从口腔上皮细胞分离核酸的利记博彩app

专利名称：从口腔上皮细胞分离核酸的利记博彩app
从口腔上皮细胞分离核酸
交叉引用
根据35 US.C119(e)的规定，本申请要求享有2003年11月12日申请的 美国临时申请号60/519,103和2004年1月30日申请的美国临时申请号 60/540,929 (其内^jfc飾弓阅作为参考)的利益。
鹏支持
根据国立卫生研究所裁定的合同号R21-HL71771,本发明在政府支持下 得以完成。自享有本发明的一些权利。 发明领域
本发明涉M口腔上皮细胞分离核酸的方法、用于获得戶;f^核酸的装置以
^^f获得的核酸的应用。
背景技术：
主要的兴趣集中在从多种部位和组织获得RNA。基因鋭领懂日益丰細 作理解疾病发病机理和粒多种疾病和病症(例如癌)的诊断和预后以及其它 应用的工具。
确定从呼吸道获得的上皮细胞的基因鋭的能力具有重要含义。例如，开 发早期自和诊断技术，以用于确定个体(其已被暴^例如刺激M1雾或香 烟烟雾的环境污染物)是否已经发展劍市癌或处于发展成肺癌的危险中的能 力。齡呼吸道的上皮细胞(胸腔内和胸腔外气道)繊暴露于包括香烟烟雾 的环境污染物，并因此在BW个体中具有遗传损伤的迹象。检测这种损伤类型
的能力可指明个体是否患有肺癌或正处于发^市癌的危险中，以及戶;M巿癌
的类型。
肺癌、环銜污染和特别是吸烟，依旧是重要的鶴问题。吸烟魏鹏过 90%的肺癌的原因，而仅仅15%的吸烟者实际上^^|總。 一旦己经赚， 肺癌几乎是普，死的，5 ，活率仅仅10-15%。在美国肺癌导致死亡数(一 年约160，000)鹏其次最常见的四种癌类型的组合。另外，在美国2500 ^J见 在的吸烟者和2500万曾经的吸烟者处于发展劍市癌的危险中。肺癌的一个最大问题是早期检测。在治疗B鹕中，^^f周知对于处于高危险中的个体的早期
检湖树于存活是极其重要的。在处娜癌中，非侵入性(non4nvasive)湖赋的开 发是很有帮助的。
因此，开糊TiTO个体肺癌危险(包括患有鹏和将来^^的危
险)的简单的非侵入性i ttr具具有重要的意义，戶脱iTOf咖鹏鉴定在疾
病进展的多种状态具有鋭变化的新己基因。然而，目前这翻究利用膽的 大支气管(肺内气道)刷取的上皮细胞。戶脱的方^~般包括支气管镜检査法， 皿病人具有一定危险的侵入性方法。理^k是i^从口腔上皮细胞分离RNA
的方法，以)^开究延伸至鹏外气道。如果人们i顿从口腔获得的RNA，这可 充分M^对受微的危险，并且在门诊病A^大的调査瞎况中可潜在地轻松 得至脾品。然而，如以下讨论，口腔环境不容易获得完整RNA。
不幸地是，不iM;侵入性活组织检查手术没有人可以从口腔上皮细胞(也
称为口腔粘膜)获得高质量的RNA。当将来自口腔中口腔粘膜的棉拭和刮屑 用于获得上皮细胞的DNA以用 传研究时12，可从切除的组织和口腔上皮 的活组织检查样品得到RNA。然后这可用于多种病状态以测量基因,3，4。
从口腔上皮细胞非侵入性获得RNA的一个主要障碍是唾液，其含有, RNA的^RNA銜5。从口腔刮取细胞可诱导产生唾液并释^^f述的RNA酶 的事实，使得该障碍更加鋭。财卜，口腔组织的^^且织检査包含平滑脂口其
它非上皮细胞。含有戶;M混合细胞群体的样品不合乎所有研究的需要。例如，
平滑鹏啡上飾胞很可能不受环境污鹏(例如香爝烟雾)的影响。
因此，理^4是具有可获得完整口腔上皮细胞^l取RNA的方法和錢。
分离的口腔RNA样品可用于广泛的应用，包括研究以测量基因表达。 发明
我们己开发了新的刮^g以从受蹄口腔,细胞，特别是口腔粘膜上 皮细胞，这使得可分离包括RNA和DNA的核酸。《顿这种il^h皮细胞的 刮取^g,我们还开发出用于从口腔内部获得细胞(优选口腔粘膜细胞)核酸 糊M受入性方法。我们職明口腔暴露于污鹏(例如香烟烟雾)改变了口腔 衬里的上皮细胞中某，因的,。本发明方法还提供了基于核酸的工具以评 价与暴露于气道污^W关的肺疾病危险。核酸工具包括分析基因,谱以及 分析DNA甲靴模式。因此，本发明,刮取錢，其具有近顶啲手柄端、远侧的lB^端和手柄
端和收集端之间的连接部分；其中连接部分使得手柄端和麟端可任选地彼此 分开；且其中收集端还包括外周缘和凹部，其中戶臓麟部分的至少一些外周 缘是锯齿状的，以允许刮取生物样品，并且凹部允许l^^刮取的生物样品。优 选地，在宽度，接部分与其两侧的手柄端和,繊常:1^的。
一个,的刮取^a具有勺状的收集端。在另一 方案中，刮取装置是
塑料的。在另一实施方案中，刮取CT是TO的。
在一个优选实旨案中，刮取装置的连接部^a括穿孔。在另一实施方案
中，连接部分同与其接触的手柄端和收集端不一样厚。
还在一^H^^i方案中，刮取，以及其中所W^型从大约手柄，端 到收集te端的微约是3.5-6英寸。例如，4.0英寸、4.5英寸、5.0英寸.在 一个优选的刮取装置中，收集端长度约是1-2英寸，例如L25英寸。
将收集端的长度和宽度设计成允许,^合储存容器。在一个优选实施 方案中，储存容器含有iM附着于储存容器的盖子。,地，将储存容器和收
集端设计成收集端极好;ttyi合收集容器。 一般，也可将一^!型的溶液加入储
存容器以稳定保存,的生t)^品。
本发明的一个实施方案,了生物样品的非侵入性分离法，其中样品包含 来自口腔粘膜的上皮细胞。
在一个优选实施方案中，本发明的刮取装置用于分离含有核酸的生物样
品。im是RNA或DNA。在一个实施方案中，核酸是RNA。在另一实施方 案中，核酸是DNA。雌地，从口腔粘膜的上皮细胞分离核酸，例如RNA。
本发明的一个雌实 案繊从^^口腔1 ^酸样品的非侵入性方 法，包括用刮取装置从受微口腔分离细胞、将刮取的细胞转入含有核酸稳定 溶液(艮,制核酸酶活性的溶液)的储存容器中、并随后从保存在核酸稳定溶 液中的刮取的细胞样品中提取核酸。
在一个 方案中，从样品提取核^t前，将核酸稳定溶液中的刮取的细 胞样品保存于-2(TC。在另一实施方案中，将样品igit到中央实验室以用于分析。
在一个雌实施方案中，核麟腿，且稳定溶液是灭活薩断口稳定 RNA的7K溶液，例如"RNALater"溶液(购自Qiagen， Valencia, CA)。可<柳育纵样品提取完整RNA的樹可方法。一^M^^^法是^ffi TRIzol 试剂(购自Invitrogen， Carisbad， CA)。
在一^K^实施方案中，分离约2(XW000 ng总RNA。在另一实施方案 中，分离约1000ng。
本发明另一优选实施方案提供了试剂盒，其含有收集生物样品的刮取装 置、储存容器和核酸稳定溶液。
本发明另一雌的实 案麟rna ti^统，戶;M^统包括含有具有
近侧的手柄端、包含锯齿微卜周缘的远侧ij^^端和手柄端和收集端之间的连接 部分的刮取装置，其中连接部分允i恃柄端和收集端可任M彼此分开；以及 包含RNA稳定溶液的储存容器。 ^ife，储存容器含有盖子。甚至更,地, 盖子附着于储存容器。
本发明还，用于从口腔粘膜il^h皮细胞的试剂盒，包^y取^s和含 有RNA稳定溶液的储存容器。在一，选的实施方案中，RNA稳定溶液是 RNALater。
本发明一4^选的实 案,收,品的方法，其包括如下步骤■ 具有近侧的手柄端、包含锯齿微卜周缘的远侧收集端和手柄端和麟端之间的 连接部分的刮取装置；4!^包含RNA稳定溶液的储存容器；用,端的锯齿 微卜周缘从受微口腔的口腔粘膜刮取上皮细胞；将刮取的上皮细胞收驗刮 取装置的收集端；将舌陬的上皮细胞转入储存容器；以及旋转刮取體手柄以
使得^a的手柄端在连接部分与收集端分开，以至于储存，包含RNA储存
液、刮取的样品以及刮取體的iB^端。
本发明^l^用于收皿酸样品的刮取装置，包^5侧的手柄端；远侧的 ,端；和手柄端和,端之间的连接部分；其中，在宽度上连接部分与其两 侧的手柄端和收集端錢续的且刻痕(score)的，例如Mil穿孔；或雜接部 分比其两侧的手柄端和收集端薄；并且连接部分使得手柄端和收集端可任选地 彼此分开；且其中收集端还包含外周缘和凹部，其中戶脱的收集部分的至少一 些外周缘是锯齿状的，以允许刮取核酸样品，且凹部允许lB^刮取的核酸样品。
用于获得分离自口腔上皮细胞的核酸的非侵入性方法，包括将从^# 口腔非侵入性分离的细胞转入可使核酸酶失活的核酸稳定溶液中，并从分离的 细胞提取目的核酸，以获得分离的核酸样品。在一个雌的实施方案中，核酸是RNA。 i^M,用本发明的刮取縫M刮職口腔非侵入性分离细胞。
核酸，雌是RNA，可在最高室温且包括室温的鹏下以最低,稳定 保存最多三天，雌一至两天。鹏趣氏，RNA保荆寻越长。在用于从口腔 上皮细胞获得分离的核酸糊N1入性方法的一个雌实施方案中，在从样品提 取RNA之前，将RNA稳定溶液中的刮取的细胞样品保存于-15'C至-25'C 。优 选地，RNA稳定溶液是RNA稳定试剂RNALatero
我们己乡5^现口腔粘MJ:皮细胞中基因^i可用作为肺细胞的状态(或状 况)的畅。这允许人们鉴定患有或处于^^^病危险中的个体。
在一个实施方案中，从口腔上皮细胞分离的RNA可用于基因^iii^析。 在另一实施方案中，从口腔上皮细胞分离的DNA可用于鉴定其中的变化，例 如3131 DNA甲,分析的甲m。
舰分析与不同病症(例如肺癌期)有关的基因鋭的口腔上飾胞的特 征，本发明的一个实 案皿鉴定患有或处于，病症(例如肺癌)危险的 吸烟者。
因此，本发明一个实肺案麟用于检测口腔粘ah皮细胞样品中目的靶
基因皿的方法，其包括根据戶;M从口腔粘^h皮细胞分离核酸样品；将步 戰a)分离的核酸样品^至少一种可特异杂交目的,因的核酸探针；和在核 酸样品中检测戶腿目的鹏因的械。在一个实 案中，在实施步iKb)之前， 将目的,因附着在固相上。,核酸是RNA或DNA。
在一个,实 案中，目的基因在患有肺癌的^^与未患有肺癌的受 试者中^异M的。例如，目的基因在患有肺癌的受试者中泰逸，而在不患 有肺癌的^#中不縱。tmt&，人们检査至少2个基因，更i^M少5个 目的基因。
我们以前发现约208个基因在患有肺癌的吸烟者与未患有l鹏的吸烟者的 气道中^异,的，其包括肺癌诊断性气道转鬆且(lranscriptome)。类條也， 本发明的方、M2H^用于鉴定差异表达的基因(包括肺癌诊断性口,录组) 的方法，所述基因的,模式可用于如文中所述的预后、诊断和治疗应用。包 含诊断性口^^组的基因可在口腔上皮细胞中表达，并御市癌个体和M^个 体之间具有显著不同的皿模式。肺癌诊断性口l^录组也称作吸烟者的差异 口腔转录组。所述的肺癌诊断性口,录组的表达模式可用于肺病预后、肺病诊断和定期筛查相同个体以，是否个体已暴露T^险的气道污染物，例如可
改变^/^的^ii^的f^烟烟雾中。
本发明的一个鄉方案麟鉴另瞎因，该基因包括不同的口麟影且。一 个有用的口腔转影且包含在支气管中魏且也在口腔中鋭的基因，其中在支 气管中的，受到污染物(例如香烟烟雾)的差异影响。另一有用的转录组是 肺癌诊断性口，录组。 一种鉴定包含肺癌诊断性口腔转录组的基因的方法是 首先鉴定口腔转录组(如上所述)，然后确定这些基因的哪一些在患有肺癌的
个体和在自个体的口腔中;W异^i的。
在一个实施方案中，我们现己鉴定了包含口麟影且的约166个基因，即
在支气管中^iia也在口腔中鋭的基因，其中在支气管中基因的魏^ij香
烟烟雾的影响，由下列基因組成ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1、 AGTPBP1、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20orfl 11 、 C5orf5、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1 、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEM、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDN10、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1 、 CYP2A6、 CYP4F3、 DEFB1 、 DIAPH2、 DKFZP434J214、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FU13052、 FLJ130521、 FLJ20359、 FM02、 FTH1 、 GALNT1 、 GALNB 、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1 、 GHTTM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 HIG1、 HIST1H2BK、 HN1 、 HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1 、 IDS、 MPA2、 r認A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC5腦、LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、 函、MGC4342、 MGLL、固E、画F、固G、 MT1H、固X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1 、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1 、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S100P、 SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1 、 TIAM1 、 TJP2、 TLE1 、 TM4SF1 、 TM4SF13、 TMP21 、 TNFSF13、 TNS、 TRA1、 TRIM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463。这些符号f^HUGO鉴定符号。

图11列 出对应于这錢因的各自转录物的详细资料，包跪雖因在吸烟者和非吸烟 者之间相比较的^i比率(正在吸烟者/从不吸烟者比率)以及p值，这显示了
这,因在吸烟者和一顿烟者中^^异的显著性(正在吸:)@#/从不吸烟者p
值)。图11也显示出现在包括HUGO、 GenBank和GO的i^库中的这， 因的多种基因符号。也显示了这些转录物的A^metrix cDNA芯片定位。在 一个实施方案中，对这，因在患有肺癌的个体和，个体之间的^S行比
较，以便鉴定形鹏癌诊断性口i^^a的基因。
在一个优选的实施方案中，另一口腔转录组由用它们的人类基因组组织 (HUGO)鉴定符号所鉴定的下列基因组成AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDNIO、 CYP1B1、 DPYSL3、 FLJ13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 腦、HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMPIO、函F、廳G、画X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1 、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1 、 SRPUL、 TALDOl 、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRIM16、 TXN以及TXNRD1。图12列出对应于这 ，因的所鉴定转录物各自的详细资料，包皿些基因在吸烟者和非吸烟者之 间相比较的鋭比率(吸烟者/萄舰烟者魏比率)以及p值，M示了这離 因在吸烟者和一敞烟者中，差异的显著性(吸烟者/非吸烟者p值)。在一个 雌实施方案中，比较这蝶因在患有肺癌的个体和赚个体之间的表达，以
鉴定产创市癌诊断性口腔转影且的基因。然后w^诊断性口j^t^a可用于 筛选患有肺癌或处于，劍ffi危险的个体。
本发明的一个，方案$| 定个体是否处于^^|市病的增加危险的方
法，其包括从暴露T^道污鄉或处于暴露于气道污鹏的危险中的个体的 口舰集生物样品；并分析口麟影且基因中的至少一个基因、雌两个基因、 雌5-10个基因、雌l(MOO个基因是否出J鹏传变化，其中与对照个体组 中至少一个相同基因相比，在口腔转录组基因的一个或多个中的遗传变化的存
在，可指示个皿有皿劍市病的增加危险。在一个实施方案中，遗传变化是 基因的DNA甲基化模式的偏差或基因的表达模式的偏差。在一4^ 方 案中，空气污M/是来自香烟或雪茄的烟雾，JJ市病慰市癌。^ife，肺癌是 腺癌、皿细胞癌、小细胞癌、大细胞癌，劍市的良性赘生物。在一个雌实施方案中，个体是吸鹏，并^iA们检查至d^佛自于肺 癌诊断性口腔转录组基因的基因的表达，其中与^t应的吸烟者对照组中相 比，在吸烟者中至少一个基因的更f綠达，是，市癌的危险增加的指示。在
另一,实施方案中，人们检查口mt影且的至少三个基因的^。更^m, 人们检查至少五个基因的鋭。
在一个,实施方案中，个体是吸烟者，并且人们检査至少一，自于诊 断性肺癌口腔转录组基因的基因的表达，其中与在对应的吸烟者对照组中相 比，在吸烟者中至少一个基因的更高表达，是，市癌的危险增加的指示。在 另一优选实施方案中，人们检査诊断性肺癌口腔转录组的至少三个基因的表 达。更^&，人们检査至少五个基因的^。
在一个优选实施方案中，人们检査编码醛脱氢酶(ALDH3A1)、 NADPH (NQOl)和CEACAM5(CEACAM5)^ii的基因o
在另一优选实施方案中，个体是吸烟者，并且人们检查至少一个选自于编 码原癌基因的诊断'卿市癌口,录组的基因的表达，其中与在对应的吸烟者对 照组中相比，在吸烟者中至少一个基因的更高或更低表达，是发厕市癌的危险 增加的指示。在一^^实施方案中，在自原癌基因的M口,录组中至
少一个基因的更高^mt^ii是^Wf癌的危,加的矛标。
在另一雌实施方案中，个体是吸烟者，并且人们检査至少一个选自于编 码肿瘤抑制基因的诊断倒市癌口腔緣组的基因的鋭，其中与^t应的吸烟 者对照组中相比，在吸烟者中至少一个基因的更高或更低表达，是，市癌的
危险噌加的指示。在一个实施方案中，在编码肿瘤抑制基因的^H会断糊市癌 口腔转影且中至少一个基因的更高lS^i^i是^^癌的危险增加的f际。 本发明也,诊断吸烟者或一舰烟者患肺病的素因的方法，其包括分析一
种或多种选自下列的基因的表达模式ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1 、 AGTPBP1 、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20orfl11、 C5orf6、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEI>6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDN10、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1、 CYP2A6、 CYP4F3 、 DEFB1 、 DIAPH2 、 DKFZP434J214 、 DKFZP564K0822 、DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FLJ13052、 FU130521 、 FLJ20359、 FM02、 FIH1 、 GALNT1 、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1、 GHTTM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 MG1、 HIST1H2BK、 ■、 HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1 、 IDS、 IMPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1 、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC5脳、LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、 ME1、 MGC4342、 MGLL、固E、 MT1F、 MT1G、 MT1H、 MT1X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S證、SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1、 TTAM1、 TJP2、 TLE1、 TM4SF1、 TM4SF13、 TMP21、 TNFSF13、 TNS、 TRA1、 TRM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12 以及ZNF463。在一个雌实施方案中，一种或多种选自下列的基因的鋭模 式AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDN10、 CYP1B1、 DPYSL3、 FLJ13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 HN1、 HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMP10、 MT1F、固G、固X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1、 SRPUL、 TALDOl、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRIM16以 及TXN。 i^地，在从吸烟者或非吸烟者釆集的生物样品中分析一种或多种 基因的,模式，其中与对照个体组中的这些基因的,模式相比， 一种或多
种这錢因的趋异魏模式是个体患肺病的素因的指示。在一^H^i实施方案
中，肺病劍市癌，包括腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌以刻巿的良性 赘生物。
在一个实施方案中，本发明,用于筛选^者患肺病素因的方法，其中
用于诊断的生物样品是核酸样品。在一个雌实施方案中，其中核酸是RNA 或DNA。皿地，样品是RNAo在另一，实施方案中，使用核酸阵列进行 分析。在另一雌实施方案中，用定量实时PCR顿谱法进行分析。 附图简述图1是本发明的一个鄉方案图，包括具有可拆开的手柄端和锯齿状收集
端以及储存容器的完整刮取^s。
图2图解了本发明的实施方案，其中显示从刮取装置的手柄分开的、含有 刮取的生物样品的收集部分，和含有核酸稳定溶液的储存織。
图3图解了本发明的实施方案，包括拆开的刮取装置，其中手柄在连接部
分与收集端分开，并且麟端SA含有核酸稳定溶液的储存容器中。
图4图解了本发明具有一，齿状，的刮^S,端的选择性实施方案。
图5图解了本发明的几1^择性实施方案，包括用于il^端的不同形伏。
图6显示在1%琼月離RNA变imi:^U:皮细胞系(泳道1)和口腔粘膜 刮屑(泳道2)提取的RNA。显示了28srRNA (上面的箭标)和18srRNA (下 面的箭标)条带。这i，;iM寻的最好实例中的一个。多数刮屑产^C少的RNA 用于M^可显示一些RNA降解的m。该部分,不会繊iM3i实时PCR 颇谱法测量RNA的能力。
图7显示使用本发明的方法，在得到的口腔粘膜细胞中细胞角蛋白 (pancytokeratin)的免,胞化学染色的结果。所有细胞具有上皮形态学，且 对多种，的抗体,为阳性(褐色)。
图8A-B显示在吸烟者和非吸烟者中选择的口腔粘Rh皮细BIS因的, 水平。在图8A中，Mil实时QRT-PCR测量口腔粘膜上皮基因,。显示了3 个从未吸烟者和2个正在吸烟者对于#^基因的平均(+/-SD)^i倍数变化(只 对一个正在吸烟者样品进行测量NQOl)。倍数变化指与一个非吸烟者样品相 比，在样品组中基因的平均皿水平比率。对于旨样品一式两，行所有实 时PCR试验。在图犯中，ita竞靴PCR和MALDI TOF质i普法测量口腔 粘膜上皮基因,。将^ifcK平对总RNA浓度(10-7 P M/P g总RNA)进行 标准化。显示了 7个絲吸烟者和10个正在吸烟者对針基因的平均(+/- SD) 衮达。在正在吸烟者中，在ALDH3A1和NQ01的基因泰逸中存，著地增加 (p〈.05)。
图9显示气道和口腔中几个基因,的相互关系。数据显示在从未吸烟的 人("从未吸烟者")和正在吸烟者中三个基因(ALDH3A1 、 CEACAM5和NQOl) 的倍数变化。图中比较了两种基因,检测技术质谱法和基因P车列。图10阐明了肺癌呈现的三个主要问题。尽管85%的月鹏发现在现在或以 前吸烟者中， <职有15%的吸鹏^^鹏。第一个争论问题是鉴定具有发 展 癌的易感性的那旨体，,早期诊断和fM起决定作用。当癌仍然是 高度局部化时，可诊断15%的肺癌；舰于这些病人，5特活率是50%。然 而，对于诊断具有远侧癌的B鹏病人中的50%, 5特活率低于5%。因此， 早期诊,决定作用。
图11显示在支气管中敬受香烛烟雾影响的基因列表。这蝶因也在口 腔上皮细胞中,。
图12显示图11中所示基因的亚型，雜支气管中的^iii要受香烟烟雾 的影响。这錢因也在口腔上皮细胞中鋭。
发明详述
我们现已发5鹏于从口腔内部的细胞获得核酸糊一侵入性方法。我们也发 明了用于收集生物样品的刮取装置，和用该刮取^S从口腔粘膜上皮细胞获得 核酸糊瞎入性方法。本发明的方馳H^于核酸的工具，以i愤与暴露于 气道污 有关的肺病危险。核酸工具包括基因表达谱的分析以及DNA甲基 化模式的分析。
我们也显示了使口腔暴露于例如香烟鹏的污 )#改变在口腔衬里的上 皮细胞中某難因的敏。例如，肺癌涉及从正常到恶化前再到癌的组织病理 学进展和肝鹏。肺肿瘤的基因魏阵列已乡2ffi于表征肺癌的鋭谱，和用 于显示从非恶性的肺组织到肺癌的^ 变化的进展。然而，为了自和早期诊 断目的，/揚获得样品是不可行的。因此，本发明第一次鄉从口腔(气道最 ,的部位)获得细胞的方法，以在个体中鉴定上皮基因^ii模式。
确定哪旨#^他们的气^1±皮细胞中存在^^变化和这^变化如何涉及 肺病(例如恶化前和恶性变化)的能力，是用于确定危险和诊断肺病(例如处 于治疗非常有效的时期的癌)的显著雌，因而斷氏了肺癌的死亡率和发病率。 本发明允许从口腔粘膜刮屑中获得气^±皮细胞的简易性，显示该方法具有广 泛的临,用性并在标准临床筛选处于发展鄉市病危险的大量受试者中是有用 的工具。
在一个，方案中，从口腔上皮细胞分离的RNA可用于基因，i紛析。 在另一实施方案中，从口腔上皮细胞分离的DNA可用于DNA甲基化分析。M5i分析与肺癌不同时期有关的口腔粘Jii:皮细胞的基因表达谱，本发明 的一个^方案,鉴定患有或处于^M^械危险的吸烟者的方法。 刮取體
刮取^M允许人们从允i^离核酸(包括RNA和DNA)的受试者口腔 中非侵入性收集细胞。该工具具有允许从口腔粘膜麟大量高质量核酸(包括 RNA)的两，征可刮下几层上皮细胞的精细的锯齿状，，禾口在收集端中 可收集刮取的细胞的凹表面(或凹部)。
现在参考类似参考数對1^类似元件的附图，图1图解本发明的示范性实 施方案，其包括具有手柄和锯齿状^端以及储存容器的^刮^置。刮取 ^S具有近侧的手柄端10、远侧的收集端14和位于手柄端10和iB^端14之 间的连接部分12;其中连接部分12在宽度上与其两侧的手柄端10和ii^^端14 通常;13^续的。连接部分12允i恃柄端10和ij^^端14任自m分开。收 集端14还包括外周缘16和凹部8，其中至少一些外周缘16是锯齿状的，以允 许舌陬生物样品，并且凹部8允许麟刮取的生鹏品。该实驗案中的储存 容器18具有ilil^头20附着至U储存，18的盖子22。
图2图解如图1例证的本发明的实施方案，其中手柄端10已会纵lB^端 14拆开。舰可^g26和28拆开的穿子L^连接端刻痕，可发生拆幵。储存 容器18含有核酸稳定溶液34。
图3图解如图1和2例证的本发明的，方案，其中刮取^g被拆开，手 柄在连接部分从收集端分离，并且收集端置入含有核酸稳定溶液的储存容器 中。从麟端14拆开手柄端10。将刮取體的麟端14 ^A含有核酸稳定溶 液34和含有生物样品32的储存容器18中。在该实驗案中，储存鄉18也 有盖子22和将盖子22连接到储存容器18的接头20。
如图1-3戶标，一^HM的实施方案鹏塑料的或一些其它聚合物工具， 其具有可刮下几层上皮细胞的锯齿状纖和收穀陛细胞的弯曲表面。在该实
施方案中，标准塑料工具具有锯齿^i^的凹面勺TO^ (例如5/16英寸宽和 1 6/16英寸长)和3英寸的手柄，其中当含有TO的细胞的刮取Xi^i入储 存織(例如2ml微量离心管(microfbgetube))时该手,以被断开。
收集端^l可部分的外周缘可为锯齿状。如图1-3所述，在一个实施方案中， 使收集端的全部外周缘成锯齿状。然而，本发明包括其它实施方案，其中使不至廿鄉外周缘成锯齿状。例如，图4图解刮取體收集端14外周缘40的一面 (50%)为锯齿状的本发明选 实施方案。
刮取装置的收集端可具有任意形状。一^HM的刮取^S具有勺状的, 端。图5图解了几个实施方案，它们中顿具有M3i接部分52与收集端54 连接的手柄端50，其中1|^^端具有锯齿彬卜周缘560
本发明的刮取装置由可允许手柄端和收集iWii^接部^l行可拆开的连
接的任意材料制成。在一个,实施方案中，刮取^g是塑料的。
连接部分具有可允i^^鹏拆开手柄端和收集端的任意设计或结构。在一
个雌实施方案中，刮取體的连接部他括穿孔。在该实施方案中，当装置
手柄端绕轴向后和向前旋转时，收集端从手柄的穿孔部位被拆开。在另一实施
方案中，连接部分比鹏,手柄端和麟端薄。
刮取装置可以是允许其用于收集样品的任意大小。在一个优选实施方案
中，刮取體以及本文所有翅从大约手柄^5端到麟te端的长度约是3.5
至6英寸，例如4.5英寸。在一^HM的刮取縫中，麟端以及本文所有变
型的长度约是l-2英寸，例如约是L25英寸。
将^a,端的长度和宽度设计为可允许收集^s合储存容器。在一个优
选实施方案中，储存容器含有盖子，雌其附軒储存容器上。
在另一实施方案中，刮取装置是已被切成一半的移液管尖头，以产生用于 刮取口腔表面以ll^细胞的弯曲表面。
本发明的刮取^a可用于分离和收集任意目的样品。在一^HM实施方案 中，样品是生物样品。在特别雌的实施方案中，样品是来自口腔粘膜的大量 上皮细胞。
核酸样品的收集和储存
本发明麟从^#口腔收餓酸样品的非侵入性方法，包括用刮取縫 从受i錄口腔分离细胞、将舌陬的细胞转入含有核酸稳定溶液(即可抑制核酸 酶活性的溶液)的储存容器中、以及在核酸稳定溶液中从刮取的细胞样品提取 核酸。此后，储存样品1S用于分析。
使用刮取^g从^者口腔iB^样品。用柔和压力，将锯齿状ii^(J取面
颊内部的口腔粘膜，例如四至十次，并立即将麟的细胞臥核酸稳定溶液中，
例如Sil将，收集端置入储存容器。在一个皿实施方案中，本发明的刮取装置用.于分离含有核酸的生物样
品。，是RNA或DNA。在一个实施方案中，核酸是RNA。在另一实施方 案中，核酸是DNA。然后^fi存的样品送去分析。
在一个 方案中，可将核酸稳定溶液中刮取的细胞样品保存于从最高为 且包含室温(约22'C)至IJ-30'C的任奮離下。鹏越低，可越^fe稳定保存 样品。在从样品中提取核酸之前，繊雌是-5'C至-30'C,更雌是-15°(:至-2CTC，还更优选是-2(TC。在另一实施方案中，在从样品提取核酸之前，样品 可在4'C保存24^96小时。甚至更^t是24小时。
在特别雌的实施方案中，抓样品提取核酸之前，核酸稳定溶液中的刮 取的细胞样品可在室温保存24至72小时。这样将样品从提取位点送往用于分 析的中央场所。
将本发明刮取的细胞样品转入适于储存样品中含有的核酸的任意储存容 器。戶脱的容器是本领域公知的，并可从多种来源得到。在一^H^实施方案 中，储存容器是小管，例如便于允许进一步处理样品的微量离心管。例如，具 有约1.5-2毫升体积的塑料管。在一个雌实施方案中， 一旦收集端从其手柄 端拆下，储存容器就具有容纳刮取^S收集端的大小和形状。甚至更^i也， 储存容器具有盖子，并且在刮取錢收集端體入容器中后，可关闭盖子。优 选储存容器盖子附着于储存鄉。
雌储存容器含有适于样品转移和储存的溶液，以允i條存目的核酸。优 选地，稳定溶液灭活可降解目的核酸的任何核酸酶。如果核酸是RNA,则稳 定溶液灭活RNA酶。如果核酸是DNA,则稳定溶液灭活DNA酶o
在一^H^实施方案中，核酸是RNA并且稳定溶液在5 ^H中内灭活至少 75%的RNA酶活性，,在一併中内灭活至少75%的RNA酶活性。还更优 ^i也，在^1A RNA的4 ，内稳定溶液灭活至少85%的RNA酶活性。甚至 更tmtlk,在^A RNA的一，内稳定溶液灭活至少85%的RNA酶活性。 更iMife，在^tA RNA的两，内稳定溶液灭活至少90%的RNA酶活性， 还更，在、;tA RNA的一^H中内稳定溶液灭活至少90%的RNA酶活性。还 更^i也，在^A两辦中内稳定溶液灭活至少95%的RNA酶活性。甚至更优 选在i!A—^l中内稳定溶液灭活至少95%的RNA酶活性。
允许回收完整总RNA的倒可RNA稳定餘舰用于储存麟的样品。在一个优选实施方案中，RNA稳定溶液是购自于Qiagen， Valencia, CA的 "RNALater"稳定试剂。
在一个，实施方案中，本发明方法可用于分离大量的分离出的口腔上皮 细胞RNA。 ^fe,单个分离a^，克-微克量的RNAo在一^i^实施 方案中，分离约200-200Qng总RNA。在一^H^实施方案中,分离了约1000 ng。
本发明中分离的口腔上皮细胞RNA可用于需要具有fM完整总RNA的 樹可方法離程。
Miffi术人员公知的樹可标准方法可分离从口腔上皮细胞样品中得至啲核 酸0在S咖brook等人的Afo/ecw/lar历o/oigy:爿/akrafcvy v4p戶ac/j, Cold Spring Harbor, N. Y 1989、 Ausubel，等人的Cwnnen^wtoco/j f》M /ecw^历o/f^, Greene Publishing, Y, 1995中描述了 DNA和RNA分离的标准:^法，以及本文中经 常用到的重组核酸方法。
Mii导i^M少一种稳定溶液的组分中分离核酸的樹可适宜技术，可从稳
定溶液回收或提取目的核酸。^f柳已知方法，人们也可鉴定核麟自于哪些细 胞。舰用有机试剂提取法，氯臓取法，酚-氯^$1取法，M31乙醇、异丙醇
或任何其它低级,淀法，M:包括离子交,析法、大小排PIM析法、硅胶 层析法和反向层析法的层析法，^M;包括聚丙烯鹏凝胶电泳和劇鼸凝胶 电泳的电泳法，从稳定溶液可回收核酸，鄉本领域技术人员题而易见的。 雌用酚氯臓取法从稳定溶液回收核酸。
从样品提取完整RNA的一，别，的方法Ji^ffi TRIzol试齐IJ(购自于 Invi1rogen Carlsbad, CA)0
回收核,，M3tt领域公知技术可任^M—，化核酸。在一4^& 实施方案中，进一，化导致RNA基本上没有污染的DNA或蛋白质。■ 用于核酸回收的任意前述技术可完皿一步纯化。,^ffi低级醉(尤其是乙 醇或异丙醇)的沉淀法纯化核酸。^t在存在皿沉淀的载体(例如糖原)时 进行沉淀。
M31多种机制扩增本发明的核酸样品，其中一些可4顿PCR。参见例如尸Q 7k;W/ogy: 7V/na》/es a <^ i4/ / /z'cortcra， DA^4爿附;7/辨cart0w (Ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992)、 PO PwfocoZs:爿Gw油to腧k^ W ^/7/ //o ft'ora (Eds. Innis等,Academic Press, San Diego， CA， 1990)、 Mattila等人的A/krfe/c Ar幼19， 4967 (1991)、 Eckert等人的PCK A^/kx& J/ /7/Zcoft'ons 1， 17(1991)、尸C及(Eds. McPherson等，IRL Press, Oxfoni)以及美 国专利号4,683^02、 4,683,195、 4,800,159、 4,965,188和5,333,675，它们分别 在此为所有目的,弓间作为参考。可在阵列上扩增样品。参见，例如美国专 利号6,300,070和美国专禾伸请09/513,300， ^jtfc弓间作为参考。
其它适宜的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)(例如Wu和Wallace, Gfeww!'os4, 560(1989), Landegren等人的5fcfewe241， 1077(1988)和Barringer 等人的G微89:117 (1990))、转录扩增(Kwoh等，Phx .Ato/. 5b: LS4 86， 1173 (1989)和W088/10315)、自动维持序列扩增(GuateUi等，尸wc. Ato. C/S4， 87， 1874 (1990)和WO90/06995)、靶多核苷,列的选择扩增(美国专 利号6，410 276)、 ^W序列引物聚合H^M应(CP-PCR)(美国专利号4，437，975)、 任意弓卿聚合酶链反应(AP-PCR)(美国专利号5,413,909、 5,861,245)以及基 于核酸的序列扩增(NABSA)。(参见美国专利号5,409,818、 5,554,517和 6,063,603,其分别在此引用作为参考)。美国专利号5^242,794 、 5,494,810、 4，988，617和USSN 09/854^17中描述了用到的其它扩增方法，其分别在此引用 作为参考。
通过本发明方法分离的RNA可包括信使RNA (mRNA)、转运RNA (tRNA)、核糖体RNA (rRNA)以及病毒RNA。
M3tt发明方法分离的RNA适于多种目的和^生物学方法，包括但不 限于反转录成cDNA;为了在基因芯片、 苷酸微阵列等等上分析，生产 娜性、荧光鄉它^H己的cDNA;舰丙烯,^^月i^,电泳法进行电 泳；M:层析法(例如，离子交换、赚、反相駄小排P脂析法)进1彌化;
用核酸Wht行杂交以及M:机械、超声波^它方法进行片段化。用于分析
RNA的常规方,括RNA印迹法、核糖核^BIW测定(RPAs)、反,酶 聚合,反应(RT-PCR)、定量实时PCR、制备cDNA用预行克隆、体夕溯 译和微阵列分析。
M本发明方法分离的DNA适于多种目的和^生物学方法，包括但不 限于为了在基因芯片、寡核苷酸微阵列等等上分析，生产Mt性标己、荧光 标记或其它^i己的DNA;通过丙烯鹏或琼月i^繊电泳法进行电泳；通过 层析法(例如，离子交换、赚、反相或大小排P脂析法)进行纯化；用核酸探针进行杂交以及通过机械、超声波或其它方法进行片段化。用于分析DNA 的常规:^^括DNA印迹法、聚合,反应(PCR)、定量实时PCR、克隆 法、体外转录和翻译，以及微阵列分析。
本发明的一个皿实施方案,含有用于,生物样品的刮取装置、储存 容器以及核酸稳定溶液的试剂盒。
本发明的另一雌实施方案还麟RNA收絲统，其包括具有近侧手柄 端和远侧收集端(包含锯齿状外周缘)以及在手柄端和收集端之间的连接部分 的刮取装置，其中连接部分允许手柄端和i^^^任M彼此分开；还包括含有 RNA稳定溶液的储存容器。^地，储存容器含有盖子。甚至更优选地，盖 子附着于储存織。
本发明也,用于收集口腔粘膜的上皮细胞的试剂盒，其包蹄嫩^g和 含有RNA稳定溶液的储存容器。在一个雌实施方案中，RNA稳定溶液是 RNALater。
本发明的一个,实施方案,用于收,品的方法，其包括步骤提供 具有近侧手柄端和远侧收集端(包含锯齿微卜周缘)以及在手柄端和收集端之 间的连接部分的刮取装置；JH^含有RNA稳定溶液的储存容器；用收集端的 锯齿状外周缘从^#口腔的口腔粘膜刮取上皮细胞；将刮取的上皮细胞收集 到刮取錢的麟端中；将刮取的上皮细胞转入储存容器；旋转刮取體手柄， 使装置手柄端与收集端在连接部分拆开，从而使得储存容器包含RNA储存溶 液、刮取的样品以及刮取錢的lB^端。
如下讨论的，从这些口腔上皮细胞分离的核酸劍市细胞状况的指示。这允 i转J劐市的非侵入性测试。
肺病的生辦蔬物
我们也发现在口腔粘膜上皮细胞中的基因表达可用作肺细胞状态(或状 况)的指示。这允许人们来鉴定患有或处于发展为肺病(例如肺癌)危险的个 体。
我们已纟^M示气道(包括口腔)暴露于例如香烟烟雾的污染物，导致所谓 的"场缺损(field defect)",这指从口腔粘膜上皮衬里皿支气管上皮细胞衬 里到肺的所有气道衬里上皮细胞中基因魏的变化。(Spira等，Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2004 Jul 6; 101(27): 10143-8)。也可参见国际申请PCT/US04/18460。由于场 ,现在可能检测变化，例如，导,病的靴前和恶性变化，其中
^ffi从上皮细胞(其不但;W活组织检査获得而皿其它更易得到的包括口腔 上皮细胞样品的气道部分中得到)分离的细JW品。
本发明一个方面基于在吸烟者和非吸烟者之间有不同的基因m模式的发 现(Spim等，2004)。本发明另一方面基于另外的基于核酸的变化(DNA甲 基化)与肺癌有关的发现。因此，在本发明的一个实施方案中，从口腔上皮细 胞分离的RNA可用于基因敬i紛析。在另一实施方案中，从口腔上皮细胞 分离的DNA可用于DNA甲基化分析。
本发明一个方面,用于检湖明tt自^im个体发展劍市癌风险的生物
标记物，也称为耙基因。本发明麟用于检测口腔粘膜上皮细胞样品中目的耙 基因魏的方法，其包括M^M的口腔粘MJ:皮细胞分离核酸样品；将步iKa) 中分离的核酸样品接触至少一种特异杂交目的耙基因的核酸探针；和在核酸样 品中检测戶;M目的耙基因的存在。在一个实施方案中，在实施步H(b)之前将目 的鹏因附着于固相。核^t^是RNA或DNA。
本发明方法可用于鉴定在患有或处于发展为肺病风险的个体的口腔上皮细 胞中发生改变的IE^因或生tltti己物。
有用的生t/^己,括在患有或处于发展为肺病风险的个体的口腔上皮细 胞中更高水平a低水平^ii的基因。
如图4所示，^^吸烟的人中,并在正在吸烟者的口腔上皮细胞中更 髙7K平表达的基因的具体实例包括ALDH3A1 、 CEACAM5和NQOl 0
其它有用的生辦射己物是在患有或处于，为肺病风险的个体的口腔上皮 细胞中具有不同DNA模式例如甲基化模式的那些(Tsoij等，Oncogene 21: 5450-5461(2002); Fukami等，IntJ. Cancer 107:53-59(2003))。
本发明也提供"气道转录组"的鉴别和表征，或提供气道的标签基因 (signature gene)魏谱，以及麟在与上皮暴露于污鄉(例如直接或间接暴露 于香烟烟雾、石棉和烟雾)有关的转录组中变化的鉴别。特别皿的气道转录 组是口，录组，其包括在^Ji吸烟者和IUi非吸烟者的口腔上皮细胞之间的 表达显著不同的基因。这^道转影且基因^谱,停止吸烟后肺组织功能 的信息、非吸烟者和吸烟者中的肺癌素因以及織其它肺病的素因。从非吸烟 者可获得口l^^组,模式，其中在正常,模式中的偏差劍市病增长风险 的指示。也可从暴露于空气污染物的非吸烟受试者中获得口腔转录组表达模式，其中与对空气污膽正常应答有关的^ii模式偏差是发展湖市病的增长风 险的指示。
本发明也,口腔转录组，其包括下列的编石骚因ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1、 AGTPBP1、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1 、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20o舰、C5o漁、C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEI>6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDNIO、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1 、 CYP2A6 、 CYP4F3 、 DEFB1 、 DIAPH2 、 DKFZP434J214 、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FLJ13052、 FLJ130521、 FLJ20359、 FM02、 FTH1、 GALNT1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC:、 GCLM、 GGA1、 GHTIM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 HIG1、 HST1H2BK、 HN1、 HPGD、 HRMFB2122、 HSPA2、 IDH1、 IDS、 IMPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KKT15、 LAMP2、 LOC5脳、 LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、画、MGC4342、 MGLL、固E、固F、 MT1G、固H、固X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 0RL1、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S證、SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQS漏、SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDO、丁ARS、 TCF7L1、 TIAM1、 TJP2、 TLE1、 TM4SF1、 TM4SF13、 TMP21、 TNFSF13、 TNS、 TRA1、 TRIM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463。以下表1列出该基因列表中所示的HUGO 鉴定符号(ID)相对应的GenBank ED和GenBank说明。
表l
GENBANK—ID HUpOJtD GENBANIL说明
NM一07781.1 FU20359 假定的蛋白FU20359
NMJ)8004.
FU034 假定的蛋白FLJ10134
AF07S844,
MT1F 鲷硫蛋白1F(功育&I4)NM 00595 UMTIH鍋硫蛋白1H
BC0O5894.1FM02^m单力喊酶2
AP182275.1CYP2A6"细胞色素P450,家族2，鹏
BF246115MT1F鍋硫蛋白1F(功能性)
NM 005952.1M丁X鍋硫蛋白IX
雨一00595(UMT1G鍋硫蛋白1G
麵一OO能.lCKB"肌酸鹏，脑"
NM一000860'1HPGD縫前列素ratHl5"(NAD)
AL021786ITM2A齡膜蛋白2A
L2卯08.1SORD山梨麟鹏酶
NM 002275.1KRT15角蛋白15
AF333388.1加由S68948支持的假定的基因
U56725.1HSPA2皿70kDa蛋白2
M麵3MT1F魏硫蛋白1F(功能性)
BF217861MT1E顿硫蛋白1E(功離)
AF052094.1EPAS1内皮PAS结构^g白l
X97671EPOR促,K^素受体
NM一002450.1MT1X^ii硫蛋白IX
AF114012.TNFSF13"肿瘤 因滩彬
NM一005953,1MT2A^M硫蛋白2A
AL046979TNS张力蛋白
NM一000851,1GSTM5谷臓太S-转移酶M5
AB017546PEX〗4过氧化t^生物发生因子14
NM 006312.1NC0R2核受糊鹏物2
NM 006314.1 CNK
KSR样的M增强^ (ras的剩勒ABO 14605.1AIP1atrophiii"l相互作用蛋白1
NM二031283.1TCF7U"转录因子7样l(J细旨异性的，HMG4 '
AB007857KIAA0397KIAA0397基因，
NM一001888.1CRYM"晶体蛋白，nrn"
NM一005769.1CHST4微化^(N-乙g^胺W)赠S^酶4
BC0O6230.1MGIX甘油单酯脂肪酶
NM一Ol 8555.2ZNF463锌指蛋白463
NM一015001.1SHARPSMART/HDAC1相关的,鹏白
NM 01柳5.1C5or伤她体5可雜6
"高尔基体相关的，含Y衔接蛋白耳(adapto
AWO01443ear)的，ARF结雜白1"
AA046650HRIHFB2122Tara样蛋白
Z97056KDELR3KDEL(Lys-AsjvGlu-Leu)内质网蛋白,受体3
BCOO 1049.1UFD1L泛素齢,1样
NM一Ol 5523.1DKFZP566E44小片段核,
NM一006694.JTB瑕歐易位断点
NM 030796.1假定的蛋白DKFZp564K0822AF217514.1C20orfl11雜体20可雜111
AF027205.1SPINT2"丝氨麟白SIW^怖J, Kunite型，2"
BC0O3379.1LOC57228来自克隆643的假定的蛋白
BC0O6249.1GUK1鸟苷酸鹏1
NM O04872.1Corf8鹏体1可維8
M94859.1CANX
NM一00080.1FKBP1A"FK506结合蛋白1A, 12kDa"
AV7O6096L0C簡2假定的蛋白LOC92482
MM O06367.2CAP1"CAP,腺苷酸环,目关蛋白1 (,)"AL556438 BC003560.1 雨014297.1 丽OQ3艮l
丁LE1 RPN2
SQSTM1
",的转导素节DNA !性的
鵷体结^IS白n
甲状腺中泰逸的蛋白 sequestosome 1
BC004146.1 PSMB5 NM 004786.1 TXNL
AI951720
TLE
"蛋白,前体，macropain)亚基，p型，5" "硫縱蛋白样，32kDa" "Spit 1的转导素样增强子(E(spl)同源物，果 蝇)"
雨一006280,1 SSR4 NM 030810.1 TXNDC5
"信号序列受体，A(易位子相关蛋白-厶)" 含硫縱蛋白结构域的5
雨004766.1 C0PB2
AF139131.1 NM一006827.
mi 003299.1
BECN1 丁MP2
TRA1
"夕敞体蛋白复^1,亚勒-2(p，)"
"beclin 1 (巻曲! , m蛋白样BCL2相互
作用蛋白)"
跨鹏输蛋白
肿瘤排斥繊(gp96) 1
NM 020474.2 GALNT1
UDP-N-乙酰Kx-D^半乳糖胺多肽N-乙酰, 半,S^酶1 (GalNAc-Tl)
NM一005886.1 KATOB1
雨一024329,1 MGC4342
NM一004817,1 TJP2
AK000095.1 CHP
剑蛋白p80(包含WD重餅歹i》亚基B 1 假定的蛋白MGC4342
紧密雜蛋白2(紧密连合2) 钙结合蛋白P22BC000758.1 C6orfS0 AB035745.1 DSCR5
NM一005805.1 PSMD14
她体6可雜80 唐氏^征，区基因5 "蛋白,前体，macropain)26S 3ES，非ATP 酶，14"
K)4152
TACS丁D2 肿瘤相关辦缩号转导物2
NM O廳l.l UBE2JI
(泛織娜E2， J1(UBC6同源物，,)
BC00437U APLP2 NM 004255.1 C0X5A
崎粉状蛋白(A4)前,蛋白2 细胞色素c氧娜亚基Va
AJ215102
RAB1A
"RAB11A，癌基因家方滅员RAS"
K)4183.1
LAMP2
^WB关的膜蛋白2
NM一005896.1
M97655.1
AK024976.1
IDH1
PTS
RNP24
"异機^^Hl(NADP+),可溶的" 有被小mmg白
AF13820.1 GHITM
生长^l导型的跨膜蛋白
NM 000202.2 IDS NM 00H77.2 ARU
艾杜糖,2-硫鹏,unter総御 ADP赚靴因子样1
A歸0826.1 雨一006406.1 D83485.1 NM 014056.
RAB7 PRDX4 GRP58 HJG1
"RAB7,癌基因^^员RAS" peroxircdoxin4
" 节的蛋白，58kDa" 小鼠缺氧诱导的基因1的可能的直向同源物丽000177.1 GSN
" :胶蛋白(淀粉样鄉，Finnish型)，
BG054844 ARHE BC001709.1 FLJ3052
"ras同源糖因家族，成员E，， NAD,
，902,1 T画l BC000893.1 HIS丁1H2BK
AL353759
NM 012434.1 SLCI7A5
AF00456U
蘭一014933.1
NM一003909.1
AW134535
BH)3829
ARPC3
KIAA0905
CPNE3
CCNG2
DSG2
T细胞淋巴麟和鄉l "组蛋白l, H2bk,"
"智人(Homo sapiens)组蛋白1, H2ac, mRNA(cDNA克隆MAGE: 6526471),部分 cds"
"可溶的载体家族17(阴离子/^t蛋白)，成 员5"
"肌动蛋白相关蛋白2/3复合物，亚基3, 21kDa"
酵母Sec31p W物 copine m 细m期蛋白G2 桥粒糊蛋白2
U48296.I
PTP4AJ
"蛋白酪^m,ivA型，成员r
BC001709.1 窗0J5239.1
B4GALT5
FU13052
AGTPBP1
"UDP-Gal: pGicNAc p 1,4 半孚111驗移酶, 多肽5" NAD, ATP/GTP结合蛋白1
J02783.1
P4HB
"前胶原-臓酸，2-酮^:酸4"加双彌脯麵一020672.1 S100A14
AL527430 GSTM3
NM一004753.1 SDR1
爾一00701U ABHD2
AI539710 ABCC1
NM一002865.1 RAB2
BG28画 LYPLA1
NM一002032.1 FTH1
賜002885.1 RAPGA1
NM一006729.1 DIAPH2
AF200715.1 CED-6
BC005911.1 SCP2
B蘭271 GALNT3
NMJ)143效,1 TM4SF13
NMJH9094.1 NUDT4
AI762U3 GMDS
NM一0"214.1 IMM2
AV728268 SORL
NM一0039.1 丁ARS
氨酸冬羟化斷，P"多肽(蛋白二硫键异构酶； 甲>1^1 结合蛋白55)"
S100钙结合蛋白A14 谷臓太S-鄉酶M3(顿 短OT^II/还原酶1 含ab水解酶结构域2
"ATP-结始，3E^IC(CFTR/MRP),成员1"
"RAB2,癌基因家鹏员RAS " 溶血磷鹏I
"铁蛋白，重多肽l"
"RAP1, GTP酶活化蛋白1" 透明同源物2(剩笔) FTB结1W繊蛋白CED^ 固醇载体蛋白2
UDP-N-乙酰^a-D"半孕U^胺多肽N-乙酰, 判LH驗移酶3(GalNAoT3) 跨膜4鹏麟员13
UDP-N-乙酰,胺-2-差向异构6l/N-乙酰甘露 糖胺鹏
nudix (二磷m^g^的部分X)-型基序4 "GDP-甘MH4, 6")!fe7K酶" 鹏肌H喊4》单^mSl2
"sortilin相效体，含L(DLR类)A重餅列" 苏氨酰-tRNA合鹏觀一0訓3.1 Xq22.2
NM一012243.1 AA873600 W87466 NM 06315,1
"可溶的载体家族35(UDP-N-乙酰葡糖胺 SLC35A3(UDP佳NAc)2^蛋白)，成员A3" ASM3A 鹏綱,磷酸二酉鹏 Loc92689假定的蛋白bc001096 CED、6 PTB结构域衔接蛋白CED"6
AF247704.1 NKX3-1
"NK3 ^因子相关的，基因座l(剩尾)"
NM 001072.1 UGT1A10
"UDP糖SI^酶1家族，多肽A10"
NM一002359.1 MAFG NM 005980.1 SI00P
v-maf Ml^刊隹肉瘤癌基因同源物G (鸟) S100妈结合蛋白P
NM—000896.1 CYP4F3
"细胞色素P450,家族4, M^族F,多肽3' peroxiredoxin 1
"sioo钙结合蛋白aio(W^白n配体，依
兩002966.1 S脆IO鵰合飾'轻多肽(PU))"
NM 021027.
UGT1A10
"UDP糖S^酶1 ,，多肽A10"
NM 017423.1 GALNT7
UDP-N-乙酰《-D"半孕Utt胺多肽N-乙酰g 半儘S^酶7(GalNAc-T7)
BF67, NM一OO函.l NM 016185.1
GCLC GMDS HN1
"谷氨酸-半胱氨^im催 基"
"GDP-甘,4务船娥' 血液学和神经学鋭的lAA083483
FTH1
"铁蛋白，重多肽1"
AL117536.1
M92934.1
M63310.1
加
CTGF ANXA3
由AK057191、 AL117536支持的假定WS因
结^SiP在长因子
膜麟白A3
NM 000463.1 UGT1A10
MM
NM一001218，2 CA12
雨012189.1 CABYR
"UDP糖 / 酶1家族，多肽A10"
碳酸酐酶xn
钙-结合酪氨酸^Yy磷酸化调节的(fibrousheathin 2)
3BC005008.1 NM一003330.1 NM一00263U NM一00206U NM 006755.1
Ml 8728.1
NM一005213,1
U73945.1
AF31391U
BF5M079
雨一00647(U
丽014467.1
CEACAM6
丁XNKD1
PGD
GCLM
TALD01
CEACAM6
CSTA
DEFB1
TXN
KXF4
TRIM16
SRPUL
癌胚抗原相关的细51*占附肝的辦异性效
硫,蛋白还原酶i
"谷氨酸-半胱氨mi^酶，働亚基"
转,
癌胚抗原-相关的细胞粘附分子6(非特异性交 半胱氨麟白^p^剂A (stefin A)
"防御素，p-r
硫鞭蛋白 Kn^el样因子4(肠) 含三麟序的16 sushi重复蛋白
AL049699
ME1
"苹果,l' NADP(+)^M的，鹏的"觀一002395'2 ME1
BC002690.I KRTI4 AI346S35 TM4SF1
"苹果,l, NADP(+)^5M的，M的" "角蛋白1《单纯性大疱性表皮松解，
Dow!ing-Meara, Koebn改)"
跨膜4驗麟员1
NM一OOl 353.2 BC00O卯6.1 蘭OO薩.l
AKRCI CLDN0
"醛酮还原酶家族1,成员Cl(二氢二醇脱氢 酶1; 2(kx(3"a)^^固醇月
"NAD(P)H MSI,醌l " claudin10
S6S290.1
AKRC
",还原酶家族i，成员ci(m醇脱氢
酶1; 20"O(3《)^^l固醇I^ID "
M33376.1 NM一002083.1 NM 000卯3.1
AKRC2
GPX2
NQ01
"醛,原酶家族i,成员C2(m醇脱氢
ffl型)"
谷胱甘^Mft化tlSl2(胃脚 "NAD(P)H^tSI，醌l"
舰ALDH3A1
"醛^tH3繊，鹏A1"
NM 004363.1 CBACAM5
癌Mdi相关的细皿附^ 5,
兩000]04.2 CYP1B1
"细胞色素P450，家族1，嫁族B,多肽1J
雨020299.1 AKRB0在一个雌实施方案中，本发明H^包織码下列的基因的口麟魏 AGTPBPl 、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDNIO、 CYP1B1、 DPYSL3、 FU13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 ■、 HSPA2、 MAFG、應、MGLL、 MMPIO、 固F、顧G、固X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 RAB11A、 SIOOAIO、 SDR1、 SRPUL、 TALDOl 、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRM16以及 TXN。以下表2列出该基因列表中所示的HUGO鉴定符号(ID湘对应的GenBank ED和GenBank说明。
表2
AFFXGENBANKHUGOGOGENBANK说明
IBIDIDID
基质金属蛋白酶IO(,质
205680—atNM一002425MMPIO30574素2)
210524一x一atNM一007372MT1F5737隐解旋,关蛋白
20S5Sl一x一atNMJ)05952MT1X9634顿硫蛋白IX
211538一s一atNM 021979HSPA27286皿70kD蛋白2
204745一x一atNM一005950M丁〗G46872，流蛋白1G
217165一x一atM讓3MT1F5737
221016一s—atNMJJ31283TCF-36355HMG框綠因子TCF-3
2函6一s一atNM_007283MGLL6954甘油单酯脂肪酶
200599一s一atNM—003299TRA15524肿瘤排斥繊(gp96)1
RAB11A,癌基因家族成员
200863一s一at顧一0(M663RAB1〗A6S86RAS
201923一at廳一006406PRDX47252peroxiredoxin 4
20S918 s atNM一023018FU13052NAD鹏20S9l9丄at NM一02308 HJ13052
NAD袋
2024Sl一atNM一004753 SDR1
S152 短^^还原酶1
2(M500一s一at丽一015239 AGTPBP1
ATP/GTP结合蛋白1
206302一s一at NM一Ol, NUDT4
nudix(二磷酸核苷连接的部 簡分，基序4
200748一s一at NM一002032 FTH1
6826铁蛋白，重多肽1
203397丄at雇一0044S2 GALNT3 5975
214106一s一at NM一00500 GMDS
201263一at NM_00391 TARS
204970一s一at NM一002359 MAFG
UDP-N-乙酰"tt-D-半乳糖 胺多肽N-乙酰氨基半乳 糖SH^酶3(GalNAoT3)
5975 GDP-甘赚4，6"船KSI
6435 苏氨酰-tRNA合鹏
v-maf ^働瘤癌基 6355 因同源物G(鸟)
200S72一at NM—002966 S]OOAIO 7165
S100钙结合蛋白A10(膜联
蛋白n配体，依钙结合蛋 白i,轻多肽(pn》2086S0一at NM一002574 PRDX
歸 peroxiredoxini
283〗3一s丄at画一07423 GALNT7 5975 201431 s at丽001387 DPYSL3 7165
UDP-N-乙酰"tt-D"半乳糖
胺多肽N-乙酰氨基半乳 糖 ^酶7(Ga脆c-T7) 二都
217755—at NM一016185 ■ 203963一at NM一001218 CA12
202923一s一at NM一001498 GCLC
血液学糊申经学魏的1 6730碳酸酐酶xn
谷氨酸-半胱氨酸连接酶，
6534催舰基
204875一s一at NM一001500 GMDS 201266一at NM一003330 丁XNRD1
5975 GDP-甘,4务船鹏 6118 ^^蛋白还原酶1
20:il〗8一at 209369—at
203925一at 21657一at 208S64一s一at 201463一s一at
NM一002631 PGD NM 005139 ANXA3
NM一002061 M18728.1 NM一003329 NM 006755
203757_s_at NM_002483 205柳一at NM一04467 20434at 雨006470
GCLM CEACAM6 丁XN TALD01
CEACAM6
SRPUL
TRIM16
9051 5737
6534 7165 7〗65 5975
7〗65 6118 5737
膜麟白A3
谷氨酸-半胱氨酸连接酶， ,亚基
硫縱蛋白 ^11
癌胚抗原相关的细胞粘附 肝6 (機异性交叉反应 繊)
sushi重复蛋白 含H^S序的162CM05S一atAL049699 ME1
6099
221841一s一at NM一004235 —
Kn jpel样因子4(肠)
204059一s一at NM一002395 ME1
苹果,1, NADP (+>依 6099鹏的，M的
204151 x at 2固9一s一at 216594 x at
NM一001353 BC000906.1
AKJUCI NQ01
20283 l一at NM一002083 GPX2 205328一at NM—006984 CLDN10
醛酮还原酶家族1,成员
6S05 oc(3"a",固醇MH) 6118
谷胱甘肽过氧化物酶2(胃 6979肠)
20'1468一s一at NM一000903 NQ01
額NAD(P)H^i[^,醌l
201467一s一at NM一0009(B
6118蘭(P)HMLSI,醌l
20， x at NM 001354 AKR1C2
217626 at BF508244 AKR1C1
ra^原SI^1，成员C2
(二氛二醇脱氨酶2;胆汁 酸结合蛋白；3KX羟基类固
15722醇M(^m勤
ESTs ,高度类似于 DBDD—HUMAN反式-1>2-6805 二辦-u-二醇J3JSg[gt智人]205623_at NM—000691 ALDH3A1 6081醛fl^tH3家族，成员Al
202435一s一at NM一000104 CYP1B1 6118
202436—s一at NM一000104 CYP1B1 6118
202437—s一at NM一000]04 CYP1B1
6118
细胞色素P450,麟夷I(二 氧芑诱导型的)，多肽1 (原 发性婴儿青舰3)
细胞色素P450,亚家族I(二 氧芑诱导型的)，多肽1 (原 发性婴儿青舰3)
细胞色素P450,鄉矣I(二 氧芑诱导型的)，多肽1 (原 发性婴儿青光眼3)
本发明预计i^该方^^在吸烟者和非吸烟者的肺和肺癌的m前相关的 口腔上皮细胞中鉴定口腔转录组、表达的基因的独特组或基因表达模式。所有
的这些，模式构成指示细胞功能的可操作性和途径的^ii^^，其可用于指
导涉及 贩、诊断和可能疗法的决定。因此，从相对易魏的位点(例如口腔) 得到的上皮细胞基因，谱可,重要的预后、诊断和治疗信息，这可应用于 诊断和治疗肺病。
因此，在一个实施方案中，本发明麟"口腔转录组"，其鋭模式可用 于文中戶脱的鹏、鹏、诊断和治疗'鹏途。
本发明的技术包括用核苷酸探ft^行检测。伏选地，核苷 针可以皿 择性杂交目的鹏因的任意核苷酸。例如，它与鹏因转录物杂交更强于与其 它天然存在的转录因子序列杂交。^!十种类包括cDNA、 RNA ^f十(riboprabe)、合成的寡核苷酸和基因组Mh通常特殊瞎形决定所用到的探针种类，例如用
于原，交的RNA探针，和例如用于RNA印迹法的cDNA。耙编$ 因的检 测本身可用于 与增强的^有关的条件。更容易与^i-转录物和其它^ii 产物水平相关的其它检测耙的测定方式通常也是有用的。探针可以根据需求而 尽量短以差异识别目的mRNA转录物，且例如可魅15鹏，更iMM少是 17麟。探针更雌超少20離
本领域，人员从耙基因的MS,列也可反向工程构，针。然而限制 了所述探针的用途，因为由 传密码的简并性，可以理解任意一种给定的反 向工程构建的序列并不必定与来自相同肽的倒可给定的反向工程构建的互补序 列良好杂交或根本不与其杂交。这是本领域技术人员通常考虑到的因素，而且 任何给定序列的简并性通常范围太宽，以至于对樹可一个序列产生大量数目的 微。
探针的标己形式可以是任何适合的形式，例如使用舰性同位素，如32P 和35S。无论微是化学合成还是生物合成的，通过使用合适的标记碱基，可 实UW性同位素t斜己。其它新己形式可以包括,抗^^i己，例如具有ELISA 的特点，或任意报告分子。本文所用的"报告分子"，是皿可允许杂交探针 检测的可分析鉴定的信号的分子。检湖何以是定性或定量的。通常用到的报告 舒包括荧光团、酶、生物素、化学发光舒、生物发光舒、洋地黄毒苷、 抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白g^lt性同位素。其中通常用到的,括辣 根过氧化物酶、减性磷酸酶、葡麟化酶和&半乳蹄酶。酶可缀合抗生物素 蛋白或链霉抗生物素蛋白以与生物素化探针一起使用。类1自，' 可缀合抗 生物素蛋白或,抗生物素蛋白以与生物素化酶一起使用。通常选择在被相应 酶水解后产生可检测至啲鹏变化的与这些酶一起j顿的底物。例如，磷舰 硝基苯酉驢于与喊性磷酸斷艮告M—起使用；对于辣根过氧化物酶，通常使 用l二苯二胺、5-氨基水杨酸或联甲苯胺。M31技术人员已知的任何方法可将 报告分子M入DNA探针，例如Mil切口平移、引物延伸、随,核苷酸引 发、通过3'或5'端，giB或iia其它方、樹参见，例如Sambrook等. 5z'o/ogy.'爿/akvato^v ^p/ raac/j, Cold Spring Harbor, N. Y 1989)。
基因,的检测
在本发明的一个实施方案中，iOT本领域中用于测量基因鋭的倒可已知方法(包括mRNA转录物分析以及DNA甲,分析)，将分离的上皮核, ^W^基因或多基因的^iio
对于本领,术人员而言，评价mRNA 7K平的方法是^^f周知的。在一 个，实施方案中，SM检测RNA转录物来确定基因^ii,例如M RNA 印迹法，例如，其中将RNA制剂在变性琼月^^繊上电泳、并将辦Ait宜 的支持物(如活化的纤维素膜、硝酸纤维素膜或玻璃膜或尼龙膜)。然后使用 本领域公知方法(例如娜自显影术)，将标己的(例如舰性新己的)cDNA 或RNA与制剂杂交、并进t亍冼涤和分析。
使用已知的扩增方法，可进一步完成RNA转录物的检测。例如，将mRNA 反转录成cDNA，随后进行聚合,反应(RT-PCR);或i^ffl美国专利号5,322,770 中描述的两步骤中的一种酶，或如R L. Marshall等人的PCR Methods and Applications 4: 80~84 (1994)中描述的将mRNA反转录成cDNA,随后进行)(tf尔 缺口连接,反应(RT-AGLCR),均在本发明范围内。
本文用到的其它己知扩增方飾括，但不限于PNAS USA 87: 1874^1878 (1990)中描述的并也在Nature 350 (No.6313):91-92(1991)描述的所谓的 "NASBA"或"35R"力法;公幵的欧洲专利申i^(EPA)号4544610中描述的 扩增法；艘縱增法(如G.T Walker等人的Clin. Chem. 42: 9-13 (1996)和欧 洲专利申请号684315中所述以及如PCT公幵文件W09322461所述的耙介 导扩增法。
也可利用原^V魏示，其中将娜性新己的反义RNA微与雜且织检 査样品的薄切片杂交、洗涤、用RNA酶切割，并暴露于舰自显影术的敏感 乳剂中。用苏7Mf染色样品以证实样品的组织学组成，且皿，的滤光器， 暗场成像显示显影的享服。也可^^非目性标记，例如洋地黄毒苷。
棘，$ DNA阵列、芯片或微阵列上检测醒毅，包括mRNA鋭。 将与目的基因对应的寡核苷酸固定在芯片上，然后使其与从患者中得到的测试 样品的新己核自交。含有目的基因转录物的样品可得到阳性杂交信号。DNA 阵列的制备方法及其用途都是本领域公知的(参见例如，美国专利号 6,618,6796、 6,379,897、 6,664,377、 6,451,536、 548^57、 U S. 20030157485,以 及Schena等人的1995 Science 20: 467470; Geihold等人的1999 Trends in Biochem. Sci. 24， 168-173;和Lennon等人的2000 Drug discovery Today 5: 59-65,它们在此全部引用作为参考)。也可进行基因敬连续分析(SAGE)(参 见美国专利申请20030215858)。
本发明方法可使用固体基片，包括一些优选实施方案中的阵列。在 US,S,N09/536，841、 WOOO/58516、美国专利号5，143，854、 5 242，974、 5 252，743、 5，324，633 、 5,384^61、 5,405,783 、 5,424,186、 5,451,683、 5,482,867、 5,491,074、 5,527,681、 5,550^15、 5,571,639、 5,578,832 、 5,593,839、 5,599,695 、 5,624,711、 5,631,734、 5,795,716、 5,831,070、 5,837,832、 5,856,101、 5,858,659、 5,936,324、 5,968,740、 5,974,164、 5,981,185、 5,981,956、 6,025,601、 6,033,860、 6,040,193、 6,090,555、 6，136 269、 6,269,846和6,428,752， PCT申请号PCT/US99/00730(国 际公幵号WO99/36760)以及PCT/US01/04285中描述了适于聚，阵列合成的
方法和M,出于所有目的，它们iP&tk全部引用作为参考。
在特别实施方案中描述了合成方法的专利包括美国专利号5,412,087、 6，147 205、 6^62-16、 6,310,189、 5,889,165以及5,959,098。
用于本发明的核酸阵列包括，但不限于根据商标GeneChip7从Afifymetrix (Santa Clam， CA)购买的那些阵列。在aflfymetrix.com网站上显示了阵列实例。
本发明也预计将聚合物附着在固体基片的许多用途。这些用途包括基因表 皿控、特征分析、文库筛选、基因型分析和诊断法。美国专利号5,800,992、 6,013,449、 6,020,135、 6,033,860、 6,040,138、 6，177 248和6^09,822中显示了 基因^ 控禾崎征分析方法的实例。在USSN60/319，253、 10/013,598和美国 专利号5,856,092 、 6,300,063、 5,858,659、 6，284，460、 6,361,947、 6,368,799和 6,333,179中公开了基因型分析及其用途的实例。在美国专利号5,871,928、 5,902,723、 6,045,996、 5,541,061和6,197,506中具体鋭了用途的其它实例。
例如，为监控mRNA 7k平，从待检的生物样品提取mRNA、反转录、并 制备荧光标记的cDNA探针。然后将能与目的基因杂交的微阵列用所树己的 eDNA ^fHt行探测、扫描载玻片并测量荧光3M。 ^m应于杂交 贼和表 駄平。
在一个，实施方案中，用定量实时PCR测量基因,。定量实时PCR 指在扩增过程中，禾IJ用荧光随时间推移监控的聚合麟反应，以须懂与特殊序 列扩增禾g^对应的参数。在扩增f盾环期间，释放的荧光量与PCR各个循环中 扩增的产物量成比例。本发明也预计将聚合物附着在固体基片的许多用途。这翻途包括基因表
达监控、特征分析、文库筛选、基因型分析和诊断法。美国专利号5,800,992、 6,013,449、 6,020,135、 6,033,860、 6,040,138、 6,177 248和6,309,822中显示了 基因^i^控和特征分析方法的实例。在USSN60/319253、 10/013,598和美国 专利号5,856,092、 6,300,063 、 5,858,659、 6,284,460、 6,361,947 、 6,368,799和 6，333，179中公开了基因型分析及其用途的实例。在美国专利号5，871，928、 5，902，723 、 6,045,996、 5,541,061和6,197,506中具体鋭了用途的其它实例。
在某^^实船案中，本发明也预计样品制备方法。在鋭分析之前或 同时，通过多种机理可扩增核酸样品，其中一些用到PCR。参见如，/>CK 7fec/iwo/ogy: /V/w^7/es owe/ JpWcaft'ora》r Z)iV^ Jwp/拆cato" (Ed. H. A. Erlich， Freeman Press, NY， NY, 1992)、尸C7 尸ratoco/y." CM^ ft M"/kw(f aw/脉/歸ora (Eds. Innis等，Academic Press, San Diego， CA, 1990)、Mattila等人的A^cfe/cMc油
19， 4967(1991); Eckert等人的PO Afe^ocfe owcMp; //caft'om 1, 17(1991)、 尸O (Eds. McPherson等，IRL Press, Oxford)以及美国专利号4,683^02、 4，683，195、 4,800,159、 4,965,188和5,333,675，出于所有目的，它们各自ttetb 鄉引用作为参考。可在阵列上扩增样品。参见，例如，美国专利号6,300，070 和美国专利申请09/513,300， ^&fc弓间作为参考。
其它合适的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)(如，Wu和Wallace的 Gfewwto4， 560(1989)、 Landegren等，5bfewe241, 1077(1988)以及Bairinger 等人的C 微狄117(1990))、 ^i:扩增(Kwoh等人的/yw. Ato/.爿ok/. <SW. OS4 86, 1173(1989)和W088/10315)、自动维持序列扩增(Guatelli等人的Pwc. Ato 爿a^ LS4， 87， 1874(1990)和WO90/06995)、靶多核苷,列的选择性 扩增(美国专利号6，410"6)、，序列引物聚合,反应(CP-PCRX美国专利 号4,437,975)、任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)(美国专利号5,413,909、 5,861^45)以及基于核酸的序列扩增(NABSA)(参见美国专利号5，409，818、 5，554，517和6，063，603，它们分别舰弓间作为参考)。在美国专利号5,242,794、 5，494，810、 4,988,617和USSN 09/854,317中描述了其它可用的扩增方法，它们 分别在此弓间作为参考。
例如，在Dong等人的Gewowe /toeorc/j 11, 1418 (2001)、美国专利号 6,361,947、 6，391，592和美国专利申请号09/916,135、 09/920,491、 09/910^292和10/013,598中，描述了用于斷赚,品M^度的样品制备的其他方法和駄。 本领域中己经充分开发了实施多核苷麟交测定的方法。杂交测定力法和 割牛依赖于应用而变化，并根据已知的常规结合方法进at择，包括下列中提 到的Maniatis等人的Afofecw/a^ C7o"/"g.v4 L360mto7MawMa/ (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N. Y， 1989)、 Beiger和Kimmel的Afef/jo^/" ￡>z^wo/ogy, Vol.152, Gi^afe to M /ecw/ar C7o"f"g Tkr/zra^wes (Academic Press, Inc. ■ ， San Diego, CA ， 1987)、Young和Davism的P.N.A.S,肌'1194 (1983)。例如，在美国专利5,871,928、 5,874^19、 6,045,996和6,386,749、 6,391,623中已描述了用^t行重复的和控 制的杂交反应的方法和仪器，所述辨盼别在此弓间作为参考。
在某^^实施方案中，本发明也预计在配体之间杂交的信号检测。参见, 例如，美国专利号5,143,854、 5,578,832、 5,631,734、 5,834,758、 5,936,324、 5,981,956、 6,025,601、 6,141,096、 6,185,030、 6 201，639、 6 218，803以及6,225,625、 美国临时专利申请60/364,731和PCT申请PCT/US99/06097(公开号 W099/47964)'出于所有目的，它们也都分别^ltb^P弓间作为参考。
例如，在美国辨U号5，143，854、 5,547,839、 5，578，832、 5，631，734、 5，800，992、 5,834,758、 5,856,092、 5,902,723 、 5,936,324、 5,981,956、 6,025,601、 6,090,555、 6，141，096、 6,185,030、 6^01,639、 6^18,803和6^25,625、美国专利申请60/364,731 和PCT申请PCT/US99/06097(公开号W099/47964)中公开了用于强度数据的信 号检测和处理的方法和仪器的实例，出于所有目的，它们也都分别在此鄉引 用作为参考。
本发明在实践中也可〗顿常规生物方法、软件和系统。本发明的计，软 件产品通常包括具有用于实施本发明方法的逻辑步骤的计,可执行指令的计 算机可读的介质。合适的计算机可读的介质包括软盘、CD~ ROM/DVD/DVDROM、硬盘驱动器、瞬时储存器、ROM/RAM、磁带等等。 计#^几可执行指令可用雜的计,语言§)1^种语言的组合编写。如，在Setubal 禾口 Meidanis等人的/"frtx/wcdort to Cow/ wtoft'o a/ 5Jo/ogy Afef/jocfe (FWS Publishing Company, Boston, 1997)、 Salzberg， Searles， Kasif， (Ed.)， Cow/ M加'ona/
Afofecw/<ar历o/ogy(Elsevier ， Amsterdam ， 1998) 、 Rashidi禾口 Buehler'的 5wz'^& naft'Gs 5as7'cs: y4/y &'caft'ow 5fc>/og^ca/ 5Wewce Afecft'c/ne (CRC Press, London, 2000)，以及Ouelette禾口 Bzevanis的历o争/7wwft'cy.. J尸rac /a / C w^fey4na/声&o/Genea K/^r te^s (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed.， 2001)中描述了基本的 计對几生物学旅。
本发明也可使用用于多种目的的多种计Mie^产品和软件，例如弓i物设
计、娜管理、分析和仪纖作。参见，例如，美国专利号5，593，839、 5,795,716、 5,733,729、 5,974,164、 6,066,454、 6，090，555、 6,185,561、 6,188,783 、 6，223，127、 6,229,911以及6,308,170。
另夕卜，例如在美国专利申请10/063,559、 60/349,546、 60/376,003、 60/394,574、 60/403,381中所显示的，本发明具有iM的实施方案，其包,过网络(例如 因特网),遗传信息的方法。
贯穿本说明书，以范围形式,本发明的多个方面。应当SH的是，说明 书的范围形式仅仅为了方便和简洁起见，且不应该^^释为对本发明范围的硬 性限制。因此，说明书范围应当可理解为具体公开了该范围内所有可能的子范 围以及个别数值。例如，如从1至6的说明书范围可被鹏为具体公开了子范 風如从1至3、从至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等等， 以及公开了该范围内的个别数字，例如1、 2、 3、 4、 5和6。 1M用与范围宽 度无关。另外，^^舰的例证體中也包括分数范围。因此，例如1至3的范 围包括例如l.l、 1.2、 1.3、 1.4、 1.5、 1.6等的分数。
差异DNA甲皿
本发明,分析DNA甲基化模式的方法，与患有或处于，鄉市病危险 的个体相比较，戶脱的DNA甲S^模式与麟个体口腔上鹏胞的基因特异 性相关。鹏只在差异DNA识别位点，，滩择性切割的酶，可检测戶腿的 差异甲謝七。例如，用只在被甲基化的DNA识别位点上进^t刀害啲酶，綱 只在未被甲靴的DNA识别位点上切割的酶，来消化DNA。本发明可f顿任 何育继择性切割麟个体的DNA区域但不切割患有或处于鄉劍市病危险的 个体的对应DNA区域的酶。
如文中所述，"甲基敏感型"酶是活性，于其DNA识别位点的甲基化 状态的DNA限帝胜内切核酸酶。例如，存在只有在未被甲基化时切割其DNA 识别序列的甲纖感型酶。因此，未被甲靴的DNA样品比甲靴DNA样 品可被切割成更小尺寸。类似地，超甲基化DNA样品不会被切割，且比普通 未被甲靴的DNA样品产生更大的片段。与此相反，存在只有在被甲靴时切割其DNAi鄉j序列的甲纖感型酶。如文中戶脱，可鄉i顿术语"切割"、 "切"和"消化"。
适于本发明方激顿的、消化非甲靴DNA的甲纖感型鹏括，但不 限于，HpaH、 Hhal、 Madl、 BstUI和Acfl。用到的,酶是HpaH,其只切割 非甲割娘列CCGG。也可j飾只消化非甲靴DNA的甲^i型酶的组合。 只消化甲基化DNA的适宜自括，但不限于Dpnl和McrBC (New England BioLabs)。
M^:领域技术人员已知的标准方法，可分离从口腔上皮细胞样品得至, DNAo在Sambrook等人的M fecw/ar历o/ogy..」to rato/yy^pwflcA， Cold Spring Harbor, N. Y 1989和Ausubel等人的Cwt^ pratoco/sMo/ecw/or说o/ogy, Greene Publishing, Y, 1995中描述了 DNA分离的标准施。
选择在特定位点切割DNA的限制酶的切割》法和禾將，对于技术人员而 言是已知的。例如，限制酶的许多供应商JH^定限制酶切割的DNA序列的 条件和种类的信息，包括New England BioLabs、 ProMega Biochems、 Boehringer-Mannheim等等。Sambrook等人(参见Sambrook等,M)fecw/or胸/ogK. 爿torato;7柳羅/|， Cold Spring Haibor, N. Y1989)鹏了限制,其它酶 的^ffi力法的常规描述。在本发明的方法中，伏选在能以95°/"00%效率来切 割DNA的^f牛下j^g酶。
检测差异甲基化DNA的甲基多态性微的鉴定
本发明禾,在自和非MJi DNA中的差异作为鉴定甲基多态性機十的方 法。在一个实施方案中，本发明使用差异甲基化。在哺乳动物细胞中，甲基化 在基因鋭中起重要作用。例如，基因(启动子和第一外显子区)在鋭它们 的细胞中经常不被甲基化，且在不,它们的细胞种类中被甲基化。已经知道 甲基化改^^常出现御市癌中(Tsou等，2002)。榭"^异甲靴区域的DNA 片段进行测序，并筛选可用作本发明的生物銜己的多姚^E的雜。可在公 共 库(例如NCBI)中寻找^13±测序发现多态性标记。通过iWT鉴定的 甲基多态性^iB在自个体中与患有或处于发展働市病(例如肺癌)危险的个 体中相比的关系，然后可将其用作^fe体异常的诊断。
通过本领域公知的任何方法，以及从而制备的对应于这些区域的探针和/ 或引物，可鉴定差异甲基化区域。在美国专利号5,871,917、 5,436,142和美国申请号US 20020155451A1和US 20030022215A1、 20030099997中描述了用于
鉴定差异甲靴区域的多种方法，其内^jtb弓间作为参考。
以下是如何鉴定在麟个体中与患有或处于鄉劍市病(例如肺癌)的个 体中相比差异甲基化的区域的实例。
在美国专利号5，871，917中描述了一种^r法。该方法MM用不^i刀割甲基 化DNA的CNG特异性P艮制酶切害綱试DNA对照DNA来检测在CpNpG序 列的差异甲基化。该方制吏用偶联了扣除杂交的一轮或多轮DNA扩增，来鉴 定差异甲基化的或突变的DNA片段。因此，戶脱^法可以有选銜也鉴定甲基 化不是基因组或超甲皿的基因组的区域。
实施DNA印迹絲确定分离的片段可检测差异甲靴区域。用甲纖感 型酶切害顿 縱口对照基因组DNA，并Mim察用限制酶切割的DNA片段的大 小或3贼在样品之间是否相同，来检测特定位点的甲基化不足繊甲基化。通 过电泳分析并鹏针杂交测縱卩对照DNA样品、以忍见麵个杂交复，的 大小或3破是否相同或是不同，来鄉该过程。在Sambnx)k等人的Afofecw/or .'爿/fl6omto^y脉/t ac/1, Cold Spring Hartior， N. Y 1989中可找到用于 7 电1^卩核,交^的具体方法。
然后筛选片旨列中可用作为本文所述的甲基多态性探针的多态性标己。 iiaJd^技术分离的,具有至少14个核苷,约200个核苷酸o
用于Jd^方法的^t限制酶的实例包括，但不限于BsiSI、 Hin21、 Msel、 Sau3A、 Rsal、 TspEI、 Mael、 Niaffl、 Dpnl等等。雌的甲纖感型酶是HpaII， 其可识另,切害排甲基化的CCGG序列，但不识别和切割外部的胞嘧啶被甲 靴的CCGG序列。
也可舰美国专利申请号2003009997中描述的方法，W^差异甲靴， 该^法公开了{顿可隨非甲^^甲靴DNA的酶，用于在两种DNA源 之间鉴定差异甲皿的存在的方法。例如，用只切割非甲,DNA的甲 感型酶混合物(例如啤an、 Hhal、 Mael、 BstUI禾卩AciI)处旨自| 个体的 DNA，从而降解非甲皿DNA。然后用降解甲皿DNA的酶(例如McrBC， New England Biolabs)处S^自肺癌患者的DNA。然后扣除杂交可允许选#|4 提取在 个体和患有肺癌的个体之间是差异甲,的序列。
检测差异甲基化的可选择的方、M括二硫化物处理，随后l)测序，或2) #异切割，随后进行质i紛析，如von Wintzingenxie等人的2002, PNAS, 99.'70394戶腐，在此弓间作为参考。
为了作为探针，通过本领域任何已知方法可标记所鉴定的甲基多态性标 记，例如鹏掺入与以上限定的"报告肝"连接的核苷酸。
或者，所鉴定的甲基多态性1tia不必进行t斜己，并可用DingC.和CantorC R的2003， Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A. 100， 3059-64中描述的质谱扰术(在
此全部弓间作为参考)，将戶臓的^ia用于定s^^基因频率。 应用
本发明的方法、核酸以及刮取^g可用于多种应用。 本发明预计鉴^t香烟烟雾,性应答，并因此显示易例如受其致癌效应 的影响的吸烟者亚群，这使m)t们可^处于，劍市病危险的个体。如图io
所示，月轆呈1LH个主要问题。尽管85%的月轆发5赃现在或以前的吸烟者中， 但只有15%的吸烟者^ ^市癌。第一个争论问题是鉴定具有^^市癌的易
感性的那齡体，鄉早期诊断和予鹏起决定作用。当癌臓是高度局部化时,
可诊断15%的肺癌；JM"于这，人，5 ，活率是50%。然而，对于诊断具 有远侧癌的肺癌病人中的50%, 5特活率低于5%。因此，早期诊断起决定 作用。
此处和贯穿说明书所用的术语"对照"或短语"对照个体组"或"对照 个体"指至少一个个体，^S少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10个"t体，更 tt^M少10-100个个体或甚至10O1000个个体，认为他们的气道已被暴露于 与测试个体或其诊断/预后/治疗正被讨论的个体相似的污染物。作为对照，他 们是被衫^出的与测试个糊似的个体。例如，如果个体是吸烟者，则对照组 由相似年龄、人种和吸烟方式自龄的吸烟者组成。然而，如果个体是非吸烟 者，对照则来自非吸烟者组。
舰文中戶腿的方法诊断或治疗的肺病，包括但不限于哮喘、慢性支气管 炎、肺气肿、支气管扩张、原发糊市动脉高压和急性呼吸窘迫综合征。文中所 述的方^^可用于诊断或治疗涉及免疫系统的肺病，包括过敏粗市炎、嗜酸性 细鹏市炎和持续性真菌感染、肺纤维化、系统性硬化病、特发啦市含铁血黄素 沉积症、肺泡蛋白沉积、肺癌(例如腺癌、鳞状细胞癌、小细胞和大细胞癌和 肺的良性赘生物，包括支气管腺瘤和错构瘤)。Mil分析口腔上皮细胞中与J3鹏不同期相关的基因^i谱，本发明的一个 实施方案麟鉴定暴露于环發污膽的个体(如患有或处于发臓市癌危险的 吸烟者)的方法。
在本发明的一个实施方案中，分离的口腔上皮细胞核酸可用于开发以非侵 入性方式实施的对多种状况的诊断性测试，作为il31从口腔刮取细胞而不是通 过支气管镜检査法得至御胞的常规鹏方法。一^NI合戶脱诊断的特别雌的 状况JiM (包括，成为肺癌的危险)。
本发明的一个实施方案麟鉴定包含不同口麟鬆且的基因。 一个有用的 口腔转影且包括在支气管中表达的且，支气管中的,受香烟烟雾影响的、 并也在口腔中,的基因。另一有用的转录组，癌诊断性口腔转录组。一种 用于鉴定包括肺癌诊断性口l^^组的基因的方法是:首先鉴定口,;t^且(如 上所述的)，然后确定这些基因中哪一些在患有肺癌的个体和1 个体的口腔 中^M异,的。
在一个实施方案中，我们现己鉴别出约166 4^括口麟影且的基因，即 在支气管中皿的且，支气管中的,受f^烟烟雾影响的、并也在口腔中表 达的基因，由下列基因乡滅ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1、 AGTPBP1、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20orfUl、 C5orf6、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEI>6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDNIO、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1、 CYP2A6、 CYP4F3、 DEFB1 、 DIAPH2、 DKFZP434J214、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FLJ13052、 FLJ130521、 FLJ20359、 FM02、 FTH1 、 GALNT1 、 GALNT3 、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1 、 GHTIM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GS簡、GSTM5、 GUK1、 HIG1、 HIST1H2BK、 HN1 、 HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1 、 IDS、 IMPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC5腦、LOC57228、 LOC簡2、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、 ME1、 MGC4342、 MGLL、画E、 MT1F、固G、 MT1H、 MT1X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1 、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1 、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S證、SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC簡、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1、 TTAM1、 TJP2、 TLE1、 IM4SF1、 TM4SF13、 TMP21、 TNFSF13、 ■、 TRA1、 TRIM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463。这些符号f^HUGO鉴定符号。图11列 出对应于这難因的各自转录物的详细资料，包縱難因在吸烟者和非吸烟 者之间相比较的敏比率(正在吸烟者/从不吸鹏比率)以及p值，鄉示了 这，因在吸烟者和一鹏烟者中^ii差异的显著性(正在吸烟者/从不吸烟者p 值)。图11也显示出现在包括HUGO、 GenBank和GO的l!^库中的这些基因 的多种基因符号。也显示了这些转录物的Affymetrix cDNA芯片定位。在一个 实施方案中，对这蝶因在患有肺癌的个体和麟个体之间的^t行比较， 以便鉴定生鄉繊诊断性口J^^且的基因。
在一个优选的实施方案中，另一口腔转录组由用它们的人类基因组组织 (HUGO)鉴定符号所鉴定的下列基因组成AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDNIO、 CYP1B1、 DPYSL3、 FU13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 画、HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMP10、 MT1F、固G、固X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1 、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1 、 SRPUL、 TALDOl 、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRM16、 TXN以及TXNRD1。图12列出对应于这 雖因的所鉴定转录物各自的详细资料，包跪蝶因在吸烟者和非吸烟者之 间相比较的魏比率(吸烟者/非吸烟者鋭比率)以及p值，腿示了这錢 因在吸鹏和非吸烟者中^i^异的显著性(吸烟者/非吸烟者p值)。在一个 ，实施方案中，比较这，因在患有肺癌的个体和 个体之间的 , 以 鉴定产创,诊断性口 ,录组的基因。
本发明的一个优选实施方案提供鉴定"异常(outlier)"基因的方法，该基 因可作为对f^烟烟雾和其它空气污，的致癌，易感性的生物^H己。所述的 异常基因被定义为在处于污染物(如对发展劍市癌的吸烟者的烟草烟雾)危险 的个体小亚群中趋异鋭的那難因；并朋脱的异常基因代鋭些吸烟者不 能提髙对烟# 4的适宜应答，以及可显示，劍鹏增加风险的M。例如，舰前述的气道转录组，我们鉴定了三销在吸烟者的亚群，这些吸烟者不会
将许多主要的氧，殿异生素基因的^i上调至与其他吸烟者相同的程度。在 分析的6个月内，这舰'鹏中的一个赚劍鹏。财卜，我们发现了一个在 从不吸烟者中是异常的并以正在吸烟者的水平^i基因亚群的从不吸烟者。在 吸烟者小亚群中基因表达的这，异模式代^些吸烟者不能提高对烟雾接触 的适宜应答，以及可显示，^^癌增加风险的，Q
因此，在一个鄉方案中，本发明麟在吸鹏中确劍市病(例如肺癌)
增加的危险的方法，其包括从个体釆集气道样品；分析至少一种、,至少两
种、还更^M少4种、还更tt^S少5种、还更^ms少6种、还更iMM
少7种、还更^fM少8沐还更tt^M少8种、腿更t^M少9种异常基
因的表达，其中与对照组相比，所避少一种、tms少两种、还更it^S少
4禾中、还更^iS少5种、还更1^M少6种、还更i^iS少7种、还更,
至少8种、还更1MM少8种、且还更^M少9种的^ii偏差可指示正处于
发展鄉市病(例如肺癌)增加的危险的吸烟者o
在本发明的一个实施方案中，可从口腔上皮细胞获得足够的核酸，棘征
在不同疾病状态中超过6,000个基因的,^:。皿地，御巿癌的进展期。
在该实施方案中，M皮细胞分离的核酸可用于定义不同群体的基因表达(以 下称为口腔转影且)的正常模式，以鉴定可能影响转录组的因素，例如年龄、 性别、人种。类f鹏，已经证实吸烟者具有显著改变的气1±皮基因皿模式, 并且在个体停止吸烟后，在正在吸烟者中发生变化的基因中的许多保持异常。 包含特殊目的气道转录组的基因中的一个亚群在口腔中，，并在本文中指口
腔转影且。
本发明分离的核酸也可用于鉴定在患有肺癌的吸烟者的口腔上皮细胞中是 驗卜改变的基因，并可用于幵发"类别 翻IJ"算絲鉴定患有肺癌的吸烟者。 在吸烟者小亚群中基因，的趋异^f^些吸烟者不肖鹏高对烟雾接
触的适宜应答，以及可显示赚劍鹏增加风险的絲(Spim等，2004)。结果，
所述的耙基因可作为对香烟烟雾和其它空气污自的致癌效应易感性的生物标记。
因此，在一个实施方案中，本发明鹏在吸烟者中确定肺病(例如肺癌) 增加的危险的方法，其包括从个体采集口腔上皮细胞样品；分析至少一种、优魅少两种、还更iMM少4种、还更^ll少5种、还更^M少6种、还 更^S少7种、还更i^M少8种、还更i^M少8种、腿更^M处 部耙基因的泰逸，其中与对照组相比，戶，至少一种、1MM少两种、还更优 选至少4种、还更皿至少5种、还更iMM少6种、还更^^M少7种、还 更^M少8种、还更tt^S少8种、腿更tt^M少鄉9种的遗传变化可 指示正处于发,市病(例如， )增加的危险的吸烟者。
在一个优选的实施方案中，遗传变化是基因鋭的增加的水平。在另一优 选实施方案中，遗传变化是基因泰逸的降低的水平。在一个,实施方案中， 与 个体相比，遗传变化是DNA甲基化中的偏差。
在一个特别优选的实施方案中，使用基于核酸芯片的测定，分离的RNA 可用于基因^i谱分析来一次分Hfi午多基因,征。例如， <顿AfifymetrixU133 人基因毅阵列。
在另Ht别雌的实施方案中，本发明分离的RNA的用途可用于开刻市
皿显示在从非吸烟者口腔中采集的生物样品中ia因的增加^^降低 表达，本文公开的方^tii可用于显示非吸烟者对环境污染物的接触。如果观察 到所述的变化，贝何分析所暴露的个体的工作離住环境的齡个体组，且如 果在口麟魏敏中他们中樹可一个都不显顽示的增加和斷氐，且他们可 能处于赚劍市病的和易受TO影响的更大危险中。例如，可4顿这些,絲 进行工作场所 分析，其中结果可用于评价个懒皮暴露于香烟烟雾、矿区烟 尘、钻井烟尘、石棉和/或其它化学和/或物理气道污染物中的工作环境。筛选 可用于衫,自危险环境的高危险工人以转移至低危险环境。
因此，在一个实施方案中，本发明麟鹏和诊断方絲,处于魏成 肺病(例如肺癌)危险的个体，其包括鹏口麟录组的基因魏模式中的变 化。方、魏括从个体口腔获得核酸样品并测量根据本文,的口麟录组的基 因转录物的^ii7jC平。雌测量口麟影且中至少两种、还更^M少3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10种^^物，皿更i^M少l(M5、 15-20、 20-50种或建多 种转录物，且还更^^有基因的水平，其中与正常口腔,组相比，口腔转 录组中存在的至少一种、皿至少两种、还更,至少三种、且还更iM至少 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1(M5、 15-20、 20-30、 3(M0、 40~50、 50-60、 60-70、70-80、 8(^85种基因的^iM异，可J际肺病增加的危险。对照JiM少一个、 优选多于一个暴露于相同污染物的个体的组，并对暴露具有正常或健康的应 答。
在一个实施方案中，与这些 照中鋭的基因水平相比，在至少一种靶 基因中的差异，可J际处于鄉劍言病的增加的危险的个体。
在一个实施方案中，本发明il^预后肺病的方法，其包括在口腔转录组的
至少一个紀基因中检汲瞎因鋭变化，其中与对照组相比，魏的增加可指示
发展卿市病的增加的危险。
在一个雌实施方案中，本发明,用于在长时间间隔期间(例如数周、 数月或甚至数年)鹏口腔转影且中变化的方法。因此，在时间间隔(雌两 个或更多个时间间隔，例如与年度Wt有关)中进行口腔转彩且^ii分析，从 而使得可1^宗个体基础中口,影且,模式的变化。本发明的m方法可用 于il^气m^者在延长的时间段中所暴露的多种污染物产生的应答。所述 污鄉包括直接或间接暴露于香烟烟雾麟它空气污娜
本发明的方法和刮取體可用于研究位H道不同部分的上皮细胞损伤与 肺病(包括肺癌)的易感性、早期诊断和预后之间的联系。例如，本发明的生 物标己可用于来自口腔的核,品，以确定个体^l^fr病的易感性。类船也， 支气管分析法可用于早期诊断，而肺自身组织分析法可涉及预后。在国际申请 PCT/US2004/18460中也描述了所述的方法，^&tb，引用作为参考。
本发明的方法和刮取驢可用于流行病学研究，包掛愤不同因素对肺病 发生劍市病发生危险的影响。用于所述的流行病学研究的具体目的因素包括， 但不限于人种因素、家方魏传以及暴露于二手烟。
类似也，本发明的方法和刮取縫可用于临床研究，包括从事新香烟的研 制，来iWT不同化学预防方法的效力，和评价^^t肺病发生鄉市病发生危险 的效果。
本发明具有许多,实施方案，并,于本领m术人员详细知道的许多
专利、申请和其它参考文献。因此，当贯穿说明书全文弓间或重复专利、申请 或其它参考文献时，应当理解的是出于所有目的和出于弓l用的主张而将它们全 部引用作为参考。实施例
为了从口腔粘^±皮,完整RNA以用于研究吸烟对气^±皮的生物学 效应，劍门已开发出相对非侵入性方法以用于从口腔获得小量RNA。使用定 量实时PCR,我们已领懂了在个体^#中所衫^的基因的鋭，并已4顿新 近描述的、仅需要纳克量的总RNA进行分析，并适于高通量分析个数百基因 的质谱法。
我们用微驗液管尖头纵向切割，以相对非侵入性的模式从口腔粘膜收集 上皮细胞。随后我们设计具有锯齿>1^^凹面的标准塑料工具。它是5/16英寸 宽、1 6/16英寸长，具有3英寸手柄，当具有收集的细胞的刮取工具被插入含 有l ml RNA later溶液(Qiagen, Valencia, CA)的2 ml微量离心管时，该手柄可 折断。该工具具有两个允许从口腔粘膜收集大量高质量的RNA的部件；可刮 取几层上皮细胞的精细锯齿^i^:，和收集细胞的凹表面。用轻柔压力，将锯 齿状ii^t着面颊内部的口腔粘膜刮擦(十次)，并立即将收集的细胞浸入1 cc RNAlater溶液(Qiagen， Valencia, CA)。在4'C稳定4tft多24小时后，用TRIzol 试剂(Invhrogem Carlsbad, CA)根据制造商规程从细胞沉淀分离来自口腔上皮 细胞的总RNAo在RNA变銜 ±证^^瞇的情况中RNA的完整性(参见 图6)。 M^细胞沉舰糊胞离'lXThermoShandonCytospin， Pittsbuigh, PA) 并用细胞角蛋白抗辦Signet, DedhamMA)皿，来定量上皮细胞^4 (图7)。 4顿i^顺呈，我们已育纵齡受微获得3004500 ng RNA (平均值+A标縫 =983+A667ng)。
对于该研究中所有麟的受微而言，该方法具有良好的耐受性，并且在 刮取过程中^t后没有受^fi圣受、數或鄉。我们试过许多其它體，包括 内窥镜细胞刷(cytobrush) (CELEBRITY Endoscopy Cytology Brush, Boston Scientific, Boston, MA)、 Cell Lifter(ComingInc., Corning, NY)、巴氏涂片(pap smear)试齐检以腿舌板，且4顿战夫顺呈并不能获得大量完整RNA。财卜， 我们已发现与将细Jtl:接^A TRIzd1相比，上皮细胞在RNAJater的储存显 著提高RNA完整性的保存。我们己发现在分离RNA之前，细胞也能在 RNAlater中室温保存最多24小时。
为了iWT从口腔粘膜细胞收集的RNA的生物識性，我们测難定数目 的解毒相，因(预计其通ffi触f^烟烟雾可能发生变化7)和参与细胞粘附的基因的^ii。禾iJ用，的娜呈，从12个从不吸烟者和14正在吸烟者中麟 了口腔粘膜脆。
i^ffi定量实时RT-PCR8来测M^自3个从不吸烟者和2个正在吸;W的 样品的NAD(P)H脱氣酶、醌l(NQOl)、醛脱MH家族3成员A1(ALDH3A1)以 及癌胚抗原相关的细J^占附肝5(CEACAM5)的魏(参见图8A和表1A)。 在^H草烟雾的患者中，NQOl、 ALDH3A1和CEACAM5的平均^ii分别 增长了7、 2和3倍。用竞争PCR和基质辅助激，TO子化(MALDI)飞行时 间(TOF)质谱(MS)6,我们测量了 7个从不吸烟者和10个正在吸烟者中 ALDH3A1、 NQOl和CEACAM5的表达(图犯和表1B)。与从不吸烟者相 比，在吸烟者中所有3个基因的毅都上调，对于ALDH3A1和NQ01具有统 计学上显著的变化。
这對开究4樣第一种以非侵入性方錄口腔粘膜细胞获得RNA以用于测 量基因表达的成功方法。该方法可用于了解口腔中涉及的多种疾病的分子机 理，用BTO对吸入的污染物(例如香烟烟雾)的应答和其弓胞的损伤、以及 iWT吸入的传^J的诊断和生物影响，和用于开发气道和肺癌的简单、早期诊 断性生物标记(可应用于筛选有危险的群体)。质谱系统允许短时间段内高通 量分析大量基因(100-200)，并适于大量样品的大量 。表1:用于由QRT-PCR和MALDI TOF MS测量的3个基因的正向和反
向引物
A.用于QRT-PCR的引物
ALDH3A1正向 CEACAM5正向 NQOl正向 ALDH3A1反向 CEACAM5反向 NQOl反向
5,-ATG GGA TCC TAC CAT GGC AAG-3' [SEQ IDNO:l〗
5，-GTC TTG TTT CCC AG A TTT CA<3 GAA-3, [SEQ ID NO:2]
5、TGG GAG ACA GCC TCT TAC TTG C-3，SEQIDNO:3]
5，-GCG GCG GTG AGA GAA AGT CT-3'SEQIDNO:4]
5,-AGA GTG GAT AGC TTA AAA GAA AAA AAG TTT C-3，SEQIDNO:5]
5，-CAG CTC GGT CCA ATC CCT TC.3, [SEQIDNO:6]
B.用于竞争PCR和MALDI-TOFMS的引物
PCR
引物
ALDH3A1
正向
CEACAM5
正向
NQOl正向
ALDH3A1
反向
5、ACGTTGGATGCACTGAAAGAGTTCTACGGG-3' [SEQIDNO:7]
5，-ACGTTGGATGATGTGAAACCCAGAACCCAG-3， [SEQIDNO:8]
5 '-ACGTTGGATGCCAC AGAAATGCAGAATGCC-3' [SEQIDNO:9]
5 ，-ACGTTGGATGCGGGCACTAATGATTCTTCC-3' [SEQ ID NO: 10CEACAM5
反向
NQOl反向
延伸
引物 ALDH3A1-B CEACAM5-E NQ01-E
5，-ACGTTGC5ATGTCCGGGCCATAGAGGACATT-3， [SEQIDNO:ll]
5,-ACGTT(3<3ATGTGTACTCTCTGCAAGGGATC-3, [SEQIDNO:12]
5,-GGGAAGATGCTAAGAAATC-3， [SEQIDNO:13〗
5，-CAGGCGCAGTGATTCA(3T-3' 〖SEQIDNO:14]
5'-GAATGCCACTCTGAATT-3, [SEQIDNO:15]1. King, I. B., J. Satia-Abouta, M. D. Tho，ist, J. Bigler, R- E. Patterson, A. R. Kristal， A. L. Shattuck, J. D. Potter, E. White, and J， S. Abouta. 2002. Buccal cell DNA yield, quality, and collection costs: comparison of methods for laTge scae studies. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev餘11:1130-1133,
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此^B^^f有文献都弓l用作为参考。
权利要求
1. 一种试剂盒，其含有i)用于收集生物样品的刮取装置，其包括；a)近侧的手柄端；b)远侧的收集端；和c)手柄端和收集端之间的连接部分；其中连接部分在宽度上与其两侧的手柄端和收集端通常是连续的；并且连接部分允许手柄端和收集端可任选地彼此分开；和其中收集端还包含外周缘和凹部，其中所述的收集部分的至少一些外周缘是锯齿状的，以允许刮取生物样品，并且凹部允许收集刮取的生物样品；ii)储存容器；和iii)稳定溶液。
2. 权利要求l戶脱的试剂盒，其中戶脱的收集端是勺状的。
3. 权利要求i戶脱的试剂盒，其中戶;f^t包含塑料。
4. 权利要求1戶脱的试剂盒'其中0f^i接部雜含穿孔。
5. 权利要求1戶脱的试剂盒，其中从大约手柄^5端到麟鹏端的装 置长度约是3-6英寸。
6. 权利要求1戶脱的试剂盒，其中^端长度约是1-2英寸。
7. 权利要求1臓的试剂盒，其中,端的长度和宽度允许蝶鹏合 储存容器。
8. 权利要求1戶腿的试剂盒，其中戶腿样品包含来自^#的口腔粘膜 的上皮细胞。
9. 权利要求l戶臓的试剂盒，其中戶瓶生,品含有核酸。
10. 权利要求1戶脱的试剂盒，其中戶脱核,自RNA和DNA。
11. 权利要求l戶脱的试剂盒，其中戶; ^储存^i含有盖子。
12. 权利要求ll戶舰的试剂盒，其中戶;MM子附着于储存容器。
13. —种RNAiB^系统，其包括(a)具有近侧的手柄端、包含锯齿微卜周缘的远侧收集端和手柄端和收 集端之间的连接部分的刮取装置，其中连接部分允许手柄端和收集端可任选地彼此分开；和(b)包含RNA稳定溶液的储存容器。
14. 权利要求13臓的试剂盒，其中^M储存容器含有盖子。
15. 权利要求14戶，的试剂盒，其中戶;f3M子附^f储存，。
16. —种用于从口腔粘膜1{^±皮细胞的试剂盒，其包括(a) 具有近侧的手柄端、包含锯齿状外周缘的远侧收集端和手柄端和收 集端之间的连接部分的刮取装置，其中连接部分允许手柄端和收集端可任选地 彼此分开；和(b) 包含腿稳定溶液的储存容器。
17. —种用于获得分离自口腔上皮细胞的核酸的非侵入性方法，其包括(a) 将从受蹄口腔非侵入性分离的细胞转入可灭活核酸酶的核酸稳定 溶液中，和(b) 从分离的细胞提取目的核酸，以获得分离的核酸样品。
18. —种用于^核,品的刮取CT,其包括-a) 近侧的手柄端；b) 远侧的收集端；和c) 手柄端和麟端之间的连接部分；其中连接部分在宽度上与其两侧的手柄端和lfe^M常Ji^的；并且连 接部分允许手柄端和收集端可任舰彼此分开；且其中收集端还包含外周缘和 凹部，其中戶腿的收集部分的至少一些外周缘是锯齿状的，以允许刮取核酸样 品，且凹部允许,刮取的核酸样品。
19. 一种1|^#品的方法，其包^^骤(a) 鄉具有近侧手柄端、包含锯齿微卜周缘的远侧收集端和手柄端和 收集端之间的连接部分的刮取装置；(b) 鄉含有職稳定溶液的储存容器；(c) 用收集端的锯齿微卜周缘从^#口腔的口腔粘膜刮取上皮细胞；(d) 将刮取的上皮细胞收穀括IJ^S的收集端中；(e) 将刮取的上皮细胞转入储存容器；和(f) 旋转刮取装置手柄，以使装置手柄端在连接部分与收集端分开，从 而使得储存容器包含RNA储存液、刮取的样品以及刮取装置的t^^端。
20. 权利要求17戶脱的方法，其中戶腐核酸是RNA。
21. 权利要求17戶脱的方法，其中Mffl刮取装置进^^取，从口腔非 侵入性地分离细胞。
22. 权利要求21戶腿的方法，其中戶腿刮取錢是能以相对非侵入性的 方式从口腔粘膜收集大量上皮细胞的塑料工具，其中该塑料工具包含可刮下几 层上皮细胞的锯齿^lti^fBil^^些细胞的凹表面。
23. 权利要求20戶脱的方法，其中在从样品提取RNA之前，将RNA稳 定溶液中刮取的细胞样品保存于-15至-25'C。
24. 权利要求23戶服的方法，其中戶腿RNA稳定溶液是RNALaterRNA稳 定试剂。
25. —种用于检测口腔粘膜上皮细胞样品中目的ia因衰达的方祛，其包括(a) 用权利要求17戶脱的方法，从口腔粘Rh皮细胞分离核酸样品；(b) 将步驟a)中分离的核酸样品^至少一种特异杂交目的耙基因的核 酸探针；和(c) 在核酸样品中检测戶，目的IES因的存在。 . 权利要求24戶做的施，其中臓目的基因在患有肺癌的受微中 ，而不在未患肺癌的^t中，。
26. 权利要求25所述的方法，其中在实施步W))之前，将所述的目的耙 基因附着于固相。
27. 权利要求25所述的方法，其中所述核酸是RNA。
28. 权利要求25戶脱的方法，其中戶;f^核酸是DNA。
29. 包^1l码下列的基因的口,影且.'ABCC1、 ABHD2、 AF333388.1、 AGTPBP1、 AIP1、 AKR1B10AKR1C1、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20o戲、C5orf6、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CED"6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLDN10、 CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1、 CYP2A6、 CYP4F3、 DEFB1、 DIAPH2、 DKFZP434J214、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FU13052、 FUB0521、 FLJ20359、 FM02、 FTH1、 GALNT1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1、 GHTTM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 HIG1、 MST1H2BK、 HN1、 HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1、 IDS、 IMPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC51186、 LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、 ME1、 MGC4342、 MGLL、 MT1E、 MT1F、 MT1G、 MHH、 MT1X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S證、SCP2、 SDR1、 SHARP 1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1、 HAM1、 TJP2、TLE1、 TM4SF1、 TM4SF13、 1MP21、 ，SF13、 TNS、 TRA1、 TRIM16、 TXN、 TXNDC5、 TXNL、 TXNRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463。
30. 包,码下列的基因的口,影且AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDN10、 CYP1B1、 DPYSL3、 FU13052、 FIH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、 ■、 HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMP10、 固F、顧G、顧X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1、 SRPUL、 TALDOl、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRIM16以及 TXNo
31. —种确定个体是否处于,劍市病的增加的危险中的方法，其包括a) 从暴露于气道污染物或处于暴露于气道污^l:险中个体的口腔采集生物样品；和b) 分析权利要求29的口腔转录组基因中的至少一个基因是否出现遗 传变化，其中与对照个体组中至少一个相同基因相比，在口腔转^^且基因的一 个或多个中的遗传变化的存在，可^^个M有^M^市病的增加危险。
32. 权利要求31所述的方法，其中所^t传变皿自基因的DNA甲基化模式偏差和基因的^ii模式偏差。
33. 权利要求32戶腿的方法，其中戶;f^t传变化是基因的敏模式偏差。
34. 权利要求33戶脱的方法，其中戶腐空气污鄉絲自香烟或雪茄的 烟雾，朋湖輪慰轆。
35. 权利要求34戶腿的方法，其中戶細鹏选自腺癌、鳞状细胞癌、小 细胞癌、大细胞癌以刻市良性赘生物。
36. 权利要求34或35戶脱的方法，其中戶;M个体是吸鹏，并JA们检 查至少一y^自口腔转录组基因的基因的表达，其中与自应的吸烟者对照组中相比，在吸烟者中至少一个基因的更低泰逸，是发展劇市癌的危险增加的指
37. 权利要求36戶腿的方法，其中口腔转录组的至少三个基因的更低表 达，是发展湖市癌的危,加的J际。
38. 权利要求34或35戶脱的方法，其中戶脱个体是吸烟者，并且人们检 查至少一4^自口腔转录组基因的基因的泰逸，其中与M应的吸烟者对照组 中相比，在吸烟者中至少一个基因的更高表达，是发展鄉市癌的危险增加的指 示。
39. 权利要求38自的方法，其中选自口腔转录组基因的至少三个基因 的更高鋭，是发展劍轆的危,力啲J际。
40. 权利要求34或35戶服的方法，其中戶; ^个体是吸鹏，并且人们检 査至少一个选自编码原癌基因的口,录组的基因的，，其中与M应的吸 烟者对照组中相比，在吸烟者中至少一个基因的更高，，是发展劍市癌的危 险增加的矛标。
41. 权利要求40所述的方法，其中编码原癌基因的每个口腔转录组中至 少一个基因的更高表达，是，湖鹏的危险增加的指示。
42. 权利要求34或35戶脱的方法，其中0M个体是吸烟者，并且人们检 查至少一个选自编码肿瘤抑制基因的口腔转影且的基因的泰达，其中与M应 的吸烟者对照组中相比，在吸烟者中至少一个基因的更低,，是发展劍巿癌 的危卩魏加的J际。
43. 权利要求42戶，的方法，其中编码肿瘤抑制基因的^口腔转录组 中至少一个基因的更^^达，是^^i市癌的危险增加的^^。
44. —种诊断吸烟者患肺病的素因的方法，其包括在从吸烟者口腔采集的 生物样品中分析一种或多种选自下歹啲基因的表达模式ABCC1、 ABHD2、AF333388.k AGTPBP1、 AIP1、 AKRIBIOAKRICI、 AKR1C2、 AL117536.1、 AL353759、 ALDH3A1、 ANXA3、 APLP2、 ARHE、 ARL1、 ARPC3、 ASM3A、 B4GALT5、 BECN1、 Clorf8、 C20orfUl、 C5orK、 C6orf80、 CA12、 CABYR、 CANX、 CAP1、 CCNG2、 CEACAM5、 CEACAM6、 CEI>6、 CHP、 CHST4、 CKB、 CLD扁、CNK1、 COPB2、 COX5A、 CPNE3、 CRYM、 CSTA、 CTGF、 CYP1B1 、 CYP2A6 、 CYP4F3 、 DEFB1 、 DIAPH2 、 DKFZP434J214 、 DKFZP564K0822、 DKFZP566E144、 DSCR5、 DSG2、 EPAS1、 EPOR、 FKBP1A、 FLJ10134、 FLJ13052、 FU130521 、 FLJ20359、 FM02、 FTH1 、 GALNT1 、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GGA1、 GHITM、 GMDS、 GNE、 GPX2、 GRP58、 GSN、 GSTM3、 GSTM5、 GUK1、 HIG1、 HS丁1H2BK、訓、HPGD、 HRIHFB2122、 HSPA2、 IDH1、 IDS、 MPA2、 ITM2A、 JTB、 KATNB1、 KDELR3、 KIAA0397、 KIAA0905、 KLF4、 KRT14、 KRT15、 LAMP2、 LOC5脳、 LOC57228、 LOC92482、 LOC92689、 LYPLA1、 MAFG、廳、MGC4342、 MGLL、 MT1E、 MT1F、 MT1G、 MT1H、 MT1X、 MT2A、 NCOR2、 NKX3-1、 NQOl、 NUDT4、 ORLl、 P4HB、 PEX14、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 PSMB5、 PSMD14、 PTP4A1、 PTS、 RAB11A、 RAB2、 RAB7、 RAP1GA1、 RNP24、 RPN2、 S100A10、 S100A14、 S100P、 SCP2、 SDR1、 SHARP1、 SLC17A5、 SLC35A3、 SORD、 SPINT2、 SQSTM1、 SRPUL、 SSR4、 TACSTD2、 TALDOl、 TARS、 TCF7L1、 TIAM1、 TJP2、 TLE1、 TM4SF1、 TM4SF13、 TMP21、 TNFSF13、 TNS、 TRA1、 TRIM16、 TON、 TXNDC5、 TXNL、 TOSIRD1、 UBE2J1、 UFD1L、 UGT1A10、 YF13H12以及ZNF463;其中与这些基因^t照个体组的^ii模式 相比， 一种或多种这，因的趋异^i模式是个体患肺病的素因的^t^。
45. —种诊断吸烟者患肺病的素因的方法，其包括在从吸烟者口腔采集的 生物样品中分析一种或多种选自下列的基因的^ii模式AGTPBP1、 AKR1C1、 AKR1C2、 ALDH3A1、 ANXA3、 CA12、 CEACAM6、 CLDNIO、 CYP1B1、 DPYSL3、 FLJ13052、 FTH1、 GALNT3、 GALNT7、 GCLC、 GCLM、 GMDS、 GPX2、蘭、HSPA2、 MAFG、 ME1、 MGLL、 MMP10、固F、固G、 MT1X、 NQOl、 NUDT4、 PGD、 PRDX1、 PRDX4、 RAB11A、 S100A10、 SDR1、 SRPUL、 TALDOl 、 TARS、 TCF-3、 TRA1、 TRM16以及TXN;其中与这些基因^1" 照个体组的，模式相比， 一种或多种这些基因的趋异^ii模式是个体患肺病的素因的，^。
46. —种诊断不吸烟者患肺病的素因的方法，其包括抓不吸烟者口腔采 集的生物样品中分ITO自异常基因的一种或多种基因的表达模式，其中与不发 展^W癌的那些吸烟者相比，异常基因定义为那些在发展劍市癌的吸烟者亚群 中趋异，的基因，其中与这,因，照个体组的表达M相比， 一种或多种的这，因的趋异^i模^h体患肺病的素因的指示。
47. 权利要求45或46所述的方袪，其中所淑市病慰市癌。
48. 权利要求47戶脱的方法，其中戶;f^M癌选自腺癌、鳞状细胞癌、小 细胞癌、大细自以 良性赘生物。
49. 权利要求3M8任一项戶脱的方法，其中戶腿生,品是核酸样品。
50. 权利要求49戶脱的方法，其中戶;M核酸是RNA或DNA。
51. 权利要求50所述的方法，其中用核酸阵列实施分析。
52. 权利要求50所述的方法，其中用定量实时PCR自谱法实施分析o
全文摘要
本发明涉及用于收集生物样品的刮取装置，和涉及用该刮取装置获得来自口腔粘膜上皮细胞的核酸的非侵入性方法。所述的核酸可用于例如基因表达谱分析，包括评价与气道污染物相关的肺病危险。
文档编号A61B10/02GK101420907SQ200480040286
公开日2009年4月29日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月12日
发明者A·斯皮拉, J·S·布罗迪 申请人:波士顿大学信托人