专利名称：骨形成蛋白4基因的反转录病毒载体及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及骨组织基因工程技术领域，具体地说及涉及含骨形成蛋白4基因的重组载体，该载体转化包装的病毒颗粒以及利用病毒颗粒制备组织工程化骨及其应用。
背景技术：
骨形成蛋白(BMP)属于转化生长因子超家族，其中BMP 2、4、5、6、7等与骨、软骨、肌腱、牙周组织、牙本质的形成有极为密切的关系，均有明确的诱导成骨的作用。但传统的BMP蛋白制备，无论是从骨基质中提纯，还是用基因工程表达，程序复杂，产量低，活性不稳定；在修复大面积骨缺损时，BMP的用量大，可能会生毒性反应；BMP作为外源性蛋白植入体内，也可能引起免疫反应。近年有学者探索应用BMP基因治疗的方法加速骨缺损的修复。1988年Wozney等首先克隆出hBMP1-4cDNA。随后陆续克隆获得了BMP家族中的其它成员，为骨缺损修复的BMP基因治疗奠定了基础。BMP基因转移的载体各有特点，反转录病毒能将目的基因整合到靶细胞基因组中，可长期表达，腺病毒不论靶细胞增殖状况均可高效转移，介导的基因转移是非整合型的，但目前构建的载体含有许多编码蛋白质的基因，其产物免疫原性强；裸DNA直接转导方法简单，无免疫原性，安全，费用低，缺点是转导效率低。应用BMP基因治疗结合组织工程技术促进新骨的形成已成为目前骨再生领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于1)选择pLEGFP(Invitrogen)作为反转录病毒载体，成功构建了pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体，2)通过PA317细胞的包装，获得了LEGFP-hBMP-4和LEGP反转录病毒颗粒，3)以hBMP-4基因修饰的骨髓基质细胞作为组织工程化骨的种子细胞构建组织工程化骨。
pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体，1)利用PCR方法获取hBMP-4基因；2)hBMP-4基因克隆入pEGFP载体3)pEGFP-hBMP-4、pLEGFP反转录病毒载体以BglII/SalI(Promega)双酶切，回收；4)T4DNA连接酶连接，转化，抽提pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体。
pLEGFP-hBMP-4病毒颗粒，1)pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体与Lipofectamine有效的体积比，2)pLEGFP-hBMP-4-Lipofectamine复合物与PA317包装细胞混合，培养，收集pLEGFP-hBMP-4病毒颗粒。
组织工程化骨，1)pLEGFP-hBMP-4病毒颗粒感染体外培养的骨髓基质细胞，2)骨髓基质细胞、生物支架材料构建组织工程化骨。
本发明的技术要点是选择新型的反转录病毒表达载体pLEGFP，优点是，该空白载体本身含有绿色荧光基因，在实验中可以作为对照，荧光显微镜下可以方便的观察绿色荧光蛋白的表达。更有利的是，该载体还可以用于细胞的标记和追踪，这在组织工程研究中判断细胞的来源以及归宿有着重要的意义。PA317细胞是目前较广泛使用的第2代包装细胞，能产生宽宿主谱的双向性病毒颗粒，而不产生可测出的辅助病毒，本发明选择骨髓基质细胞(bone marrow stromalcells，bMSCs)具有来源丰富，采集方便，容易在体外培养、诱导、扩增的特点，并具有明确的成骨潜能，是组织工程化骨理想的种子细胞。该细胞在体外培养具有较强的传代增殖能力，外源目的基因易于导入，因此也是骨缺损基因治疗较为理想的靶细胞。应用bMSCs来表达基因有许多优点，bMSCs很容易采集并进行组织培养，其自身具有成骨潜能，转基因分泌的BMP可以对它们起作用。以天然型无机骨(non-organic bone，NNB)等生物材料为支架构建组织工程化骨，NNB为一种新型的多孔羟基磷灰石材料，其天然网孔，符合生理要求，经生物安全性监测，该材料符合国际标准化组织ISO的规定。
图1是酶切反应，1分子量标记2pLEGFP载体BglII/SalI双酶切产物3pEGFP-hBMP-4 BglII/SalI双酶切产物图2是酶切鉴定，1分子量标记2pLEGFP-hBMP-4BglII/SalI双酶切产物图3是LEGFP反转录病毒上清感染NIH3T3细胞，有绿色荧光蛋白表达，(荧光显微镜下观察，放大倍数200)图4是体外培养4天骨髓基质干细胞在无机骨支架表面增殖(扫描电镜下观察，放大倍数300)图5是LEGFP组术后4周(HE染色，放大倍数100)图6是LEGFP-hBMP-4组术后4周(HE染色，放大倍数100)图7是hBMP-4基因修饰的组织工程化骨修复犬颌骨缺损的动物模型具体实施方式
现结合具体实验及其结果分析和相应的说明书附图，骨形成蛋白4基因的反转录病毒载体及其应用进一步详细说明。本发明涉及骨组织基因工程技术领域，具体地说及涉及含骨形成蛋白4基因的重组载体，该载体转化包装的病毒颗粒以及利用病毒颗粒制备组织工程化骨及其应用。选择新型的反转录病毒表达载体pLEGFP，这是由Moloney小鼠白血病病毒启动子(MoMuLV)驱动的绿色荧光表达体系，转染包装细胞后能够瞬时或稳定表达包装信号Ψ，插入目的基因及标志基因neo，包装的子代病毒颗粒以芽生的方式从包装细胞膜分泌至培养上清，具有感染性，但无复制能力。反转录病毒包膜中含有env基因编码的糖蛋白，许多哺乳动物细胞具有识别这种糖蛋白的受体，两者结合可介导反转录病毒对靶细胞的有效感染。应用pLEGFP反转录病毒载体的优点是，该空白载体本身含有绿色荧光基因，在实验中可以作为对照，荧光显微镜下可以方便的观察绿色荧光蛋白的表达。更有利的是，该载体还可以用于细胞的标记和追踪，这在组织工程研究中判断细胞的来源以及归宿有着重要的意义。
PA317细胞是目前较广泛使用的第2代包装细胞，能产生宽宿主谱的双向性病毒颗粒，而不产生可测出的辅助病毒，用它制备的反转录病毒可以感染人和其它哺乳动物细胞，是一种广泛使用、较安全的包装细胞。本发明通过亚克隆法，成功构建了pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体，通过PA317细胞的包装，获得了LEGFP-hBMP-4和LEGP反转录病毒颗粒。荧光显微镜下观察，NIH3T3(取购自中科院生物化学与细胞生物学研究所)细胞转染LEGFP后，有明显的绿色荧光表达，表明取得的病毒颗粒有较强的感染能力。裸鼠肌内注射实验中，LEGFP-hBMP-4实验组肌肉注射部位，均出现了异位形成的新骨块，骨块中央有骨髓形成，而LEGFP对照组肌肉注射部位，均未见新骨，表明建立的LEGFP-hBMP-4反转录病毒体系能够诱导成骨。病毒颗粒可能是感染了肌肉中的间充质细胞，通过hBMP-4自分泌或旁分泌的作用，诱导了新骨形成。研究还发现，动物在整个观察期间均未出现炎症、肿瘤。组织学观察，在各组肌肉注射部位均未见异型性细胞，无明显的炎症细胞浸润，显示该载体较为安全。
选择合适的靶细胞是基因治疗成功与否的一个重要因素。靶细胞应易取出和移植，容易在体外培养，外源目的基因能高效导入，具有较长的寿命。本发明选择骨髓基质细胞，具有来源丰富，采集方便，容易在体外培养、诱导、扩增的特点，并具有明确的成骨潜能，是组织工程化骨理想的种子细胞。该细胞在体外培养具有较强的传代增殖能力，外源目的基因易于导入，因此也是骨缺损基因治疗较为理想的靶细胞。应用bMSCs来表达基因有许多优点，bMSCs很容易采集并进行组织培养，其自身具有成骨潜能，转基因分泌的BMP可以对它们起作用。应用hBMP-4反转录病毒体外转染兔、羊、猪、狗等bMSCs，然后将基因修饰的细胞与生物支架材料复合(如天然型无机骨NNB，三磷酸钙TCP、珊瑚、藻酸钙、PGA、PLGA、胶原等)可以构建组织工程化骨。以NNB为例，它是一种新型的多孔羟基磷灰石材料，其天然网孔，符合生理要求，经生物安全性监测，该材料符合国际标准化组织ISO的规定。材料可以降解吸收，但较珊瑚慢。兔bMSCs在材料内表面贴壁良好，并扩增，说明NNB是bMSCs较为理想的支架材料。应用LEGFP-hBMP-4基因修饰的bMSCs还可以与支架材料复合，构建大块组织工程化骨，修复大动物如狗的下颌骨的节段性缺损。综上，本发明成功建立了hBMP-4反转录病毒体系，获得了LEGFP-hBMP-4和LEGFP反转录病毒，为骨组织工程中BMP-4基因治疗以及种子细胞的标记和追踪提供了工具。本发明把BMP基因治疗与组织工程方法结合起来，以bMSCs作为基因治疗的靶细胞，同时应用其作为组织工程化骨的种子细胞，通过基因修饰bMSCs后的自分泌和旁分泌作用，加速成骨。hBMP-4基因修饰的组织工程化骨植入裸鼠体内后，材料网孔内新骨成骨多，提示hBMP-4基因修饰的组织工程化骨，可望成为骨缺损修复理想的替代材料。
实验方法一、pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体的构建步骤一、hBMP-4全长目的基因的获得 从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，ATCC)获得了克隆有目的基因的λgt10phage(no.40342)。设计PCR引物，在两个引物的5’端分别接上BamH1和EcoR1酶切位点，并在下游引物中加入了中止密码子。序列如下，上游引物5’GGGGGATCCATGATTCCTGGTAACCGAATG；下游引物5’GGGGAATTCTCAGCGGCACCCACATCCCT。PCR产物1％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶纯化试剂盒(Gibco)回收纯化。
步骤二、T载体克隆并测序 回收纯化后的PCR产物在T4DNA连接酶(Promega)的作用下与pGEM T-easy载体(Promega)反应，连接产物转染大肠杆菌JM109(取购自中科院生物化学与细胞生物学研究所)，接种含X-GAL的氨苄青霉素平板，挑选白色菌落，扩增后提取质粒DNA(华舜)，送DNA测序。
步骤三、pEGFP-hBMP-4质粒的构建 鉴定目的基因序列完全正确的T-hBMP-4克隆质粒用EcoR I(Promega)单酶切，回收1.3kb条带。pEGFP载体(Invitrogen)应用EcoR I单酶切，回收4.7kb条带，SAP酶(Promega)去磷酸化。然后在T4DNA连接酶的作用下以单端相连接，产物接种卡那霉素平板，阳性克隆扩增后提取质粒，酶切鉴定方向。
步骤四、pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体的构建 单端连接成功的pEGFP-hBMP-4以BglII/SalI(Promega)双酶切，回收全长1.4kb的hBMP-4基因。pLEGFP反转录病毒载体(Invitrogen)同样以BglII/SalI双酶切，回收6.9kb条带。以T4DNA连接酶连接16℃过夜，转化JM109感受态细菌，铺卡那霉素平板，挑阳性克隆，摇菌，抽提质粒，并进行酶切鉴定。
二、病毒颗粒的包装及滴度测定步骤一、病毒颗粒的包装在六孔板中进行，通过预初实验取得了优化的转染条件。PA317(取购自中科院生物化学与细胞研究所)包装细胞的接种密度为每孔2×105，传代后继续培养18～24h，待细胞50～80％汇合时在Lipofectamine(Invitrogen)介导下，分别转染pLEGFP-hBMP-4及pLEGFP。具体方法如下，在无菌管中配制溶液A质粒1μg，溶于100μl无血清培养液；溶液B8μlLipofectamine(Invitrogen)溶于100μl无血清培养液中。混合溶液A和溶液B，室温放置30min后，加0.8ml无血清培养液。吸尽培养板中的培养液，无血清培养液洗涤后将质粒-Lipofectamine复合物滴加到细胞表面，置37℃培养箱中培养5h，置换完全培养基。800μg/ml的G418(Sigma)筛选阳性克隆，2周后，每组各挑选6个克隆继续扩增培养，至细胞融和，收获病毒上清，步骤二、进行病毒滴度测定。具体方法为，将病毒上清液梯度稀释后加入Polybrene至8μg/mL，感染NIH3T3细胞(取购自中科院生物化学与细胞研究所)，然后用含500μg/mL G418的DMEM培养液筛选抗性克隆，病毒滴度＝抗性克隆数×病毒稀释倍数/病毒上清液体积。筛选高滴度的病毒上清液，抽滤，置-70℃冻存备用。荧光显微镜观察NIH3T3细胞感染LEGFP对照基因后，绿色荧光蛋白的表达。
三裸鼠肌内成骨试验取6周龄BALB-C裸小鼠4只，LEGFP-hBMP-4实验组及LEGFP对照组病毒均以无血清DMEM培养基稀释到5×104pfu/ml，加入Polybrene(Sigma)至8ug/mL，分别在裸鼠双侧股部肌肉内注射100μl稀释的病毒液。术后8周取材，40％福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，HE(苏木素伊红)染色，组织学观察。
四、组织工程化骨的构建第一种方法步骤一、兔bMSCs的培养无菌条件下抽取兔股骨大转子处骨髓2～4ml，按培养液3×109个/L有核细胞接种，4～6d半量换液，7d换液2次。等细胞融合后首次传代。培养液为DMEM(GibcoBRL)，含10％胎牛血清(Hyclone)，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠(Sigma)，50mg/L维生素C(Sigma)，2mmol/L谷氨酰胺(Sigma)，108mol/L地塞米松(Sigma)。
步骤二、病毒颗粒转染在优化的转染条件下应用lipofectamine进行基因转染。原代细胞传代至10cm培养皿，等生长至50～70％汇合时，弃培养基，分别加入2ml含8ug/mlPolybrene的培养基，实验组加入30ulLEGFP-hBMP-4，对准组加入约30ulLEGFP，在培养箱培养4～6小时后，更换新鲜培养基。
步骤三、组织工程化骨的构建转染目的基因、对照基因3d后的细胞，以及空白组bMSCs，分别以50×109/L的密度与生物支架材料复合(如天然型无机骨NNB，三磷酸钙TCP、珊瑚、藻酸钙、PGA、PLGA、胶原等)。以NNB为例，细胞接种到直径6mm、厚3mm的圆柱体NNB中。使得材料湿润，而液体不流出。
步骤四、组织工程化骨体外培养及扫描电镜检测制备的组织工程化骨续在养液中培养，4d后取材，戊二醛固定，临界点干燥，镀金后扫描电镜观察材料与细胞贴附情况。
步骤五、裸鼠体内植入实验及组织学检查制备的组织工程化骨，LEGFP-hBMP-4组、pLEGFP组和bMSCs组每组6例，并取2块NNB作为空白对照分别植入BALBC裸小鼠皮下。4周取材，30％甲酸脱钙后，常规HE染色观察。
第二种方法步骤一、狗bMSCs的培养无菌条件下抽取兔股骨大转子处骨髓2～4ml，按培养液3×109个/L有核细胞接种，4～6d半量换液，7d换液2次。等细胞融合后首次传代。培养液为DMEM(GibcoBRL)，含10％胎牛血清(Hyclone)，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠(Sigma)，50mg/L维生素C(Sigma)，2mmol/L谷氨酰胺(Sigma)，108mol/L地塞米松(Sigma)。
步骤二、病毒颗粒转染在优化的转染条件下应用lipofectamine进行基因转染。原代细胞传代至10cm培养皿，等生长至50～70％汇合时，弃培养基，分别加入2ml含8ug/mlPolybrene的培养基，实验组加入30ulLEGFP-hBMP-4，对准组加入约30ulLEGFP，在培养箱培养4～6小时后，更换新鲜培养基。
步骤三、组织工程化骨的构建转染目的基因、对照基因3d后的细胞，以及空白组bMSCs，分别以50×109/L的密度与2cm×1cm×0.5cm的TCP材料复合。使得材料湿润，而液体不流出。
步骤四、组织工程化骨体外培养及扫描电镜检测制备的组织工程化骨续在养液中培养，4d后取材，戊二醛固定，临界点干燥，镀金后扫描电镜观察材料与细胞贴附情况。
步骤五、狗下颌骨缺损修复实验制备的组织工程化骨，LEGFP-hBMP-4组、pLEGFP组和bMSCs组每组3例，用以修复犬下颌骨的缺损(图7)。
实验结果一、成功构建了pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体PCR从λgt10phage载体中拉出1.3kb单一条带，回收后与T-easy载体连接，通过蓝白斑试验挑选白色阳性克隆，扩增后提取质粒，经3个测序反应，测通全长DNA序列，与Genebank公布的序列(M22490)比对，证实获得序列完全正确的hBMP-4全长基因。然后把测序确认的1.3kb hBMP-4全长基因用EcoR I单酶切，并插入真核表达载体pEGFP的相应的去磷酸化位点中，通过酶切反应验证，取得了正向插入的阳性克隆pEGFP-hBMP-4。该质粒进一步扩增后以BglII/SalI双酶切，回收全长约1.4kb的hBMP-4基因。pLEGFP反转录病毒载体也以BglII/SalI双酶切，回收约6.9kb条带(图1)。经双粘端连接后，酶切鉴定(图2)，证实获得了pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体。
二、病毒颗粒的包装和滴度测定优化的条件下以Lipofectamine包裹pLEGFP-hBMP-4及pLEGFP质粒，转染PA317包装细胞，经G418筛选2周后，获得了阳性克隆。两组分别挑选6个克隆，进一步扩增，收集上清液。通过滴度测定，获得了较高滴度的病毒上清液，LEGFP-hBMP-4组为3.7×105pfu/ml，LEGFP组为3.9×105pfu/ml，过滤，备用。在荧光显微镜下，LEGFP对照组病毒上清感染NIH/3T3细胞后，可见较强的绿色荧光蛋白表达(图3)，提示获得的病毒滴度较高。
三、裸鼠体内实验所有动物在整个观察期内均未出现炎症、肿瘤。组织学检查，LEGFP-hBMP-4实验组肌肉注射部位，均出现了异位形成的新骨块，骨块中央有骨髓形成。而对照组均未见新骨。各标本均未见异型性细胞，无明显的验证细胞浸润。
四、组织工程化骨的构建以第一种方法的兔bMSCs与NNB复合构建组织工程化骨为例，bMSCs可以在NNB支架网孔内表面贴壁生长扩增，呈典型的成纤维细胞样形态(图4)裸鼠体内实验实验动物无1例死亡，皮下植入部位伤口无感染，植入物无排出。各组标本均未见明显的炎症反应，HE切片见NNB空白组材料中无新骨形成；bMSCs组或转染PLEGFP基因组，材料中有部分新骨形成(图5)；而转染LEGFP-hBMP-4基因组材料中已大部由新生骨充满(图6)。
权利要求
1.pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体，其特征在于1)利用PCR方法获取hBMP-4基因；2)hBMP-4基因克隆入pEGFP载体3)pEGFP-hBMP-4、pLEGFP反转录病毒载体以BglII/SalI(Promega)双酶切，回收；4)T4DNA连接酶连接，转化，抽提pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体。
2.如权利要求1所述的pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体，其特征在于上游引物5’GGGGGATCCATGATTCCTGGTAACCGAATG；下游引物5’GGGGAATTCTCAGCGGCACCCACATCCCT。
3.如权利要求1所述的pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体，其特征在于回收6.9kb条带。
4.pLEGFP-hBMP-4病毒颗粒，其特征在于1)如权利要求1所述的pLEGFP-hBMP-4反转录病毒载体与Lipofectamine有效的体积比，2)pLEGFP-hBMP-4-Lipofectamine复合物与PA317包装细胞混合，培养，收集pLEGFP-hBMP-4病毒颗粒。
5.如权利要求4所述的pLEGFP-hBMP-4病毒颗粒，其特征在于pLEGFP-hBMP-4-Lipofectamine复合物与PA317包装细胞混合，在37℃培养箱中培养5h。
6.组织工程化骨，其特征在于1)如权利要求4所述的pLEGFP-hBMP-4病毒颗粒感染体外培养的骨髓基质细胞，2)骨髓基质细胞、生物支架材料构建组织工程化骨。
7.如权利要求6所述的组织工程化骨，其特征在于生物支架材料是多孔羟基磷灰石、三磷酸钙、珊瑚、藻酸钙、胶原。
8.如权利要求7所述的组织工程化骨，其特征在于多孔羟基磷灰石是天然型无机骨。
9.如权利要求6所述的组织工程化骨，其特征在于骨髓基质细胞来源兔羊、猪、狗骨髓基质细胞。
10.如权利要求9所述的组织工程化骨，其特征在于骨髓基质细胞来源兔骨髓基质细胞、狗骨髓基质细胞。
全文摘要
本发明涉及骨组织基因工程技术领域，具体地说及涉及含骨形成蛋白4基因的重组载体，该载体转化包装的病毒颗粒以及利用病毒颗粒制备组织工程化骨及其应用。本发明选择pLEGFP作为反转录病毒载体，成功构建了pLEGFP－hBMP－4反转录病毒载体，通过PA317细胞的包装，获得了LEGFP－hBMP－4和LEGP反转录病毒颗粒，以hBMP－4基因修饰的骨髓基质细胞作为组织工程化骨的种子细胞构建组织工程化骨。
文档编号A61F2/28GK1664108SQ20041008924
公开日2005年9月7日 申请日期2004年12月8日 优先权日2004年12月8日
发明者蒋欣泉, 张志愿, 陈建国, 常庆, 王丽珍, 潘红芽, 袁荣涛, 张秀丽, 张濒 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院