专利名称：用于基因转移的病毒包膜载体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种用于体外和体内基因转移的安全、高效载体。具体地，本发明涉及通过使用病毒或灭活的病毒，尤其灭活的HVJ(仙台病毒)所制备的基因转移载体。而且，本发明所述基因转移载体还可用于基因治疗和大规模(high throughput)筛查。
背景技术：
现已开发了多种旨在用于基因治疗的病毒性和非病毒性(合成的)基因转移方法(Mulligan，科学，260，926-932(1993)和Ledley，人类基因治疗，第6卷，1129-1144(1995))。一般而言，病毒方法比非病毒方法能更有效地将基因转移至细胞中。但病毒载体由于同时引入了亲代病毒的基本基因元件，以及病毒基因的渗漏表达，免疫原性，和对宿主基因组结构的修饰，使得它存在安全性方面的考虑。非病毒载体一般具有较少的细胞毒活性和较小的免疫原性。但大多数非病毒方法的基因转移效率(尤其在体内)低于某些病毒载体。
因此，病毒载体和非病毒载体都既有限制又有优点。因此必须开发体内应用的高效、低毒性基因转移载体，以便弥补其中一类载体系统的限制又具有另一类系统的优点。
另一方面，HVJ具有较高免疫原性，且已知可诱导CTL，特别是当产生大量NP蛋白时(Cole，G.A.等，免疫学杂志158，4301-4309(1997))。也有人担心宿主的蛋白质合成可能被抑制。
HVJ还有一个问题，当使病毒融合蛋白经离心或柱操作而纯化以便在脂质膜上重建时，所产生的颗粒可能由于重建而失去病毒的其它蛋白(主要是M蛋白)，从而使要求融合活性的F1与HN蛋白间的比率不能维持在与野生型病毒相同的水平，导致较低融合活性。此外，由于融合蛋白在重建时插入脂质膜的方向不必与在野生型中一样，故可提呈某些未知抗原。
另有人报道了一种通过添加新的分子而实施重建的方法(Uchida，T.等，细胞生物学杂志80，10-20，1979)。但该方法存在失去原有病毒功能的高度危险，因为合成颗粒的膜组分本质上不同于天然病毒颗粒的膜组分。
涉及将基因或蛋白包入脂质体并将其与灭活的HVJ融合而产生融合颗粒(如在传统HVJ-脂质体中一样)的方法已能将非侵袭性或非毒性基因转移至培养的细胞或体内组织中。该项技术在世界各地频繁用于动物试验中(Dzau，V.J.等，美国国家科学院学报，93，11421-11425(1996)和Kaneda，Y.等，今日分子医学，5，298-303(1999))。但已有人发现该项技术的缺陷例如，由于须制备两种不同载体，即病毒和脂质体，该方法可能比较复杂；由于与脂质体融合而致使平均直径比病毒颗粒大1.3倍的那些颗粒，它们的融合活性为病毒的10％或更低。
此外，就某些组织而言，基于传统HVJ的载体可能不能获得任何基因转移，或如果可以，效率也极低。这表明，根据传统方法可用于基因治疗的组织很有限。
有需要开发一种用于人类基因治疗的病毒性载体，其可安全、高效、并简单地制备，还能将基因转移至广泛多种体内组织中。
因此，本发明的一个目标是开发一种安全、高效、且简单的基于病毒的基因转移载体，其可应用于广泛多种培养细胞或体内组织，它克服了传统重建型HVJ载体方法或HVJ-脂质体方法的缺点。
发明公开在本发明的一个方面中，提供一种安全、高效的利用灭活病毒的基因转移载体。灭活病毒(其中病毒的基因组已被灭活)不能复制病毒蛋白，因此比较安全并具有低细胞毒性和低抗原性。通过将基因包入病毒包膜载体这种利用灭活病毒的基因转移载体，可制备一种安全、高效、且简单的用于培养细胞或体内组织的基因转移载体。
在本发明另一方面中，提供一种能将基因转移至很多种体内组织中的病毒包膜载体。在一个实施方案中，所用病毒是HVJ。可利用本发明之病毒包膜载体获得体内基因转移的组织的实例有，但不限于肝脏、骨胳肌、子宫、脑、眼、颈动脉、皮肤、血管、肺、心脏、肾脏、脾脏、癌组织、神经、B淋巴细胞、以及呼吸道组织。
在本发明另一方面中，提供简单实现(realizing)向悬浮细胞的基因转移的方法。利用本发明病毒包膜载体向悬浮细胞实施基因转移的优选方法实例包括，在有硫酸鱼精蛋白的条件下使悬浮细胞与病毒包膜载体混合，并使混合物离心的基因转移方法。
在本发明另一方面中，通过利用本发明的能在短时间内包容大量基因的基因转移载体实现向培养细胞和体内组织中高效且快速的基因转移。因此，在本发明另一方面中，利用本发明基因转移载体建立对基因组的高流通量、快速质量分析系统。
在本发明另一方面中，基因转移载体可长期以冷冻状态贮存于-20℃。例如，可将该基因转移载体以冷冻状态密封、贮存、并运输。
本发明另一方面提供一种基因转移载体，其对优选70％或更多的细胞，更优选80％或更多的细胞，还更优选对90％或更多的细胞，最优选对95％或更多的细胞具有体外基因转移活性。
本发明一个特定方面提供一种基因转移载体，当灭活病毒制备成功的2个月后，产生病毒包膜载体作为基因转移载体时，可维持基因转移活性的60％或更多，优选70％或更多，更优选80％或更多，最优选90％或更多。
本发明另一方面提供一种基因转移载体，当体内局部给与时，其对优选30％或更多的组织中细胞，更优选40％或更多的组织中细胞，还更优选50％或更多的组织中细胞，最优选60％或更多的组织中细胞具有基因转移活性。
本发明的一方面提供一种含有灭活病毒的包膜的基因转移载体。
本发明的一方面中，用于制备基因转移载体的病毒可以是野生型病毒或重组型病毒。
本发明又一方面中，所用病毒属于逆转录病毒科(Retroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、以及嗜肝DNA病毒科(Hepdnaviridae)。本发明一个具体方面中，所用病毒为HVJ。在本发明另一方面中，用Hasan，M.K.等(普通病毒学杂志，78，2813-2820(1997))或Yonemitsu，Y.等(自然生物技术学(Nature Biotechnology)18，970-973(2000))所述重组仙台病毒制备基因转移载体。
本发明另一方面提供能向动物体内组织实施基因转移的基因转移载体。
在制备本发明基因转移载体的方法中，不必灭活病毒。因此，本发明一个方面中，可在不进行灭活病毒的步骤的前提下，利用含以下步骤的方法制备基因转移载体1)使病毒与外源基因混合，和2)冻融该混合物，或进一步使该混合物与一种表面活性剂混合。
本发明另一方面提供用于基因转移的灭活型病毒包膜载体的制备方法，该方法包括以下步骤灭活病毒，使该灭活的病毒与外源基因混合，和冻融该混合物。
本发明又一方面提供用于基因转移的灭活型病毒包膜载体的制备方法，该方法包括以下步骤灭活病毒，和使该灭活的病毒与外源基因在有表面活性剂存在的情况下混合。
在本发明另一方面中，所用表面活性剂选自辛基葡糖苷、Triton-X100、CHAPS和NP-40。
本发明一个具体方面提供制备灭活型病毒包膜载体的方法，该方法还包括在外源基因与灭活病毒的包膜混合之前，向外源基因中添加硫酸鱼精蛋白的步骤。
本发明另一方面提供将基因导入分离的动物组织中的方法，该方法包括以下步骤制备含所需基因的基因转移载体，和通过基因转移载体将基因导入动物组织。
本发明另一方面提供将外源基因导入悬浮细胞的方法，该方法包括以下步骤使悬浮细胞与基因转移载体在有硫酸鱼精蛋白存在的情况下混合，和离心该混合物。
本发明还有一方面提供含本发明基因转移载体的用于基因治疗的药用组合物。
图1显示，多次冻融HVJ包膜载体并转染培养的细胞后，外源基因(萤光素酶基因)表达水平(萤光素酶活性)的测量结果。
图2显示，当培养的细胞被转染后，萤光素酶活性的测量结果，确保使用相同数量的病毒来制备添加至培养的细胞中的HVJ包膜载体。
图3显示，当HVJ包膜载体中使用各种量的外源基因(萤光素酶表达载体)时，萤光素酶活性的测量结果。
图4显示，当使用各类缓冲液制备HVJ包膜载体时，萤光素酶活性的测量结果。
图5显示用传统基因转移载体、灭活型HVJ-脂质体以及本发明的方法进行基因转移的结果比较。
图6图示利用表面活性剂的情况下，制备灭活的HVJ包膜载体的方法。
图7示用表面活性剂制备的HVJ包膜载体中所含蛋白的SDS-PAGE模式。
图8是HVJ包膜载体的显微电镜负染图，其显示(1)未处理的HVJ；(2)不含DNA但接受了辛基葡糖苷处理的HVJ；和(3)含DNA并接受了辛基葡糖苷处理的HVJ。
图9A-9C显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取自辛基葡糖苷的不同浓度；辛基葡糖苷对HVJ的不同处理时间；是否进行超声(声)处理；以及所用载体的不同大小，如图所示。
图10A和10B显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取自硫酸鱼精蛋白(PS)的如图所示不同浓度和不同转染时间。
图11A和11B显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取自图示的不同DNA量(实验中所用量)，以及不同贮存温度。
图12显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取自用各种HAU滴度的HVJ制备HVJ包膜载体并将其用于基因转移的情况，如图所示。
图13A显示如图所示的不同UV辐射量下，以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力。
图13B显示以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取自图中所示的不同β-丙醇酸内酯(BPL)浓度。
图14显示对人的舌上扁平上皮癌(SAS)的以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取自图中硫酸鱼精蛋白的不同浓度和转染保温的不同时间。
图15显示对人的主动脉内皮细胞(HAEC)的以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性取自图中硫酸鱼精蛋白的不同浓度和转染保温的不同时间。
图16A显示对小鼠肝脏的以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性通过利用本发明的HVJ包膜载体或HVJ-AVE(人工病毒包膜)脂质体获得。
图16B显示对小鼠子宫的以萤光素酶活性水平表示的基因转移效力，所述酶活性通过利用本发明的HVJ包膜载体或HVJ-AVE(人工病毒包膜)脂质体获得。
图16C显示用本发明的HVJ包膜载体向小鼠子宫实施pEB-CMV-LacZ基因转移后，对子宫组织的LacZ染色结果。通过LacZ染色可见，LacZ基因的表达主要在子宫内膜的腺上皮中。
图16D显示，将含有pEGFP-1(10,000 HAU)的HVJ包膜载体经小脑延髓池或经颈动脉给药至SD大鼠(雄性，体重300-400g)的结果。给药的3-4天后，处死大鼠，制备活组织切片(live section)，在荧光显微镜下进行观察。
①经小脑延髓池给药经证实基因已导入脑表面。另一方面又证实没有向脑的深部进行基因转移。还证实，没有向脉络丛中进行基因转移。
②，③经颈动脉给药在左侧(即给药处)证实有显著高表达。在脑内表面部分、基底核部、以及另一脑的脑表面均证实有表达。在另一脑的脑表面的表达被认为已通过侧流(collateral)传(flow)向另一侧。
图16E显示pCMV-NK4对VEGF-诱导型血管生成的剂量依赖性抑制作用，所述载体能表达一种HGF突变体，该突变体可抑制HGF的功能。
图16F显示通过向气管注射HVJ包膜载体而实施的基因转移的结果。
图17A和17B显示将寡核苷酸导入细胞后，第二天在荧光显微镜下观察到的细胞荧光结果。保温10分钟后获得约10％的寡核苷酸导入效力(图17B)，而保温60分钟后寡核苷酸已导入80％或更多的细胞中(图17A)。
图18显示在人的白血病细胞系CCRF-CEM，NALM-6，和K-562中的导入实验的结果。
当使用脂质体或存在脂质体试剂(Gibco BRL的Lipofectamine、lipofectin等)时，这些细胞系(尤其CCRF-CEM和NALM-6)显示极低的导入效力。
加入600-1,000μg/ml硫酸鱼精蛋白，于20℃以10,000rpm或15,000rpm离心10分钟，即可获得高萤光素酶活性。未观察到与HVJ包膜载体相关的显著细胞毒活性。硫酸鱼精蛋白的离心和添加是基因转移所必需的。
图19显示癌组织的基因转移结果。在癌组织的肿瘤实体中观察到基因表达。尤其，用500μg/ml硫酸鱼精蛋白获得了较高的基因转移活性。另一方面，在较低硫酸鱼精蛋白浓度下未检测到基因表达。
图20显示用疱疹病毒包膜载体将基因转移至细胞的结果。尽管总萤光素酶活性低，但已确定，用Triton-X10处理5分钟可获得具有最高导入效力的载体。一种未利用硫酸鱼精蛋白的制备方法具有高导入效力。所有样品经形态学观察均未见任何细胞毒性。
图21显示用贮存于-80℃的疱疹病毒包膜载体将基因转移至细胞的结果。用添加了10％血清的培养基所获导入效力高于用无血清培养基所获。用200μl载体溶液(估计量2.8×107病毒颗粒/孔)所获基因转移活性高于用100μl载体溶液(估计量1.4×107病毒颗粒/孔)所获。
实施本发明的最佳模式(定义)本文中“基因转移”指将天然、合成、或重组的所需基因或基因片段(体外或体内)导入靶细胞，其导入方式可使所导入的基因维持其功能。本发明将被导入的基因或基因片段包括DNA、RNA、或任何核酸(DNA或RNA的具有特定序列的合成类似物)。本说明书中，术语“基因转移”、和“转染”可互换使用。
本文中“基因转移载体”、“基因载体”或“病毒包膜载体”指通过在病毒包膜中包含外源基因而获得的载体。用于制备基因转移载体的病毒可以是野生型病毒或重组型病毒。
本发明的一个方面中，所用病毒属于逆转录病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、杆状病毒科、以及嗜肝DNA病毒科。本发明一个具体方面中，所用病毒为HVJ。
本文中“基因转移活性”指载体的“基因转移”活性，其可利用所导入的基因的功能(如果是表达载体，则是所编码蛋白的表达和/或该蛋白的活性等)作为指标来检测。
本文中“灭活的”用于指基因组已被灭活的病毒。灭活病毒具有复制缺陷。优选，灭活可通过UV处理或用烷基化试剂处理来获得。
本文中“外源基因”指包含在基因转移载体中的任何核酸序列，但该核酸序列并非病毒来源。本发明的一个方面中，将外源基因可操作连接至使被基因转移载体导入的基因能表达的适当调节序列(如转录所必需的启动子、增强子、终止子、poly A加尾信号，以及翻译所必需的核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等)。本发明另一方面中，外源基因不包括用于该外源基因表达的任何调节序列。本发明还一方面中，外源基因为寡核苷酸或诱骗(decoy)核酸。
包含在基因转移载体中的外源基因主要是DNA或RNA核酸分子，但所导入的核酸分子可包括核酸类似物分子。基因转移载体中所含分子种类可以是一种，也可以是多种不同基因分子。
本文中“基因文库”指含有自然界分离的或人工合成的核酸序列的核酸文库。核酸序列的自然来源包括真核生物、原核生物、或病毒的基因组序列或cDNA序列，但不限于此。通过向自然界分离的序列中加入任意序列(如信号或标记)而获得的文库也包括在本发明的基因文库中。在一个实施方案中，基因文库包含诸如导致其中所含核酸序列转录和/或翻译的启动子等序列。
本文中，“HVJ”和“仙台病毒”可互换使用。
本文中，“HAU”指可凝集鸡红细胞的0.5％的病毒活性水平。一个HAU相当于约24,000,000个病毒颗粒(Okada，Y.等，Biken Journal 4，209-213，1961)。
(基因治疗)治疗性核酸构建物可利用本发明的基因转移载体而局部或全身性给药。当这类核酸构建物包括蛋白的编码序列时，该蛋白的表达可利用内源性哺乳动物启动子或外源启动子诱导。编码序列的表达可以是组成型的或可以调节。
当本发明的基因转移载体被作为基因治疗的组合物使用时，本发明载体的给与，可通过将载体的PBS(磷酸盐缓冲液)、盐水等悬浮液直接注射至局部位点(如癌组织内部、肝内、肌肉内和脑内)，或经由其脉管(如动脉内、静脉内或门静脉内)给与。
在一个实施方案中，基因转移载体通常是将单位注射剂型(溶液、悬浮液、或乳液)的基因转移载体与可药用载体(即在所用剂量和浓度下对受体无毒性且能与制剂中其它成分相容的物质)混合而配制成。例如，制剂优选不包括氧化剂以及已知对基因转移载体有害的其它化合物。
可药用载体最好包含少量添加剂如增强渗透性和化学稳定性的物质。这些物质在所用剂量和浓度下对受体无毒性，且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸、及其它有机酸或它们的盐；抗氧化剂如抗坏血酸；小分子多肽(约不到10个残基)，如多聚精氨酸或三肽；蛋白质(如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(如聚乙烯吡硌烷酮)；氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸)；单糖、二糖、及其它碳水化合物(包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精)；螯合剂(如EDTA)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；反离子(如钠)；和/或非离子表面活性剂(如聚山梨酯(polysorbate)或聚羟亚烃(polyxamer))，或PEG。
含基因转移载体的药用组合物通常以水溶液形式保存在单剂型或多剂型的容器，如密封的安瓿瓶或小瓶中。
本发明还提供一种药剂包装或试剂盒，其包括一或多个容器，其中装载本发明药用组合物的一或多种成分。此外，本发明的多肽可与其它治疗性化合物一起使用。
含有本发明基因转移载体的药用组合物可根据医疗实践进行配制和用量，应考虑患者个人的临床状况(如需预防或治疗的状况)、含基因转移载体的组合物的运送位点、靶组织、给药方法、给药时间表、以及本领域技术人员已知的其它因素。因此，本说明书中描述的基因转移载体的“有效量”或适当剂量可根据上述考虑而定。
例如，将本发明的基因转移载体给药至小鼠时，每只小鼠可给与相当于20-20,000 HAU、优选60-60,000 HAU、更优选200-2,000 HAU的基因载体。所给与的基因载体中外源基因的含量为0.1-100μg，优选0.3-30μg，更优选1-10μg/小鼠。
如果将本发明的基因载体给药至人，每人可给与相当于400-400,000HAU、优选1,200-120,000 HAU、更优选4,000-40,000 HAU的基因载体。所给与的基因载体中外源基因的含量为2-2,000μg，优选6-600μg，更优选20-200μg/人。
以下实施例旨在举例说明本发明，并非限制。
实施例1.基因转移载体的利用冻融法的制备，以及其应用(实施例1利用冻融法制备HVJ包膜载体)用萤光素酶基因作为外源基因。将重组HVJ病毒冻融多次后，将该基因导入培养的细胞中。
将500μl TE、750μg萤光素酶表达载体pcOriPLuc(Saeki和Kaneda等，人类基因治疗，11，471-479(2000))与各种浓度的HVJ病毒混合。将HVJ病毒的浓度调整至10、25、50、或100 HAU/μl。将该溶液分为12等份，每份均保存在4℃，用干冰冷冻然后解冻；如此重复最多达30次。将已冻融了指定次数的溶液加入BHK-21细胞中(24孔板，4×104细胞/板，0.5mlDMEM，10％FCS)。使细胞与5％CO2在37℃反应20分钟后，细胞用PBS洗涤，然后再加入0.5ml培养液，培养24小时。
除去培养基。向细胞中加入500μl 1×细胞培养物裂解试剂(Promega)以裂解细胞，将该溶液置于微量离心管中，离心。用Promega萤光素酶分析系统和Lumat LB9501发光仪(Luminophotometer)测定20μl所得上清的萤光素酶活性。每种溶液测三次，取平均值。
结果见图1。萤光素酶活性随着重组HVJ病毒冻融次数的增加而增加。冻融20次时的萤光素酶表达10倍或更多倍于冻融三次的观察结果。这些结果证实，在本实施例所用条件下，重组HVJ病毒的冻融次数优选为5次以上，更优选约15-约20次。
(实施例2经冻融制备的HVJ包膜载体的基因转移效力)将类似于实施例1所用的重组HVJ病毒冻融30次后，在确保将相同量病毒加入到宿主细胞的前提下，检查向细胞内转移基因的效力。
结果见图2。图2中，在X轴的500 HAU处，具有10 HAU/μl病毒浓度的溶液的加入量为50μl，而100 HAU/μl溶液的加入量为5μl。如图2所示，具有100 HAU/μl病毒浓度的溶液的基因表达效力与具有10-50HAU/μl病毒浓度的溶液相比减少约50％。该结果表明，在本实施例的条件下，重组病毒的浓度优选为10-50 HAU/μl。
此外，将重组HVJ病毒冻融29次后，第30次实施冷冻，然后将该HVJ病毒溶液以此冷冻状态保存一周，然后冻融，加至细胞中。结果，在冷冻状态下保存了一周的重组HVJ病毒也显示与经受了连续30次冻融的病毒相同的萤光素酶基因表达水平。
(实施例3测定用萤光素酶表达基因进行的基因转移效力)利用不同量的萤光素酶表达载体制备HVJ包膜载体，检查向宿主细胞的基因转移效力。
HVJ病毒的量为50 HAU/μl TE。萤光素酶表达载体pcOriPLus的量为0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，或5.5μg/μl TE。冻融20次，将所述溶液的终体积调整至100μl，然后用如实施例1所述相同的方法测定萤光素酶活性。
结果见图3。以表达载体pcOriPLuc(约9.5kb)为外源基因，随着它的添加，其表达量以剂量依赖的方式增加，直至添加量达1.5μg；随后，表达量几乎不再有变化。该结果证实，在本实施例的条件下，优选用1.5μg/μl或更多的外源基因DNA进行基因转移。
(实施例4缓冲液类型对基因转移效力的影响)用不同类型的缓冲液制备HVJ包膜载体，检查向宿主细胞实施基因转移的效力。
HVJ病毒的量为50 HAU/μl缓冲液。萤光素酶表达载体pcOriPLuc的量为15μg/μl。所用缓冲液为TE、PBS、或BSS(137mM NaCl，5.4mM KCl，10mM Tris-HCl，pH7.5)、或向这些缓冲液中添加蔗糖至终浓度为0mM，20mM，40mM，或60mM。冻融20次，将所述溶液的终体积调整至100μl，然后用如实施例1所述相同的方法测定萤光素酶活性。
结果见图4，其证实，在本实施例的条件下，优选只使用TE作为制备重组HVJ病毒的缓冲液。
(实施例5AVE(人工病毒包膜)型载体和本发明之HVJ包膜载体的比较)利用灭活的HVJ脂质体(具有最佳基因转移效力的AVE型(Saeki，Y.等，人类基因治疗，8，2133-2141(1997)))这种传统基因转移载体进行的基因转移，与本发明的基因转移方法进行比较。
HVJ脂质体或HVJ病毒的量为50 HAU/μl TE，萤光素酶表达载体pcOriPLuc的量为1.5μg/μl。重组HVJ病毒的冻融次数为2次或15次。其它条件与实施例1中的相同，不同的是用人胚肾细胞系HEK293作为宿主细胞。
结果见图5。其证实，本发明中将HVJ包膜载体重复冻融15次的方法比用HVJ脂质体进行的传统基因转移方法的基因转移效力高很多。
(实施例6合成寡核苷酸的导入效力)将已用FITC(异硫氰酸荧光素)标记的合成寡核苷酸(20bp)以1mg/ml的浓度与灭活的HVJ病毒混合。将该溶液冻融20次后，使之与BHK-21细胞反应20分钟。17小时后观察荧光信号。结果，几乎在100％的细胞的细胞核中观察到荧光信号。该结果表明，本发明的方法也可有效用于将合成的核酸导入细胞。
(实施例7GFP基因的导入效力)将GFP(绿色荧光蛋白)基因与灭活的HVJ病毒的混合溶液冻融20次后，将2ng-5μl该混合液注射至大鼠大脑。结果在注射部位观察到荧光信号。此外，将利用了GFP基因的HVJ包膜载体冻存3个月，然后注射至大鼠大脑。同样，在注射部位观察到因GFP基因表达而产生的荧光信号。
以上结果表明，本发明的方法确实能实现基因的体内转移。此外，还证实HVJ包膜载体的冷冻保存是可能的。
2.基因转移载体的利用表面活性剂的制备，以及其应用(实施例8利用表面活性剂制备灭活的HVJ包膜载体)利用表面活性剂制备灭活的HVJ包膜载体的方法图示于图6。
(1HVJ的培养)
通常可将HVJ种子病毒接种在受精的鸡胚中以便进行培养。但也可利用培养的细胞(如猴或人)或持续感染系统(即一种培养液，其中已将一种水解酶如胰蛋白酶添加至培养的组织中)培养HVJ，或通过以克隆化病毒基因组感染培养的细胞，导致持续感染，而培养HVJ。
在本实施例中，HVJ如下培养。
利用SPF(不含特异性病原体的)受精卵培养HVJ种子病毒。将分离并纯化的HVJ(Z种)分配至保存细胞的试管中，添加10％DMSO后保存于液氮中。
取刚刚完成受精的鸡卵，将其置于培养箱(SHOWA-FURANKI P-03型；能容纳约300个受精卵)中，在36.5℃和40％以上湿度的环境下培养10-14天。在暗室中，用检卵器(其中将来自灯泡的光线引导穿过一个直径约1.5cm的窗口)证实胚的活力以及气室和绒毛尿囊膜的位置。用铅笔标出绒毛尿囊膜上方约5mm处的病毒注入部位(选择该部位应避开任何厚血管)。将种子病毒(其取自液氮)用多聚蛋白胨溶液(其中将1％多聚蛋白胨与0.2％NaCl混合，用1M NaOH调节至pH7.2，然后经高压灭菌，保存在4℃)稀释500倍，并于4℃静置。鸡胚用IsodineTM和乙醇消毒。用锥子(pick)在病毒注射部位制造一个小洞。用1ml的注射针(26号)将0.1ml稀释的种子病毒液注入绒毛尿囊腔。用Pasteur移液管以Molten石蜡(熔点50-52℃)封闭洞口。将受精卵置于培养箱中，在36.5℃和40％以上湿度的环境下培养3天。然后，将已接种的受精卵于4℃静置过夜。第二天，用小镊子打开气室，将带有18号针头的10ml注射器深入绒毛尿囊膜中以吸取尿囊液，将其收集在无菌小瓶中，4℃保存。
(2HVJ的纯化)HVJ可通过利用离心进行纯化的方法，利用层析柱进行纯化的方法，或领域内已知的任何其它方法来纯化。
(2.1通过离心进行纯化的方法)简单说，收集含病毒的溶液，低速离心以除去该培养液以及绒毛尿囊液中的组织或细胞碎片。其上清利用蔗糖密度梯度(30-60％w/v)经高速离心(27,500×g，30分钟)和超速离心(62,800×g，90分钟)来纯化。纯化期间尽可能温和地处理病毒，将病毒4℃保存。
具体在本实施例中，HVJ用如下方法纯化。
将约100ml含HVJ的绒毛尿囊液(取自含HVJ的鸡胚，收集并保存于4℃)用Komagome型广口移液管装入两个50ml离心管中(见Saeki，Y.和Kaneda，Y用于运送基因、寡核苷酸和蛋白质的蛋白质修饰型脂质体(HVJ-脂质体)。细胞生物学实验室手册(第二版)，J.E.Celis编(Academic Press Inc.，San Diego)，第四卷，127-135页，1998)，于4℃以3000rpm低速离心10分钟(关闭制动闸(brake))。以此除去鸡胚中的组织碎片。
离心后，将上清转移至4个35ml离心管(高速离心型)，用角度转子以27,000g离心30分钟(加速器和制动闸均打开)。除去上清，沉淀中加入BSS(10mM Tris-HCl(pH7.5)，137mM NaCl，5.4mM KCl；高压灭菌，4℃保存)约5ml/管，4℃静置过夜。用Komagome型广口移液管轻轻吹打沉淀并转移至一个试管中，用角度转子以27,000g类似地离心30分钟。除去上清，沉淀中加入约10ml BSS，4℃静置过夜。用Komagome型广口移液管轻轻吹打沉淀，4℃以3000rpm低速离心10分钟(制动闸关闭)，从而除去尚未彻底除去的组织碎片和病毒凝集块。将上清转移至新的无菌试管中，4℃保存，作为纯化的病毒备用。
将0.9ml BSS加入0.1ml该病毒液中，用分光光度计测定540nm处的吸收值。将病毒滴度转换为红细胞凝集活性(HAU)。540nm处的吸收值为1约相当于15,000 HAU。据认为，HAU与融合活性基本成正比。此外，红细胞凝集活性可利用含鸡红细胞(0.5％)的溶液进行真实地测定(见“动物细胞操作实用手册”)，REALIZE公司(内田，大石，古沢编)，259-268，1984)。
此外，必要时可利用蔗糖密度梯度纯化HVJ。具体是，将病毒悬浮液转移至已将60％和30％的蔗糖溶液(已高压灭菌)分层的离心管中，以62,800×g密度梯度离心120分钟。离心后，回收60％蔗糖溶液中所发现的一条带。将所回收的病毒悬浮液于4℃对BSS或PBS溶液透析过夜，以除去蔗糖。如果不必立即使用该病毒悬浮液，可加入甘油(已高压灭菌)和0.5M EDTA(已高压灭菌)至终浓度分别为10％和2-10mM，温和冻存于-80℃，并最终冻存于液氮(该冻存可用10mM DMSO代替甘油和0.5M EDTA溶液)中。
(2.2利用层析柱和超过滤进行纯化的方法)利用层析柱进行HVJ纯化的方法也可取代通过离心进行纯化的方法而应用于本发明。
简单说，利用截留分子量为50,000的超滤膜进行浓缩(约10倍)和通过离子交换层析(0.3M-1M NaCl)进行洗脱均可达到纯化的目的。
具体在本实施例中，用以下方法层析纯化HVJ。
收集绒毛尿囊液，经滤膜(80μm-10μm)过滤。将0.006-0.008％BPL(终浓度)加至绒毛尿囊液中(4℃，1小时)，以灭活HVJ。将绒毛尿囊液于37℃保温2小时以灭活BPL。
用500 KMWCO(A/G Technology，Needham，Massachusetts)经切向流超滤法浓缩约10倍。所用缓冲液为50mM NaCl，1mM MgCl2，2％甘露醇，以及20mM Tris(pH7.5)。HAU分析表明，HVJ产量接近100％。故，获得了极好的结果。
用Q Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech KK，Tokyo)经柱层析纯化法(缓冲液20mM Tris HCl(pH7.5)，0.2-1M NaCl)可纯化HVJ。产量为40-50％，纯度为99％或更高。
用500 KMWCO(A/G Technology)经切向流超滤法浓缩HVJ级分。
(3HVJ的灭活)如果必须灭活HVJ，可如下通过UV光辐射或烷基化试剂处理而实施。
(3.1UV光辐射法)将1ml HVJ悬浮液置于一个直径30mm的平皿中，接受99或198mJ/cm2的辐射。也可使用γ射线辐射(5-20Gy)，但它不能彻底灭活。
(3.2用烷基化试剂进行处理)使用前，在10mM KH2PO中制备0.01％β-丙醇酸内酯。制备期间将该溶液保持在4℃，操作应快速完成。
将β-丙醇酸内酯加入刚刚完成纯化的HVJ悬浮液中至终浓度为0.01％，于冰上静置60分钟。然后于37℃将该混合物保温2小时，再分配至Eppendorf管(10,000 HAU/管)，以15,000rpm离心15分钟。沉淀物-20℃保存。不用上述灭活法，无需将沉淀物在-20℃保存，可经表面活性剂处理掺入DNA，从而构建一个载体。
(4HVJ包膜载体的构建)将含有200-800μg外源DNA的92μl溶液加入保存的HVJ中，吹打使之充分悬浮。将该溶液于-20℃保存至少3个月。DNA在与HVJ混合前加入硫酸鱼精蛋白可将表达效力增强2倍或更多倍。
将所述混合物于冰上静置1分钟，加入8μl辛基葡糖苷(10％)。使该试管在冰上振动15秒，冰上静置45秒。用表面活性剂进行处理的时间优选为1-5分钟。也可用Triton-X00(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、CHAPS(3-[(3-氯酰氨基丙基)-二甲基氨]-1-丙烷磺酸)(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)、或NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)等表面活性剂代替辛基葡糖苷。Triton-X100，NP-40和CHAPS的终浓度分别优选为0.24-0.80％、0.04-0.12％、和1.2-2.0％。
加入1ml冷BSS，迅速将该溶液以15,000rpm离心15分钟。在所得沉淀中加入300μl PBS或盐水等，经涡旋或吹打使沉淀悬浮。可将该悬浮液直接用于基因转移或可在-20℃保存后用于基因转移。保存至少2个月后，该HVJ包膜载体维持了同样的基因转移效力。
(实施例9HVJ包膜载体中F1蛋白与HN蛋白之比)(1样品制备)(i)将相当于10,000 HAU的纯化HVJ以15,000rpm离心15分钟，将沉淀悬浮于300μl PBS中，-20℃保存。
(ii)用紫外线(198mJ/cm2)对相当于10,000 HAU的纯化HVJ进行辐射，然后以15,000rpm离心15分钟，使沉淀悬浮于300μl PBS中，-20℃保存。
(iii)用紫外线(198mJ/cm2)对相当于10,000 HAU的纯化HVJ进行辐射，然后以15,000rpm离心15分钟。向沉淀中加入200μl pcLuci DNA(溶液92μl)，通过吹打来悬浮。将悬浮液置于冰上，加入8μl辛基葡糖苷(10％)。用手将试管振动15秒，于冰上静置45秒。加入1ml冷BSS，迅速以15,000rpm离心15分钟。此后，使沉淀悬浮于300μl PBS中，-20℃保存。
(2蛋白质电泳)将×5 Laemli样品缓冲液加入三种样品(5，10，20μl)中，进行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，凝胶用考马斯亮蓝染色。脱色后，将凝胶贴在玻璃纸(cellophane)上，风干。
(3蛋白质鉴定)将已电泳并染色的样品插入LAS2000(富士胶卷，东京)(图7)，测定对应于F1和HN的蛋白质带的浓度。对每种样品的三种不同量进行电泳。计算各自的F1/HN密度，并计算每份样品的平均值和标准差。
(4结果)样品(i)、(ii)和(iii)的F1/HN保持在约1.7。考虑到F1(51kD)和HN(68kDa)的分子量，分子比应为2.3。这与报道(实验细胞研究，142，95-101，1985)一致，该报道中，F1/HN值约为2时，F1和HN所重构的脂质体具有最佳融合。在其他研究者所报道的重构类型中，该比例不同于野生型病毒的(病毒学杂志，67，3312-3318，1993)。其它蛋白组合物在HVJ和HVJ包膜载体之间也基本相同。
(实施例10DNA向HVJ包膜载体中的包裹以及包裹率)(1HVJ包膜载体的电子显微镜显像)(其中的DNA被包膜包裹或未被包膜包裹)如上述，将130μg pSFV-LacZ(14.5kb)包入10,000 HAU的HVJ(已用紫外线灭活)中，并制备HVJ包膜载体。
将已包入的HVJ包膜载体悬浮于300μl PBS中，-20℃保存。10天后，将1μl该悬浮液置于栅格(grid)中，负染后用电子显微镜进行观察。用未包裹DNA的HVJ包膜载体作对照。
(结果)结果见图8。大多数HVJ包膜载体具有基本相同于HVJ病毒本身所具有的外膜构象。与未包入DNA的HVJ包膜载体相比，在应用了DNA的HVJ包膜载体中可观察到一种高电子密度结构。另一方面，所述未包裹的HVJ包膜载体具有较高的内部透光率，据此可推论病毒基因组已被破坏或丢失。
(2HVJ包膜载体中的DNA包裹率)将157μg pcLuci(7.4kb)以上述方式包裹至6,700 HAU的HVJ(UV灭活型)中，从而制备HVJ包膜载体。将该HVJ包膜载体悬浮于300μl BSS中，用15个单位的微球菌(Micrococcal)核酸酶、2mM CaCl2、以及20μg/ml RNA酶A于20℃处理30分钟，对1L PBS透析(4℃，过夜)。将HVJ包膜载体用1％SDS于37℃处理1分钟，再用500μl苯酚(phenol)和500μl氯仿-异戊醇处理，然后进行乙醇沉淀。将该沉淀物悬浮于100μl BSS中，用分光光度计测定260nm或280nm处的吸光度值。
(结果)产量为85.7％。将其转化后，可得HVJ包膜载体中DNA掺入效率为3.8％。将279μg pcLuci掺入10,000 HAU的HVJ中时，效率为7.2％。
根据以上结果推断，当使用辛基葡糖苷时，向10,000 HAU的HVJ中掺入DNA的效率约为6-7％，但根据DNA的使用量不同略有变化。此外，已发现当硫酸鱼精蛋白与DNA和HVJ包膜载体同时存在时，导入效率提高，认为这是由于DNA被HVJ包膜载体包裹的效率得到提高。据推断，使用Triton-X100或NP-40可使效率进一步提高约10-40％。
(实施例11借助HVJ包膜载体将基因转移至细胞)(1基因转移方法)将1,000 HAU装入Eppendorf管(30μl)中，加入5μl硫酸鱼精蛋白(1mg/ml)。更换BHK-21细胞(其于前一天以200,000个细胞/孔的量接种在6个孔中)的培养基，每孔加0.5ml培养基(10％FCS-DMEM)。每孔加上述载体(相当于1,000 HAU)与硫酸鱼精蛋白的混合物，前后左右摇晃该平板，使载体与细胞充分混合。将混合物于5％CO2培养箱中37℃保温10分钟。
更换培养基，于5％CO2培养箱中37℃保温过夜(16-24小时)，然后检查基因表达。如果检查萤光素酶(pcLuci带有CMV启动子的萤光素酶基因)，则细胞用0.5ml细胞裂解缓冲液(Promega)裂解，用萤光素酶分析试剂盒(Promega)测定20μl溶液的活性。如果是绿色荧光蛋白(pCMV-GFPE；Promega)，则在荧光显微镜下观察完整细胞，放大400倍的情况下观察5-8个视野，计算发出荧光的细胞的比率。
(2有关培养细胞之导入效力的影响条件的研究)用BHK-21细胞作为培养的细胞。
(2.1对HVJ包膜载体的制备中辛基葡糖苷(OG)浓度的研究)对上述(1)的基因转移方法进行以下改变，并检查辛基葡糖苷(OG)在以下浓度(即用于制备HVJ包膜载体时的OG终浓度)之时通过HVJ包膜载体对基因转移的影响(A)辛基葡糖苷浓度1、2、或3％；制备HVJ包膜载体时灭活的HVJ接受OG处理的时间1分钟、5分钟、或10分钟；进行或不进行超声处理(声处理)。
(B)辛基葡糖苷浓度0.125-1.25％；用于转染的载体的体积10μl，100μl。
(C)辛基葡糖苷0.55-0.8％；转染时间30分钟，过夜(O/N)。
结果见图9。
(2.2向细胞内转移基因的条件，硫酸鱼精蛋白(PS)的浓度/处理时间)对上述(1)的基因转移方法进行以下改变，并检查硫酸鱼精蛋白通过HVJ包膜载体对基因转移的影响(A)硫酸鱼精蛋白浓度0-100μg/ml培养基；转染时间20、40、或60分钟。
(B)硫酸鱼精蛋白浓度0-40μg/ml培养基；转染时间5、10、或20分钟。
结果见图10。
(2.3包入HVJ包膜载体的DNA的浓度对基因表达水平的影响)对上述(1)的基因转移方法进行以下改变，并检查该实验所用DNA量通过HVJ包膜载体对基因转移的影响(A)DNA量20-200μg；将HVJ包膜载体于-20℃或-80℃保存5天。
(B)DNA量180-360μg/HVJ10,000 HAU。
结果见图11。
(2.4用于基因转移的HVJ滴度对基因表达水平的影响)对上述(1)的基因转移方法进行以下改变，并检查基因转移所用HVJ滴度通过HVJ包膜载体对基因表达量的影响利用滴度为5,000、10,000、或20,000 HAU的HVJ制备HVJ包膜载体，用相当于250、500、1,000、或2,000 HAU的量转染BHK-21细胞。
结果见图12。
(2.5HVJ灭活条件对HVJ包膜载体的基因转移效力的影响)对上述(1)的基因转移方法进行以下改变，并检查HVJ灭活方法(UV或β-丙醇酸内酯)对BHK-21细胞中萤光素酶基因表达的影响(A)用于UV辐射的辐射量0-231mJ/cm2。
(B)用于HVJ处理的β-丙醇酸内酯(BPL)的浓度0-0.025％。
结果见图13。
(实施例12利用HVJ包膜载体将基因转移至各种细胞)根据本发明实施例11所述，将基因转移至人舌上的鳞状细胞癌(SAS)中。结果见图14。通过基因转移，用于转染的硫酸鱼精蛋白浓度和保温时间发生变化，如图14所示，根据萤光素酶基因的表达来测定基因转移效力。在用于转染的条件下，当用200μg/ml硫酸鱼精蛋白转染60分钟时，基因转移的效力最大。但通过进一步增加硫酸鱼精蛋白的浓度，有望进一步提高基因转移效力。
用本发明实施例11的方法向人的主动脉内皮细胞(HAEC)中导入基因。结果见图15。
通过基因转移，用于转染的硫酸鱼精蛋白浓度和保温时间发生变化，如图15所示，根据萤光素酶基因的表达来测定基因转移效力。在用于转染的条件下，当用100μg/ml硫酸鱼精蛋白转染60分钟时，基因转移的效力最大。但通过进一步增加硫酸鱼精蛋白的浓度，有望进一步提高基因转移效力。
(实施例13利用HVJ包膜载体将基因转移至各种类型的体内组织中)本实施例描述利用实施例11所述的HVJ包膜载体将基因转移至各种类型的体内组织中。
(13.1小鼠肝脏)将0.8％辛基葡糖苷与200μg pcLuci(其已悬浮于300μl PBS中)一起在冰上静置1分钟，由此制备HVJ包膜载体。所制备的悬浮液取1/10(30μl，相当于l,000 HAU)，用70μl PBS稀释(总量100μl)，将该稀释液注射至小鼠(C57BL/6)肝脏的一个小叶中。
通过与200μg pcLuci一起涡旋/挤压，然后进行蔗糖梯度离心(62000g，90分钟)，可制备HVJ-AVE(人工病毒包膜)脂质体。然后通过离心(27000g，30分钟)使该制剂沉淀，将沉淀悬浮于500μl PBS中。取100μl该样品注射至小鼠(C57BL/6)肝脏的一个小叶中。
24小时后，分离所注射的肝脏小叶，用萤光素酶分析系统(Promega)分析肝小叶的萤光素酶活性。
结果见图16A。这些结果清楚表明，本发明的HVJ包膜载体显示了非常高的基因转移效力，该效力比传统HVJ-AVE脂质体的基因转移效力高出约2倍。
(13.2小鼠子宫)如13.1所述制备HVJ包膜载体。将50μl和100μl样品用PBS稀释至500μl，灌注至小鼠的输卵管，将子宫颈结扎10分钟。24小时后，分离小鼠子宫，用萤光素酶分析系统(Promega)分析小叶或子宫的萤光素酶活性。结果见图16B。本发明的HVJ包膜载体能将基因转移至小鼠子宫中，而利用HVJ-AVE脂质体的方法向子宫组织转移基因则不显示可检测到的转移水平。
含pcLuci的HVJ包膜载体如13.1所述制备。为了进行LacZ表达，用200μg pEB-CMV-LacZ(13kb)制备含有该质粒的HVJ包膜载体。将含有这些质粒的HVJ包膜载体如上注射至子宫中。结果见图16C。通过LacZ染色，测得LacZ基因的表达主要见于子宫内膜的腺上皮中。
(13.3大鼠脑部)用与上述含pcLuci之HVJ包膜载体的制备方法类似的方法制备含pEGFP-1(即，已将水母的绿色荧光蛋白基因(约0.7kb)引入携有巨细胞病毒启动子的表达载体中的一种载体；可得自Clontech，Palo Alto，CA)的HVJ包膜载体。将30μl该载体(相当于1000 HAU，该制品的1/10)注射至SD(Sprague-Dawley)大鼠的颈动脉或经小脑延髓池注射至髓腔内。基因转移的3-4天后，将大鼠处死，制备脑组织切片但不固定。在荧光显微镜下观察荧光。如图16D的结果所示，绿色荧光蛋白(GFP)的脑内表达在注射至颈动脉或经小脑延髓池注射至髓腔内的情况下都可观察到。另一方面，当利用HVJ-AVE脂质体经大鼠颈动脉进行类似的基因转移时，未观察到脑内GFP表达。
(13.4家兔眼部)pCMV-NK4由大阪大学医学系研究科中村敏一教授等友情赠送，该质粒是将人HGF(肝细胞生长因子)基因的突变体，NK4 cDNA(1.4kb)克隆至pCDNA3(In Vitrogen，San Diego，CA)的HindIII/XbaI位点而构建成的。
用与上述含pcLuci之HVJ包膜载体的制备方法类似的方法制备HVJ包膜载体，不同的是，使用400或800μg pCMV-NK4以及10000 HAU的灭活HVJ。pCMV-NK4是表达能抑制HGF功能的HGF突变体的一种载体。将50μl该载体(1/6的该制品)注射至已用重组VEGF块处理以诱导血管生成的家兔角膜组织中。7天后，将家兔处死，观察眼内的血管生成。结果如图16E所示。pCMV-NK4以剂量依赖的方式抑制由VEGF诱导的血管生成。
(13.5大鼠肺动脉)用与上述含pcLuci之HVJ包膜载体的制备方法类似的方法制备含pSV-LacZ(Promega，Madison，WI)的HVJ包膜载体，其中pSV-LacZ含有在SV40启动子控制下的LacZ基因。将50μl该载体(1/6的该制品)注射至大鼠气管。基因转移的3天后，将大鼠处死，组织用1％戊二醛固定，然后用X-gal显像动脉中的LacZ表达。结果见图16F。在将HVJ包膜载体经肺动脉引入的情况下，也观察到支气管上皮中有基因表达(资料未显示)。
(实施例14病毒包膜载体作为药物运送系统(DDS)的功能)本发明的基因转移载体还可作为寡核苷酸或诱饵(decoy)核酸治疗的有效药物运送系统。
(14.1荧光寡核苷酸的导入)利用本发明的病毒包膜载体将荧光标记的寡核苷酸导入细胞。
20体寡核苷酸(5’-CCTTgAAGGGATTTCCCTCC-3’)(194μg/92μlBSS)在其5’位置用FITC标记，将其与10,000 HAU的HVJ(已用198mJ/cm2的紫外线灭活)沉淀混合。加入TritonX-100(终浓度0.24％)，将该混合物于冰上静置1分钟。加入1μl BSS，将该混合物离心(15,000rpm，15分钟，4℃)。在沉淀中加入100μl PBS，将该混合物保存在-20℃。1个月后，将该混合物解冻，取10μl与5μg硫酸鱼精蛋白混合，与5,000,000 BHK-21细胞(于0.5ml培养基中)一起保温(10分钟，60分钟)。导入后的第二天，在荧光显微镜下观察细胞的荧光。结果，10分钟后获得约10％的寡核苷酸导入效率(图17B)，60分钟后寡核苷酸已导入80％或更多的细胞(图17B)。
(14.2用Stat6诱饵核酸治疗接触性皮炎)利用本发明的病毒包膜载体将诱饵核酸导入细胞。
将含有Stat6 DNA结合序列(5’-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAATCTAT-3’和5’-CATGTTCTGGAAAAGGGTTCTTAGATA-5’，(Wang，L.H.等血液95，1249-1257，2000))的双链核酸(250μg/300μl BSS)与30,000 HAU的HVJ(已用99mJ/cm2的紫外线灭活)沉淀混合。
加入TritonX-100(终浓度0.24％)，将该混合物于冰上静置1分钟。加入1ml BSS，将该混合物离心(15,000rpm，15分钟，4℃)。在沉淀中加入300μlPBS，将该混合物保存在-20℃。给小鼠皮下注射该HVJ包膜载体，导致对IgE-诱导型变态反应和迟发型皮肤反应的抑制。
(实施例15向悬浮细胞中进行基因转移)用CCRF-CEM、NALM-6、K-562(其类似人白血病细胞)进行基因转移实验。
将200μg pCMV-萤光素酶(92μl)与10,000 HAU的灭活HVJ(99mJ/cm2紫外线)沉淀混合。
加入Triton X-100(终浓度0.24％)，将该混合物于冰上静置1分钟。加入1ml BSS，将该混合物离心(15,000rpm，15分钟，4℃)。在沉淀中加入300μlPBS，由此制备HVJ包膜载体。使60μl载体(相当于2,000 HAU)、硫酸鱼精蛋白、及4,000,000该悬浮细胞在1.5ml Eppendorf管中混合，离心(10,000-15,000rpm，10分钟，20℃)。然后，在沉淀中加入培养液，将混合物置于培养皿中。1天后，测定细胞的萤光素酶活性。
所用细胞系(尤其CCRF-CEM和NALM-6)当使用HVJ-脂质体或现有脂质体试剂(Gibco BRL的脂质转染胺试剂(Lipofectamine)，脂质转染试剂(lipofectin))时显示极低的导入效率。但如图18所示，观察到较高的向这些细胞中转移基因的效力。
优选的基因转移条件如下加入600-1,000μg/ml硫酸鱼精蛋白，于20℃以10,000rpm或15,000rpm离心10分钟。未观察到与HVJ包膜载体相关的显著细胞毒活性。离心和硫酸鱼精蛋白的添加是基因转移所必需的。
(实施例16向癌组织的基因转移)将354μg pCMV-萤光素酶(92μl)与34,000 HAU的灭活HVJ(99mJ/cm2紫外线)沉淀混合。加入Triton X-100(终浓度0.24％)，将该混合物于冰上静置1分钟。加入1ml BSS，将该混合物离心(10,000rpm-15,000rpm，10分钟，20℃)。在沉淀中加入300μl PBS，-20℃保存。1天后，将该混合物与500μg/ml或1000μg/ml硫酸鱼精蛋白混合。取100μl注射至小鼠黑素瘤B16-F1的肿瘤实体(直径7-8mm)中。1天后测定萤光素酶活性。如图19所示，在肿瘤实体中观察到基因表达。优选硫酸鱼精蛋白的浓度为500μg/ml。另一方面，使用较低浓度的硫酸鱼精蛋白检测不到基因表达。
(实施例17疱疹病毒包膜载体的制备)(17.1灭活病毒的制备)单纯疱疹病毒1型(HSV-1)(1010空斑形成单位/ml)由大阪大学医学系研究科细菌学专业的山西教授友情赠送。根据培养的猴细胞(Vero细胞)中病毒空斑的形成来检查该病毒的灭活条件。当病毒用β-丙醇酸内酯(BPL)0.05％灭活时，空斑以9.1×10-4(空斑/Vero细胞)的频率出现在Vero细胞中。另一方面，当病毒用200或400mJ/cm2紫外线灭活时，空斑出现频率分别为4.3×10-4或2.2×10-6(空斑/Vero细胞)。
(17.2利用灭活病毒进行的基因转移)将100μl HSV-1(109颗粒)用620μl PBS稀释，用400mJ/cm2紫外线照射该稀释液。取其10％(72μl)与DNA(pCMV-萤光酶素8.83μg/μl)混合。于冰上加入8μl 3％ TritonX-100(终浓度0.24％)，1、2、3、4、5、或6分钟后，加入1ml PBS以稀释该溶液。每种样品取100μl，导入BHK-21细胞(在6孔板中)。将细胞培养在含10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco极限必需培养基(DME)中。在另一实验中，每种样品取100μl与5μg硫酸鱼精蛋白混合，然后导入BHK-21中。将样品于培养箱(37℃，5％CO2)中放置60分钟后，培养液用10％FCS-DME更换。22小时后测定萤光素酶活性。如图20所示，用本发明方法制备的疱疹病毒包膜载体具有较高基因转移效力。经形态学观察，没有一种样品显示任何细胞毒活性。
疱疹病毒包膜载体用Triton-X100处理5分钟，于-80℃保存2天，然后解冻，再次加入BHK-21细胞中，测定导入效力。这一次，在导入后60分钟时加入10％FCS-DME(2.5ml/孔)，培养过夜，然后测定活性。对血清的效应以及载体的量进行研究。
如图21所示，即使在-80℃保存2天后仍具有较高基因转移效力。用添加了10％血清的培养基比用无血清培养基的导入效力高。用200μl载体溶液(估计2.8×107个病毒颗粒/孔)比用100μl载体溶液(估计1.4×107个病毒颗粒/孔)的基因转移活性高。
(17.3利用灭活病毒进行的基因转移)根据以上内容，本领域技术人员可显而易见地认识到，本发明利用表面活性剂产生包膜载体的技术不仅可应用于HVJ，还可应用于更大范围的具有脂质膜的包膜病毒。因此，本领域技术人员显然可轻易地利用任何其它包膜病毒，按本发明的公开内容，制备用于基因转移的包膜载体。从而可产生利用了属于逆转录病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、杆状病毒科、嗜肝DNA病毒科等的病毒的包膜载体。相应地，可以认为，将目标导入特定器官可利用病毒的组织针对性来实现。例如，利用了疱疹病毒的包膜载体可作为导向神经的载体来应用；利用Epstein-Barr病毒的包膜载体可作为导向淋巴细胞的载体来应用；利用了流感病毒的包膜载体可作为导向呼吸器官的载体来应用。
因此，本发明的具体实施方案在本说明书中作为举例来描述。但显然，在不违背本发明的精神和范围的前提下可作各种修改。具体是，尽管本说明书中的实施例在利用灭活型HVJ的基因转移载体方面进行了描述，但本领域技术人员显然可根据本说明书的公开内容，利用不同于HVJ的其它灭活病毒制备本发明的基因转移载体，也可不通过灭活步骤而利用类似的制备方法来制备本发明的基因转移载体。因此，本发明仅由所附权利要求书来限定。
工业实用性本发明提供了一种新的基因转移方法，该方法操作简单并具有很好的基因转移效力。据认为这使得能快速筛选基因文库。本发明还提供了一种进行大量筛选的试剂盒，它包含本发明的病毒包膜载体。此外，本申请提供的病毒包膜载体可耐受较长期的冷冻保存，使得它无需在使用时临时制备。从而可极大地简化操作过程，并可实现以大量产生的导入载体为基础的匀质基因转移。此外，本发明的基因转移载体使得基因转移比任何传统的基于HVJ制备的载体更有效，并使得可将基因转移至比传统方法更大范围的体内组织中。
本发明还提供了含有本发明基因转移载体的用于给与药物的药物运送系统，药物筛选系统，以及用于基因治疗的载体。
权利要求
1.一种含有病毒包膜的基因转移载体。
2.权利要求1的基因转移载体，其中所述病毒衍生自野生型病毒或重组病毒。
3.权利要求1或2的基因转移载体，其中所述病毒衍生自属于逆转录病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、杆状病毒科和嗜肝DNA病毒科的病毒。
4.权利要求3的基因转移载体，其中所述病毒是HVJ。
5.权利要求1-4中任一项的基因转移载体，其中所述基因转移载体利用含以下步骤的方法来制备将所述病毒与一种外源基因混合；和将该混合液冷冻和解冻2次或更多次。
6.权利要求1-4中任一项的基因转移载体，其中所述载体利用以下方法来制备，所述方法包括将该病毒与一种外源基因在有表面活性剂存在时进行混合的步骤。
7.权利要求5或6的基因转移载体，其中所述方法进一步包括灭活所述病毒的步骤。
8.权利要求7的基因转移载体，其中所述表面活性剂选自辛基葡糖苷、Triton-X100、CHAPS和NP-40。
9.权利要求8的基因转移载体，其中所述表面活性剂是辛基葡糖苷。
10.权利要求1-9中任一项的基因转移载体，其中所述方法进一步包括将硫酸鱼精蛋白添加至所述外源基因的步骤。
11.权利要求1-10中任一项的基因转移载体，其用于将基因导入动物体内组织中。
12.权利要求11的基因转移载体，其中所述组织选自肝脏、骨骼肌、子宫、脑、眼、颈动脉、皮肤、血管、肺、心脏、肾脏、脾脏、癌组织、神经、B淋巴细胞、以及呼吸系统的组织。
13.一种用于基因治疗的药用组合物，其包含权利要求1-12的基因转移载体。
14.一种用于筛选基因文库的试剂盒，其包含权利要求1-12的基因转移载体。
15.一种制备基因转移载体的方法，所述载体包含用于基因转移的病毒包膜，所述方法包括以下步骤将所述病毒与一种外源基因混合；和将该混合液冷冻和解冻2次或更多次。
16.一种制备基因转移载体的方法，所述载体括包含用于基因转移的病毒包膜，所述方法包括以下步骤将所述病毒与一种外源基因在有表面活性剂存在的情况下混合。
17.权利要求15或16的方法，进一步包括灭活所述病毒的步骤。
18.一种将基因导入分离的动物组织中的方法，该方法包括以下步骤制备如权利要求1-12中任一项所述的基因转移载体，该载体含有所需的外源基因；和通过该基因转移载体将基因导入分离的动物组织。
19.一种将外源基因导入悬浮细胞的方法，该方法包括以下步骤将所述悬浮细胞与权利要求1-12中任一项的基因转移载体在有硫酸鱼精蛋白存在的情况下混合；和离心该混合液。
全文摘要
本发明通过将外源基因导入灭活病毒的包膜，经由冻融处理或与表面活性剂混合，来制备基因转移载体。本发明还提供含有该基因转移载体的基因治疗药用组合物，含有该基因转移载体的试剂盒，以及应用该基因转移载体的基因转移方法。
文档编号A61K48/00GK1657103SQ200410100219
公开日2005年8月24日 申请日期2001年2月2日 优先权日2000年2月2日
发明者金田安史 申请人:安增子摩祺株式会社, 金田安史