专利名称：喹啉类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明属中药制药领域，涉及喹啉类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的新用途。尤其是茵芋碱和5-甲氧基白鲜碱在抗乙肝病毒药物中的应用。
背景技术：
乙肝病毒(HBV)感染是全球性的影响人类健康的主要疾病之一，据统计，全世界大约有3亿多人为慢性HBV携带者，我国约占半数。由于HBV感染可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此已成为影响人类寿命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217，因此在全世界每年大约有200万人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国又是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相关的慢性肝病(肝硬化与肝癌)。这给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻求高效低毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。
尽管药物化学工作者在筛选抗HBV药物的过程中进行了不懈的努力，但到目前为止人们还没有找到一种特效药来治愈HBV感染。临床上已获得FDA正式批准使用的α-干扰素和核苷类药物拉米呋啶只能在某种程度上获得治疗效果，对大多数病人还达不到治愈的目的，停止治疗后的“反跳”现象是医药工作者最感棘手的问题，所以开发研制高效、低毒、不“反跳”的抗HBV新药向药物化学工作者提出了挑战。在筛选抗HBV新药的过程中，越来越多的药物化学工作者把注意力转向了植物来源丰富，价廉易得，毒副作用小，分子结构复杂多样的天然化合物。
中药两面针(Zanthoxylum nitidum)属芸香科花椒植物，主要分布在我国南方省区，如广西、广东、福建等地，广西资源尤其丰富。民间常用其根、根茎、根皮和茎皮入药，具有行气止痛、活血散淤、通络祛风之功效，用于跌打损伤、风湿痹痛、牙痛胃痛、毒蛇咬伤。应用于洁齿，是制造两面针牙膏的主要原料；近年来，有研究发现其有抗肿瘤活性。该药材含有苯骈氮杂菲类生物碱、喹啉类生物碱和香豆素等成分，其中苯骈氮杂菲类生物碱是该药材的抗肿瘤药效物质基础。但至今尚未见两面针中喹啉类生物碱单体对抗HBV的作用及用于治疗乙肝的报导。
发明内容
本发明的目的是提供新的抗病毒活性物质，具体涉及喹啉类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的新用途。特别涉及茵芋碱和5-甲氧基白鲜碱在制备治疗乙肝药物中的用途及其提取方法。
本发明根据“祛邪扶正”原则，应用现代药理筛选方法，对植物药中抑制HBV的活性物质进行研究，从芸香科花椒属植物两面针(Zanthoxylumnitidum)中生物碱部位提取活性生物碱喹啉类生物碱并证实其有抗HBV病毒活性。
本发明所述的喹啉类生物碱包括茵芋碱(1)和5-甲氧基白鲜碱(2)。
本发明的活性生物碱类化合物具有式I的化学结构 其中1 R1＝H， R2＝R3＝OCH3，2 R1＝OCH3， R2＝R3＝H。
本发明所述的化合物喹啉类生物碱通过下述方法制备取两面针根茎粗粉10kg，用2％硫酸(v/v)室温冷浸(30L×4次)至酸水液不呈生物碱反应，合并酸水提取液，经NaOH碱化至pH10～11后以氯仿等体积多次萃取完全，减压回收氯仿得总提取物110g(提取率1.10％)。总碱浸膏100g干法上样进行硅胶柱层析，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱层析和sephadex LH-20柱层析，分离得到茵芋碱(1)、5-甲氧基白鲜碱(2)。
其中，茵芋碱(skimmianine)(1)白色片状结晶(甲醇)，mp168-170℃；C14H13NO4，分子量259；1HNMR(CDCl3，400MHz)δppm8.00(1H，d，J＝9.39Hz，5-H)，7.57(1H，d，J＝2.74Hz，2-H)，7.22(1H，d，J＝9.39Hz，6-H)，7.02(1H，d，J＝2.74Hz，3-H)，4.42(3H，s，4-OCH3)，4.11(3H，s，OCH3)，4.02(3H，s，OCH3)；13C-NMR(CDCl3，100MHz)δppm164.3(C-9′)，157.2(C-4)，152.1(C-8′)，143.0(C-2)，141.8(C-7)，141.4(C-8)，118.2(C-5)，114.8(C-3′)，111.9(C-6)，104.6(C-3)，101.9(C-4′)，61.6(8-OCH3)，58.9(4-OCH3)，56.7(7-OCH3)；EI-MS m/z259([M]+)(70)，258(26)，244(100)，230(53)，229(26)，216(24)，213(26)，201(26)。
其中，5-甲氧基白鲜碱(5-methoxydictamnine)(2)白色针晶(丙酮-石油醚)，mp126-128℃；C13H11NO3，分子量为229；IR(KBr)υmax(cm-1)2952，1629，1618，1580，1552，1516，1464，1446，1393，1365，1329，1303，1260，1188，1156，1047，979，812，770，747，725，641；1HNMR(CDCl3，400MHz)δppm7.83(1H，d，J＝8.61Hz，8-H)，7.63(1H，d，J＝2.74Hz，2-H)，7.35(1H，t，J＝8.61Hz，7-H)，7.05(1H，d，J＝8.61Hz，6-H)，7.06(1H，d，J＝2.74Hz，3-H)，4.43(3H，s，4-OCH3)，4.07(3H，s，5-OCH3)；13C-NMR(CDCl3，100MHz)δppm163.1(C-9′)，156.8(C-4)，154.5(C-5)，143.9(C-2)，137.4(C-8′)，123.4(C-7)，119.6(C-4′)，114.0(C-8)，107.6(C-6)，104.5(C-3)，103.8(C-3′)，59.0(8-OCH3)，55.9(4-OCH3)；EI-MS m/z229([M]+)(100)，228(72)，214(29)，200(65)，199(30)，185(17)，184(24)，156(25)。
上述生物碱经药理试验，结果证实具有显著的抗HBV作用，且有效浓度低，细胞毒性较小的特点(表1)。所测生物碱对HBsAg和HBeAg均显示有抑制作用。所述5-甲氧基白鲜碱在0.2μmol/mL时对HBsAg的抑制率高于阳性对照拉米呋啶(1.0μmol/mL时抑制率为29.6％)。所述茵芋碱在0.2μmol/mL时对HBeAg亦有一定的抑制作用，抑制率为3 1.9％，和拉米呋啶相当(1.0μmol/mL时为35.4％)。5-甲氧基白鲜碱在0.2μmol/mL时对HBeAg的抑制率高于阳性对照拉米呋啶(1.0μmol/mL时抑制率为35.4％)。
图1是两面针根茎酸水提取碱化后氯仿萃取部位提取分离流程图。
具体实施例方式
实施例1 制备喹啉类生物碱两面针根茎粗粉10kg，用2％硫酸(v/v)室温冷浸(30L×4次)至酸水液不呈生物碱反应，合并酸水提取液，经NaOH碱化至pH10～11后以氯仿等体积多次萃取完全，减压回收氯仿得总提取物110g(提取率1.10％)。总碱浸膏100g干法上样进行硅胶柱层析，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱，进一步具体操作如下1.氯仿-甲醇(98∶2)洗脱所得流份进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(10∶1～6∶4)洗脱。石油醚-乙酸乙酯(7∶3)流份，反复硅胶柱层析，再经Sephedax LH-20柱(80％甲醇)得白色片状结晶茵芋碱(1)8mg。
2.氯仿-甲醇(95∶5)洗脱所得的流份进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(7∶3)洗脱。石油醚-乙酸乙酯(6∶4)流份，反复硅胶柱层析，再经sephedax LH-20柱(80％甲醇)得白色针状结晶5-甲氧基白鲜碱(2)10mg。
实施例2 体外抗HBV试验HevG2 2.2.1.5(教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海)，在96孔细胞培养板中培养一周后，加入0.2μmol/ml的样品液，37℃，5％CO2培养16h，用MTT法检测化合物对HepG2 2.2.1.5细胞的毒性，酶标仪读取OD570(nm)值。
HepG2 2.2.1.5在96孔细胞培养板中培养一周后，加入0.2μmol/ml的样品液，37℃，5％CO2培养24h，收集上清液，用ELISA法检测HBV抗原变化。具体操作如下将HepG2 2.2.1.5上清10μl与5％封闭液40μl加入96孔板、双复孔；每孔加入50μl酶结合物，混匀，37℃水浴30min；弃液体，每孔加入200μl PBST，静置20秒，再弃液体，重复五次；加入50μl显色液A和50μl显色液B，混匀，37℃水浴15min；每孔加入终止液50μl；酶标仪读取OD450(nm)值，参考波长650(nm)。
表1是本发明生物碱对HepG2 2.2.15细胞的毒性及对HBsAg和HBeAg的抑制效果。
表1
其中，-“未见明显毒性”系指用MTT法检测细胞存活率≥75％；+“显示毒性”指细胞存活率＜75％。
权利要求
1.喹啉类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其中所述的喹啉类生物碱具有式I的结构， 1 R1＝HR2＝R3＝OCH32 R1＝OCH3R2＝R3＝H。
3.按权利要求1所述的用途，其中所述的喹啉类生物碱通过下述步骤制备①两面针根茎用2％硫酸(v/v)室温冷浸(30L×4次)至酸水液不呈生物碱反应，合并酸水提取液，经NaOH碱化至pH10～11后以氯仿等体积多次萃取完全，减压回收氯仿得生物总碱；②两面针生物总碱经反复硅胶柱层析和sephadex LH-20柱层析的方法获得喹啉类生物碱茵芋碱(1)、5-甲氧基白鲜碱(2)。
4.按权利要求1所述的用途，其中所述的喹啉类生物碱是茵芋碱。
5.按权利要求1所述的用途，其中所述的喹啉类生物碱是5-甲氧基白鲜碱。
全文摘要
本发明属中药制药领域，涉及喹啉类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的新用途。特别涉及茵芋碱和5－甲氧基白鲜碱在制备治疗乙肝药物中的用途及其提取方法。本发明从芸香科花椒属植物两面针(Zanthoxylum nitidum)中生物碱部位提取活性生物碱喹啉类生物碱经药理试验，结果证实具有显著的抗HBV作用，且有效浓度低，细胞毒性较小的特点。所测生物碱对HBsAg和HBeAg均显示有抑制作用。其中5－甲氧基白鲜碱的抑制率高于阳性对照拉米呋啶，所述茵芋碱对HBV的抑制作用与拉米呋啶相当。
文档编号A61K31/4738GK1698610SQ20051002657
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月8日 优先权日2005年6月8日
发明者陈道峰, 杨国红 申请人:复旦大学