专利名称：抗hiv－1重组导向毒素的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体的说是针对HIV-1感染细胞的重组导向毒素。
背景技术：
目前国内外用于HIV-1治疗的药物主要是化学药物，1987年首先开始的核苷类药物，如齐多夫定(ADV)、去羟肌苷(ddI)、扎西他淇滨(ddC)、拉杰夫定(3TC)等，但临床应用来看，核苷类药物对HIV-1的疗效不尽人意；1994年，经过4-5年的研究，非核苷类反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂开始被用于临床，主要包括奈韦拉平、沙奎那韦、RitonAvir和IndinAvir，这些药物可减少病毒量，增加CD4细胞计数，但单药疗效不佳，1995年开始使用多种药物的联合治疗，即高效抗病毒疗法(Highly Active Anti-retrovirAl therApyHAART)，目前研究发现，高效抗病毒疗法可以取得较好的治疗效果，可有效抑制病毒复制，对于HIV-1感染的治疗起到了十分重要的作用，它可以基本上完全清除血液中的游离HIV-1病毒粒子。但尽管如此，这种方法仍不能完全治愈艾滋病，其根本原因在于，在静止的CD4+记忆T淋巴细胞中存在HIV-1的潜伏感染，因此当停止使用高效抗病毒疗法的治疗性药物时，这种潜伏感染的HIV-1可随着原本处于静止状态的CD4+记忆T淋巴细胞的激活而再次复制，造成体内HIV-1病毒数量的反弹，同时抗逆转录病毒药物费用昂贵，并给患者身体带来严重累积毒性，还伴有病毒产生耐药的危险。对于这种状况，人们提出了两种可行的辅助治疗途径，第一种途径就是利用IL2激活原本处于静止状态HIV-1感染的CD4+记忆T淋巴细胞，激活的CD4+记忆T淋巴细胞可被机体的CTL反应所识别杀伤，另外感染的HIV-1本身也可对激活的CD4+记忆T淋巴细胞造成一定的破坏，从而使这些细胞崩解散并释放出HIV-1病毒粒子，这些病毒粒子则被机体的中和抗体及HAART药物所杀灭；另外一种治疗策略是利用重组毒素对HIV-1感染的靶细胞进行特异性杀伤破坏。
现研制的抗HIV-1重组毒素大多是利用人细胞表面特异性抗原(CD4或CD45RO等)，抗HIV-1结构蛋白的单抗(抗gp120，gp41单抗)作为导向载体；用作“弹头”的物质主要有三类，即放射性核素、药物和毒素。目前体外实验证明，重组毒素可特异性地杀伤被HIV-1感染的靶细胞，抑制病毒复制。
技术内容本发明的目的在于，提供针对HIV-1外膜蛋白，可有效识别并介导激活的CD8+淋巴细胞杀伤HIV-1感染靶细胞的两种抗HIV-1重组导向毒素。
本发明是由抗HIV-1跨膜糖蛋白gp41的单链抗体与葡萄球菌外毒素A构成，其核苷酸序列是ggatccagcg agaaaagcga agaaattaat gaaaaagatt tgcgtaaaaa gtctgaattg60
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本发明可导向杀伤HIV-1感染细胞，作为艾滋病的治疗药物。
本研究采用抗HIV-1外膜蛋白的单链抗体(single chain Fvfragment，ScFv)为导向载体是由于其有以下优点(1)ScFv由轻链可变区VL与重链可变区VH通过一个15肽接头(Gly4Ser)3的短肽连接而成，结构简单；(2)ScFv易于在大肠杆菌及真核细胞中表达；(3)ScFv被认为是具有高亲和力的最小抗体片段，分子量约为27kDA，组织穿透力强，适合导向治疗；(4)ScFv没有恒定区Fc片段，因而不能与非靶细胞上的Fc受体结合，特异性增强。采用的“弹头”为葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A，SEA)，SEA为一种超抗原，与普通抗原不同，它无需经抗原递呈细胞(APC)的加工处理，即可直接与APC膜上的主要组织相容性复合体(MHC)II类分子的肽结合沟外侧的高度保守区结合，使表达有T细胞抗原受体(TCR)Vβ区的T细胞大量激活，强烈诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性及产生各种细胞因子，如TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-6等。细胞因子可对HIV-1感染的细胞直接产生杀伤作用，而CTL在抗HIV-1抗体或相应受体介导下可杀伤HIV-1感染的细胞。
1、本发明得到的重组导向毒素，一方面可激活并清除HIV-1潜伏感染的静息CD4+记忆T淋巴细胞，防止停药后病毒反弹；另一方面可直接杀伤表达HIV-1抗原的感染细胞。
2、发明中所涉及的重组导向毒素，体外实验证明对健康细胞及组织无破坏作用。
3、发明中所涉及的重组导向毒素，对实验动物无明显毒副作用，不产生特异性病理变化。
图1是本发明的重组毒素的制备原理模式图；图2是本发明pBV-SL120/41质粒构建流程图；图3是本发明pPIC9K-SL120/41质粒构建图。
具体实施例方式本发明是由抗HIV-1跨膜糖蛋白gp41的单链抗体与葡萄球菌外毒素A构成，其核苷酸序列是ggatccagcg agaaaagcga agaaattaat gaaaaagatt tgcgtaaaaa gtctgaattg60cagggagcag ctttaggcaa tcttaaacaa atctattatt acaatgaaaa agctaaaact120gaaaataaag agagtcacga tcaattttta cagcatacta ttttgtttaa aggctttttt180acaaatcatt catggtataa cgatttatta gtagattttg attcaaagga tattgttgat240aaatataaag ggaaaaaagt agacttatat ggtgcttatt atggttatca atgtgcaggt300ggtacaccaa acaaaacagc ttgcatgtat ggtggtgtaa ctttacatga taataatcgt360
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tcaccatgga ccttcggcca ggggaccaag gtggaaatca aacgttctag atag 1494本发明利用重组导向病毒可激活HIV-1潜伏感染的静息的CD4+记忆T淋巴细胞，使之表达HIV-1蛋白，以被CTL识别并杀伤。
本发明可导向杀伤HIV-1感染细胞，作为艾滋病的治疗药物。
下面通过重组导向毒素表达质粒构建、制备与鉴定叙述本发明的
2.重组表达质粒的构建2.1用于原核表达的重组表达质粒pBV-SL120/pBV-SL41的构建用限制性内切酶BamH I+Hind III将ScFv120/ScFv41基因从质粒pKS-120/41中切下，回收ScFv120/ScFv41基因，定向插入pET28a中构建成质粒pET-120/pET-41，同时用人工合成的引物以质粒pMD-S为模板扩增SEA基因，目的是在其末端加入柔性连接肽序列，然后将扩增产物克隆入pGEM-T载体中，测序正确后再用限制性内切酶BamHI+Bgl II将其切下定向克隆入质粒pET-120/pET-41 ScFv120/ScFv41基因的上游，构建成质粒pET-SL120/pET-SL41，最后将SL120/SL41切下连入pBV220中，构建成表达质粒pBV-SL120/pBV-SL41。
(PCR引物上游引物5’-GGCCATGGAGCGAGAAAAGCG-3；下游引物5’-GGAGATCTAGATCCGCCTCCACCACTTGTATATAAATATATAGC-3’)(构建过程见图1)。
2.2用于真核表达质粒pPIC9-SL120/pPIC9-SL41的构建首先用限制性内切酶Spe I+Xba I酶切质粒pKS，回收大片段，Klenow补平后自身环化，命名为pKS`，此操作的目的是调整读码框。用BamH I+Xho I将基因从SL120/SL41质粒pET-SL120/pET-SL41中切下，回收，定向克隆入pKS`中，然后用Not I单酶切，回收SL120/SL41，连入质粒pPIC9K中，构建成质粒pPIC9-SL120/pPIC9-SL41(构建过程见图2)。
3.重组导向毒素的制备(1)重组导向毒素在大肠杆菌中的表达将构建的重组质粒pBV-SL120/pBV-SL41分别转化受体菌E.coliDH5α、E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)，进行温控诱导表达，分别对诱导表达的宿主菌、温度及表达时间进行优化，确定最佳表达条件，表达产物利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描测定表达量。
(2)重组导向毒素在酵母中的表达将构建的重组表达质粒pPIC9-SL120/pPIC9-SL41线性化，电击法转化酵母GS115感受态细胞，挑选在MD板生长快而在MM板生长缓慢的菌落，YPD扩菌后用玻璃珠法提取酵母基因组，以所提基因组为模板PCR扩增，挑选外源基因整合入酵母基因组内的阳性菌，然后对这些菌进行甲醇诱导表达，挑选高表达菌株，同时对培养基和表达时氧饱和度等条件进行优化。
(PCR引物上游引物5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3；下游引物5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)(3)原核表达重组导向毒素的制备用1/10培养基体积50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)、2mmol/LEDTA(pH8.0)溶液重悬表达菌体，加溶菌酶(10mg/ml)至终浓度100μg/ml，加1/10体积的1％Triton X-100，振荡混匀，30℃水浴15min；置冰浴中超声波处理或加DNA酶I(1mg/ml)至终浓度20μg/ml室温放置至不再粘稠；分别利用5％TritonX100约30ml洗涤包涵体两次，再利用2％DOC(脱氧胆酸盐)按每克菌/6ml洗涤包涵体一次，用含1M NaCl的Tris-Cl(pH8.0)缓冲液洗涤包涵体，按每克菌/6ml脲溶解包涵体，4℃12000rpm离心20分钟后，对变性包涵体进行复性，建议以下复性体系蛋白的初始浓度为30-50ug/ml，50mM Tris-HCl PH8.5，1M脲，1Mm GSH，0.1M GSSG，2mM MT，放于10-20℃冷室中复性20小时，用2000ml 50mM Tris-Hcl(pH8.0)缓冲液于4℃透析，每12小时换液一次，共48小时，超滤浓缩，利用离子交换树脂对复性产物进行纯化，纯化产物-20℃冻存备用。
(4)真核表达重组导向毒素的制备将挑选阳性的酵母工程菌按优化的表达条件进行诱导表达，培养液4℃离心10000rpm10分钟，取上清液，加入固体(NH4)2SO4达所需饱和度，室温放置过夜。10000rpm离心10分钟，获得含有目的蛋白的沉淀。沉淀用2ml 0.01mol/l的磷酸盐缓冲液溶解后，上样于SephadexG-100凝胶过滤层析柱，并用同种磷酸盐缓冲液洗脱(流速为30ml/h)。分别收集不同洗脱峰的洗脱液，并用DOt-ELISA进行检测，纯化产物-20℃冻存备用。
4.单链抗体的抗原结合活性测定利用HIV-1血清抗体标准检测膜条，采用蛋白印迹法对单链抗体进行活性测定，所用一抗为抗gp160单克隆抗体，具体操作如下利用封闭液(10mmol/L Tris-Cl pH7.5、150mmol/L NaCl、2％Tween20、3％BSA)浸泡HIV-1血清抗体标准检测膜条，室温封闭2小时，以封闭无关蛋白质结合位点，回收封闭液；用洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5、0.15mol/L NaCl、0.05％Tween20)漂洗膜条3次，每次5分钟；用含0.4％BSA的洗涤缓冲液1∶10稀释待检单链抗体，与HIV-1血清抗体标准检测膜条进行反应；室温反应2小时；回收抗体，用洗涤缓冲液洗涤HIV-1血清抗体标准检测膜条3次，每次5分钟；倾去洗涤缓冲液后加入用含0.4％BSA的洗涤缓冲液1∶200稀释的表达HIV-1 gp160抗原的人肝癌细胞(SMMC7721)，室温反应2小时，回收抗原，用洗涤缓冲液洗涤HIV-1血清抗体标准检测膜条3次，每次5分钟；后与用含0.4％BSA的洗涤缓冲液1∶200稀释的抗HIV-1 gp160单克隆抗体反应，室温作用2小时，回收抗体，用洗涤缓冲液洗涤HIV-1血清抗体标准检测膜条3次，每次5分钟；用含0.4％BSA的洗涤缓冲液1∶7500稀释碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体，与HIV-1血清抗体标准检测膜条进行反应，室温作用2小时；回收抗体，用洗涤缓冲液漂洗硝酸纤维素膜3次，每次5分钟。取0.5gNBT溶于10ml 70％二甲基甲酰胺溶液中配制NBT液；取0.5gBCIP溶于10ml 100％二甲基甲酰胺溶液中配制BCIP液。将33μl NBT液和16.5μl BCIP液依次加入碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/LNAC1、5mmol/LMgCl 2、100mmol/L Tris·Cl pH9.5)混匀，配制NBT/BCIP显色液。用碱性磷酸酶缓冲液漂洗硝酸纤维素膜后，加入显色液进行显色。显色完成后，将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中终止显色。
5.重组导向毒素的生物学活性测定为了验证所得到的产物是安全有效的生物活性物质，本发明对目的蛋白进行了一般性药理、药效、及急性和亚急性动物毒性试验。
(1)细胞杀伤作用效应细胞的制备用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核淋巴细胞(PMBC)，使细胞密度达1×106/ml，加入一定浓度纯化的重组导向毒素和100IU IL2，4℃孵育30分钟。
靶细胞的制备(HIV-1强毒操作需在P3级实验室进行)，将传代的淋巴肿瘤细胞MT4调整细胞密度为106/ml，接入B亚型HIV-1，感作2小时后，去除病毒，更换健康M-1640完全细胞培养基，于37℃、5％CO2下培养过夜，用完全培养液调整细胞浓度至1×105。
细胞杀伤试验按细胞毒测定试剂盒的说明书进行。即按效应细胞和靶细胞50∶1和25∶1两个效靶比在圆孔96孔培养板的培养孔中加入细胞，每孔液体总体积为200μl，设两个复孔。用96孔板水平转头500rpm离心5min，37℃5％CO2培养4-6h。1000rpm离心5min，每孔吸取100μl上清，加于另一ELISA反应板的孔中，每孔中加入新鲜配置的底物液50μl，室温避光反应30min后，每孔加入50μl终止液，终止酶促反应。在酶联检测仪494nm波长下读取各孔OD值，CTL活性用杀伤率表示，按如下公式计算 (2)抗原亲和力测定利用液相阻断ElISA法，具体步骤如下ELISA板每孔用50μl的鼠抗HIV-1gp120(或鼠抗HIV-1gp41)单克隆抗体包被，并置于室温下湿盒内过夜；在“U”型的多孔板内，将每一份被检重组导向毒素制备成2份50μl，两倍连续稀释，起始滴度为1∶4，向每一孔内加入50μl重组HIV-1Env抗原，混合物于4℃过夜，或在37℃孵育1h，加入抗原使重组导向毒素的起始稀释度上升到1∶8；用PBS液将ELISA板洗涤5次；将50μl重组导向毒素/抗原混合液从载体转移到鼠抗HIV-1gp120(或鼠抗HIV-1gp41)单克隆抗体包被的ELISA板中，置于旋转震荡器上孵育1h；每孔滴加50μl前一步使用的相同病毒抗原的人抗血清，置于旋转震荡器上孵育1h；每孔加入羊抗人免疫球蛋白辣根过氧化物酶结合物，置于旋转震荡器上37℃孵育1h，洗板；显色每孔加50μl含有0.05％H2O2(30％W/V)的联苯二胺溶液；
终止用50μl 1.25M硫酸溶液终止反应15min；测定 将ELISA板置于分光光度计上，在490nm条件下读取光吸收值；对照对照由下列各项组成对于每一个使用的抗原，用4-8孔，不加重组导向毒素只加50μl用PBS(含有0.05％Tween-20和酚红指试剂)稀释的抗原；对应的人标准抗血清，2倍连续稀释，每个稀释度2孔；阴性人血清，2倍连续稀释，每个稀释度2孔。
重组导向毒素与鼠抗HIV-1gp160单克隆抗体平行作。
测定结果证明重组毒素具有与鼠抗HIV-1gp160单克隆抗体相同的抗原亲和力。
(3)毒理学检查动物静脉注射相当于人用剂量100倍的抗HIV-1重组毒素，通过动物的生长状况及病理学检查测定重组毒素对实验动物的毒副作用，结果表明，抗HIV-1重组毒素没显示出明显的毒副作用。
研究结果证明，抗HIV-1重组导向毒素是一种安全、有效的新型融合蛋白，具有开发利用成为新的艾滋病治疗药物的良好前景。
权利要求
1.一种抗HIV-1重组导向毒素，其特征在于是由抗HIV-1跨膜糖蛋白gp41的单链抗体与葡萄球菌外毒素A构成，其核苷酸序列是ggatccagcg agaaaagcga agaaattaat gaaaaagatt tgcgtaaaaa gtctgaattg60cagggagcag ctttaggcaa tcttaaacaa atctattatt acaatgaaaa agctaaaact120gaaaataaag agagtcacga tcaattttta cagcatacta ttttgtttaa aggctttttt180acaaatcatt catggtataa cgatttatta gtagattttg attcaaagga tattgttgat240aaatataaag ggaaaaaagt agacttatat ggtgcttatt atggttatca atgtgcaggt300ggtacaccaa acaaaacagc ttgcatgtat ggtggtgtaa ctttacatga taataatcgt360ttgaccgaag agaaaaaagt gccaatcaat ttatggcttg acggtaaaca aaatacagta420cctttggaaa cagttaaaac aaataagaaa aatgtaactg ttcaggagtt ggatcttcaa480gcacgtcgtt atttacagga aaaatataat ttatataact ctgatgtttt tgatgggaag540gttcagcgtg gattaatcgt gtttcatact tctacagaac cttctgttaa ttacgattta600tttggtgctc aaggacagaa ttcaaataca cttttacgta tttatcgtga taataaaacc660attaactctg aaaacatgca tattgctatt tatttatata caagtggtgg cggcggatct720agatcccagg tgcagctggt gcagtctggg gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg780cgtgtttcct gcaaggcatc tggacacacc ttcaccggcc actacactca ctgggtgcgt840ctggcccctg gacaaggact tgagtggatg ggagttatct accctagtgg tggttccact900aactacgcac agaagttcca ggaccgcgtc accatcaccc gtgacacctc caccaacact960gtctacatgg aactgagtac cctgcgttct gaggacaccg ccatctattt ctgtgcacgc1020ccatttatga accagctgcg taacgctctg gatatctggg gccaagggac aatggtcact1080gtctcttcag gtggtggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcagaaatt 1140gtgctgactc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaacgtgc caccctgtcc 1200tgccgtgcca gtcagagtgt tagcagcagc tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 1260gaggctccac gccttctgat ctatggtgca tccagccgtg ccactggcat cccagaccgt 1320ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actcttacca tcagccgtct ggagccagaa 1380gattttgcag tgtattactg tcagcagtat ggtcgctcat ccttcacttt cggccctggg 1440acacgcctgg agattaaacg ttctagatag 1470
2.根据权利要求1所述的抗HIV-1重组导向病毒，其特征在于是由抗HIV-1表面糖蛋白gp120的单链抗体与葡萄球菌外毒素A构成，其核苷酸序列是ccatggagcg agaaaagcga agaaattaat gaaaaagatt tgcgtaaaaa gtctgaattg 60cagggagcag ctttaggcaa tcttaaacaa atctattatt acaatgaaaa agctaaaact 120gaaaataaag agagtcacga tcaattttta cagcatacta ttttgtttaa aggctttttt 180acaaatcatt catggtataa cgatttatta gtagattttg attcaaagga tattgttgat 240aaatataaag ggaaaaaagt agacttatat ggtgcttatt atggttatca atgtgcaggt 300ggtacaccaa acaaaacagc ttgcatgtat ggtggtgtaa ctttacatga taataatcgt 360ttgaccgaag agaaaaaagt gccaatcaat ttatggcttg acggtaaaca aaatacagta 420cctttggaaa cagttaaaac aaataagaaa aatgtaactg ttcaggagtt ggatcttcaa 480gcacgtcgtt atttacagga aaaatataat ttatataact ctgatgtttt tgatgggaag 540gttcagcgtg gattaatcgt gtttcatact tctacagaac cttctgttaa ttacgattta 600tttggtgctc aaggacagaa ttcaaataca cttttacgta tttatcgtga taataaaacc 660attaactctg aaaacatgca tattgctatt tatttatata caagtggtgg cggcggatct 720agatccgagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gcgttccctg 780cgtctttcct gtgcagcctc tgaattcacc ttcaatcgtt atgatatgca ctgggtccgt 840caggctccag gcaaggggct ggcatgggtg gcagttattt cacatgatgg aagcagtaaa 900gattacgcag actccgtgaa gggccgtttc accatctccc gtgacaattc caagaacacc 960ctgtatctgc aagtgaacag cttgcgtgct gacgacaccg ctgtgtactt ctgtgcacgt 1020ggcgcaatga aagactacga tttctggagt ggttaccgtc acttgggtgc ttttgatatc 1080tggggccaag gcaccctggt cactgtctcc tcaggtggtg gcggttcagg cggaggtggc 1140tctggcggtg gcggatcaga aattgtgctg actcagtctc caggcaccct gtctttgtct 1200ccaggggaac gtgccaccct gtcctgccgt gccagtcaga gtgttagcag cagctactta 1260gcctggtacc agcagaaacc tggccaggct ccacgtctgc tgatctatgg tgcatccagc 1320cgcgccactg gcatcccaga ccgcttcagt ggcagtgggt ctgggacaga cttcactctg 1380accatcagcg gactggagcc tgaagatttt gcagtgtatt actgtcagca gtatggtagc 1440tcaccatgga ccttcggcca ggggaccaag gtggaaatca aacgttctag atag1494
3.根据权利要求1或2所述的抗HIV-1重组导向病毒，其特征在于利用重组导向病毒可激活HIV-1潜伏感染的静息的CD4+记忆T淋巴细胞，使之表达HIV-1蛋白，以被CTL识别并杀伤。
4.根据权利要求1或2所述的抗HIV-1重组导向病毒，其特征在于可导向杀伤HIV-1感染细胞，作为艾滋病的治疗药物。
全文摘要
本发明提供抗HIV－1重组导向毒素，属于生物技术领域。重组导向毒素分别由抗HIV－1表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41的单链抗体与金黄色葡萄球菌外毒素A(Staphylococcus enterotoxin A，SEA)融合共表达制备。此重组导向毒素可对HIV－1感染的靶细胞进行特异性杀伤破坏，可用于作为艾滋病病毒感染的治疗药物。
文档编号A61P31/18GK1621418SQ200310110098
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月26日 优先权日2003年11月26日
发明者金宁一, 王宏, 金洪涛, 张立树, 金扩世, 夏志平, 徐一鸣 申请人:中国人民解放军军需大学军事兽医研究所