专利名称：抗动脉粥样硬化核酸疫苗的纳米颗粒化与粘膜免疫的利记博彩app
技术领域：
在医药领域中，本发明所提供的抗动脉粥样硬化核酸疫苗/壳聚糖纳米颗粒，能方便应用于粘膜免疫，并且诱发机体产生的特异性抗体水平优于单纯核酸疫苗的肌肉注射免疫。
背景技术：
动脉粥样硬化(Atherosclersis，AS)是严重危害人类健康的常见病，并且发病率在我国有明显增加的趋势。动脉粥样硬化的发生是多因素作用的结果，其病因尚未完全阐明。目前普遍认为，胆固醇酯转移蛋白(cholester ester transfer protein，CETP)与动脉粥样硬化发生和发展密切相关。由本实验室构建的核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-CETPC，通过肌肉注射可以有效地产生特异性抗CETP抗体，且能够有效的预防动脉粥样硬化的发生。
粘膜免疫系统是机体免疫网络中重要的组成部分。是通过粘膜相关淋巴组织(MALT)接受抗原，诱发机体免疫反应的。鼻腔、咽喉乃至肛门有一系列的淋巴样组织，它们均位于粘膜下区域，是一些弥散的淋巴组织，既可以是一大片密集较均匀的淋巴组织，也可以是一小片淋巴细胞、有时形成淋巴滤泡，在这些淋巴滤泡中有丰富的树突状细胞和巨噬细胞等专职抗原递呈细胞。粘膜的M细胞具有吸附和吞噬抗原颗粒的功能，大分子物质粘附于表面上皮细胞后，很快就被摄入M细胞质内的吞饮囊，并转运至周围的淋巴细胞或细胞下的淋巴滤泡。粘膜层上皮细胞对粘膜表面的抗原也有摄入和呈递作用，是一种“非专职”的抗原呈递细胞。由于鼻腔是吸入性抗原的第一结合位点，几乎所有引起呼吸系统疾病的病毒、细菌和寄生病原体都是通过鼻腔粘膜表面进入并感染机体的，因此，鼻腔粘膜在整个粘膜系统中是非常重要的，鼻腔给药，疫苗的靶部位是鼻相关淋巴组织(NALT)，它可以引起局部和周边的粘膜免疫反应。鼻腔免疫需要的疫苗量比口服免疫少，可能是由于鼻腔粘膜能够更有效地吸收并利用疫苗。另外，鼻腔免疫比传统注射方式更方便安全，易于对广大人群进行推广免疫。
裸露DNA很难自主进入细胞，选择合适的载体，载荷核酸疫苗DNA进入细胞有效表达是基因免疫成功的关键。基因载体分为病毒和非病毒二大类，病毒类作为一种高转染率的基因载体已被研究多年，但它在临床上暴露出的免疫原性和致瘤性等安全问题，阻碍着此类载体的进一步发展，近年来，人们致力于寻找安全有效的非病毒类载体。
壳聚糖是一种从甲壳类动物中提取的天然聚多糖，由于其具有良好的生物相容性，可生物降解、免疫原性低、成本低廉等特点，近年来广泛用作递药系统的载体。其中包括大分子的多肽、蛋白质和核酸类药物。随着在此方面研究的不断深入，人们已经认识到了壳聚糖作为核酸疫苗非病毒载体的应用前景，并且将这一技术广泛地应用到多种疾病的治疗研究中。
壳聚糖分子中的葡糖胺基在酸性溶液中发生质子化，呈正电性，而DNA中的磷酸基团呈负电性，因而二者可通过电性作用共聚形成多聚复合物，使DNA压缩成纳米(或微米)级的颗粒。由于纳米颗粒尺度微小，可以靶向鼻相关淋巴组织中特殊上皮细胞-M细胞，并转运到深层的淋巴组织，提高机体对抗原的摄取。
壳聚糖作为载体的优点体现在促渗作用和生物粘附作用这两个方面。它的促渗作用表现在，质子化壳聚糖可以增加药物在粘膜上皮细胞的细胞内外之间(transcellular)和细胞与细胞之间(paracellular)转运。促进核酸疫苗穿过粘膜屏障与其下的淋巴组织作用，提高M细胞对核酸疫苗的摄取率。其生物粘附性是因为粘膜上的粘液在生理pH下带有负电荷，而核酸与壳聚糖结合形成的纳米颗粒表面带有正电荷，与粘液之间存在静电作用，而使其粘附于上皮细胞表面，延长疫苗与粘膜的作用时间，有利于细胞对核酸的摄取。两个方面协同作用，显著提高疫苗的有效性。
用壳聚糖递送核酸的另一个显著优点是可以有效的减少核酸的降解。外源性核酸在转移到淋巴细胞的过程中易被核酸酶降解，而壳聚糖将核酸包裹于其中，可以抵御核酸酶的酶解作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备抗动脉粥样硬化核酸疫苗纳米颗粒的方法。
本发明的另一目的是提供抗动脉粥样硬化核酸疫苗纳米颗粒的粘膜免疫方法。
在本发明的第一个方面，提供了一种制备抗动脉粥样硬化核酸疫苗的纳米粒的方法。通过该方法制得的纳米颗粒可有效地装载核酸。其制备是将壳聚糖与核酸在弱酸性溶液中，利用二者的电性中合，并在絮凝剂硫酸钠的作用下，共聚形成纳米颗粒。如图1.所示，核酸疫苗与壳聚糖经共聚后形成的纳米颗粒与裸露核酸疫苗在琼脂糖凝胶板上的电泳行为不同，共聚后的核酸疫苗几乎完全滞留于加样孔中。经透射电子显微镜观察，如图2.所示，通过本发明提供的方法可制得不规则球形纳米级颗粒。并且可以通过调整壳聚糖和核酸的比例，制得100nm-1000nm粒径范围，动电电位在12-24mV，包封率＞90％，载药量约为28％的纳米颗粒。
在本发明的第二方面，提供纳米颗粒化核酸疫苗的粘膜免疫方法。将抗动脉粥样硬化核酸疫苗纳米颗粒通过鼻腔免疫新西兰白兔，通过壳聚糖纳米粒的递送作用，使抗动脉粥样硬化核酸疫苗进入鼻腔粘膜系统，经宿主细胞的转译系统在机体内表达出表面呈现含有CETP表位的重组抗原，激发机体产生针对胆固醇酯转移蛋白C端多肽的特异性抗体。
图1.抗动脉粥样硬化核酸疫苗/壳聚糖纳米粒的电泳行为。图例1.未经纳米颗粒化的抗动脉粥样硬化核酸疫苗；2.经纳米颗粒化的抗动脉粥样硬化核酸疫苗图2.抗动脉粥样硬化核酸疫苗/壳聚糖纳米粒在透射电子显微镜下的图片(放大100000倍)。
图3.ELISA测定结果显示核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-CETPC诱发兔产生抗CETP抗体。图例 表示生理盐水组； 表示壳聚糖(滴鼻)组； 表示裸露核酸疫苗(滴鼻)组；■表示核酸疫苗纳米颗粒(滴鼻)组； 表示裸露核酸疫苗(肌肉注射)组
具体实施例方式
通过以下实施例进一步说明本发明抗动脉粥样硬化核酸疫苗的纳米颗粒的制备方法实施例1.
将适量壳聚糖溶解于5mM醋酸-醋酸钠缓冲溶液中(pH5.5)，制成浓度为2mg/ml溶液。将适量抗动脉粥样硬化核酸疫苗溶解于15mM硫酸钠溶液中，制成浓度为500μg/ml溶液。将上述二溶液分别于55℃中水浴加热5分钟，用旋涡振荡仪将1倍体积的核酸疫苗溶液旋起，迅速将0.5倍体积的壳聚糖溶液倒入核酸疫苗溶液中，旋涡20秒，室温静置1h以上，即得抗动脉粥样硬化核酸疫苗/壳聚糖纳米粒的胶体溶液。
实施例2.
将适量壳聚糖溶解于5mM醋酸-醋酸钠缓冲溶液中(pH5.5)，制成浓度为300μg/ml溶液。将适量抗动脉粥样硬化核酸疫苗溶解于15mM硫酸钠溶液中，制成浓度为100μg/ml溶液。将上述二溶液分别于55℃中水浴加热5分钟，等体积迅速混合，涡旋30秒，室温放置1h，即得抗动脉粥样硬化核酸疫苗/壳聚糖纳米粒的胶体溶液。
实施例3.
将适量壳聚糖溶解于5mM醋酸-醋酸钠缓冲溶液中(pH5.5)，制成浓度为2mg/ml溶液。将适量抗动脉粥样硬化核酸疫苗溶解于6.25mM硫酸钠溶液中，制成浓度为800μg/ml溶液。将上述二溶液分别于55℃中水浴加热5分钟，等体积迅速混合，涡旋30秒，室温放置1h，即得抗动脉粥样硬化核酸疫苗/壳聚糖纳米粒的胶体溶液。
实施例4.
将实施例2中得到的抗动脉粥样硬化核酸疫苗/壳聚糖纳米粒的胶体溶液加入0.75％(W/V)填充剂(甘露醇/乳糖＝2∶1)，搅拌使溶解，经冷冻干燥，制成冻干粉剂。抗动脉粥样硬化核酸疫苗的药效学研究实施例5.
选用新西兰大白兔40只，雌性，随机分为5组，每组8只，分别为生理盐水组，壳聚糖溶液组，裸露核酸疫苗组和核酸疫苗/壳聚糖纳米粒组，鼻腔给药，另设裸露核酸疫苗肌肉注射组。给药剂量为250μg核酸疫苗/只，给药体积200μl。其中，肌肉注射组用无菌生理盐水将250μg核酸疫苗稀释成1.25μg/μl备用。以200μl 0.25％盐酸布比卡因(无菌生理盐水为溶剂)处理兔后肢双侧股四头肌。3天后，在每只兔的处理肌肉处两侧各分别多点注射200μl裸露核酸疫苗。分别于3、6周以相同方法加强免疫一次，按2、5、7、9周行耳缘静脉取血，离心取血清-20℃冷冻保存。
抗人胆固醇酯转移蛋白特异抗体的ELISA检测用纯化的重组人血管内皮生长因子121及人胆固醇酯转移蛋白C端26肽的融合蛋白(rhVEGF-CETPC)4℃包被96孔ELISA酶标板过夜，每孔100μg，弃去包被液。加入5％牛血清白蛋白溶液(pH7.4磷酸盐缓冲液的配制)，37℃满孔封闭1小时，弃去封闭液。将兔血清用封闭液稀释50倍，然后每孔加入100μl稀释后的兔血清，于37℃孵育1小时。弃去血清，用磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)满孔洗涤6次，每孔加入按1∶10000稀释的羊抗兔IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)100μl，37℃孵育1小时，弃去二抗液，磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)满孔洗涤6次，洗涤后，每孔加入100μl过氧化氢尿素和3、3｀、5、5｀-四甲基联苯胺溶液，于37℃显色30分钟后，加入50μl 2M硫酸终止反应，用酶标仪测定450nm波长的吸光度值。兔血清ELISA检测结果见图3，结果表明，抗动脉粥样硬化核酸疫苗/壳聚糖纳米粒组能诱发兔产生特异的抗CETP的抗体，且抗体水平高于核酸疫苗肌肉注射组和裸露核酸疫苗组，经t检验，7周时，核酸疫苗/壳聚糖纳米粒组与生理盐水组，壳聚糖溶液组，裸露核酸疫苗组比较，均存在非常显著性差异(p＜0.01)；与裸露核酸疫苗肌肉注射组比较存在显著性差异(p＜0.05)。
权利要求
1.一种制备抗动脉粥样硬化核酸疫苗(pCR3.1-X8-HBc-CETPC)颗粒的方法，其特征是通过共聚作用将抗动脉粥样硬化核酸疫苗与壳聚糖组成多聚复合物，使之更有效的被机体所吸收，增强其免疫原性。
2.权利要求1的多聚复合物，其形态特征是纳米或微米级的颗粒，粒径为50nm～10μm。
3.权利要求2的多聚复合物颗粒，其特征是颗粒的粒径优选为100nm～500nm。
4.权利要求1的多聚复合物，其特征是壳聚糖的分子量为1万～200万。
5.权利要求4的壳聚糖的分子量，其特征是分子量优选为3万～20万。
6.权利要求1的多聚复合物，其特征是核酸疫苗与壳聚糖的重量比，壳聚糖以分子中的N计算，核酸以分子中的P计算，N和P的重量比为1～10∶1。
7.权利要求6的N和P的重量比，其特征是N和P的重量比优选为3～6∶1。
8.权利要求1的多聚复合物，特征是其剂型为胶体溶液、混悬液、冻干粉剂、喷雾剂。
9.一种抗动脉粥样硬化核酸疫苗纳米颗粒的粘膜免疫方法，其特征在于，它将权利要求1所述抗动脉粥样硬化核酸疫苗颗粒应用于粘膜免疫。
全文摘要
将壳聚糖溶液和抗动脉粥样硬化核酸疫苗质粒DNA在共聚作用下结合形成纳米颗粒。通过鼻腔粘膜免疫，抗动脉粥样硬化核酸疫苗纳米颗粒能诱发兔产生特异的抗胆固醇酯转移蛋白抗体，且抗体水平高于核酸疫苗肌肉注射组。应用这项技术，优化了核酸疫苗的免疫方式与途径。
文档编号A61K48/00GK1679966SQ200510038150
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月19日 优先权日2005年1月19日
发明者宗莉, 顾凯, 龙军, 王学军, 陈伶俐, 曹荣月, 吴洁, 刘景晶 申请人:中国药科大学