专利名称：犬白细胞干扰素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种白细胞干扰素，具体的说是一种用于紧急预防和治疗犬瘟热、犬细小病毒病、犬病毒性腹泻等病毒性疾病的犬白细胞干扰素的制备方法。
背景技术：
犬瘟热、犬细小病毒病、犬病毒性腹泻等病毒性感染在犬群中较为常见，是当前严重危害养犬业健康发展的主要传染病。各种年龄的犬均易感，尤其是幼犬。犬一旦感染发病，则有起病急、临床症状严重、极易传播扩散，以及感染率和死亡率均较高的特点，给养犬业者造成巨大经济损失。更为重要的是，宠物犬与人类接触密切，某些人兽共患病还给人类健康带来潜在威胁。而对于此类病毒性疾病，目前临床上尚缺乏有效治疗措施，传统的犬传染病治疗方案针对病毒性疾病方法不多，有时难以奏效，尤其是有可能引起人类新型传染病。因此，积极预防和治疗犬病毒性疾病一直是共同关注的问题。
人白细胞干扰素(Interferon，IFN)自1959年Isaacs等发现以来，已在临床应用多年，是目前公认的机体抗病毒感染防御体系中，出现最早且对大多数病毒均有抑制作用的一组糖蛋白，此外该组糖蛋白还具有明显的免疫调节功能和抗肿瘤活性。但由于犬白细胞干扰素具有相对种属特异性，及受到犬新鲜血源易受污染、生产工艺等问题的困扰，专供犬类预防和治疗病毒性疾病的犬白细胞干扰素尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种犬白细胞干扰素的制备方法，借鉴人脐血白细胞干扰素制备工艺，使用鸡新城疫病毒(NDV)作为诱生剂诱导健康犬白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装和冻干等工艺，制成犬白细胞干扰素冻干粉针剂。
本发明技术方案如下犬白细胞干扰素的制备方法，依次进行以下步骤(1)、制备犬的新鲜抗凝血、分离收集白细胞悬液；
(2)、犬白细胞悬液中加入启动用粗纯犬白细胞干扰素进行短时培养；(3)、加入诱导剂——鸡新城疫病毒NDV，诱生培养18-24小时；(4)、加入含有犬血清或血浆的营养液进行诱生，培养后，收集上清液，灭活鸡新城疫病毒、除菌；(5)得到犬白细胞干扰素粗制品，冷冻保存。
上述的犬白细胞干扰素的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)、以800～2500rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml；(2)、在前述已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯犬白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；(3)、在启动后的犬白细胞悬液中加入鸡新城疫病毒NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量含10％犬血清或犬血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4～8，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0～2.4，4℃下放置4～5天，每日振摇2～3次；再用6N NaOH调至pH7.2，即得到犬白细胞干扰素粗制品。
PB是指不含有盐的缓冲溶液，预温的培养液是指把温度4℃ RPMI 1640加热到接近37℃，过夜一般指8～24小时。
本发明制备的犬白细胞干扰素，经分离纯化后，制成冻干粉针剂，加2ml无菌双蒸水后，能迅速溶解为均匀悬浊液，规格为干扰素含量≥2万单位/瓶，2～8℃或室温≤25℃保存。使用时要轻轻摇匀后方可进行肌肉注射，幼犬5000～10000单位/只/天；青年犬10000～20000单位/只/天；成年犬20000～40000单位/只/天。每日注射1次，一个疗程3～5次。
本发明成功解决了犬新鲜血源来源及污染等问题，经过严格田间实验和区域实验证实，无可见不良反应。犬白细胞干扰素注入动物机体后，治疗犬瘟热、犬细小病毒病、犬病毒性腹泻等病毒性疾病，具有疗效好、安全可靠、无毒副作用和不污染环境等特点。
在治疗已发病犬的同时，应及时隔离未发病犬，并给予等量药物预防注射，使用本发明制备的犬白细胞干扰素时，应注意环境的消毒等综合预防措施，防治再感染或疫病的复发。
具体实施例方式犬白细胞干扰素制备工艺一、配制抗凝剂(每支12500单位的肝素钠加Hank`s液10ml，每毫升为1250单位)及抗生素(卡那霉素，使用时终浓度为100μg/ml)。
二、犬全血采集，在动物手术间，将无菌采集犬心脏全血，收集至事先加有抗凝剂与抗生素的无菌瓶中，摇匀，在4℃冰箱放置备用。
三、制备鸡新城疫病毒(F系)，并滴定其效价。
四、按产品说明书规定溶解RPMI 1640粉剂，经蔡氏滤器加压过滤，无菌检测后在4℃冰箱放置备用。
五、粗制品干扰素制备(1)、以800～2500rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml。
(2)、在已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯犬白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时。
(3)、在启动后的犬白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量含10％犬血清或犬血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0，4放置4～5天，每日振摇2～3次。再用6N NaOH调至pH7.2，即得到犬白细胞干扰素粗制品。
PB是指不含有盐的缓冲溶液，预温的培养液是指把温度4℃ RPMI 1640加热到接近37℃。
上述经检验合格的粗制干扰素在4℃下，2000～3000rpm/分钟离心30分钟，取上清液用蔡氏滤器加压过滤，无菌收集滤液，再取样进行无菌检验效价测定、安全检验和外源病毒检验合格后，加入终浓度含5％体积脱脂牛奶、5％GS和10％犬血清(或血浆)作为冻干保护剂混匀后，置入冻干机保存。
干扰素粗制品可依下列步骤精制(硫氰酸钾盐析纯化)(1)、在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾(KCNS)，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8～12小时，(2)、4℃下，2000rpm(转/分，下同)离心20min(分钟，下同)，弃去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0，(4)、4℃下2500rpm离心20min，弃沉淀；(5)、上清液用1N NaoH调至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(7)、上清液用0.1N NaoH调至PH5.6～6.0；(8)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(9)、上清液用1N NaoH调至pH8.0，(10)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(11)、沉淀物中加入原1/10～1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS)溶液；(12)、4℃搅拌过夜(8～24小时)，使之充分溶解；(13)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀；(14)、上清液用2N HCl调至pH3.0；(15)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；(16)、沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-；(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止；(18)、3万g离心1小时，弃沉淀；(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格；(20)、无菌分装，-70℃保存。
权利要求
1.犬白细胞干扰素的制备方法，依次进行以下步骤(1)、制备犬的新鲜抗凝血、分离收集白细胞悬液；(2)、犬白细胞悬液中加入启动用粗纯犬白细胞干扰素进行短时培养；(3)、加入诱导剂——鸡新城疫病毒NDV，诱生培养18-24小时；(4)、加入含有犬血清或血浆的营养液进行诱生，培养后，收集上清液，灭活鸡新城疫病毒、除菌；(5)得到犬白细胞干扰素粗制品，冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的犬白细胞干扰素的制备方法，其特征在于(1)、以800～2500rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml；(2)、在前述已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯犬白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时；(3)、在启动后的犬白细胞悬液中加入鸡新城疫病毒NDV，使其最终浓度为100～150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1～1.5倍体积量含10％犬血清或犬血浆的RPMI1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4～8，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm～3000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0～2.4，4℃下放置4～5天，每日振摇2～3次；再用6N NaOH调至pH7.2，即得到犬白细胞干扰素粗制品。
3.根据权利要求1所述的犬白细胞干扰素的制备方法，其特征在于(1)、以2000rpm离心装有新鲜抗凝血瓶30min，收集灰黄层，得到富含白细胞的悬液，用已预温的培养液稀释成1×107白细胞/ml。(2)、在前述已稀释好的细胞悬液中加入少量粗纯犬白细胞干扰素，使其最终浓度为100单位/ml，置于37℃水浴摇床搅拌培养2小时。(3)、在启动后的犬白细胞悬液中加入NDV，使其最终浓度为150血凝单位/ml，并同时在白细胞悬液中加入原全血液1.5倍体积量含10％犬血清或犬血浆的RPMI 1640营养液，加入终浓度为10μg/ml的卡那霉素，调悬液pH7.4，37℃摇床搅拌培养18～24小时；(4)、经2000rpm离心30min，取上清液，加入6N HCl调至pH2.0，4℃放置4～5天，每日振摇2～3次。再用6N NaOH调至pH7.2，即得到犬白细胞干扰素粗制品。
4.根据权利要求1所述的犬白细胞干扰素的制备方法，其特征在于对犬白细胞干扰素粗制品依下列步骤精制(1)、在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾(KCNS)，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8～12小时，(2)、4℃下，2000rpm(转/分，下同)离心20min(分钟，下同)，弃去上清液，取沉淀；(3)、沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0～4.5，(4)、4℃下2500rpm离心20min，弃沉淀；(5)、上清液用1N NaoH调至pH5.0～5.5，(6)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(7)、上清液用0.1N NaoH调至PH5.6～6.0，(8)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(9)、上清液用1N NaoH调至pH8.0，(10)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液，(11)、沉淀物中加入原1/10～1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS)溶液，(12)、4℃搅拌过夜，使之充分溶解，(13)、4℃下2000rpm离心20min，弃沉淀，(14)、上清液用2N HCl调至pH3.0，(15)、4℃下2000rpm离心20min，弃上清液，(16)、沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS-，(17)、用HNO3、0.1N AgNO3检测CNS-，直至透析除尽为止，(18)、3万g离心1小时，弃沉淀，(19)、测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×105国际单位/mg蛋白为合格，(20)、无菌分装，-70℃保存。
全文摘要
本发明公开了一种犬白细胞干扰素的制备方法，使用鸡新城疫病毒(NDV)作为诱生剂诱导健康犬白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分离、纯化等工艺，制成犬白细胞干扰素冻干粉针剂。本发明成功利用了犬新鲜全血作为原料，制备工艺简便及经冻干后易运送和保藏，产品质量可靠。犬白细胞干扰素注射犬机体后，具有疗效好、安全可靠和无毒副作用等特点。可用于治疗犬瘟热、犬细小病毒病、犬病毒性腹泻等病毒性疾病。
文档编号A61P31/12GK1661036SQ200410065929
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月25日 优先权日2004年12月25日
发明者王明丽 申请人:王明丽