(5-thiazolymethyl)guanine]，O6-(2-氯-4-砒叮甲基)鸟嘌呤(O6-(2-chloro-4-picolyl)guanine)和其它类型的性O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶抑制剂(McElhinney etal，J.Med.Chem.1998，41，5265-5271)；(2)DNA碱切除修复系统(BER，base excision repair)抑制剂，甲基羟胺(methoxyamine)等；(3)错配修复系统(mismatch repair system，MMR)恢复剂，如2`-脱氧-5-氮-胞核嘧啶核苷(2`-deoxy-5-azacytidine，5-aza-CdR)。
替莫唑胺类抗癌药物抗癌活性是体现在他们对DNA碱有效的甲基化，生成一系列甲基化产物，包括N-甲基嘌呤(N-methylpurines)，N3-腺嘌呤(N3-methyladenine)，N7-甲基鸟嘌呤(N7-methylguanine)和O6-甲基鸟嘌呤(O6-methylguanine).因此表达DNA烷基化修复酶的癌细胞对替莫唑胺类抗癌药物有不同程度的耐受性，使替莫唑胺类抗癌药物抗癌活性降低或失效.使用DNA烷基化修复酶抑制剂增加替莫唑胺药效已有很多研究，如US5731304描述的O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶抑制剂对替莫唑胺产生增效作用，和US6465448描述的DNA碱切除修复系统(BER，base excision repair)抑制剂对替莫唑胺产生增效作用.Barvaux et al描述了错配修复系统恢复剂2`-脱氧-5-氮-胞核嘧啶核苷独立或同O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶抑制剂O6--(4-溴-噻吩甲基)鸟嘌呤合用可以增强替莫唑胺抑制癌细胞生长的活性(Barvaux，et al.Mol Cancer Ther.2004；3(2)123-127)。
以上的DNA烷基化修复酶抑制剂或错配修复系统恢复剂同替莫唑胺时联合使用，需要先将癌细胞经DNA烷基化修复酶抑制剂或错配修复系统恢复剂处理后，再给替莫唑胺.临床试验实践和实际使用时很不方便.因此至今仍在实验中.本发明利用替莫唑胺-8-羧酸的酸性和这些DNA烷基化修复酶抑制剂和错配修复系统恢复剂的碱性将它们有机的结合成水溶性衍生物，使它们可以一同使用，同时发挥作用.这个发明使联合使用替莫唑胺和DNA烷基化修复酶抑制剂的实践成为可能，而且使用方便，尤其便于大剂量局部注射，如皮下，腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等局部注射给药。
5.本发明中另一类首选与替莫唑胺-8-羧酸结合的LEWIS碱有机化合物是碱性的血管收缩剂(vasocontrictors)，如肾上腺素(epinephrine)，去甲肾上腺素(noradrenaline)，间羟胺(metaraminol)，去氧肾上腺素(phenylephrine)，和血管生成抑制剂，如塞内昔布(Celecoxib)，卤夫酮氢溴和酞胺哌啶酮(thalidomide)。已有研究证明抗癌药与适量的上述血管收缩剂和血管生成抑制剂合用，可以增化抗癌的药物的治疗效果，例如，Favoulet等描述了利用血管收缩剂抑制抗癌药物的遗失和增加药物对局部组织的渗透的性质，增化抗癌药物的治疗效果(Favoulet et al，EJSO 2001，27，59-64)，US 6642211描述了利用血管生成抑制剂，抑制癌症病灶局部组织的新血管生成，达到抑制抗癌药物的遗失和癌症扩散的目的.替莫唑胺-8-羧酸与上述血管收缩剂和血管生成抑制剂形成的水溶性衍生物为这种联合使用开辟了简洁的机制.替莫唑胺-8-羧酸与血管收缩剂或血管生成抑制剂形成的水溶性衍生物的制备，可以采取等摩尔的替莫唑胺-8-羧酸和血管收缩剂或血管生成抑制剂结合，所得的产物同上述替莫唑胺-8-羧酸-胺基酸衍生物一同使用.原因是血管收缩剂或血管生成抑制剂的剂量低，不能直接使用等摩尔的替莫唑胺-8-羧酸和血管收缩剂或血管生成抑制剂衍生物.等摩尔的替莫唑胺-8-羧酸和血管收缩剂或血管生成抑制剂衍生物的使用剂量由血管收缩剂或血管生成抑制剂的需要剂量决定，需要的替莫唑胺-8-羧酸剂量由替莫唑胺-8-羧酸-胺基酸衍生物补齐.替莫唑胺-8-羧酸与血管收缩剂或血管生成抑制剂形成的水溶性衍生物的制备，也可以采取固定比例血管收缩剂或血管生成抑制剂于充分的替莫唑胺-8-羧酸结合，不足的部分用碱性赋形剂(上述的碱性，中性胺基酸和常用来制备有机盐的有机胺化合物)补足。这类水溶性衍生物尤其适用于癌症病灶组织局部注射给药，替莫唑胺-8-羧酸水溶性有机碱衍生物(式II)是将上述一种或两种有机碱化合物缓慢的加入替莫唑胺-8-羧酸的水悬浮液中，搅拌形成澄清水溶液，过滤后，冷冻干燥制得.替莫唑胺-8-羧酸水溶性有机碱衍生物(式II)多是类白色粉末，根据所用胺基酸或有机硷的不同有时会略带黄或粉色.它们在室温和干燥的环境稳定，因此替莫唑胺-8-羧酸水溶性有机碱硷生物适合于制成水基质的注射剂用于静脉滴注，皮下，腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等局部注射给药，也适合与制成水溶液当作手术后清洗剂，清洗手术部位和周围清除脱落的癌细胞。
三.本发明第三类替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物是替莫唑胺-8-羧酸与是水溶性高分子聚合物R经过脱水缩合形成的以共价键结合的聚合衍生物(式III)。
式III用于形成水溶性替莫唑胺-8-羧酸聚合衍生物(式III)的水溶性高分子聚合物包括普鲁兰(PULLULAN)，维生素E聚乙二醇聚合物(VETPGS)，羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose)，甲基纤维素(methylcellulose)，聚丙稀酸[Poly(acrylic acid)]，聚乙稀醇[Poly(vinyl alcohol)]，混聚丙稀酰胺和丙稀酸Poly(acrylamide-co-acrylic acid)，完全或部分水解的单聚或混聚马来酸酐[Poly(maleic anhydride)]，聚缩醛(Polyacetal)，聚糖(Glycans)，聚乙二醇(PEG).水溶性替莫唑胺-8-羧酸聚合衍生物(式III)是替莫唑胺-8-羧酸的羧酸基团与水溶性高分子聚合物的羟基或羧酸基在缩合剂的存在下脱水缩合形成的酯或羧酐.生成的水溶性替莫唑胺-8-羧酸聚合衍生物(式III)在水中的溶解度可以通过选择不同分子量的水溶性高分子聚合物来调节，也可以通过调整替莫唑胺-8-羧酸在水溶性高分子聚合物上的结合数来调节.例如由替莫唑胺-8-羧酸与普鲁兰制成的水溶性酯聚合物上的替莫唑胺-8-羧酸结合数可以是一个，几个，几十个，或几白个，因为普鲁兰上自由羟基是成千上万的，而每一个都有和替莫唑胺-8-羧酸结合的可能，选择多少个替莫唑胺-8-羧酸结合数将根据实际需要来定.替莫唑胺-8-羧酸与聚乙二醇制成的水溶性酯聚合物上之能结合一个或两个替莫唑胺-8-羧酸.Rathbone等(D.L Rathbone，D.Su，Y.Wang and D.C.Billington，J.Pharm.Pharmacol.1999，51(Supplement)26)报道了替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇水溶性聚合衍生物的合成和它们在猪肝酯酶作用下分解的现象，但是他们并没有证实替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇水溶性聚合衍生物在体内外是否对癌细胞和癌组织有抑制活性.更没有探讨制剂研究和应用.本发明确定了这组化合物的体内外对癌细胞和癌组织有生长抑制活性，和它们用于制成水基质的注射剂用于静脉滴注，皮下，腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等局部注射给药治疗癌症的应用。
第三类水溶性替莫唑胺-8-羧酸聚合衍生物(式III)多是类白色粉末，有时会略带黄或粉色.它们在室温和干燥的环境稳定.因为这类水溶性替莫唑胺-8-羧酸聚合衍生物只有在被体内酯酶分解释放出替莫唑胺-8-羧酸后才能发生药效，同时又是水溶性大分子，因此它们可以在血液中循环较长时间，而不通过血脑屏障.这个特点恰恰弥补了替莫唑胺血液中半衰期短的缺陷.本发明中的水溶性替莫唑胺-8-羧酸聚合衍生物(式III)，使增长替莫唑胺类化合物血液中半衰成为可能.因此这类化合物(式III)尤其适合于静脉滴注治疗转移性皮肤癌包括转移到淋吧，直肠，神经组织等部位，而不伤及大脑.一般地说，本发明的上述替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I，式I，式III)除主要适合于制备用于人体不同部位和不同组织器官注射剂用的抗癌药物剂型外，本发明的上述化合物也适合口服，局部和其它给药途径。
本发明另一个重大贡献是提供一个可行的微观酸性条件下顺序加料制备本发明中第一类(式I)和第二类(式二)替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物的方法.替莫唑胺类化合物在水中溶解度极微(0.3％左右).同时对亲核基团敏感.在pH＞7的介质中分解迅速.要想制备替莫唑胺类化合物水溶性衍生物，必须创造出新的理念和创造出新的实验技能去克服这类化合物的这些内在的缺点.本发明创造的微观酸性条件下顺序加料制备替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物的方法，是利用替莫唑胺-8-羧酸在中性水中微弱的溶解性，先将替莫唑胺-8-羧酸与中性水混合，在搅拌下使替莫唑胺-8-羧酸充分溶解，形成由替莫唑胺-8-羧酸造成的酸性水溶液(pH＜7)，然后分期分批的加入等摩尔或微低于等摩尔(0.99-0.7摩尔)的相应金属的弱酸盐(例如碳酸氢盐，碳酸盐或有机酸盐，包括乙酸盐，油酸盐、硬脂酸盐、亚麻酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、酒石酸盐、山梨酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐)或有机ELWIS碱化合物[包括制备上述第二类替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式II)所列举的所有的广义的LEWIS碱有机化合物，1.硷性和中性胺基酸，2.常用来制备有机盐的有机胺化合物，3.临床使用的碱性抗癌药物，4.碱性的DNA烷基化修复酶抑制剂，5.血管收缩剂和血管生成抑制剂].由于相应的成盐物质是分期分批的加入，用的又是等摩尔或微低于等摩尔的量，替莫唑胺-8-羧酸在制备过程中一直保持在一个酸性的环境，最终点或是中性或是酸性.由此保证了替莫唑胺-8-羧酸母核所在的微观环境始终是酸性或中性，而不受亲核基团攻击.成盐所使用的物质在成盐后或者在冷冻干燥过程中排除，如碳酸以水和二氧化碳形式排除，或者同替莫唑胺-8-羧酸盐一起固化。
本发明另一个重大贡献是提供了一个可以在癌症病人身上使用大剂量替莫唑胺类药物的机制.以往因为替莫唑胺在水性介质中的不溶性，大剂量注射替莫唑胺是不可能的.本发明中的替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(I)，(II)和(III)在水性介质中的高溶解度和稳定性使大剂量给癌症病人注射替莫唑胺成为可能.尤其是局部，皮下，腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等部位，高浓度大剂量的给药。
本发明另一个重大贡献是提供了一个可以保持替莫唑胺类药物高血药浓度和长半衰期的机制。以往因为替莫唑胺半衰期只有1.8小时，保持有效的血药浓度极其困难.因此静脉给替莫唑胺效果不佳.本发明中的第二(式II)和第三(式III)类替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物在水性介质中的高溶解度和稳定性，使得静脉给药可以实现.尤其是第三(III)类替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物，它们只有在被体内酯酶分解，释放出替莫唑胺-8-羧酸后才能发挥药效，可以在血液中循环较长时间，而不通过血脑屏障.因此这类化合物(式III)尤其适合于静脉滴注治疗转移性皮肤癌包括转移到淋巴，直肠，神经组织等部位，而不伤及大脑。
本发明另一个重大贡献是提供了一个降低替莫唑胺类药物毒性的机制.口服替莫唑胺的毒性是不可避免的.本发明中的替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I)，(式II)和(式III)在水性介质中的高溶解度和稳定性非常适合局部高浓度大剂量的给药.腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等部位，高浓度大剂量的给药在保证局部药物高浓度减少系统药物浓度的同时，也减少对系统的毒性.尤其是本发明第二类(II)中的替莫唑胺-8-羧酸与血管收缩剂和血管生成抑制剂形成的水溶性衍生物在防止局部药物流失，减少系统的毒性方面更有效。
本发明另一个重大贡献是提供了一个增强替莫唑胺类药物药效的机制.因为表达DNA烷基化修复酶的癌细胞对替莫唑胺类抗癌药物有不同程度的耐受性，使替莫唑胺类抗癌药物的抗癌活性降低或失效.实验证明将产生DNA烷基化修复酶的癌细胞经DNA烷基化修复酶抑制剂处理后，替莫唑胺类抗癌药物对这些癌细胞的活性显著增强，而且，在细胞暴露于抗癌药物后，DNA烷基化修复酶抑制剂仍然有增强替莫唑胺类药物药效的作用(Clin Cancer Res.2005.11(7)，2747-2755)。本发明第二类(式II)中替莫唑胺-8-羧酸与碱性DNA烷基化修复酶抑制剂形成的水溶性衍生物是创造性的联合使用抗癌药和增效剂的实践，使用方便，尤其便于大剂量局部注射，如皮下，腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等局部注射给约.本发明第二类(式II)中替莫唑胺-8-羧酸与碱性的血管收缩剂和血管生成抑制剂形成的水溶性衍生物通过抑制药物流失和癌细胞转移增强替莫唑胺类药物药效。发明第二类(式II)中替莫唑胺-8-羧酸与碱性抗癌药物形成的水溶性衍生物通过协同作用达到增强替莫唑胺类药物药效的作用。
本发明另一个重大贡献是提供了一个制备替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物抗癌药物制剂的机制。替莫唑胺类药物在水性介质中的不溶性一直是开发高浓度大剂量注射剂的障碍.本发明中的替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I)，(式II)和(式III)在水性介质中的高溶解度和稳定性使制备任何一种注射剂都成为可能.同时几个药物可以混合使用，例如，为了发挥替莫唑胺-8-羧酸与碱性的血管收缩剂水溶性衍生物中血管收缩剂的增效作用，可以取含有1或0.5毫克的这种衍生物同适量的替莫唑胺-8-羧酸与碱性的氨基酸衍生物和在一起使用。
本发明另一个重大贡献是提供了一个应用替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物治疗癌症的机制.替莫唑胺类药物一直被认为是水中不溶性的物质，虽然通过晶型的改变和使用助溶剂提高了替莫唑胺在水中的溶解度，但是还没有实际使用的例子.本发明中的替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I)，(式II)和(式III)在水性介质中的高溶解度和稳定性提供了一个应用替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物治疗癌症的机制.非常适合高浓度大剂量的给药。
本发明另一个重大贡献是提供了一个开发新药的新途径.在药物研究中将酸性药物与无机或有机碱反应制成水溶性盐，或将碱性药物与无机或有机酸反应制成水溶性盐是常见的.但是将酸性药物与碱性药物反应制成水溶性盐的复合药物一同使用还是没有先例的，尤其是一个酸性抗癌药物与一个碱性抗癌药物反应制成水溶性盐的复合药物.本发明第二类(式II)中替莫唑胺-8-羧酸与碱性抗癌药物形成的水溶性衍生物是创造性的联合使用两种抗癌药，实现协同作用的实践.这个实践不仅为替莫唑胺-8-羧酸与碱性抗癌药物联合使用，实现协同作用开辟了新道路，也为其它酸性抗癌药物或碱性抗癌药物与相应的碱性抗癌药物或酸性抗癌药物联合使用，实现协同作用开辟了新道路，乃至为所有的酸性药物或碱性药物与相应的碱性药物或酸性药物联合使用，实现协同作用开辟了新道路，成为一个开发新药的新途径。
根据本发明，替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I，II，III)的抗肿瘤作用通过以下体外和体内实验来证实。
1.替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I，II，III)体外杀伤肿瘤细胞作用。选择甲胺喋啶作为阳性对照药，同替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I)的代表，替莫唑胺-8-羧酸钠盐(TMZANa)和钾(TMZAK)盐；替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式II)的代表，替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)，替莫唑胺-8-羧酸-组氨酸(TMZAHis)，替莫唑胺-8-羧酸-赖氨酸(TMZALys)，替莫唑胺-8-羧酸-5-氟尿嘧啶(TMZA5-Fu)，替莫唑胺-8-羧酸-顺铂(TMZACpl)，替莫唑胺-8-羧酸-奥曲酞(TMZAOct)，替莫唑胺-8-羧酸-O6-苯基鸟嘌(TMZAO6Bg)；替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式III)的代表，替莫唑胺-8-羧酸普鲁兰(PULLULAN)酯(TMZAPul)，替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇(PEG)酯(TMZAPeg)；替莫唑胺-8-羧酸(TMZA)和替莫唑胺(TMZ)一起进行杀伤癌细胞株的实验。癌细胞株包括MV3，MV14(人黑色素瘤细胞)，B16，B16-BL6(小鼠黑色素瘤细胞)，TJ905，TJ899和SHG44(人神经胶质瘤细胞)。
2.替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I，II，III)体内杀伤肿瘤细胞作用。
A.替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)盐和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)分别溶于生理盐水中，制成0.3mmol/ml溶液。经λ射线灭菌.分别给大鼠接种人黑色素瘤MV 鼠异种移植瘤和接种人神经胶质瘤TI899鼠异种移植瘤.待肿瘤体积生长至100-300mm3时，将接种同种移植瘤的动物按肿瘤大小分成给药组和对照组，每组8只。给药组按1mmol/m2/d剂量给药。方法是取适量上述配置好的0.3mmol/ml溶液，用生理盐水稀释到1ml，然后在大鼠的尾静脉缓慢的推注。相同剂量每天一次，连续5天。对照组大鼠任其自然生长。然后，动物按正常方式饲养，动态观察，记录动物生长情况，直至自然死亡.用给药组同对照组相比的生命期的延长率(％ILS)评价药物的活性。
B.替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)盐和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)分别溶于生理盐水中，制成0.3mmol/ml溶液。分别给BALB/c-nu裸小鼠接种人黑色素瘤MV3裸鼠异种移植瘤和接种人神经胶质瘤SHG44裸鼠异种移植瘤.待肿瘤体积生长至100-300mm3时，将接种同种移植瘤的动物按肿瘤大小分成给药组和对照组，每组8只小鼠。使用20号注射针头向给药组小鼠的癌瘤组织直接注射30μmol/kg剂量，对照组小鼠任其自然生长。然后，动物按正常方式饲养，动态观察，记录动物生长情况，直至自然死亡.用给药组同对照组相比的生命期的延长率(％ILS)评价药物的活性。
具体实施例方式
下面结合对比例和实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
替莫唑胺酸的合成如CN02131346.6所述。
在实施例中所用的水是双去离子水.所用的化学试剂都是符合制药标准的试剂.冷冻干燥制备的给动物使用的替莫唑胺酸水溶性固体衍生物，在包装前都经过γ-射线和必要的杀菌处理.制备替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物实施例中的产物由核磁共振分析鉴定，以替莫唑胺酸的特征氢为标准，以D2O(化学位移δ＝4.8ppm)为溶剂。
实施例一替莫唑胺酸钠(TMZAN)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将碳酸氢钠(15.2mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品32mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3).
实施例二替莫唑胺酸钠醋酸(TMZAAcOH)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将醋酸钠(18mg 2.2mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品31mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.5(s，3，H-CH3)。
实施例三替莫唑胺酸钾(TMZAK)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将碳酸氢钠(18mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品38mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例四替莫唑胺酸钙(TMZACa)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将磷酸氢钙(13.6mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品35mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.8(s，3，H-CH3)。
实施例五替莫唑胺酸锌(TMZAZn)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将水合硝酸锌[18mg 0.095mmol(FW 189.38)]缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品34mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.5(s，3，H-CH3)。
实施例六替莫唑胺酸-精胺酸(TMZAArg)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将精胺酸(35mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品59mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例七替莫唑胺酸-组胺酸(TMZAHis)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将组胺酸(28mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品52mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例八替莫唑胺酸-赖胺酸(TMZALy)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将赖胺酸(26.3mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品50mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.4(s，3，H-CH3)。
实施例九替莫唑胺酸-脯胺酸(TMZAPr)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将脯胺酸(21mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品45mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.5(s，3，H-CH3)。
实施例十替莫唑胺酸-丝胺酸(TMZASe)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将丝胺酸(19mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品46mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例十一替莫唑胺酸苄星(TMZABzt))的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将苄星(32mg0.15mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品58mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例十二替莫唑胺酸普鲁卡因(TMZAPrc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将普鲁卡因(32mg 0.15mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品61mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例十三替莫唑胺酸乙二胺(TMZAEda)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将乙二胺(6mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品35mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例十四替莫唑胺酸氮芥(2，2’-dichloro-N-methyldiethylamine)(TMZADcma)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将氮芥(31。2mg 0.2mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例十五替莫唑胺酸磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯(glyciphosphofamide)(TMZAGpf)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯(78mg 0.2mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品105mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例十六替莫唑胺酸L-苯丙氨酸氮芥(melphalan)(TMZAMp)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将L-苯丙氨酸氮芥(61mg 0.2mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品85mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例十七替莫唑胺酸异磷酰胺(ifosfamide)(TMZAIfa)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将异磷酰胺(52mg 0.2mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品84mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例十八替莫唑胺酸尼氮芥(nimustine)(TMZANm)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将尼氮芥(49mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品75mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例十九替莫唑胺酸卡波醌(carboquone)(TMZACbq)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将卡波醌(32mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例二十替莫唑胺酸三胺硫磷(tris(1-aziridinyl)phosphine sulphide)(TMZATaps)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将三胺硫磷(19mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例二十一替莫唑胺酸六甲三聚氰胺(N，N，N’，N’，N”，N”，-hexamethyl-1，3，5-triazine-2，4，6-tramine)，(tris(1-aziridinyl)phosphinesulphide)(TMZAHmtt)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将六甲三聚氰胺(21mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例二十二替莫唑胺酸博来霉素(bleomycin)(TMZABlc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将博来霉素(21mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例二十三替莫唑胺酸培洛霉素(peplomycin)(TMZAPpc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将培洛霉素(147mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例二十四替莫唑胺酸自力霉素(mitomycin)(TMZAMtc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将自力霉素(33mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例二十五替莫唑胺酸阿霉素(doxorubicin)(TMZADrc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将阿霉素(98mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例二十六替莫唑胺酸柔红霉素(daunorubicin)(TMZADarc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将柔红霉素(95mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例二十七替莫唑胺酸表阿霉素(epirubicin)(TMZEprc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将表阿霉素(97mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例二十八替莫唑胺酸去甲柔红霉素(idarubicin)(TMZAIrc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将去甲柔红霉素(89mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例二十九替莫唑胺酸阿柔比星(aclarubicin)(TMZAArc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将阿柔比星(146mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例三十替莫唑胺酸米托蒽醌(mitoxantrone)(TMZAMxt)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将米托蒽醌(48mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例三十一替莫唑胺酸更生霉素(dactinomycin)(TMZADatc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将更生霉素(125mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例三十二替莫唑胺酸丙卡巴肼(procarbazine)(TMZAPcz)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将丙卡巴肼(40mg 0.19mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例三十三替莫唑胺酸顺铂(cisplatin)(TMZACpl)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将顺铂(30mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例三十四替莫唑胺酸卡铂(carboplatin)(TMZACbpt)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将卡铂(37mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例三十五替莫唑胺酸甲氨喋呤(methotrexate)(TMZAMttx)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将甲氨喋呤(45mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例三十六替莫唑胺酸5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(TMZA5-fu)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将5-氟尿嘧啶(24mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.3(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例三十七替莫唑胺酸蚨喃氟尿嘧啶(tegafur)(TMZATgf)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将蚨喃氟尿嘧啶(36mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例三十八替莫唑胺酸卡莫氟(carmofur)(TZMACf)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将卡莫氟(47mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.5(s，3，H-CH3)。
实施例三十九替莫唑胺酸巯嘌呤(mercaptopurine)(TZMAMp)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将巯嘌呤(17mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例四十替莫唑胺酸硫鸟嘌呤(thioguanine)(TMZATg)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将硫鸟嘌呤(17mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.5(s，3，H-CH3)。
实施例四十一替莫唑胺酸氨甲酰基胺(hydroxycarbamine)(TMZAHca)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将氨甲酰基胺(8mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例四十二替莫唑胺酸阿糖胞苷(cytarabine)(TMZACar)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将阿糖胞苷(44mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例四十三替莫唑胺酸喜树碱(camptothecin)(TMZACthc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将喜树碱(35mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1HNMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.5(s，3，H-CH3)。
实施例四十四替莫唑胺酸羟基喜树碱(hydroxycamptothecin)(TMZAHcthc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将羟基喜树碱(37mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例四十五替莫唑胺酸长春花碱(vinblastine)(TMZAVbt)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将羟基喜树碱(91mg 0.1mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例四十六替莫唑胺酸秋水仙碱(colchicine)(TMZACcc)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将秋水仙碱(4mg 0.01mmol)和精胺酸(33mg 0.17mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.4(s，3，H-CH3)。
实施例四十七替莫唑胺酸三尖杉酯碱(harringtonine)(TMZAHgt)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与4毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将三尖杉酯碱(5mg 0.01mmol)和精胺酸(33mg 0.17mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例四十八替莫唑胺酸尖亮丙瑞林(Leuprorelin)(TMZALpl)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将亮丙瑞林(1。2mg 0.001mmol)和精胺酸(35mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品60mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例四十九替莫唑胺酸奥曲酞(octreotide)(TMZAOct)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将奥曲酞(1mg 0.001mmol)和精胺酸(35mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品58mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例五十替莫唑胺酸O6-苯基鸟嘌呤(O6-benzylguanine)(TMZO6Bg)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将O6-苯基鸟嘌呤(43mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品71mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例五十一替莫唑胺酸O6-噻吩甲基鸟嘌呤(O6-thenylguanine)(TMZAOtg)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将O6-噻吩甲基鸟嘌呤(47mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品73mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例五十二替莫唑胺酸O6--(4-溴-噻吩甲基)鸟嘌呤(O6-4-bromothenylguanine)(TMZAObtg)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将O6--(4-溴-噻吩甲基)鸟嘌呤(61mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品96mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例五十三替莫唑胺酸O6-(5-噻唑甲基)鸟嘌呤[O6-(5-thiazolymethyl)guanine](TMZAOtmg)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将O6-(5-噻唑甲基)鸟嘌呤(46mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品68mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例五十四替莫唑胺酸O6-(2-氯-4-砒叮甲基)鸟嘌呤(O6-(2-chloro-4-picolyl)guanine)(TMZAOcpg)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将O6-(2-氯-4-砒叮甲基)鸟嘌呤(51mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品76mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.5(s，3，H-CH3)。
实施例五十五替莫唑胺酸甲基羟胺(methoxyamine)(TMZAMa)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将甲基羟胺(8mg 0.18mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品35mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例五十六替莫唑胺酸肾上腺素(epinephrine)(TMZAEpph)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将肾上腺素(36.6mg 0.2mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品35mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.1(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例五十七替莫唑胺酸去甲肾上腺素(noradrenaline)(TMZANadl)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)与2毫升水混合，搅拌。然后分期分批地将去甲肾上腺素(33.6mg 0.2mmol)缓慢加入.继续搅拌，至形成澄清溶液.过滤，滤液冷冻干燥，得白色固体产品35mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.2(s，1，H-6)，3.7(s，3，H-CH3)。
实施例五十八替莫唑胺酸普鲁兰(PULLULAN，Mw 331000g/mol)(TMZAPul)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol，普鲁兰[1g，hydroxyl group 18mmol)和PyBrop(98mg，0.22mmol)与10毫升DMF(N，N-dimethyl formamide)混合.去空气后，反应瓶充干燥氮气，密封后，搅拌冷却下缓慢滴加N，N-二异丙基乙胺(N，N-DIISOPROPYLETHYLAMINE)(0.38毫升，0.22mmol)。继续搅拌二十四小时。蒸干溶液，固体用乙醇重结晶，过滤，干燥后，得白色固体产品650mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.3(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例五十九替莫唑胺酸维生素E聚乙二醇聚合物(VETPGS，Mw 1513)(TMZAVetpgs)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)，VETPGS[287mg，0.19mmol)和PyBrop(98mg，0.22mmol)与6毫升DMF(N，N-dimethyl formamide)混合.去空气后，反应瓶充干燥氮气，密封后，搅拌冷却下缓慢滴加N，N-二异丙基乙胺(N，N-DIISOPROPYLETHYLAMINE)(0.38毫升，0.22mmol)。继续搅拌二十四小时。蒸干溶液，固体用乙醇重结晶，过滤，干燥后，得白色固体产品265mg.1H NMR(D2O/ppm)δ8.3(s，1，H-6)，3.6(s，3，H-CH3)。
实施例六十替莫唑胺酸聚乙二醇(PEG，Mw 4000)(TMZAPeg)的制备室温下(15℃-20℃)，替莫唑胺酸(39mg，0.2mmol)，聚乙二醇(400mg，0.1mmol)和PyBrop(98mg，0.22mmol)与10毫升DMF(N，N-dimethyl formamide)混合.去空气后，反应瓶充干燥氮气，密封后，搅拌冷却下缓慢滴加N，N-二异丙基乙胺(N，N-DIISOPROPYLETHYLAMINE)(0.38毫升，0.22mmol)。继续搅拌二十四小时。蒸干溶液，固体用乙醇重结晶，过滤，干燥后，得白色固体产品365mg.MP，1H NMR(D2O/ppm)δ8.4(s，1，H-6)，3.8(s，3，H-CH3)。
实施例六十一.替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物体外杀伤肿瘤细胞作用药品及试剂替莫唑胺，微土白色粉状固体。替莫唑胺酸，白色粉状固体。替莫唑胺-8-羧酸钠盐(TMZAN)和钾盐(TMZAK)，替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAarg)，替莫唑胺-8-羧酸-组氨酸(TMZAHis)，替莫唑胺-8-羧酸-赖氨酸(TMZALys)，替莫唑胺-8-羧酸-5-氟尿嘧啶(TMZA5-Fu)，替莫唑胺-8-羧酸-顺铂(TMZACpl)，替莫唑胺-8-羧酸-奥曲酞(TMZAOct)，替莫唑胺-8-羧酸-O6-苯基鸟嘌(TMZAO6Bg)，替莫唑胺-8-羧酸普鲁兰酯(TMZApul)，替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇酯(TMZAPeg)。阳性对照药甲胺喋啶。RPMI 1640为GIBCO产品。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。MTT为Bebco产品。
细胞株MV3，MV14(人黑色素瘤细胞)，B16，B16-BL6(小鼠黑色素瘤细胞)，TJ905，TJ899和SHG44(人神经胶质瘤细胞，由北京药物所培养传代。
仪器BIORAD 550型酶标仪。
实验方法四氮唑盐[3-(4，5)-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide，MTT]还原法。收集生长良好的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基配置成1×104/ml细胞悬液，于96孔培养板内接种，每孔100ul(含1000个肿瘤细胞)，置37℃，5％CO2温箱内培养24小时后加药，实验设空白对照，阳性对照药为氟尿嘧啶。受试样品设5个浓度，每浓度3个平行孔，置37℃，5％CO2温箱内，培养4天。弃去培养液，每孔加入MTT溶液(0.4mg/ml，RPMI 1640配制)100ul，37℃孵育4小时。弃去上清液，每孔加入DMSO 150μl，溶解Fomazan颗粒，轻度振荡后，用550型酶标仪在检测波长540nm，参考波长450nm下测定OD值。
结果计算以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度IC50(表1)。
表1.MTT法替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物体外杀伤肿瘤细胞实验结果
实施例六十二.替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I，II，III)体内杀伤肿瘤细胞作用A.静脉注射(intravenous)药物替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)盐和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)。
采用大鼠，接种人黑色素瘤MV3鼠异种移植瘤和接种人神经胶质瘤TI899鼠异种移植瘤.待肿瘤体积生长至100-300mm3时，将接种同种移植瘤的动物按肿瘤大小分成给药组和对照组，每组8只。给药组按1mmol/m2/d剂量给药。对照组大鼠任其自然生长。
溶液配制方法为定量称取上述替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)盐和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)，溶于生理盐水中，制成0.3mmol/ml清澄药物。
取适量上述配置好的0.3mmol/ml溶液，用生理盐水稀释到1ml，然后在大鼠的尾静脉缓慢的推注。相同剂量每天一次，连续5天。然后，动物按正常方式饲养，动态观察，记录动物生长情况，直至自然死亡。用给药组同对照组相比的生命期的延长率(％ILS)评价药物的活性。
B.癌组织直接注射(Intratumoral)药物替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)盐和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)采用BALB/c-nu裸小鼠，接种人黑色素瘤MV3裸鼠异种移植瘤接种人神经胶质瘤SHG-44裸鼠异种移植瘤，待肿瘤体积生长至100-300mm3时，将接种同种移植瘤的动物按肿瘤大小分成给药组和对照组.给药组小鼠的癌瘤组织注射剂量为30μmol/kg，对照组小鼠任其自然生长。
溶液配制方法为定量称取上述替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)盐和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)，溶于生理盐水中，制成0.3mmol/ml清澄药物。
取适量上述配置好的0.3mmol/ml溶液，使用20号注射针头向给药组小鼠的癌瘤组织直接注射30μmol/kg剂量。
然后，动物按正常方式饲养，动态观察，记录动物生长情况，直至自然死亡。用给药组同对照组相比的生命期的延长率(％ILS)评价药物的活性。
结果大鼠连续5天静脉注射1mmol/m2/d剂量的替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)对大鼠体内人黑色素瘤肿瘤和人神经胶质瘤生长显示同等抑制作用，动物生存时间显著延长(表2，3)。
一次向小鼠的癌组织直接注射30μmol/kg剂量的替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸对小鼠体内人黑色素瘤肿瘤和人神经胶质瘤具有强的杀伤作用，动物生存时间显著延长(表4，5)。
表2.静脉注射替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)杀伤大鼠体内人神经胶质瘤实验结果
*％ILS生命期的延长率(percent increase of life span)＝[(给药物组平均生存时间-对照组平均生存时间)÷对照组平均生存时间]×100.§t-检验统计学显著不同。
表3.静脉注射替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)杀伤大鼠体内人黑色素瘤肿瘤实验结果
*％ILS生命期的延长率(percent increase of life span)＝[(给药物组平均生存时间-对照组平均生存时间)÷对照组平均生存时间]×100.§t-检验统计学显著不同。
表4.癌组织直接注射替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)杀伤小鼠体内人神经胶质瘤实验结果
*％ILS生命期的延长率(percent increase of life span)＝[(给药物组平均生存时间-对照组平均生存时间)÷对照组平均生存时间]×100.§t-检验统计学显著不同。
表5.癌组织直接注射替莫唑胺-8-羧酸钾(TMZAK)和替莫唑胺-8-羧酸-精氨酸(TMZAArg)杀伤小鼠体内人黑色素瘤肿瘤实验结果
*％ILS生命期的延长率(percent increase of life span)＝[(给药物组平均生存时间-对照组平均生存时间)÷对照组平均生存时间]×100.§t-检验统计学显著不同。
权利要求
1.替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I) 式I其中X-可以是O和S；M+是金属离子。
2.根据权利要求1所述，用于形成替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I)的金属离子包括铝(aluminium)，钙(calcium)，锂(lithium)，镁(magnesium)，钙(potassium)，钠(sodium)，锌(zinc)等所有药学上可以接受的金属离子。
3.权利要求1，2所述的替莫唑胺-8-羧酸水溶性金属盐衍生物是由替莫唑胺-8-羧酸与相应金属的弱酸盐，主要是碳酸盐和碳酸氢盐，反应形成中性的替莫唑胺-8-羧酸盐水溶液，然后冷冻干燥制得。
4.替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式II) 式II其中X可以是O和S；R是可以提供电子的广义的LEWIS硷有机化合物，R----H是由R提供电子形成的配位键(氢键)。
5.根据权利要求4所述，替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式II)是替莫唑胺-8-羧酸与的广义的LEWIS硷有机化合物(R)形成的，用于形成这类水溶性衍生物(式II)的广义的LEWIS硷有机化合物(R)包括(1).硷性和中性胺基酸，包括精胺酸(arginine)，组胺酸(Histidine)，赖胺酸(Lysine)，脯胺酸(Proline)，丝胺酸(serine)等。(2).常规药用硷性有机化合物，包括尿素(urea)，苄星(benzathine)，氯普鲁卡因(chloroprocaine)，胆碱(choline)，二乙醇胺(diethanolamine)，乙二胺(ehtyldiamine)，甲基葡胺(meglumine)，普鲁卡因(procaine)等。(3).临床使用的硷性抗癌药物，包括氮芥(2，2’-dichloro-N-methyldiethyamine)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯(glyciphosphofamide)，消瘤芥(nitrocaphane)，L-苯丙氨酸氮芥(melphalan)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，异磷酰胺(ifosfamide)，尼氮芥(nimustine)，地吖醌(diaziquone)，卡波醌(carboquone)，三胺硫磷(tris(1-aziridinyl)phosphine sulphide)，曲他胺(triethylene melamine)，六甲三聚氰胺(N，N，N’，N’，N”，N”，-hexamethyl-1，3，5-triazine-2，4，6-tramine)，博来霉素(bleomycin)，平阳霉素(bleomycin A5)，培洛霉素(peplomycin)，自力霉素(mitomycin)，阿霉素(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，去甲柔红霉素(idarubicin)，阿柔比星(aclarubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，更生霉素(dactinomycin)，丙卡巴肼(procarbazine)，达卡巴嗪(dacarbazine)，顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)，甲氨喋呤(methotrexate)，砒曲克新(piritrexim)，三甲曲沙(trimetrexate)，5-氟尿嘧啶(fluorouracil)，蚨喃氟尿嘧啶(tegafur)，卡莫氟(carmofur)，azaguanine，巯嘌呤(mercaptopurine)，硫唑嘌呤(azathioprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)，脱氧肋间型霉素(2’-deoxycoformycin)，氨甲酰基胺(hydroxycarbamine)，阿糖胞苷(cytarabine)，胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)，喜树碱(camptothecin)，羟基喜树碱(hydroxycamptothecin)，长春花碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，长春稀碱(vinorelbine)，长春地新(vindesine)，依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(teniposide)，秋水仙碱(colchicine)，三尖杉酯碱(harringtonine)，高三尖杉酯碱(homoharringtonine)，亮丙瑞林(leuprorelin)，曲普瑞林(triptorelin)，布舍瑞林(buserelin)，高舍瑞林(goserelin)，那法瑞林(nafarelin)，奥曲酞(octretide)等。(4).碱性的DNA烷基化修复酶抑制剂，包括O6-苯基鸟嘌呤(O6-benzylguanine)，O6-噻吩甲基鸟嘌呤(O6-thenylguanine)，O6--(4-溴-噻吩甲基)鸟嘌呤(O6-4-bromothenylguanine)，O6-(5-噻唑甲基)鸟嘌呤[O6-(5-thiazolymethyl)guanine]，O6-(2-氯-4-砒叮甲基)鸟嘌呤(O6-(2-chloro-4-picolyl)guanine)，甲基羟胺(methoxyamine)和错配修复系统(mismatch repair system，MMR)恢复剂2`-脱氧-5-氮-胞核嘧啶核苷(2`-deoxy-5-azacytidine，5-aza-CdR)等。(5).碱性的血管收缩剂(vasocontrictors)，包括肾上腺素(epinephrine)，去甲肾上腺素(noradrenaline)，间羟胺(metaraminol)，去氧肾上腺素(phenylephrine)，和血管生成抑制剂(antiangiogenesis agents)CC5013(lenalidomide，alpha-N{phthalimido}glutarimide)，LY317615(3-(1-Methyl-1H-indol-3-yl)-4-[1-[1-(2-pyridinylmethyl)-4-piperidinyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2，5-dione)，塞内昔布(Celecoxib)，卤夫酮氢溴(TempostatinTM)，酞胺哌啶酮(thalidomide)等。
6.替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式III) 式III其中X可以是O和S；R水溶性高分子聚合物。
7.权利要求6所述的替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式III)，是水溶性高分子聚合物R与替莫唑胺-8-羧酸经过脱水缩合形成的由共价键结合的聚合衍生物。一般是替莫唑胺-8-羧酸酯或酸酐，它们在体内酯酶的作用下，分解为替莫唑胺-8-羧和水溶性高分子聚合物。用于形成水溶性替莫唑胺-8-羧酸聚合衍生物的水溶性高分子聚合物包括普鲁兰(PULLULAN)，维生素E聚乙二醇聚合物(VETPGS)，羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose)，甲基纤维素(methylcellulose)，聚丙稀酸[Poly(acrylic acid)]，聚乙稀醇[Poly(vinyl alcohol)]，混聚丙稀酰胺和丙稀酸Poly(acrylamide-co-acrylic acid)，完全或部分水解的聚或混聚马来酸酐[Poly(maleic anhydride)]，聚缩醛(Polyacetal)，聚糖(Glycans)，聚乙二醇(PEG)等。
8.权利要求4，5要求的酸性抗癌药物(替莫唑胺-8-羧酸)与硷性抗癌药物，酸性抗癌药物(替莫唑胺-8-羧酸)和其它硷性生物活性物质形成的水溶性衍生物(式II)的协同作用和增效作用。
9.权利要求1，2，3，4，5，6，7所述的替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I，II，III)，在体内外有效的抑制癌组织和癌细胞生长，是新的抗癌活性化合物，适合于制备水性基质抗癌药物制剂，包括注射剂，手术后清洗剂，软膏等。
10.根据权利要求9，替莫唑胺-8-羧酸水溶性衍生物(式I，II，III)的水基质抗癌药物注射剂适合于静脉滴注，皮下，腱鞘，脊椎，颅腔，腹腔，有癌变的器官，癌组织等局部注射给药。适合用于治疗神经交支瘤(glioma)，恶性神经交支瘤(malignant glioma)，黑色素瘤(melanoma)，间皮瘤(mesothelioma)，皮瘤(sarcoma)，淋巴组织瘤(lymphoma)，白血病(leukemia)，直肠和卵巢癌(carcinoma of thecolon and ovary)等。
全文摘要
本发明公开几类替莫唑胺－8－羧酸水溶性衍生物，包括替莫唑胺－8－羧酸的金属盐，有机胺盐，和利用酸碱成盐的原理替莫唑胺－8－羧酸与硷性胺基酸，硷性抗癌药物，碱性的DNA烷基化修复酶抑制剂，碱性的血管收缩或血管生成抑制剂形成的具有协同作用的水溶性衍生物。本发明还公开制备这几类替莫唑胺－8－羧酸水溶性衍生物的方法，它们抑制癌细胞生长和抑制动物体内癌组织生长的活性，以及它们作为新的抗癌活性化合物在制备抗癌药物制剂中的应用。
文档编号A61K45/00GK1948313SQ200510112688
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月13日 优先权日2005年10月13日
发明者王永峰 申请人:天津倍方科技发展有限公司