专利名称：转基因合成的人i型胶原融合蛋白神经基质膜仿生材料的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种用于神经再生领域的神经基质膜仿生材料，具体关于一种用于神经损伤修复的转基因合成的人I型胶原融合蛋白神经基质膜仿生材料。
背景技术：
缺损神经的修复与功能的重建是人类尚待攻克的难题之一。人工神经导管桥接术是一种很有应用前景的缺损神经修复方法，是组织工程学、材料学、生物学、医学界共同关注的一大热点。从目前的研究现状看，主要通过各种生物相容性和可降解性材料，如牛胶原蛋白、聚乳酸、聚乙交酯丙交酯、聚壳聚糖等，加工为中空管或再在其中内置与轴平行的纤维、海绵等，在缺损神经的近体端和远体端搭桥，营造一个有利于再生功能发挥的微环境，阻止周围结缔组织的长入，诱导神经沿导管方向再生。在修复过程中，导管材料也逐渐降解被生物体吸收。并且以此类材料为基体通过物理吸附、微包囊、化学键合、使用前注射等方式在材料上结合各种神经再生促进剂，如成年蛋白(Laminin)、神经细胞粘附蛋白(NCAM)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等，以促进神经的再生；或进行雪旺细胞或干细胞培养，以构筑组织工程化人工神经导管。
尽管神经导管桥接术的研究已取得者多进展，但离临床上取代自体神经移植修复周围神经缺损还有相当的距离。其主要原因在于目前导管材料所提供的功能还不能完全满足轴突再生这一精确复杂的生理过程的要求。如聚乳酸、聚乙交酯丙交酯等具有良好的成型加工性与可降解特性、生物相容性等，但对神经细胞缺乏明显生长促进作用，必须以各种方式结合胶原蛋白、神经再生促进剂等，促进神经的再生。由于已知的三十多种神经再生促进剂大多为低分子量可溶蛋白，使用时存在作用时间过短、易流失扩散等问题。同时，聚乳酸、聚乙交酯丙交酯的酸性降解产物易引起炎症反应，使再生神经纤维组织化，中空管变得狭小，影响轴突延伸生长。又如I型胶原蛋白对神经再生具有促进作用、可成型加工性与可降解特性、生物相容性等，但它主要从动物肌腱、皮肤等中提取，由于安全与免疫原性，人们对使用动物的外源胶原有一定顾虑，但从人胎盘中大量获取胶原又不现实。而且单独使用该材料还不能满足应用要求，必须每次都添加昂贵的各类神经再生促进剂。因此，在推动神经导管桥接术临床应用的过程中，非常需要研究一种类似神经基质膜功能的神经导管仿生材料，材料本身既具有良好的成型加工性能，同时又能长效地为轴突的再生提供引导与营养作用，以更好地满足神经再生过程的要求。
发明内容
本发明提供一种转基因合成的人I型胶原融合蛋白神经基质膜仿生材料，它是通过转基因合成的人I型胶原融合蛋白或其变体。该融合蛋白或其变体可配制成0.5-10重量％的水溶液，进一步加工成纤维或其它形状。
本发明构思是基于基因决定所生成蛋白质的功能及特性的理论。首先将能提供加工及营养功能的人I型胶原蛋白的基因通过转基因合成与能提供粘附导向及再生促进作用的神经再生促进剂的基因构建融合基因。在这融合基因的密码指令控制指挥下，特定种类数量的氨基酸就按照特定的顺序在一合适的表达体系中组装起来，表达生成具有人I型胶原蛋白结构域及具有神经再生促进剂结构域的融合蛋白。神经再生促进剂可以选自成年蛋白(Laminin)神经细胞粘附蛋白(NCAM)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)或脑源性神经营养因子(BDNF)等。该融合蛋白也可通过采用基因定点突变调控融合蛋白一级结构中氨基酸的种类而构建成融合基因变体，再通过表达生成融合蛋白变体。通过改变特定位置氨基酸的极性、电荷数，可对人I型胶原蛋白某些不尽如人意的性能进行调控，进而可改善其加工性能，包括增加粘度，流变性、稳定性、降解性、溶胀性等。该融合蛋白或其变体是一种具有极高生物活性的新型转基因人I型胶原融合蛋白神经基质膜仿生材料。它可配制成0.5-10重量％的水溶液，进一步通过纺丝加工成纤维，或冻干成纤维状，或浇铸成管形、平板膜等其它形状。该材料既具有神经细胞生长所需的特定引导识别，再生促进及营养功能，又具有可成形加工特性。
本发明人I型胶原融合蛋白的转基因合成方法，下面以人I型胶原蛋白基因与神经细胞粘附蛋白基因为例，通过转基因合成方法，构建成具有人I型胶原蛋白结构域及神经细胞粘附蛋白结构域的融合蛋白。方法包括如下步骤1、构建融合质粒采用PCR方法，将人I型胶原蛋白基因片段克隆到载体上或将人I型胶原蛋白基因及NCAM基因克隆到载体上，并采用后修饰酶方法插入某种酶基因(例如脯氨酰-4-羟化酶基因、二氢叶酸还原酶基因、甲基化酶基因)，以克服表达产物生物活性可能较低的缺陷，构建成重组质粒1(图1)或融合质粒2(图2)。也可采用基因定点突变方法，调控对应的融合蛋白一级结构中氨基酸的种类，构建成重组质粒1变体或融合质粒2变体。
2、融合蛋白的表达及分离纯化选取传代迅速、操作简便的一种表达体系(例如E.coli体系、Sf9表达体系、酵母表达体系等)，在该体系中高效表达融合蛋白或其变体。表达产物经过电泳分离后，通过Western Blotting鉴定，再通过层析柱进行分离纯化，冷冻干燥，得冻干粉产物人I型胶原蛋白(a)或其变体(b)，人I型胶原蛋白基因与NCAM基因的融合蛋白(c)或其变体(d)。
融合蛋白仿生材料的应用将上述所得蛋白(融合蛋白)或其变体的冻干粉产物(a)、(b)、(c)和(d)分别配制成0.5-10重量％的水溶液，可进一步通过纺丝加工成纤维，或冻干成纤维状，或浇铸成管形、平板膜等其它形状。例如通过纺丝加工制成纤度0.8-2.8克/袋长丝的纤维，凝固液为乙醇与丙酮的混合溶液(乙醇∶丙酮＝10-90∶100)，凝固浴液浸长0.5-3m，浴温25℃左右，喷丝头孔数2000-15000，孔径0.07-0.15mm，纺丝速度3-30m/min，成型后经过水洗工序，去掉凝固液与可溶性杂质，即得纤维。纤维线密度为1.0-10dtex，断裂强度为1.0-3.0CN/dtex，断裂伸长率为2％-30％。
本发明仿生材料加工成的纤维，可进一步通过圆编法编织成管，外管径0.8-5.0mm，管壁厚度0.05-0.5mm，可作为缺损神经修复的人工神经导管应用，以模拟神经基质膜的功能与作用，引导轴突的粘附、延伸、生长、促进神经的再生及功能的恢复。或直接通过中空湿法成型获得中空导管。纤维或平板膜还可应用于矫形、整形等医学美容方面，促进创面愈合、创面止血或作为手术残腔填充物。
分别测定(a)、(b)、(c)和(d)四种冻干粉产物的营养特性及加工特性。营养特性以细胞增殖度为指标，测定值为50-99％。冻干粉的营养特性越高，神经细胞轴突生长锥的活性受其影响也会相应提高，因而使细胞增殖度增加。加工性能主要以表观粘度为指标，测定值为0.4-1.0PaS，在一定范围内，表观粘度越大，加工性能越好。测定结果参见实施例6。
本发明转基因合成的人I型胶原融合蛋白神经基质膜仿生材料的优点由于其中神经再生促进剂通过生物合成方法结合进人I型胶原结构中，解决了添加神经再生促进剂方法造成的扩散流失、容易降解等问题；同时具有极高生物活性与粘附引导、营养功能，具有更多的综合仿生功能，更能模拟神经轴突再生过程中基质膜的功能与作用，满足生物体的复杂需要；生物相容性更好，安全隐患大为减少；且成形加工性、溶胀性得以改进，降解过程更易控制；该仿生材料用转基因合成，融合质粒一次构建成功，可通过表达纯化反复无限次生物合成，大规模生产的成本低廉；本发明同时也为大量低成本地构筑具有特定功能与安全性的组织工程骨架材料(如转基因骨、转基因皮肤基体材料)、环保功能性纺织材料等开辟了新思路。
图1是重组质粒1的构建图。
图2是融合质粒2的构建图。
具体实施例方式
实施例1 人I型胶原基因重组质粒的构建人I型胶原基因片段序列ATGCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGCTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 60ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGAAGG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 120CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 180GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 240CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TAGAGGCCCA 300CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 360GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 420GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 480CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 540
CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCAA GGGAGAACCA 600GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 660AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 720CCCACTGGAC CTGCA 735(引自Wendt P.，et a1.，Eur.J.Biochem.30(1)，1972，30(1)169-183)用PCR方法，以人I型胶原基因片段为模板，在人I型胶原基因片段两端合成具有与表达载体插入位点匹配的限制酶切点，将线状基因片段定位插入PUC18载体(中国科学院典型培养物保藏委员会基因库)，并采用后修饰酶方法插入脯氨酰-4-羟化酶基因，以克服该体系表达产物生物活性较低的缺陷，构建重组质粒1(见图1)。
具体步骤如下(1)PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)合成PCR引物，引物序列为P1 5’GGGGATCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCCTCAGCTTTGTGGAT3’P25’CCGGATCCTTATGCAGGTCCAGTGGG 3’在100ul反应体系中，含5ul 2mM dNTP，5’及3’引物各50pmol，模板DNA 5ug。90℃变性5min，50℃退火10min，加入Taq酶，混匀，再加入60ul液体石蜡油，离心后按90℃变性1min，50℃退火1min，72℃反应1min，共循环30次。72℃延长50min，10℃放置10hr。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。产物溶于TE buffer。
(2)质粒提取挑取单个克隆接种于LB液体培养基中，37℃培养12hr。收集菌液，8000rpm离心3min，弃上清。加入预冷的溶液1100ul，振荡，加入溶液II200ul，冰浴5min，加入150ul溶液III，冰浴10min。8000rpm离心10min，取上清，加入RNase至终浓度10ug/ml，37℃消化30min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。产物溶于TE buffer，4℃保存。
(3)酶切与连接用限制性内切酶消化DNA，T4 DNA连接酶连接8hr。
(4)转化挑取单个克隆接种于LB液体培养基中，37℃培养12hr。按1/200的比例接种于LB液体培养基中，培养至OD＝0.6。6000rpm离心10min，收集菌体。加入1ml预冷的100mMCaCl2悬浮菌体，冰浴10min。4℃ 6000rpm离心10min，收集菌体。加入100ul预冷的100mMCaCl2悬浮菌体，冰浴12hr。将连接产物加入100ul感受态细胞中，混匀，冰浴30min。热震荡90秒，加入400ulLB培养基，37℃培养5hr。涂板，倒置培养12hr。
(5)测序，核苷酸序列见序列表中序号1(6)后修饰技术采用后修饰酶方法插入脯氨酰-4-羟化酶基因，以克服该体系表达产物生物活性可能较低的缺陷。
实施例2人I型胶原基因重组质粒变体的构建采用基因定点突变方法，调控实施例1对应的融合蛋白一级结构中氨基酸的种类，将K33→A、R98→G、K197→A，构建成融合质粒1的变体，变体的核苷酸序列见序列表中序号2。
实施例3 NCAM基因/人I型胶原基因融合质粒的构建NCAM基因片段序列GCTGCCTGCC GACACCACAG CCACTGTCGA GGACATGCTG CCTTCTGTCA CCACCGTCAC 60CACTAACTCT GACACTATCA CCGAAACCTT TGCCACTGCT CAGAACAGCC CTACCAGTGA 120GACCACTACA CTGACCTCCA GTATTGGCCC ACCGGCCACA ACTGTGCCAG ACTCAAATTC 180TGTGCCCGCT GGTCAGGCCA CCCCTTCCAA GGGTGTCACT GCTTCATCCT CGTCCCCAGC 240CTCAGCCCCC AAAGTTGCTC CTCTGGTTGA CCTGAGTGAT ACTCCAACTT CAGCTCCCTC 300TGCTAGCAAT CTGTCCTCCA CTGTCTTGGC TAACCAAGGA GCTGTACTCA GGAACTTCAA 360CCCTGCCAGT GCGGGAGAGA CCTCCAAGGC CCCTCCAGCC AGTAAGGCCT CCCCTGCTCC 420CACCCCCACT CCAGCTGGGG CAGCCAGCCC CTTAGCAGCA GTAGCCGCCC CTGCCACAGA 480
TGCCCCCCAG GCCAAGCAGG AAGCCCCCAG CACCAAAGGT CCGGACCCAG AGCCCACCCA 540GCCTGGCACC GTGAAGAACC CACCTGAGGC AGCCACAGCC CCTGCTAGCC CGAAGAGCAA 600GGCTGCAACC ACAAACCCTT CCCAGGGCGA GGACTTAAAA ATGGACGAAG GGAACTTCAA 660GACCCCAGAT ATTGACCTTG CAAAGGATGT TTTTGCAGCC CTGGGCTCTC CTCGTCCCGC 720CACTGGGGCC AGTGGACAAG CCTCTGAGCT TGCTCCTTCA CCTGCAGACA GCGCTGTGCC 780TCCCGCACCA GCAAAGACCGA 801(引自Kasper C.，et al.，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，1999，55(9)1598-1600)参照实施例1，分别以人I型胶原基因片段、NCAM基因片段为模板，通过PCR方法、限制性酶切技术、连接、转化等一系列基因工程技术，构建NCAM基因/人I型胶原基因融合质粒2(见图2)，核苷酸序列见序列表中序号3。并通过插入脯氨酰-4-羟化酶基因，以克服该体系表达产物生物活性较低的缺陷。
实施例4 NCAM基因/人I型胶原基因融合质粒变体的构建采用基因定点突变方法，调控实施例3对应的融合蛋白一级结构中氨基酸的种类，例如将K293→A、R358→G、K457→A，构建成融合质粒2的变体，变体的核苷酸序列见序列表中序号4。
实施例5-8 实施例1、实施例2、实施例3、实施例4基因的表达选取传代迅速、研究操作简便的E.Coli表达体系，经ITPG诱导技术，在该体系中高效表达，获得四种高生物活性、高表达的人I型胶原蛋白(a)或其变体(b)及人I型胶原/NCAM的融合蛋白(c)或其变体(d)。
将表达产物分别经还原与非还原12％SDS-PAGE分离，Bio-Rad凝胶转移仪转移60min。用封阻液封阻NC膜5hr。加入一抗反应10hr，用封阻液洗三次。二抗按1∶10∶200稀释后与NC膜反应5hr，用封阻液洗三次。TBS洗膜2次，每次5min。将NC膜浸于20ml TBS+10mg DAB+20ul H2O2中显色。SDS-PAGE显示表达所得蛋白的分子量分别为实施例5-21kD、实施例6-21kD、实施例7-56kD、实施例8-56kD。用GST融合蛋白亲合层析柱(Pharmacia Biotech公司)进行分离纯化，收集产物，在冻干机上冷冻干燥过夜，产物为冻干粉(a)、(b)、(c)及(d)。以12％的SDS-PAGE鉴定纯度，产物纯度都达90％以上。
四种转基因蛋白产物用氨基酸序列分析仪测序，结果见序列表中序号5，6，7，8。
实施例9融合蛋白溶液的纺丝将实施例5-8中四种转基因蛋白产物冻干粉(a)(b)(c)及(d)分别配制成5％的水溶液，采用湿法纺丝。凝固浴由乙醇与丙酮的混合溶液组成(乙醇∶丙酮＝30-50∶100)，凝固浴液浸长1m，浴温25℃左右，喷丝头孔数3000，孔径0.09mm，纺丝速度8m/min，成型后经过水洗工序，去掉凝固液与可溶性杂质。制成纤维单丝纤度1.5dtex，断裂强度2.0CN/dtex，伸长率15％的纤维。再通过圆编法编织成人工神经导管，外管径1.0mm，管壁厚度0.1mm。
分别测定四种冻干粉的营养特性及加工特性。营养特性以细胞增殖度为指标测定值为50-99％，加工性能以表观粘度为指标，测定值为0.4-1.0PaS(测定方法参见国家技术监督局.G B/T 16886-1997医疗器械生物学评价；Bao QB，et al.，Biomaterials，1996，171157)。
细胞增殖度测定如下将TF1细胞配制成1×104-5×104/ml的细胞悬液，分别注入含有培养液的培瓶中，37℃恒温培养箱培养24小时，测试组弃去原培养液，更换为测试物浸提液。更换后2、4、7天，测试组和对照组每组各取三瓶，用分光光度计测定OD588nm。细胞增殖度＝测试组平均值/对照组平均值×100％。
表观粘度可采用旋转粘度计，按照常规方法测定。
测定结果如表1所示
表1
序列表<110>东华大学<120>转基因合成的人I型胶原融合蛋白神经基貭膜仿生材料<130>SPI038382<160>8<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>735<212>DNA<213>人工序列<220.
<221>CDS<400>1ATGCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGGTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 60ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGAAGG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 120CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 180GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 240CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TAGAGGCCCA 300CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 360GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 420GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 480CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 540CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCAA GGGAGAACCA 600GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 660AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 720CCCACTGGAC CTGCA 735<210>2<211>735<212>DNA<213>人工序列<220.
<221>CDS<400>2ATGCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGCTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 60ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGGCAG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 120CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 180GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 240CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TGGCGGCCCA 300CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 360GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 420
GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 480CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 540CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCGC AGGAGAACCA 600GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 660AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 720CCCACTGGAC CTGCA 735<210>3<211>1515<212>DNA<213>人工序列<220.
<221>CDS<400>3GCTGCCTGCC GACACCACAG CCACTGTCGA GGACATGCTG CCTTCTGTCA CCACCGTCAC 60CACTAACTCT GACACTATCA CCGAAACCTT TGCCACTGCT CAGAACAGCC CTACCAGTGA 120GACCACTACA CTGACCTCCA GTATTGCCCC ACCGGCCACA ACTGTGCCAG ACTCAAATTC 180TGTGCCCGCT GGTCAGGCCA CCCCTTCCAA GGGTGTCACT GCTTCATCCT CGTCCCCAGC 240CTCAGCCCCC AAAGTTGCTC CTCTGGTTGA CCTGAGTGAT ACTCCAACTT CAGCTCCCTC 300TGCTAGCAAT CTGTCCTCCA CTGTCTTGGC TAACCAAGGA GCTGTACTCA GGAACTTCAA 360CCCTGCCAGT GCGGGAGAGA CCTCCAAGGC CCCTCCAGCC AGTAAGGCCT CCCCTGCTCC 420CACCCCCACT CCAGCTGGGG CAGCCAGCCC CTTAGCAGCA GTAGCCGCCC CTGCCACAGA 480TGCCCCCCAG GCCAAGCAGG AAGCCCCCAG CACCAAAGGT CCGGACCCAG AGCCCACCCA 540GCCTGGCACC GTGAAGAACC CACCTGAGGC AGCCACAGCC CCTGCTAGCC CGAAGAGCAA 600GGCTGCAACC ACAAACCCTT CCCAGGGCGA GGACTTAAAA ATGGACGAAG GGAACTTCAA 660GACCCCAGAT ATTGACCTTG CAAAGGATGT TTTTGCAGCC CTGGGCTCTC CTCGTCCCGC 720CACTGGGGCC AGTGGACAAG CCTCGGAGGA GGAGGAYCCG GAGGAGGAGG CTCCGGCGGC 780GGCCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGCTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 840ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGAAGG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 900CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 960GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 1020CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TAGAGGCCCA 1080CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 1140GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 1200GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 1260CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 1320CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCAA GGGAGAACCA 1380GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 1440AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 1500CCCACTGGAC CTGCA 1515<210>4<211>1515<213>DNA<213>人工序列<220.
<221>CDS
<400>4GCTGCCTGCC GACACCACAG CCACTGTCGA GGACATGCTG CCTTCTGTCA CCACCGTCAC 60CACTAACTCT GACACTATCA CCGAAACCTT TGCCACTGCT CAGAACAGCC CTACCAGTGA 120GACCACTACA CTGACCTCCA GTATTGCCCC ACCGGCCACA ACTGTGCCAG ACTCAAATTC 180TGTGCCCGCT GGTCAGGCCA CCCCTTCCAA GGGTGTCACT GCTTCATCCT CGTCCCCAGC 240CTCAGCCCCC AAAGTTGCTC CTCTGGTTGA CCTGAGTGAT ACTCCAACTT CAGCTCCCTC 300TGCTAGCAAT CTGTCCTCCA CTGTCTTGGC TAACCAAGGA GCTGTACTCA GGAACTTCAA 360CCCTGCCAGT GCGGGAGAGA CCTCCAAGGC CCCTCCAGCC AGTAAGGCCT CCCCTGCTCC 420CACCCCCACT CCAGCTGGGG CAGCCAGCCC CTTAGCAGCA GTAGCCGCCC CTGCCACAGA 480TGCCCCCCAG GCCAAGCAGG AAGCCCCCAG CACCAAAGGT CCGGACCCAG AGCCCACCCA 540GCCTGGCACC GTGAAGAACC CACCTGAGGC AGCCACAGCC CCTGCTAGCC CGAAGAGCAA 600GGCTGCAACC ACAAACCCTT CCCAGGGCGA GGACTTAAAA ATGGACGAAG GGAACTTCAA 660GACCCCAGAT ATTGACCTTG CAAAGGATGT TTTTGCAGCC CTGGGCTCTC CTCGTCCCGC 720CACTGGGGCC AGTGGACAAG CCTCGGAGGA GGAGGAYCCG GAGGAGGAGG CTCCGGCGGC 780GGCCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGATTTTG TTGCTGCTCG CAGTAACTTC ATACCTAGCA 840ACAAGCCAAC ATGTGAGTGA GGCATCTGCA GGGCGGGCAG GCCCTAGAGG AGACAAAGGG 900CCACAGGGAG AAAGGGGTCC ACCAGGTCCA CCAGGCAGAG ATGGTGAAGA CGGCCCACCA 960GGTCCTCCAG GCCCCCCTGG TCCTCCAGGT CTTGGCGGAA ATTTTGCTGC TCAGTATGAT 1020CCATCTAAAG CGGCTGACTT TGGCCCCGGA CCTATGGGTT TAATGGGACC TGGCGGCCCA 1080CCTGGAGCAT CTGGACCTCC TGGTCCTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 1140GAACCTGGTC AAACAGGTCC CCAGGGTCCT CGTGGTCCCC CTGGTCCTCC AGGAAAGGCT 1200GGTGAAGATG GTCACCCTGG CAAACCTGGA AGACCTGGTG AGAGGGGTGT TGCTGGTCCT 1260CAAGGTGCTC GTGGTTTCCC TGGAACTCCT GGTCCGCCTG GCTTTAAGGG AATTAGGGGA 1320CACAATGGTC TGGATGGTTT AACGGGACAA CCTGGTGCTC CTGGCACCGC AGGAGAACCA 1380GGAGCCCCTG GTGAAAATGG AACCCCAGGA CAACCTGGTG CTCGCGGTCT CCCTGGTGAG 1440AGAGGAAGAA TAGGTGCCCC TGGACCTGCT GGTGCTCGTG GGAGTGATGG CAGCGCTGGC 1500CCCACTGGAC CTGCA 1515<210>5<211>245<214>PRT<213>人工序列<220.
<221>CHAIN<400>5Met Leu Ser Phe Val Asp Thr Arg Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr1 5 10 15Ser Tyr Leu Ala Thr Ser Gln His Val Ser Glu Ala Ser Ala Gly Arg20 25 30Lys Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Pro Gln Gly Glu Arg Gly Pro Pro35 40 45Gly Pro Pro Gly Arg Asp Lys Glu Asp Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly50 55 60
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<220>
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Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly245 250 255Ser Gly Gly Gly Gly Leu Ser Phe Val Asp Thr Arg Ile Leu Leu Leu260 265 270Leu Ala Val Thr Ser Tyr Leu Ala Thr Ser Gln His Val Ser Glu Ala275 280 285Ser Ala Gly Arg Lys Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Pro Gln Gly Glu290 295 300Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly Pro Pro305 310 315 320Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala325 330 335Ala Gln Tyr Asp Pro Ser Lys Ala Ala Asp Phe Gly Pro Gly Pro Met340 345 350Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ser Gly Pro Pro Gly355 360 365Pro Pro Gly Pro Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly Glu Pro Gly Gln370 375 380Thr Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Ala385 390 395 400Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly405 410 415Val Ala Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Pro420 425 430Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu Asp Gly Leu Thr435 440 445Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Thr Lys Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly450 455 460Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Pro Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Glu465 470 475 480Arg Gly Arg Ile Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ser Asp485 490 495
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Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly450 455 460Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Pro Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Glu465 470 475 480Arg Gly Arg Ile Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ser Asp485 490 495Gly Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala500 50权利要求
1.一种转基因合成的人I型胶原融合蛋白神经基质膜仿生材料，其特征在于所述神经基质膜仿生材料是通过转基因合成的人I型胶原融合蛋白或其变体。
2.如权利要求1所述的神经基质膜仿生材料，其特征在于所述转基因合成的人I型胶原融合蛋白，是由人I型胶原蛋白基因与神经再生促进剂的基因通过转基因合成融合基因，再通过表达生成的具有人I型胶原蛋白结构域及具有神经再生促进剂结构域的融合蛋白。
3.如权利要求1所述的神经基质膜仿生材料，其特征在于所述的人I型胶原融合蛋白变体，是通过采用基因定点突变调控所述融合蛋白一级结构中氨基酸的种类而构建成的融合基因变体，再通过表达生成的融合蛋白变体。
4.如权利要求2所述的神经基质膜仿生材料，其特征在于所述神经再生促进剂选自成年蛋白、神经细胞粘附蛋白、神经生长因子、睫状神经营养因子或脑源性神经营养因子。
5.如权利要求4所述的神经基质膜仿生材料，其特征在于所述神经再生促进剂是神经细胞粘附蛋白。
6.如权利要求2所述的神经基质膜仿生材料，其特征在于所述转基因合成的人I型胶原融合蛋白是由人I型胶原蛋白基因与神经细胞粘附蛋白基因通过转基因合成融合基因，其核苷酸序列见序列表中序号3，再通过表达生成的具有人I型胶原蛋白结构域及神经细胞粘附蛋白结构域的融合蛋白，其氨基酸序列见序列表中序号7。
7.如权利要求3所述的神经基质膜仿生材料，其特征在于所述的人I型胶原融合蛋白变体，是通过采用基因定点突变将所述融合蛋白一级结构中的K293，R358和K457分别调控为A，G和A而构建成的融合基因变体，其核苷酸序列见序列表中序号4，再通过表达生成的融合蛋白变体，其氨基酸序列见序列表中序号8。
8.权利要求1、2、3、6或7所述的神经基质膜仿生材料的应用，其特征在于所述仿生材料可配制成0.5-10重量％的水溶液，通过纺丝加工成纤维，或冻干成纤维，或浇铸成管形、平板膜形状。
9.如权利要求8所述的神经基质膜仿生材料的应用，其特征在于所述纤维或平板膜可用于加工成人工神经导管，或用于矫形、整形美容，或用于促进创面愈合，创面止血或作为手术残腔填充物。
全文摘要
一种转基因合成的人I型胶原融合蛋白神经基质膜仿生材料，是通过转基因合成的人I型胶原融合蛋白或其变体。它是由人I型胶原蛋白基因与神经再生促进剂基因通过转基因合成得融合基因，再通过表达生成的具有人I型胶原蛋白结构域及神经再生促进剂结构域的融合蛋白。也可采用基因定点突变调控融合蛋白一级结构，构建成融合蛋白的变体。该材料具有神经细胞生长所需的特定引导识别，再生促进，营养功能及可成形加工特性。该材料可配制成0.5－10重量％的水溶液，通过纺丝加工或冻干成纤维，或浇铸成其它形状。进一步可加工成人工神经导管，以模拟神经轴突再生过程中基质膜的功能，还可用于矫形、整形美容等。又该转基因合成材料，大规模生产成本低廉。
文档编号A61L31/04GK1616117SQ20031010856
公开日2005年5月18日 申请日期2003年11月13日 优先权日2003年11月13日
发明者陈皓, 张菁, 谢涵坤, 成立萍 申请人:东华大学